ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Onur TURGUT TÜRKİYE DE TURUNÇGİL TRİSTEZA VİRÜS HASTALIĞININ MEVCUT DURUMUNUN SEROLOJİK ve MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE BELİRLENMESİ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI ADANA-2008

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TÜRKİYE DE TURUNÇGİL TRİSTEZA VİRÜS HASTALIĞININ MEVCUT DURUMUNUN SEROLOJİK ve MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE BELİRLENMESİ Onur TURGUT YÜKSEK LİSANS TEZİ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI Bu Tez / /2008 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği ile Kabul Edilmiştir. İmza... Prof. Dr. Sadettin BALOĞLU Danışman İmza Yrd.Doç.Dr.Nihal BUZKAN Üye İmza Yrd. Doç. Dr. Muharrem Arap KAMBEROĞLU Üye Bu Tez Enstitümüz Bitki Koruma Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LiSANS TEZi TÜRKİYE DE TURUNÇGİL TRİSTEZA VİRÜS HASTALIĞININ MEVCUT DURUMUNUN SEROLOJİK ve MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE BELİRLENMESİ Onur TURGUT ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI Danışman:Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU Yıl :2008 Sayfa : 51 Juri :Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU Doç. Dr. Nihal BUZKAN Yrd.Doç. Dr. Muharrem A. KAMBEROĞLU Bu çalışma Türkiye deki Turunçgil yetiştiriciliğinin yoğun olarak yapıldığı Ege ve Akdeniz bölgesindeki 6 il ve 23 İlçede yürütülmüştür. Örnekler Adana, İçel (Mersin), Hatay, Antalya, İzmir ve Aydın illerinden toplanmıştır. Değişen şiddetlerde bodurluk, geriye doğru ölüm, zayıf gelişme ve karakteristik olarak aşı yerinde şişme, aşı yerinden kaldırılan kabuk parçasının altında odun dokusunda iğne ucu şeklinde çıkıntılar, karşılığında girintiler şeklinde belirti gösteren ağaçlardan örnekler alınmıştır. Bu amaçla 147 Turunçgil bahçesi gezilmiş, 51 bahceden 2006 da 105, 2007 de 171 olamk üzere 276 örnek toplanmıştır. Toplanan örneklerin tamamı DAS-ELIAS testine tabi tutulmuş ve İçel ilinden gelen 6 ve İzmir ilinden gele 2 olmak üzere toplam 8 örnekte hastalık kesin belirlenmiştir. Hasta olduğu belirlenen 4 farklı örnek Meksika laym indeks bitkisine aşılanmış, ancak belirgin bir sonuç elde edilememiştir. Ayrıca şüpheli ve infekteli olan bazı örnekler Polymerease Chain Reaction (RT-PCR) metodu ile testlenmiştir. İki yıllık çalışma sonucunda yirmi yıl once aynı bölgelerde yapılan çalışmalarda belirlenen ağaçlar haricinde yeni hastalıklı ağaçlar belirlenememiştir. Sonuç olarak geçtiğimiz yıl süresinde ülkemizde CTV nin durumunun değişmediği belirlenmiştir. Ancak son yıllarda hastalığın etkin vektörünün (Toxoptera citricidus) Avrupa da Portekiz ve İspanya ya giriş yapmasından dolayı taşınma ve yayılma riski artmış olup, CTV Türkiye için hala önemli bir potansiyel tehlikedir ve bu tehlikenin önemi daha da artmıştır. Anahtar Kelimeler : CTV, DAS-ELISA, RT-PCR I

4 ABSTRACT MSc THESİS DETECTION OF CITRUS TRISTEZA VIRUS CURRENTLY SITUATION BY THE METHODS OF SEROLOGICAL AND MOLECULAR IN TURKEY Onur TURGUT DEPARTMENT OF PLANT PROTECTION INSTUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervısor : Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU Year:2008 Page : 51 Juri : Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU Ass. Prof. Dr. Nihal BUZKAN Ass. Prof. Dr. Muharrem A. KAMBEROĞLU This study was conducted at 23 districts of 6 different provinces are the most citrus growing areas of Mediterranean and Aegean region of Turkey. The samples were collected from Adana, Mersin, İçel, Antalya, İzmir and Aydın. Samples were collected form trees which showing symptoms like Dwarfing at different level, leaf yellowing, Slow or Quick Decline, Over-Growth at bud union, bark Stem Pitting and inverse pitting. For this aim 147 citrus orchards were surveyed and 105 and 171 leaves samples were collected in 2006 and 2007 respectively. All samples were tested by DAS-ELISA and results showed that totally 8 samples were CTV positive which are 6 samples from Mersin and 2 samples from İzmir. Four positive samples from different sources were inoculated to Mexican Lime but any typical symptoms have not been observed form indexing assay. However all positive and some suspected samples were analyzed by RT-PCR. As a result of this two years study, except the trees which founded as positive at two decades before, any new infection has not been determined in the region. Finally it is determined that the situation of CTV has no any significant change in Turkey during last years. As a conclusion; due to the entry of the most harmful vector (Toxoptera citricidus ) of the disease to Europe like Spain and Portugal CTV is still remains as a big potential hazard for citiculture of Turkey. Key Words : CTV, DAS-ELISA, RT-PCR II

5 TEŞEKKÜR Çalışmalarımın yürütülmesinde bilgi ve deneyimleri ile beni yönlendiren danışman hocam Sn. Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU na teşekkür ederim. Çalışmalarımın her aşamasında büyük bir özveri ile bana arazi ve labaratuar çalışmlarında yardımcı ve destek olan Dr. Nevzat BİRİŞİK, Yrd. Doç. Dr. Muharrem A.KAMBEROĞLU, Dr. Behçet Kemal ÇAĞLAR, Arş. Gör. Gökmen KOÇ, Zir. Yük. Müh. A.Filiz ÇALIŞKAN ve Zir. Müh. Aydın KEÇE ye teşekkür ederim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ....I ABSTRACT II TEŞEKKÜRLER III İÇİNDEKİLER.....IV SİMGELER VE KISALTMALAR.....VI ÇİZELGELER DİZİNİ......VII ŞEKİLLER DİZİNİ.....VIII 1.GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOD Materyal Biyolojik Testler İçin Kullanılan İndikatör Test Bitkileri Survey Alanı Hakkında Bilgi Metod Sürvey Çalışmaları: Arazi Gözlemleri ve Hastalıklı Bitki Materyallerinin Elde Edilmesi İnfekteli Örneklerin Saklanması ELISA Testinin Uygulanması Total RNA Ekstraksiyonu RT-PCR Çalışmaları Agaroz Jel Elektroforez Çalışmaları Biyolojik indeksleme metodu ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Arazi Gözlemleri ve Hastalıklı Bitki Materyallerinin Elde Edilmesi Sürvey Çalışmalarında Gözlenen Hastalık Belirtileri ELiSA Testi çalışmaları Total RNA ekstarksiyonu ve RT-PCR çalışmaları Biyolojik indekleme çalışmaları SONUÇLAR VE ÖNERİLER...36 IV

7 6. KAYNAKLAR.. 41 ÖZGEÇMİŞ..48 EKLER. 49 V

8 SİMGELER ve KISALTMA C : Santigrad derece cdna : Komplementer Deoksiribonükleikasid CP : Coat Protein DNA : Dekosiribonükleikasit EDTA : Ethilenediaminetetraacetic acid ELISA : Enzim linked Immunosorbent Assey PNP : Paranithrophynl phosfat gr : Gram H 2 O : Su ph : Hidrojen iyonu konsantrasyonu PCR : Polymerease Chain Reaction RNA : Ribonülik asit VI

9 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1. Dünya ve Türkiye turunçgil üretim sıralaması Çizelge 1.2 Türkiye deki turunçgil ağaç varlığının türlere göre dağılımı Çizelge 3.1 Sürvey çalışmalarında örnek alınan iller, ilçeler ve bahçe sayısı Çizelge 4.1.Toplanan turunçgil yaprak ve sürgün örneklerinin il ve ilçelere göre dağılımı...28 Çizelge 4.2. Çalışma kapsamında alınan örneklerin illere göre dağılımı ve ELISA testi sonucu bulaşık bulunan örnekler...31 Çizelge 4.3. Değişik zamanlarda yapılmış DAS-ELİSA Testi sonuçlarının 405 nm de okunan absorbans değerleri VII

