SENTETİK TOHUM ÜRETİMİ. Hazırlayan: Yük. Lis. Öğr. Zafer SEÇGİN Danışman: Prof. Dr. Ahmet OKUMUŞ

Transkript

1 SENTETİK TOHUM ÜRETİMİ Hazırlayan: Yük. Lis. Öğr. Zafer SEÇGİN Danışman: Prof. Dr. Ahmet OKUMUŞ

2 SUNUM İÇERİĞİ Tohum Nedir? Sentetik tohumun tarihçesi Sentetik tohum nedir? Sentetik tohum tipleri Sentetik tohum nasıl elde edilir? Sentetik tohumun avantajları ve dezavantajları Sonuç 2

3 Tohumun Yapısı Bitkilerde döllenme sonucu oluşan ve yeni bir bitki oluşturabilen yapıdır. 1. Embriyo 2. Endosperm 3. Testa 3

4 4

5 Sentetik Tohum Nedir? Sentetik Tohum: İn vitro ya da ex-vitro koşullarda bir bitki oluşturabilme kabiliyetine sahip ve depolanabilen somatik embriyo, sürgün tomurcukları, hücre agregatları veya herhangi bir bitki dokusunun yapay olarak kaplanmasına sentetik tohum denir. Taha ve ark.,

6 Sentetik Tohum ve Doğal Tohum 6

7 Somatik Embriyogenez Kallus ve vejetatif dokulardan gelişen embriyolara somatik embriyo olarak adlandırılmaktadır (Babaoğlu vd., 2001). Günümüzde in vitro kültür şartlarını ve özellikle de bitki büyüme düzenleyicileri kullanılarak bir bitkinin herhangi bir doku veya organındaki somatik hücreden, doğrudan ve kallus yolu ile embriyo elde etmek mümkün olabilmektedir (Babaoğlu vd., 2001). Somatik doku hücreleri öncelikle yüksek oranda oksin (genellikle 2,4- diklorofenoksi asetik asit (2,4-D), pikloram, naftalen asetik asit (NAA), dikampa içeren ortamda kültüre alınır daha sonra da oksin içermeyen ikinci bir ortama aktarılırlarsa embriyo üretme yeteneği kazanmaktadırlar. 7

8 Somatik Embriyogenesis 1. Direkt Somatik Embriyogenesis 2. İndirekt Embriyogenesis Somatik embriyogenesisin kullanım alanları 1. Klonal Çoğaltımı 2. Gen Aktarımı 3. Sentetik tohum üretimi 8

9 Yaş Tohum Kurutulmuş tohum Redenbaugh ve arkadaşları (1984) yoncanın somatik embriyolarını hidrojel ile kapladığını geliştirmiş ve 1988 de patent almıştır. Sentetik Tohum Tipleri Bu metod İlk olarak Kitto and Janick (1982) tararıfından havuç embriyolarının kaplanmasında kullanıldı. 9

10 Kurutulmuş Tohum (Desiccated System) Propagüller kurutulması ve kaplanması Propagüllerin polietilen glikol ile kaplandıktan sonra 1 gece teflon yüzeyde kurutulurlar. Uygun besi ortamına alınması PEG ile kaplanan ve kurutulan propagüllerin hayatta kalabilmesi için uygun besi ortamına alınır ve tekrar re-hidrate edilir. Propagüllerin kaplanması ve depolanması Hayatta kalan propagüller uygun bir jel ile kaplanır ve düşük sıcaklıklarda depolanır. Kitto and Janick,

11 Yaş Tohum (Hydrated System) Propagüllerin hidrojel kaplanması Somatik propagüller bir sodyum alginat gibi hidrojel matrikle kaplanır. Kalsiyum klorid ile kaplanması Sodyum alginat ile kaplanan propagüller boncuk oluşturabilmeleri için kalsiyum klorid ile kaplanırlar.. Propagüllerin yıkanması ve depolanması Kalsiyum klorid ile kaplamadan sonra kalsiyum tuzlarını uzaklaştırmak için saf suda bekletilirler ve + 4 C de depolanırlar. Redenbaugh ve ark.,

12 Propagüller % 3 sodyum aljinat MS NAA BAP Fungisit, İnsektisit CaCl2 20 dakika Steril suda 2 dakika Çimlendirme Tohumların kurutması 12

13 Hidrojel ile kaplama teknikleri 1-Tek tabakalı sentetik tohum Na- alginate + Somatic embryo En basit yolu: Temel olarak Na + & Ca ++ arasında iyon değişiminden dolayı yuvarlak ve sert Ca-aljinat boncukları oluşur. Kürelerin çapının boyu pipet ucunun boyu ile doğru orantılıdır. jel matrix bileşenleri, kapsüllenmiş dokuların bitkiye dönüşüm performanslarını etkiler. Caalginate Patel ve ark.,

14 2- Çift-tabakalı sentetik tohum Tek katmanlı boncuklar CaCl 2. 2H 2 O içersine damlatılması ardından tekrar Na-aljinat ile kaplanır. Daha iyi koruma için çift kapsülleme metodu uygulanır. Patel ve ark.,