10 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1 Turunçgil üretimi yapılan bölgeler Şekil 3.2 Tristeza için survey çalışmalarında şüpheli örnekler için aranan karakteristik belirtiler (Baloğlu, 1988) Şekil 3.3. Hasta ağaçlarda aşı yeri şişmesi (over-growth) ve aşı yerinden kaldırılan kabuk ve odun dokudaki oluşumlar (honey combing, inverse pitting ) (Baloğlu, 1988) 19 Şekil 4.1 CTV ile bulaşık olduğu belirlenmiş ağaçlarda bodurlaşma ve çalılaşma görüntüleri (Mersin) Şekil 4.2 CTV ile bulaşık olduğu belirlenmiş portakal ağaçlarında bodurlaşma ve aşı yerinde meydana gelen şişme (Over-growth) görüntüsü (Mersin)...30 Şekil li yıllarda Tristeza ile ilgili yapılan bir çalışmada hasta ağaç olarak kullanılan T21 kodlu portakal ağacından 20 yıl sonra benzer bir görüntü (Mersin ili Iğdır Köyü, Baloğlu, 1988)...30 Şekil 4.4 ELISA testi sonucu meydana gelen renk değişimleri, sarı renk oluşumu pozitif, hasta örneği göstermektedir...33 Şekil 4.5 Değişik dokulardan izole edilmiş CTV total RNA ları...33 Şekil 4.6 CTV nin 600bp boyutunda RT-PCR ile çoğaltılmış ürünleri (Örnekler,1: T3; 2: T9; 3: T12; 4:T21; 5: MT1; 6: MT2; 7: İz 1) (Dr. Bayram ÇEVİK, kişisel görüşme)...34 Şekil 4.7. Çalışmada CTV için aşılama yapılmış meksika laym bitkisi VIII

11 1.GİRİŞ Onur TURGUT 1. GİRİŞ Türkiye, yıllık tarımsal üretimi ve tarımsal ticaretiyle dünyanın önde gelen tarım ülkelerinden biridir. Ülkemiz tarımı içerisinde meyvecilik ise insan beslenmesindeki yeri ve ihracat açısından oldukça önemlidir. Turunçgil üretimi yalnız ülkemiz için de değil dünya nüfusu içinde önem arz etmektedir. Çizelge 1 de önemli turunçgil yetiştiricisi ülkelerin yıllık üretim miktarları verilmiştir. Çizelgedende anlaşılacağı üzere Dünya daki toplam Turunçgil üretimi hektarda yaklaşık olarak ton civarında gerçekleşmiş (FAO, 2007) ve 2007 yılı verileri ile önemli turunçgil üreticisi ülkeler ve bu ülkelerin üretim miktarları Çizelge 1.1 de özetlenmiştir. Çizelgede yaklaşık ton ile Brezilya birinci sırada yer alırken Türkiye bu ülkeler arasında ton üretim miktarı ile 12. sırada yer almaktadır. Ancak burada dikkat edilmesi gereken noktalardan biri Brezilya daha çok endüstriyel turunçgil üretimi yaparken İspanya ve diğer birçok ülke sofralık turunçgil üretimi yapmaktadır. Çizelge 1.1 Dünya ve Türkiye Turunçgil Üretim Sıralaması (FAO, 2007) Ülke Toplam Üretim (Ton) 1. Brezilya Çin ABD Meksika İspanya Türkiye Dünya Ülkemiz ekolojik ve ekonomik koşulların uygunluğu nedeniyle önemli bir turunçgil üreticisi ülke durumunda olup, üretimin tamamına yakını sofralık turunçgil çeşitlerinden oluşmaktadır. Portakal, mandarin, limon ve altıntop türlerinden değişik 1

12 1.GİRİŞ Onur TURGUT çeşitlerin yetiştirildiği ülkemizde turunçgiller dış satımı ülke ekonomisinde büyük bir öneme sahiptir. Çeşitlere bağlı olarak türler bazında turunçgil üretim miktarları Çizelge 1.2 de verilmiş olup en fazla portakal takiben mandarin, limon ve greyfurt üretiminin önemli olduğu görülmektedir. Çizelge 1.1 deki rakamdan fazla olarak bildirilen son çizelgedeki toplam rakam yıllar arasında farktan kaynaklanmaktadır. Turunçgil yetiştiriciliğinin Türkiye de yapıldığı alanlar Akdeniz Bölgesi nde Adana, Mersin, Hatay ve Antalya, Ege Bölgesi nde İzmir, Muğla ve Aydın illeri ve çok az miktarda Doğu Karadeniz şeklinde sıralanmaktadır. Yetiştirilen Turunçgil çeşitleri arasında Vaşington navel ve diğer erkenci yada geççi navel grubu portakallar (Lane Late, navelate, spring navel, nevhall, fukumoto ve navelina gibi), Yafa poratakalı, Valensiya portakalı (Citrus sinensis), greyfurtlarda eski çeşitlerden Marsh seedless, Redblush ve kırmızı çeşitler olarak Rio Red, Star Ruby ve Henderson gibi altıntop çeşitleri (Citrus paradisi), Klemantin ve Satsuma grubu mandarin çeşitleri (Rize, Okitsu, Dobashi beni vb.), Fremont ile bazı hibrit çeşitler (Nova, Robinson, Lee, Fortune vb), Enterdonat, Eureka ve Dikenli grubu (Citrus limon) ile Meyer Limonu gibi çeşitlerle beraber toprak ve iklim koşullarına uygun ve belli başlı hastalıklara dayanıklı ve yüksek verim ve kaliteye neden olan turunç (Citrus aurantium) anacı bazı olumsuzluklarına rağmen bölgede en yaygın anaç olarak kullanılmaktadır (AKİB, 2000; DİE (TÜİK), 2006). Çizelge 1.2. Türkiye deki Turunçgil Ağaç Varlığının Türlere Göre Dağılımı (DİE (TÜİK), 2006) Türkiye Toplamı Ağaç Sayısı Üretim (ton) Portakal Limon Mandarin Greyfurt Toplam

13 1.GİRİŞ Onur TURGUT Ülkemizde daha çok eski sayılabilecek çeşitlerin üretimde hakim olmasına rağmen son zamanlarda dış satım için talep ve rekabet koşulları gereği yetiştirilen çeşit sayısı artmış ve yeni çeşitlerin üretimi önem kazanmaya başlamıştır. Her ne kadar hala üretimin büyük kısmının eski çeşitlerden olması ve bu çeşitler ile bahçelerin kurulmaya devam etmesi ve buna bağlı olarak bilinçsiz şekilde yeni tesislerin oluşturulması hem arz fazlasına hem de dış pazarda rekabet gücü zayıf çeşitlerin üretilmesine neden olmaktadır. Ancak yine de tüm bu olumsuzluklara rağmen turunçgil yetiştiriciliği Akdeniz bölgesinin sembol ürünü olmaya devam etmektedir. Son yıllarda piyasa koşullarında meydana gelen değişiklikler, üretimin artması, buna paralel olarak değişik nedenlerden dolayı dış satımın arzu edilen düzeyde artmaması ve devletin hibe yöntemiyle diğer bazı ürünlere destek vermesi diğer ürünlerin gelişmesine neden olurken, turunçgil ekim alanlarının artışında bir yavaşlamaya neden olmuştur. Ayrıca değişik tarımsal destekler, özellikle damlama sulama sisteminin bölgede gelişmesi ile hem su daha dengeli, yeterli ve ekonomik olarak kullanılmakta, hem de üretim maliyetlerinde azalma gündeme gelmektedir. Bu yöntemle su israf olmadan ve ağaçlar herhangi bir stres yaşamadan üretim yapılmaya başlanmıştır. Ancak gelişen teknoloji ve artan verimlilikle beraber turunçgil üretiminde arz fazlası meydana gelmiştir. Bu artış sonucunda satış fiyatları düşmüş, dolayısıyla turunçgil dikim alanlarında son yıllarda oransal olarak düşüşler meydana gelmiştir. Bu gelişmelere rağmen yurt dışından değişik ülke veya bölgelerden sağlanan, üretim kalitesi yüksek, verimli ve yola dayanıklı, asit oranı düşük olan bazı yeni çeşitlerle bölgede bahçeler özellikle bilinçli üreticiler tarafından kurulmaya devam etmektedir. Diğer tüm bitkilerde olduğu gibi turunçgil üretiminde de birçok hastalık ve zararlı ile karşılaşılmaktadır. Son yıllarda sertifikalı, izlenebilir ve kontrollü üretim nedeniyle (Eurepgap Standartları, Globalgap Standartları, İyi Tarım Uygulamaları vb. sertifika uygulamaları) özellikle zararlılar için uygulanan kimyasalların eskisi kadar rahat kullanılamaması nedeniyle, doğal dengenin de bozulduğu Akdeniz Bölgesi turunçgil üretiminde problemler yaşanmaktadır. Ancak yine de zararlılara karşı kültürel önlemlerin uygulanması ve bazı yeni grup ilaçların kullanımıyla sorun aşılabilmektedir. Bazı fungal ve bakteriyel hastalıklara da gerekli önlemleri alma ve 3

14 1.GİRİŞ Onur TURGUT mücadele imkanları vardır. Ancak Turunçgillerde aşı yoluyla taşınan ve henüz kimyasal bir mücadele yönteminin geliştirilemediği virüs ve virüs benzeri hastalıklar önemini hala korumaktadır. Anaç-kalem ilişkileri göz önüne alınarak önlem alınmaya çalışılsa da her anacın ister iklim olsun, ister toprak koşulları olsun veya diğer hastalıklar ile ilişkisi olsun mutlaka bölge için bir olumsuz yanı bulunmakta ve sonuç olarak risklere rağmen belli anaçların kullanımı gerçekleşmekte veya halen devam etmektedir (Uygun, 2001; Kersting ve Özden, 2001). Turunçgillerde zarar yapan yaklaşık 78 adet virüs ve virüs benzeri hastalık vardır. Bunların bir kısmı vektör böceklerle taşınırken tamamı da aşı yoluyla taşınmakta ve yayılmaktadır. Söz konusu virüs hastalıkların bir kısmı önemli ekonomik kayıplara neden olurken bir kısmı sadece değişen oranlarda verim ve kalite kaybına neden olmaktadır (Uygun, 2001; Timmer ve ark, 2002). Özellikle turunç anacının kullanıldığı bölgelerde taşıyıcı vektörün bulunma durumuna göre turunçgillerde en fazla ekonomik kayba neden olmuş hastalık Türkçede Göçüren olarak isimlendirilmiş olan Tristeza Virüs Hastalığıdır (Citrus tristeza virus, CTV). Bu güne kadar yüz milyondan fazla ağacın ölümüne neden olan Tristeza Virüs Hastalığı bitki virüsleri içinde en önemlisidir (Baloğlu, 2001). CTV ilk olarak Arjantin de rapor edildikten sonra zamanla çevre ülkeleri daha sonraları vektörlerle Avrupa ya kadar, son zamanlarda ise ülkemiz ile sınır komşusu olan Yunanistan dahil olmak üzeri çoğu yerde görülmeye ve ekonomik kayıplara neden olmaya başlamıştır. Hastalığın yayılmasında T. citrudus, T. aurantii ve A. gossipii gibi vektörler çok önemli rol oynamışlardır. CTV nin yayılmasının aşırı hızlanmasında ayrıca dünyada taşımacılığın gelişmesi önemli bir faktör olmuş, farklı ülkelere taşınan hastalıklı aşı gözleri yayılmayı hızlandırmıştır. (Timmer ve ark, 2002). Hastalığının turunç anacı gibi duyarlı anaçlar üzerine aşılı ağaçlarda görülen simptomları bodurluk, geriye ölüm, solgunluk, yaprak dökümü ve sonucunda iki üç ay içerisinde ağacın hızlı ölümü (Quick decline) veya Akdeniz ülkelerinde ve ülkemizde olduğu gibi uzun yıllar bodur verimsiz kalma (Slow decline) şeklinde ortaya çıkmaktadır. Ayırt edici bir diğer belirti de aşı yerinde meydana gelen şişme ve bu bölgeden kaldırılan kabuk iç yüzeyinde iğne ucu ile delinmiş gibi girintiler, 4

15 1.GİRİŞ Onur TURGUT karşılığında ise çıkıntılar oluşumudur. İletimin aksamasına neden olan bu belirti ağaçların bodur kalmasına veya ölmesine neden olmaktadır (Baloğlu, 2001). Toxoptera citricidus yaprak bitinin bulunduğu ve yetiştiriciliğin turunç anacı üzerinde yapıldığı Amerika kıtasında çok ciddi kayıplara neden olan Tristeza Virüs Hastalığı Akdeniz Bölgesi turunçgil yetiştiren ülkelerinde bir başka vektör Aphis gossypii isimli yaprak biti ile taşınmaktadır. Ancak bu bölgede Amerika kıtasında olduğu gibi CTV yıkıcı olmamış, ancak birçok ağacın ekonomik olmaktan çıkmasına neden olmuştur. İspanyada 1956, ülkemizde de 1960 lı yıllardan sonra varlığı saptanan Tristeza Virüs Hastalığı üzerinde en çok çalışma yapılmış hastalıklardan biridir.(yumruktepe,1993; D'Onghia ve Lacirignola, 1997). Vektör etkinliğinin zayıf olması yanında hastalığın hafif ırklarının varlığı nedeniyle bölgede fazla yayılamayan hastalık potansiyel tehlike olarak sürekli dikkate alınmıştır. Böyle olmasına rağmen özellikle İspanya da kayıplara neden olan hastalığın etkili vektörü T. citrisidus 2006 yıllında Portekiz e ulaşmış ve böylece Avrupa kıtasına girmiştir. Potansiyel tehlike olan Tristeza virüsü artık çok ciddi gerçek bir tehdit haline gelmiş ve çalışmalarda bu konuda son zamanlarda hızlanmıştır. Bu hastalık ile mücadelede en önemli konu hastalığın bölgeye gelmesini önlemek, bulaşık olduğu belirlenen ağaçları derhal imha etmek, dayanıklı anaçlar kullanmak, virüs ve virüs benzeri hastalıklardan ari üretim materyali ile bahçeleri tesis etmek ve ayrıca vektör takibi ve mücadelesi önem taşımaktadır. Tristeza virüsüne duyarlı olan anaçların yoğun olarak kullanıldığı bölgelerde özellikle hastalık önem taşımakta ve sürekli olarak durumu rutin testler ile takip edilmektedir. Tristeza dışında diğer tüm virüs ve benzeri hastalıkların turunçgil endüstrisi gelişmemiş ülkelerde verimi % oranında azalttığı da rapor edilmiş olup Tristeza Virüsü de en tehlikeli turunçgil hastalığı olarak kabul edilmektedir (Baloğlu 2001). Ülkemizde 1960 lı yıllardan sonra simptomolojik olarak, 70 li yıllardan sonra da Meksika laymı bitkilerine indeksleme çalışmaları yoluyla biyolojik olarak varlığı saptanan CTV, 1980 li yıllardan sonra serolojik testlerden ELISA testi ve Elektron Mikroskobu Yöntemleri kullanılarak yaygınlığı saptanmış ve hastalık etmeni purifiye 5