15 Sentetik Tohum Üretme Makinası Sakamoto ve arkadaşları (1992) tarafından aletle elde edilen jel boncukları renklerine göre CCD kamera ile ayıklanır Büyük standart alanlı koyu renk taşıyan boncuklar embriyo yüklü oldukları için üretim kutusuna dökülürken, küçük alanlı embriyo yüklenmemiş boncuklar, soluk-renksiz küçük olan boncuklar, yani düşük kaliteli embriyo taşıyan boncuklar uzaklaştırılır. Bu sistem ile embriyo ile yüklü olmayan boncuklar, sistemden ayrıldığı için kaliteli embriyoların olduğu boncuklar bitki üretiminde başarı yüzdesini artırır. Ipomoea batatas (tatlı patates) de yapılan bir çalışmada, embriyolar büyüklüklerine, renklerine, şekillerine göre kamera ile ayrılmış ve sonuçta çimlenme yüzdesi artırılmıştır (Padmanabhan, 1998). 15

16 Kapsül Matriksleri Bitkilerden; (arap zamkı yada kitre zamkı), Tohumlardan (keçiboynuzu, guar ya da tamarind yani (demirhindi meyvası- amarindus indica), Deniz yosunlarından (agar, karragenan veya aljinat), Mikroorganizmalardan (dekstran, gellan veya ksanthan zamkı) yapılan hidrojellerdir (Redenbaugh vd., 1986; Shu, 2003). Katılaştırıcı maddeler Besin elementleri Koruyucu kimyasallar Agar, Alginat, Zamk, Dektran, Jel Makro ve mikro elementler, Vitaminler, Büyüme düzenleyiciler, İnsektiistler, Nematositler, Herbisitler, Fungisitler 16

17 Neden Sodyum Aljinat? Uygun vizkosite Düşük toksite Hızlı jelleşme Biyouyumluluk özelliği Oda sıcaklığında çözülebilir CaCl2 ile geçirimli jel oluşturabilir Aljinata ile uzun süre depolanabilir CaCl2 ile damla oluşturması Nadeem ve ark.,

18 Tablo 1. Kaplama maddeleri ve katılaştırma ajanları (Redenbaugh ve akr., 1986) JEL KONSANTRASYON (w/v) Sodyum ve potasyum aljinat Sodyum aljinat jelatinli KATILAŞTIRMA AJANI CaCl2, LaCl2, CoCl2, FeCL2, Ca(OH)2, Ca(NO3)2 KONSANTRASYON (mm) CaCl Karragenan KCl 500 Karragenan 3.0 KCl NH4Cl CaCl Guar sakızı 2.0 Sodyum tetraborat Agar 5.0 Tannik asit 100 Tragakant sakızı 2.5 CaCl2 100 Sodyum pektat 2.0 CaCl2 CuSO4 Karboksimetil selüloz 2.5 CuSO

19 Tablo 2. Sentetik tohumlar için kullanılan bitki ve eksplant tipleri (Reddy ve akr., 2012). Türlerin ismi Eksplant tipi Kaynak Allium satium L. (Sarımsak) Çiçek soğancığı Bekheet, 2006 Beta vulgaris L. (Pancar) Somatik embriyo Tsai ve Saunders, 1999 Brassica oleracea L. var. Botrytis (Karnabahar) Somatik embriyo Redenbaugh ve ark., 1986 Capsicum annuum L. (Biber) Somatik embriyo Phonkajornyod ve ark., 2004 Cucumis sativus L. (Hıyar) Somatik embriyo Tabassum ve ark., 2010 Helianthus annuus L. (Ayçiçeği) Sürgün uçları Katouzi ve ark., 2011 Hordeum vulgare L. (Arpa) Mikrospordan türetilmiş embriyolar Datta and Potrykus, 1989 Ipomoea batatas L. (Tatlı patates) Somatik embriyo Cantliffe, 1993 Olea europaea L. (Zeytin) Nodal kısımlar Gardi ve ark., 1999 Oryza sativa L. (Çeltik) Somatik embriyo Arunkumar ve ark., 2005 Pyrus communis L. (Avrupa armudu) Sürgün uçları Ahmad ve ark., 2007 Solanum nigrum L. (Köpek üzümü) Somatik embriyo Fiegert ve ark., 2000 Vitis vinifera L. (Asma) Somatik embriyo Nirala ve ark., 2010 Zea mays L. var saccharata (Tatlı mısır) Somatik embriyo Thobunluepop ve ark.,