16 1.GİRİŞ Onur TURGUT edilmiştir. Bugüne kadar yapılan çalışmalarda ülkemizde hastalığın yaygın olmadığı fakat yapılan testlerle var olduğu bilinmektedir (Baloğlu, 1988; 2001; Güllü, 1989). Takip eden yıllarda değişik araştırıcılar CTV ile ilgili çalışmalar yürütmüşler, ancak hastalığın son yirmi yılda değişmediği ve potansiyel tehlike olarak kaldığı görülmüştür yılları arasında yapılan çalışmalarda Güney Amerika da ve Atlas Okyanusundaki bazı adalarda bulunan ve Tristeza Virüsü için taşınma ve yayılmada en etkili vektörü olarak bilinen T.citrisidus un Avrupa kıtasına ulaştığı rapor edilmiştir. Bu vektörün girişi ile birlikte özellikle İspanya ve Portekiz de hastalığın yayılmasının artış eğilimine geçtiği belirlenmiştir. Ülkemize yurt dışından yasal olmayan yollarla yeni çeşitlerin üretim materyalinin yasal yada gayri yasal yollarla gizlice getirilmesi ile vektör ve etmenin şiddetli ırklarının gelmiş olabileceği düşünülmektedir. Bu nedenle, bu çalışmada daha önce hastalığın bulunduğu alanlar başta olmak üzere, hastalık etmenin DAS-ELISA testi ve moleküler tanı yöntemlerinden Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) kullanılarak 2005 yılından sonraki durumunun ne olduğu araştırılmıştır. Çalışmanın bu amaca ulaşması için ülkemizde yoğun turunçgil yetiştiriciliği yapılan alanlar önce simptomolojik olarak taranmış, şüpheli bitkilerden örnekler alınarak teşhis çalışmaları yapılmış, ayrıca daha önce hasta olduğu belirlenen alanlardaki ağaçlar ile çevresindeki ağaçlar da test edilerek son durum ortaya konulmaya çalışılmıştır. Tristeza Virüs hastalığının en etkili ve tehlikeli taşıyıcısı ve yayıcısı olan ve Avrupa kıtasına ulaşmış bulunan bu önemli vektörü T. citricidus un ülkemize henüz gelip gelmediği ve CTV nin mevcut durumu bilinmemektedir. Bu nedenle çalışmanın amacı, CTV nin son yıllardaki durumunu belirlemek üzere ülkemizdeki turunçgil üretim alanlarının hastalık için yeniden DAS-ELISA ve diğer bazı yöntemlerle taranması ve mevcut tehlike boyutların ortaya konması olarak belirlenmiştir. 6

17 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Onur TURGUT 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR CTV, turunçgilde ekonomik öneme sahip zararlara yol açan closteroviridae familyasının bir üyesidir. CTV virüs partiküllerinin bir kısmı 2000x11 nm boyutunda, segmentsiz tek iplikçikli, iki kapsid proteinini kodlayan RNA genomundan (yaklaşık 20 kb) meydana gelmektedir. Bu iki kapsid proteini p25 ve p27 dir. p25 virionun % 95 ini, p27 ise virionun % 5 ini oluşturmaktadır ( Bar- Joseph ve ark., 1989 ; Febres ve ark., 1996; Baloğlu, 1988). Uzun yıllar turunç anacına aşılı portakal ağaçlarında hızlı ölümleri anaç-kalem uyuşmazlığına bağlanmış, fakat daha sonra Webber isimli araştırıcı 1925 yılında bu duruma bir patojenin neden olduğunu bildirmiştir. CTV hastalığının indikatör bitkiler kullanılarak biyolojik tanısı ancak 1950 li yıllarda başarılmıştır. Wallace ve Drake isimli araştırıcılar 1951 yılında yaprak veya kabuk dokusuyla virüsü meksika laym bitkisine taşımışlar ve laym bitkisinin indikatör olarak kullanımını sağlamışlardır. Bu gün bile biyolojik tanı amacıyla CTV nin tüm ırkları için Meksika laymı genel indikatör bitki olarak kullanılmaktadır. Tristeza hastalığının simptomları Meksika laymında 3-5 hafta içinde ortaya çıkmakta ve infekteli indikatör bitkilerin yapraklarında damar açılması, damar aralarının açılması, bazen damarların koyu yeşil renge dönüşmesi, yaprağın kaşıklanması ve şiddetli izolatlarda bor eksikliğine benzeyen damar bandlaşması şeklinde simptomlar görülmektedir ( Wallace, 1978). Hastalığının duyarlı anaçlar üzerine aşılı ağaçlarda görülen belirtileri özellikle hızlı göçüren için bodurluk, geriye ölüm, solgunluk, yaprak dökümü ve sonucunda iki üç ay içerisinde ağacın ölümü şeklinde ortaya çıkmaktadır (Wallace, 1978). CTV üzerine yapılan ayrıntılı çalışmalar sonucunda hastalığa ait birbirinden farklı hastalık görünümleri gözlenmiş, bunlar, decline (göçme), seedling yellows (çöğür sarılığı) ve stem pitting ırkları olarak rapor edilmiştir (Rocha-Pena ve ark., 1995). Eğer izolat seedling yellows ırkı ise turunç en iyi indikatör ve greyfurt çöğürleri de kullanılan diğer önemli indikatör bitkilerdir. Seedling yellows ırkının turunç ve greyfurt indikatör bitkilerindeki başlıca simptomları sürgünlerde kısalma, küçük sarı yaprakların oluşması, bitkilerde bodurluk şeklinde otaya çıkmaktadır. Diğer bir ırk olan stem pitting için kullanılan indikatör bitkiler başta altıntop olmak üzere, madam 7

18 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Onur TURGUT vinous ve pera çeşitleridir. İndikatör bitkilerde stem-pitting ırkının göstermiş olduğu en belirgin simptom gövde çukurlaşması görüntürsüdür (Roistacher, 1991). CTV hastalığının önemli bir görünümü olan quick decline yani hızlı göçüren iki şekilde gelişmekte ve bunlar hızlı geriye ölüm (quick decline) ve yavaş geriye ölüm (gradual decline) olarak isimlendirilmektedir. Bu ırklar özellikle turunç anacı üzerindeki portakal, mandarin ve greyfurtları etkilemektedir. Bu ırkın en karakteristik belirtisi aşı yerinde diz şeklinde şişme ve aşı yerinin hemen altındaki turunç anacının kabuk ve odun kambiyal yüzeylerinde bal peteği şeklinde veya iğne ucu şeklinde çıkıntı ve karşılığında girintiler şeklinde görüntülerdir (Schneider, 1954 ; Roistacher ve Moreno, 1991). CTV hastalığının teşhisi için Roistacher (1991) yaptığı bir çalışmada, ºC de Meksika laym indikatör bitkisine bodurlaşma, sürgünlerin boğum aralarının kısalması nedeniyle bitki boyunda kısalma, yaprakların küçülmesi ve sararması şeklinde simptomlar gözlemlemiştir. Son 25 yıl içinde CTV nin tanılanması amacıyla çeşitli serolojik yöntemler geliştirilmiş ve kullanılmıştır. Bu serolojik yöntemlerden en çok kullanılanı Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) dır. CTV, ELISA yöntemi ile ilk defa 1979 yılında saptanmıştır (Bar-Joseph ve ark., 1979) ve bu serolojik test günümüzde hastalığın tanılanmasında rutin olarak kullanılmaktadır. Tristezanın teşhisinde kullanılan diğer bir yöntem olan Double Stranded RNA (dsrna) analizi ise bulaşık bitkilerden dsrna elde edilerek bu nükleik asitlerin belirlenmesi ve jel elktroforez yöntemi ile analizi sonucu gerçekleştirilmektedir. Elektroforez tekniği ile RNA ların başarılı bir şekilde ayrımı 1960 lı yılların ortalarında başarılmıştır ve günümüzde rutin olarak kullanılmaktadır (Gierson, 1982). Elektroforez terimi genellikle elektrik yüklü bir alanın etkisi altında, belli bir solüsyon içerisinde küçük iyonların ve yüklü makromoleküllerin hareket ettirilmesini ifade etmektedir. Bu prensipten yararlanılarak RNA ların belirli bir büyüklükte ayrımı, farklı büyüklükteki porlara sahip jel ile başarılmaktadır ( Gierson, 1982). Morris ve Dodds (1979), virüs ve funguslarla infekteli bitkilerden dsrna analizi ve izolasyonu yoluyla bir yöntem geliştirmişlerdir. Bu yöntem sadece RNA 8

19 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Onur TURGUT virüsleriyle infekteli bitkiler tarafından oluşturulan dsrna ları tanımlamak için kullanılmaktadır (Dodds ve ark., 1984 ; Toley ve ark., 1989). Morris ve Dodds (1979) adlı araştırıcılar, daha kısa sürede sonuç veren, daha kaliteli dsrna ların, elde edilmesini sağlayan ve günümüzde kullanılan dsrna analizinin temelini oluşturmuşlar, 1-10 g arasında örnek kullanımıyla dsrna analiz yöntemini geliştirmişlerdir. Daha sonraki yapılan çalışmalarda arazide daha önce diğer metotlarla pozitif olarak test edilen ve seralarda bulunan CTV ile infekteli örneklerden yapılan dsrna analiz sonuçlarının hız kazanması sağlanmıştır (Dodds ve Bar-Joseph, 1983). Dodds ve ark. (1987) araziden aldıkları 16 izolatı biyolojik indekleme sonuçlarına göre değerlendirerek seedling yellows olarak belirlemişler ve bu izolatların dsrna analizleri yapıldığında tristezaya spesifik MW= 0.5x10 6 dalton büyüklüğünde bir bandının 16 örnekten 15 inde görüldüğünü belirtmişlerdir. Lee (1984), 5 farklı CTV izolatı ile yaptığı bir çalışma sonucunda virüsün farklı konukçulardan elde edilen dsrna analizlerine bakılarak her bir izolatın farklılığının ortaya çıkarılmasından sonra çalışmalar bu konuda yoğunlaşmıştır. Hastalıktan turunçgiller içerisinde en çok turunç üzerine aşılı portakal (C. sinensis), mandarin (C. reticula) ve altıntop (C. paradisi) çeşit ve türleri etkilenmektedir. Yapılan çalışmalar sonucunda önceleri hastalığa bir çok grup dahil edilirken, son yıllarda hastalığın 3 farklı ırkının oluşturduğu bir kompleksten meydana geldiği kabul edilmiştir (McClean, 1974; Koizumi, 1991). Bu ırklar lime dieback (gradual= yavaş ve quick = hızlı olmak üzere iki formu mevcuttur), stem pitting adı verilen gövde çukurlaşması ve seedling yellows olarak değerlendirilen çöğür sarılığı ırkları olarak bildirilmektedir. CTV hastalığı Türkiye de ilk kez 1961 yılında Adana ve Mersin illerinde simptomolojik olarak saptanmıştır (Cengiz ve ark., 1976). Ege Bölgesi nde 1965 yılında İzmir de Satsuma Mandarinlerinde CTV belirlendiği rapor edilmiş (Özalp ve Azeri, 1967) ve yine Ege bölgesinde Satsuma mandarinlerde görülen virüs hastalıkları ile ilgili yapılan bir diğer çalışmada, simptomolojik olarak ve Meksika laym bitkisi üzerinde biyolojik indeksleme yolu ile doku boyama yöntemleri kullanılarak CTV hastalığına yakalanma oranınınege Bölgesi için %16.02 olduğu saptanmıştır ( Azeri 9

20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Onur TURGUT ve Heper, 1978). Aynı araştırıcılar, Ege Bölgesi nde tristeza virüsünün zayıftan, çok şiddetliye kadar değişik şiddette ırklarının bulunduğunu ve bu virüs ile bulaşıklık oranının %16,02 olduğu belirlemişlerdir (Azeri ve Heper, 1978). Doğu Akdeniz Bölgesinde yetiştirilen turunçgillerde ise, CTV nin iki ayrı zayıf ırkının mevcut olduğu ve doğal yayılmanın söz konusu olabileceği belirtilmiştir (Baloğlu, 1988) yılında Azeri, turunç üzerine aşılanmış Satsuma mandarinlerde görülen simptomlara bakarak etmeni araştırmış, Meksika laymı ile yapılan indeksleme sonuçları ve makroskobik gözlemlere göre satsuma ağaçlarının ölümünün tristeza ve xyloprosis hastalıklarının karışık infeksiyonunun neden olduğunu belirtmiştir ( Azeri, 1981). Güllü (1989), Doğu Akdeniz Bölgesinde turunçgil virüs ve virüs benzeri hastalıkların belirlenmesi amacıyla gerçekleştirdikleri surveyde, 1985 ve 1990 yılları arasında 14 farklı hastalık teşhis etmiştir; Bu hastalıklardan CTV hastalığının navel portakalllarda % 0.5 ve satsuma mandarinlerde % 0.04 şeklinde çok düşük oranlarda belirlendiği bildirilmiştir. Ayrıca Doğu Akdeniz Bölgesi ndeki Navel ve Satsuma Turunçgil çeşitlerinde CTV nin görülme oranı, sırası ile, 0.06 % % ve 0.08 % olarak belirlenmiştir. Aynı çalışmada hastalığın yaşından büyük ağaçlarda bireysel veya gruplar halinde görüldüğü belirtilmiştir. CTV hastalığının yakın mesafelere etkili bir biçimde taşınması aşı yoluyla ve vektörlerle olmaktadır (Lastra ve ark., 1992; Yokomi ve ark., 1995). Camp 1945 yılında Güney Amerika da belirli bölgelerde CTV hastalığının yol açmış olduğu turunçgil yetiştiricilik alanlarındaki görülen ani ölümlerin vektörler aracılığı ile olabileceği görüşünü öne sürmüştür (Hermoso de Mendosa ve ark., 1984). Güney Amerika da turunçgil alanlarında ağaçlardaki ani ölümlerle araştırıcılar vektörlerle ilgili çalışmalara başlamışlardır. Meneghini isimli bir araştırıcı 1946 yılında T. citricidus un CTV nin vektörü olduğuna dair ilk bulgular elde edilmiştir yılından itibaren 10 yıl boyunca Kolombia, Peru ve Venezuela da milyonlarca ağacın ölümüne neden olmuştur (Norman ve Grant, 1956; Raccah ve ark.,1980; 1988; Yokomi ve ark., 1994). CTV vektörünün taşınmasında sıcaklık faktörü ele alındığında A. gossypi nin 10

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Onur TURGUT Florida da yaz boyunca kış mevsimine göre daha az taşıma yeteneği gösterdiği rapor edilmiştir ( Raccah ve ark., 1976; Norman ve ark., 1968). Yine aynı vektörler ile İspanya daki taşınma ve yayılma durumu da bir diğer araştırıcı grup tarafından incelenmiştir (Mendoza ve ark., 1984) Bölgemizde hastalığın vektörleri arasında sayılan A. gossypi ve A. spiraecola ya sıkça rastlanmaktadır. Ayrıca ülkemizde hastalığa oldukça duyarlı olan turunç anacının yoğun bir şekilde kullanımı ülkemizin hastalık açısında büyük bir tehlike altında olduğunun göstergesidir (Azeri ve Karaca, 1978; Azeri, 1981; Baloğlu, 1988). Yılmaz ve ark. (1990) Doğu Akdeniz Bölgesinde bulunan bazı CTV izolatlarının A. gossypii, A. rubarum ( Börner), A. solonella Theobald (?) ile taşıma denemelerinde, sadece A. gosyypii nin bir virüs izolatını Meksika laym bitkisine taşıdığını bildirmişlerdir. Bölgemizde bulunan farklı turunçgil tristeza virüs izolatlarının laboratuar şartlarında A. gossypii ile Madam Vinous portakalından Meksika laymına taşıma denemelerinin yapıldığı bir çalışmada yerli izolatlardan biri vektör ile hiç taşınamazken diğer izolat % 0 ile % 21.5 arasında değişebilen oranlarda taşınabilmiştir (Satar, 1997) lu ve 40 lı yıllarda meydana gelmiş olan Brezilya ve Arjantin deki turunç üzerine aşılı portakal ağaçlarının yıkımına neden olan CTV hastalık etmeninin hızlı yayılmasının sebebinin etkili taşıyıcı vektörü olan Toxopter citricidus yaprak biti olduğu bir çok araştırıcı tarafından bildirilmiştir (Roistacher ve ark, 1980). İspanya da bulunan mevcut CTV kompleksi için en etkin vektörün Aphis gossypii olduğu bildirilmiştir (Mendoza ve ark., 1984). A. gossypii, T. citricidus kadar etkili olmasa da bu yaprak biti türünün turunçgillerde yoğun koloniler oluşturduğu ve beslenmek için göç etmeye meyilli olduğu rapor edilmiştir (Bar-Joseph ve ark., 1989). CTV hastalığının bir diğer ırkı CTV-SP (Citrus Tristeza Virüs-Stem Pitting =gövde çukurlaşması) ise ilk kez 1949 yılında Güney Afrika da kaba limona (Citrus jamphiri Lush.) aşılı altıntoplarda saptanmıştır. Stem pitting Brezilya, Avusturya, Asya ve Güney Afrika da Citrus macrophyla gibi bazı anaçlar üzerinde yetiştirilen, genellikle laym (C. aurantifolia) ve altıntoplarda CTV hastalığının oluşturduğu 11