20 Biyoreaktör ile somatik embriyo üretimi En çok kullanılan yöntem biyoreaktörlerde kontrollü şartlar altında somatik embriyo üretmektir. Bioreaktörler kültür devam ederken, kültür ortamının, ph nın, O2, diğer gazların ve sıcaklığın kontrol edilebildiği dolayısı ile devamlı üretimin sağlandığı düzeneklerdir. Kontaminasyonun en aza indirildiği bu sistemler de maksimum seviyede homojenizasyon sağlanamaktadır. İlk biyoreaktörle somatik embriyo üretimi havuçta yapılmıştır. (Stuart ve akr., 1987). Yonca (Stuart ve arkadaşları 1987) ve havuçta (Molle ve arkadaşları 1993) biyoreaktörde çok miktarda ve aynı gelişim evresindeki yüksek kaliteli somatik embriyolar üretilmişdir. Molle ve arkadaşları (1993), havuçta 10 litrelik biyoreaktörlerde %77 bitkiye dönüşüm oranı, %100 yaşayabilme kabiliyeti, gelişimde eş zamanlılık ve yüksek ürün (0.7x106 emb/l) kapasitesine ulaşmışlardır. Biyoreaktörlerin basitliği ve işlemin kolay olması, ticari üretim için büyük yarar sağlar. 20

21 Maliyet avantajı Genetik benzerlik Direkt olarak araziye aktarım Hibrit Tohum SENTETİK TOHUM AVANTAJLARI Hastalıksız Bitki Elit Gonotip Taşıma GDO Bitkiler Nesli tükenmekt e olan bitkiler 21

22 Sentetik Tohum Kullanımının Sınırları Mikroçoğaltım için yaşayabilir propagüllerin sınırlı olması Somatik Embriyoların eşzamanlı gelişmemesi Somatik embriyolarda strese tolerans ve dormansi eksikliği Somatik embriyoların tam uygun olmayan olgunlaşmaları sonucunda bitkiye dönüşememe ve çimlenememe 22

23 Mohanty ve Das 2013 yılında Alt türü olan Dendrobium densiflorum protocorm benzeri yapıları sodyum aljinat ile kaplanması sonucunda sentetik tohum elde etmişlerdir. PLB lerin bitkiye dönüşüm ve aljinat ile kaplanılabilirliğini incelemişler ve farklı sıcaklıklarda (4, 8, 16, Oda Sıcaklığında) ve Farklı depolama sürelerinde (15, 30, 60, 75, 90) depolanabilirliğini incelemişlerdir. RAPD markör kullanılarak kaplamadan sonra çimlendirilen bitkilerin genetik stabilitesi doğrulanmıştır. 23

24 Depolama sıcaklığı Depolama süresi Bozulmamış tohum sayısı Bitki oluşturabilme kabiliyet C C C 60 75, ,00 Oda sıcaklığı 15 89, ,

25 Nyende ve arkadaşlarının (2002) Kenyada yaptıkları bir çalışmada göre; tohumluk olarak kullanılmak üzere depolanan patateslerde yoğun olarak buluna viral hastalıkları ortadan kaldırmak amacı ile çimlenen yumrulardan süren ve virüs taşımayan sürgün uçları kesilip, sodyum aljinat ile kaplanarak sentetik tohumlar elde edilmiştir. Yapılan çimlendirme deneylerinde, sentetik tohumun doğrudan tarlaya ekiminde başarı oranının düşük olduğu görülmüştür. Buna karşılık, önce tohumu kontrollü şartlarda çimlendirip, elde edilen fidelerin tarlaya dikilmesi ile başarı oranının çok yükseldiği belirlenmiştir. 25

26 SENTETİK TOHUM ÇALIŞMASI 26

27 SONUÇ Sentetik tohum teknolojisini gelişmesinde, sentetik tohumun üretim sırasındaki tüm işlemlerin makineleşmesi ve senkronizasyonu için standart bir metodun oluşturulması gerekmektedir. Sentetik tohum üretimi in vitro kültür sistemleri kullanılarak laboratuar koşullarında kullanılabilir bitki materyalinin büyük oranda üretilmesi için gereklidir. Sentetik tohum teknolojisi mikroçoğaltım ve gen kaynaklarının korunması için önemli bir potansiyel sunar; bu teknolojinin ticari değerde kullanılabilmesi için mükemmel olması gerekmektedir. Yapay tohum teknolojisinin pratik uygulaması için önemli bir sınırlayıcı faktör olan yüksek kalitede mikropropagüllerin geniş çapta üretilmesi gerekmektedir. 27

28 KAYNAKLAR Redenbaugh, K., Nichol, J., Kossler, M. E. And Paasch, B., İnvitro, 1984, 20, Sakamoto, Y., Mashiko, T., Suzuki, A., Kawata, H. and Iwasaki, A., Development of encapsulating technology for synthetic seeds. Acta Horticulturae 319, Kitto, S, K. And Janick, J., Hortic Scı., 1982, 17, 488. M. Chandrasekhara Reddy, K. Sri Rama Murthy and T. Pullaiah, Synthetic seeds: A review in agriculture and forestry African Journal of Biotechnology Vol. 11(78), pp , 27 September, Nadeem A. Siddique1, Mohd. Mujeeb, Mohd Rashid, Kashif Hussain, Synthetic Seed Production; its Relevance and Future Panorama. Am. J. PharmTech Res. 2013; 3(3) ISSN: Hatice Çölgce, M.Cihat Toker, Sentetik tohum. Anadolu Üniversitesi Bilim Ve Teknoloji Dergisi Anadolu Unıversıty Journal Of Scıence And Technology Cilt/Vol.:7-sayı/No: 2 :

29 TEŞEKKÜRLER 29