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Onur TURGUT önemli bir zarar şekli olarak tanımlanmaktadır (Knorr ve Price, 1957; Fraser 1968; Wallace, 1978). Stem pitting ırkının belirtisi olan gövde çukurlaşması yanında infekteli bitkilerde bodurlaşma, geriye ölüm, kalitesiz küçük meyve oluşumu, yaprak damarları arasında sararmanın meydana gelen diğer belirtileri olduğu rapor edilmiştir. Turunçgil tristeza virüsünün bir diğer ırkı olan CTV-SY (Citrus Tristeza Virus-Seedling Yellows = çöğür sarılığı) ilk olarak 1952 yılında Fraser isimli araştırıcı tarafından Avusturalya da rapor edilmiş ve diğer CTV ırklarından farklı olduğu bildirilmiştir. Araştırıcı araziden aldığı aşı gözlerini Eureka limon, turunç ve altıntop indikatör bitkilerine aşıladığında şiddetli bodurlaşma ve indikatör bitkilerde sararma simptomları belirlemiştir. Ek olarak yapraklarda küçülme, klorotiklenme, bazen sararma ve bunların sonucunda bodurlaşma oluşmuştur. Bu nedenle, araştırıcılar seedling yellows ırkının araziden çok indeksleme sonucunda belirlenebilen bir ırk olduğunu belirtmişlerdir (Roistacher, 1991) Doğu Akdeniz Bölgesi nde 9 izolat kullanılarak yapılan bir çalışmada ise, indikatör bitki yapraklar üzerinde damar açılmaları simptomları oluşturduğunu, seedling yellows ve stem pitting ırklarının simptomları biyolojik indeksleme ile belirlenmiş, izolatların indikatör bitki üzerindeki bodurlaşma oranı %11-%37 arasında gerçekleştiği, yapılan dsrna analizi sonuçlarında farklı bahçe içinde bulunan izolatların farklı dsrna yapıları, aynı bahçeden alınan izolatların benzer dsrna yapıları gösterdikleri bildirilmiştir ( İnce, 1999). CTV hastalığının karakteristik bir belirtisi aşı yerinde diz şeklinde çıkıntı veya şişme (overgrowth) ve kabuk kesiti alındığında gövdede bal peteği şeklindeki yada iğne ucu ile delinmiş gibi delikçikler ve karşılığında çıkıntılar (honeycombing) şeklindedir. Aşı yerinden aşı çizgisini içerecek şekilde bir kabuk kesiti alındığında turunç kabuğunun alt yüzeyinde topluiğne batırılmış gibi çukurluklar vardır. Bu çukurlukların karşıtı olarak odun silindiri yüzeyinde ince uçlu iğne ucu gibi çıkıntılar görülmektedir. Gövdede meydana gelen bu belirtilere ek olarak ağacın üst aksamında yapraklarda kıvrılma ve genel bir solgunluk, meyve verimi azalması ve meyve boyutu küçülmesi şeklinde simptomlar meydana gelmektedir (Salibe, 1986). Doğu Akdeniz Bölgesi nde ELISA testinin rutin çalışmalarda kullanılmasını amaçlayan bir çalışmayla 4 ayrı bölgedeki 7 Turunçgil bahçesinden seçilen

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Onur TURGUT örneğin 72 sinde yapılan ELISA testi sonucunda CTV belirlenmiş, saflaştırması yapılmış ve X nm boyutlarında partiküller EM de görülmüş ve polyklonal antiserum üretimi gerçekleştirilmiştir. Ayrıca 1980 li yılların sonunda yapılan bu çalışmada CTV hastalığının bölgede doğal yayılmasının başladığı veya olabileceği ileri sürülmüştür (Baloğlu, 1988). Değişik araştırıcılar tarafından yine Doğu Akdeniz Bölgesinde Tristeza virüsü değişik amaçlarla çalışılmış, özellikleri, varlığı, surveyi, tanı ve antiserim eldesi gibi çalışmalar yapılmıştır (Çınar ve ark., 1993; İnce 1999; Kamberoğlu, 2000; Bozan, 2002) CTV 1930 yılında Arjantin de turunç anacı üzerine aşılı 19 milyon ve 15 yıl sonrasında 10 milyon turunçgil ağacının yok olmasına neden olmuştur. Brezilya da 12 yıl içerisinde 6 milyon, Kaliforniya da 3 milyon, Florida da çok sayıda turunçgil ağacının ölümüne neden olmuştur. CTV İsrail, İspanya, Kıbrıs ve Orta Amerika da yayılmaya ve zarar vermeye devam etmektedir. CTV hastalığın son 50 yıl içinde Güney Afrika, Güney Amerika, ABD ve İspanya da toplam 100 milyondan fazla turunç anacı üzerindeki portakal ( C. sinensis L.Osbeck) vd. ağacının ölümüne neden olduğu aynı araştırıcılar tarafından rapor edilmiştir.. (Cambra ve ark., 1988; Bar- Joseph ve ark., 1989; Roistacher, 1995; Bove, 1995). Günümüzde tristeza virüs hastalığı (citrus tristeza virüs = CTV), turunçgillere zarar veren hastalıklar içerisinde en yıkıcılarından birisi ve sınır tanımayan uluslararası bir hastalık olarak kabul edilmektedir. Dünya turunçgil yetiştiriciliğinde ekonomik olarak önemli kayıplara neden olmuş, çok tehlikeli bir hastalıktır (Whiteside ve ark., 1989 ; Bar-Joseph ve ark., 1989). Futch ve Brlansky (2004) virüs ve virus benzeri hastalıkların turunçgil endüstrisi gelişmemiş ülkelerde verimi yaklaşık % oranında azalttığını, virüs ve virüs benzeri hastalıkların turunçgil yetiştiriciliğinde olumsuz etkilere neden olan ve ekonomik turunçgil üretimini sınırlayıcı en önemli faktörlerden olduklarını bildirmişlerdir. Dünyada turunçgil fidanlarının topraklı olarak deniz yolu ile bölgeler arası taşınması sonucu tuyrunçgillerde son derece önemli bir fungal bir hastalık etmeni olan Phytopthora citrophthora (Turunçgil Zamklanma Hastalığı) etmeni bir çok bölgeye kolayca yayılmış, ve önemli ağaç kayıplarına neden olmuştur (Fawcet, 1936; 13

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Onur TURGUT Wallace, 1978 den). Bunun sonucunda, bu fungal hastalık etmenine karşı önlem olarak hastalığa dayanıklı anaç olarak turunç kullanılmaya başlanmış, sonuçta dayanıklı olması nedeniyle bu anaç tüm Akdeniz Ülkeleri ve Güney Amerika da yaygın kullanılmaya başlamıştır (Bar-Joseph ve ark., 1981). 14

25 3.MATERYAL VE METOD Onur TURGUT 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Çalışmanın esas materyalini Turunçgil Trizteza Virüsü ile infekteli veya şüpheli olduğu düşünülen muhtelif turunçgil bitki örnekleri oluştururken çalışmalarda kullanılan plastik torbalar, ELISA kitleri, PCR primerleri (Dr. Bayram ÇEVİK, SDÜ-Isparta), RT ve PCR reaksiyonları için gerekli Enzimler (Taq- MMLV, RNase,), dntps, MgCl vb biyokimyasallar, elektroforez çalışmalarında kullanılan Agar, Ethidiüm bromide, markırlar, Loading dye vb. kimyasallar ile Thermocyler, Eloktroforez tankı, microsantrfüj, mikrosantrifüj tüpü vb. araç-gereç ve malzemeler diğer materyali oluşturmuştur. ELISA ve RT-PCR çalışmalarında kullanılan kimyasallar ve tampon çözeltiler Ek 1 ve 2 de verilmiştir. Toplanan örneklerin serolojik test yöntemiyle (DAS-ELISA) ve moleküler yöntem (RT PCR) tanısını gerçekleştirmek üzere BİOREBA firmasından temin edilen turunçgil tristeza virüsü kit ve antiserumları ile İONTEK firmasına sentezlettirilen primerler kullanılmıştır Biyolojik Testler İçin Kullanılan İndikatör Test Bitkileri Bu çalışmada virüslerin biyolojik tanılarını gerçekleştirmek amacıyla test bitkisi olarak kullanılan turunç (Citrus aurantium) ve meksika laymı (Citrus aurantifolia) çöğürleri Çukurova Üniversitesi Subtropik Meyveler Araştırma ve Uygulama Merkezinden sağlanmıştır Survey Alanı Hakkında Bilgi Çalışma, Akdeniz ve Ege Bölgesi nde turunçgil yetiştiriciliğinin yoğun yapıldığı 6 il ve bu illere bağlı turunçgil üretimi yapılan 21 ilçe veya merkezde yürütümüştür.survey yapılan iller, ilçeler ve bahçe sayısı Çizelge 3.1 de verilmiştir. 15

26 3.MATERYAL VE METOD Onur TURGUT Çizelge 3.1. Sürvey Çalışmalarında Örnek Alınan İller, İlçeler ve Bahçe Sayısı Örneğin Alındığı Gezilen Örnek Bahçe Alınan İl İlçe-Belde Sayısı Bahçe Seyhan 10 3 Yüreğir 10 3 ADANA Kozan&Bucak 15 4 Karataş 10 3 İmamoğlu 5 2 HATAY Dörtyol 10 2 Erzin 10 2 Merkez 8 4 Tarsus 7 3 İÇEL Yenice 6 3 Davultepe 5 2 Alata 6 2 Silifke 4 2 Gümüldür 5 2 Seferhisar 5 2 İZMİR Güzelbahçe 5 2 Selçuk 5 2 AYDIN Kuşadası (Davutlar) Söke 5 2 Merkez-Serik 6 2 ANTALYA Alanya 5 2 Manavgat 5 2 TOPLAM Çizelge 3.1 den de anlaşılacağı üzere çalışma Adana ilinin Seyhan, Yüreğir, Karataş, İmamoğlu, Kozan-Bucak, Hatay ilinin Dörtyol ve Erzin, İçel ilinin Merkez, Tarsus, Yenice, Davultepe, Alata ve Silifke, İzmir ilinin Gümüldür, Seferhisar, Selçuk ve Güzelbahçe, Aydın ilinin Söke ve Kuşadası (Davutlar) ile Antalya ilinin Merkez-Serik, Alanya ve Manavgat ilçeleri ve civarında turunçgil yetiştiriciliğinin 16

27 3.MATERYAL VE METOD Onur TURGUT yoğun olduğu alanlardaki bahçelerde yürütülmüş ve bu bahçelerde mevcut ağaçlar araştırma materyalini oluşturmuştur. Turunçgil yetiştiriciliği açısından fazla öneme sahip olmayan Doğu Karadeniz Bölgesi survey dışında bırakılmıştır. Turunçgil üretimi yapılan ve çalışma süresince survey yapılmış yöreler Şekil 3.1. de gösterilmiştir Metod Sürvey Çalışmaları: Arazi Gözlemleri ve Hastalıklı Bitki Materyallerinin Elde Edilmesi Arazi çalışmaları esnasında hastalığının turunç gibi duyarlı anaçlar üzerine aşılı ağaçlarda görülen belirtilerinden yapraklarda küçülme, damar açılması, kaşıklaşma, meyve boyutunun küçük kalması, değişen şiddetlerde bodurluk, geriye ölüm, solgunluk, yaprak dökümü ve en karakteristik belirti olarak ta aşı yerinde şişme ve aşı yerinden kaldırılan kabuk parçasının altında odun dokusunda iğne ucu şeklinde çıkıntılar (inverse pitting), buna karşılık gelen kabuk kambiyal yüzeyinde ise iğne ucu ile delinmiş gibi küçük delikler (honey combing), şeklinde belirtilerden bir veya bir kaçını gösteren ağaçlardan alınan yaprak ve sürgün örnekleri (Şekil 3.2, Şekil 3.3) ile bu şüpheli ağaçların yanından yada yakınında belirti göstermeyen sağlıklı görülen ağaçlardan örnekler alınmıştır. Bazı ağaçlardan ayrıca meyve örnekleri de alınmıştır İnfekteli Örneklerin Saklanması Örnek olarak seçilen ağaçların değişik yönlerini içerecek şekilde genç sürgünleri test materyali olarak alınmış ve ayrı ayrı plastik torbalara konulmuş, örneklerin konduğu torbaların üzerine tarih, örneğin alındığı yer ve numara yazılarak buz kutusunda laboratuara getirilmiş, biyolojik ve serolojik testlerde kullanmak üzere +4ºC de çalışan buzdolabında veya 20ºC de derin dondurucuda muhafaza edilmiştir. 17

28 3.MATERYAL VE METOD Onur TURGUT T Ü R K İ Y E Şekil 3.1 Turunçgil üretimi yapılan bölgeler (Kırmızı Taranmış) 18

29 3.MATERYAL VE METOD Onur TURGUT Şekil 3.2 Tristeza için survey çalışmalarında şüpheli örnekler için aranan karakteristik belirtiler (Baloğlu, 1988) Şekil 3.3. Hasta ağaçlarda aşı yeri şişmesi (over-growth) ve aşı yerinden kaldırılan kabuk ve odun dokudaki oluşumlar (honey combing, inverse pitting ) (Baloğlu,

30 3.MATERYAL VE METOD Onur TURGUT ELISA Testinin Uygulanması Arazi çalışmaları ile belirtilere bakılarak şüpheli olarak seçilen veya tesadüfi olarak belirlenen CTV şüpheli örneklerden ELISA testi temel olarak Clark ve Adams (1977) ile Baloğlu (1988) in bildirdikleri Double Antibody Sandwich yöntemine ve ELISA kitinin ticari olarak temin edildiği firma önerileri dikkate alınarak yapılmıştır. ELİSA testi çalışmalarında aynı örneklerin hem yaprak orta damarı hem de sürgün kabuk dokusu ekstraktları, bazı örneklerin de meyve kabuğu ve albedosu test örneği olarak kullanılmıştır. Testin uygulanışı aşağıda verilen aşamalarda gerçekleştirilmiştir çukurlu Mikrotiter platelerin her bir çukuruna kaplama tamponunda (Ek 1) 1/1000 oranında seyreltilmiş olan IgG çözeltisinden genellikle kenar çukurlar harici tutularak 200µl eklenmiş ve 37 ºC de 4 saat inkübe edilmiştir. 2. Çukurlar PBS-Tween (Ek 1) ile doldurularak en az üç kez yıkanmış ve her yıkama işleminde üçer dk. beklenmiştir. 3. Örnek tamponunda (Ek 1) 1/10 oranında sulandırılarak ekstrakte edilip tülbentten süzülerek hazırlanan test örneklerinden her bir çukura hazırlanmış şemaya göre 200 µl eklenerek +4 ºC de tüm gece boyu veya 37 ºC de 4 saat inkübe edilmiştir. Her bir plate içinde bir sağlıklı bitki ekstraktı, bir tampon çözelti kontrol ve ayrıca birde pozitif örnek ekstraktı kontrol amaçlı olarak kullanılmıştır. Her bir test örneği ve kontroller için için yan yana veya alt alta olmak üzere ikişer çukur kullanılmıştır. 4. Plateler 2. madde de açıklandığı şekilde yıkanmıştır. 5. Konjugate, 1/1000 oranında konjugat tamponu (Ek 1) içinde sulandırılarak her bir çukura 200 µl eklenerek yine 37 ºC de 4 saat inkübe edilmiştir. 6. Plateler tekrar PBS-Tween ile 3 kez yıkandıktan sonra her bir çukura 200µl substrat tamponunda (Ek 1) seyreltilmiş olan substrat (1mg/1ml) eklenmiştir. En az 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edilmesini takiben görsel ve 405 nm de spektrofotometrik olarak değerlendirme yapılmıştır. 7. Renk oluşumundan sonra ayrıca her bir çukura 50 µl 3M NaOH eklenerek reaksiyon durdurulduktan sonra sonuçlar iki şekilde değerlendirilmiştir. 20

31 3.MATERYAL VE METOD Onur TURGUT a. Çıplak gözle sarı renk oluşumu için gözlem ve kayıt yapılmış b. 405 nm dalga boyunda absorbans değerleri ölçülmüştür. Çıplak gözle her bir çukurdaki renk değişimi belirlenerek sarı renk oluşumu pozitif olarak değerlendirilmiştir. Absorbans değeri ölçümünde ise; öncelikle testin çalışıp çalışmadığı veya doğru olup olmadığı pozitif örneğin ve tampon çözeltinin kullanıldığı çukurların verdiği sonuçlar dikkate alınarak karar verilmiştir. Pozitif kontrolun çok yüksek absorbans değeri, buna karşılık tampon çözeltinin çok düşük absorbans değeri vermesi durumunda testin uygun olduğu ve çalıştığı kabul edilmiştir. Bu durumda değerlendirme yapılmış ve sağlıklı örnek için elde edilen absorbans değerinin en az iki katı absorbans değeri veren çukurlardaki örneklerin hastalık ile bulaşık olduğu kabul edilmiştir (Bar-Joseph ve ark., 1979 ; Roistacher, 1991) Total RNA Ekstraksiyonu ELISA testi sonucunda CTV ile infekteli olduğu saptanan bazı seçilmiş arazi örneklerinden ve indeksleme amacı ile CTV bulaştırılmış indikatör bitkilerden alınan genç yapraklar kullanılarak yapılan total RNA izolasyon çalışmaları, Astruc ve ark., (1996) nın önerdiği yönteme göre yürütülmüştür. Total RNA ekstraksiyonu yönteminde izlenen basamaklar: 1. İnfekteli olduğu belirlenen turunçgil bitki örnekleri ekstraksiyon tamponu (Ek 2) (100mM Tris-HCI ph.8.0, 50mM EDTA b-ph. 7.0, 500 NaCI, 10mM 2. mercapto-ethanol (1/1000) ) içerisinde 1:2 (w/v) oranında sulandırılarak havanhavaneli kullanılarak ekstrakte edilmiş ve bitki özsuyu steril tülbentten süzülmüştür. 2. Elde edilen bitki özsuyundan 1 ml alınmış, eppendorf tüpleri içerisine konmuş ve örnekleri içeren tüpler 3 dakika rpm de santrifüj edilmiştir. 3. Süpernatant (üst sıvı) üzerine % 20 lik sodium dodecyl sulfat (SDS) den 50 µl ilave edilerek vortekste karıştırılmış ve sonra tüpler 65 ºC de 30 dakika su banyosunda tutularak inkübe edilmiştir. 4. İnkubasyonu takiben tüplere 250 µl potasyum asetat (5M) ilave edilerek 20 dakika buz içerisinde bekletilmiş ve daha sonra 15 dakika rpm de santrifüj yapılmıştır. 21

32 3.MATERYAL VE METOD Onur TURGUT 5. Santrifüj sonrası elde edilen sıvı kısım, yani süpernatant iki kısma ayrılmış ve 500 µl si yeni hazırlanmış eppendorf tüplerine konarak -70 C de saklanmıştır. Geriye kalan 500 µl süpernatant yeni hazırlanan eppendorf tüplerine konulmuş, üzerine % 100 lük hazırlanmış ethanolden 500 µl ilave edilerek 1 ml ye tamamlanmış ve vortekste karıştırılmıştır. 6. Daha sonra tüplere 50 µl 3 M sodyum asetat ilave edilmiş ve örnekler tekrar karıştırılarak -70 ºC de bir gece beklemeye bırakılmıştır. 7. İnkubasyondan sonra örnekler 15 dakika rpm de santrifüj edilerek süpernatant kısmı tüplerden uzaklaştırılmıştır. 8. Daha sonra eppendorf tüpleri filtre kağıdı üzerinde ters çevrilerek 5 dakika kurutulmuş ve tüp dibinde kalan pellet üzerine % 70 lik ethanolden 1 ml ilave edilmiştir. 9. Tüpler RNA ları çöktürmek amacıyla 5 dakika rpm de santrifüj edilmiş ve tüp içerisindeki ethanol atılarak eppendorf tüpleri kurutma kağıtları ile dikkatlice kurutulmuştur. 10. Sonuçta elde edilen total RNA lar 50 µl RNAse free saf su ile sulandırılarak, 15µl ve 35 µl olmak üzere ikiye bölünmüş ve eppendorf tüpleri içerisinde -70 ºC de muhafaza edilmiştir. Daha sonra agaroz jel elektroforez çalışmasıyla total RNA ların varlığı kontrol edilmiştir RT-PCR Çalışmaları Polimeraz Chain Reaction (PCR) veya Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR), 1980 li yıllardan itibaren in vitro ortamda spesifik bir DNA parçasının kopyalarının kısa zincirli oligonükleotid primerler yardımı ile yönlendirilerek enzimatik olarak sentezlenmesi şeklinde ortaya konmuş bir yöntemdir. DNA molekülündeki dizisi bilinen iki bölge arasındaki spesifik DNA parçasını çoğaltmak için, çok az miktarda mrna dan cdna lar oluşturarak bitki patojenlerinin nükleik asit dizileri belirlenebilmektedir. PCR, çift iplikli bir DNA molekülünde hedef dizilere iki oligonükleotid primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanmaktadır. Nükleik asit materyali RNA olan bir hedef çoğaltılmak isteniyorsa, önce RNA dan Reverse 22

33 3.MATERYAL VE METOD Onur TURGUT Transcriptase (RT) enzimi yardımı ile cdna lar elde edilmekte ve daha sonra bu cdna lar PCR işlemiyle çoğaltılmaktadır (RT-PCR). Bu tez çalışmasında kullanılan CTV izolatının moleküler yöntem ile tanılanması ve ELISA testi ile karşılaştırılması ve sonuçların teyit edilmesi amacıyla RT-PCR çalışmaları yapılmıştır. Çalışmada kullanılan CTV izolatının moleküler olarak tanılanmasına yönelik olarak CTV için indeksleme amacıyla aşılanan indikatör bitkilerden alınan dokularından elde edilen total RNA preparasyonları CTV ye spesifik primerler yardımıyla RT-PCR işlemine tabi tutulmuştur. Çalışmada iki aşamada yapılan RT-PCR yönteminde I. aşamada; RT (Reverse transcription) işlemi ile cdna'lar elde edilmiş, II. aşamada ise, bu cdna' lar kullanılarak PCR işlemi yapılmıştır. I. RT aşamasında; her PCR tüpüne, elde edilmiş total RNA dan 3 µl konulmuş ve üzerine 2 µl reverse primer ve 10 µl ddh 2 O ilave edilerek 95 C' de 3 dakika bekletilmiştir. Daha sonra tüpler buz üzerine alınmış ve bu PCR tüplerine, 3.6 µl saf su, 5 µl RT tampon çözeltisi (250 mm Tris- HCl (ph 8.3), 250 mm KCl, 20 mm MgC12, 50 mm DTI), 1 µl dntp (10 mm), 0.3 µl RNAse ve 0.1 µl RT enzimi ilave edilerek, 42 C' de 60 dakika inkübe edilmiştir. Sonuçta, cdna sentezi gerçekleştirilmiştir. II. PCR aşamasında ise, ayrı bir PCR tüpüne, yukarıdaki işlemlerden elde edilen cdna' dan 10 µl konulmuş, üzerine 26.5 µl saf su, 5 µl 10X PCR tampon çözeltisi (100 mm) Tris- HCl (ph 8.8),500 mm KCl, % 0.8 Nonidet P40), 3 µl MgCl2 (25mM), 2 µl dntp (10 mm), 0.5 µl Taq DNA polymerase, 2 µl forward primer ve 1 µl reverse primer ilave edilmiştir. Daha sonra tüpler; 94 C'de 4 dakika... 1 döngü 94 C ' de 30 saniye döngü C' de 1 dakika döngü 72 C ' de 2 dakika döngü 72 C'de 10 dakika... 1 döngü olacak şekilde ayarlanmış termocycler'a yerleştirilerek PCR aşaması tamamlanmıştır. 23