Antalya Körfezinde Bulunan İnci İstiridyesi (Pinctada radiata, Leach, 1814) nden API 20 NE Kiti Kullanılarak, Vibrio vulnificus un Tanımlanması

Transkript

1 Antalya Körfezinde Bulunan İnci İstiridyesi (Pinctada radiata, Leach, 1814) nden API 20 NE Kiti Kullanılarak, Vibrio vulnificus un Tanımlanması Nilay SÜTÇÜOĞLU 1,*, Jale KORUN 1, Mehmet GÖKOĞLU 1, Mehtap KURTOĞLU 1 1 Akdeniz Üniversitesi, Su Ürünleri Fakültesi, Kampüs Antalya, * e mail: nilaysutcuoglu@gmail.com ÖZET Ülkemiz denizlerinde yerli ve yabancı olmak üzere pek çok istiridye türü bulunmaktadır. Bu türlerden biri de Pinctada radiata (Leach,1814) dır. İndo Pasifik orijinli olan bu tür, Akdeniz ve Ege Denizi nde dağılım göstermektedir. İstiridyeler suyu filtre ederek beslenen canlılardır. Beslenmeleri esnasında suda bulunan küçük parçacıkları filtre ederken, ayrıca mikroorganizmaları da vücutlarında biriktirirler. Bu çalışmanın amacı; Antalya Körfezi Maden Koyundan alınan P. radiata lardan izole edilen şüpheli Vibrio suşlarının API 20NE hızlı tanı kiti kullanılarak tanımlanmasıdır. Çalışmada materyal olarak kullanılan istiridye örnekleri, ticari bir levrek ve çipura yetiştiriciliği yapan işletmenin mooring sistemlerinden scuba dalışıyla toplanmıştır. Daha sonra alınan örnekler içerisinde buz aküler bulunan taşıma kabına konularak, Akdeniz Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Araştırma Laboratuarına getirilmiştir. Ortalama ağırlıkları 55.6 g olan istiridyelerden (10 adet) TCBS ve Deniz Suyu agara ekimleri yapılarak 25 ± 2 o C de saat süre ile inkübe edilmiştir. Bu süre sonucunda besiyerlerinde gelişen bakteri kolonilerinden %1.5 NaCl içeren Beyin Kalp İnfüzyon agarlı besiyerleri kullanılarak, altkültürleri yapılmıştır. Dokuz Vibrio suşu izole edilmiştir. İzole edilen bakteriler, API 20 NE hızlı tanı kiti kullanılarak Vibrio vulnificus olarak tanımlanmıştır. Anahtar Kelimeler: İnci istiridyesi, Pinctada radiata, Vibrio vulnificus, Api 20NE 1

2 ABSTRACT There are many oyster species including native and exotic species in seas of our country. One of these species is Pinctada radiata (Leach,1814). This species originated from Indo Pacific shows distiribution in the Mediterranean sea and the Agean sea. The oysters are filter feeding organisms. During their feeding, they also accumulate microorganisms which are found in the water in their body. The aim of this study is to identify suspected Vibrio strains by using API 20 NE rapid identification kit isolated from P. radiata obtained from the Maden Cove at the Antalya Gulf. The oyster samples used in the study were collected from the mooring systems of a commercial seabass and seabream farm by scuba diving. The samples were placed into carrying box with ice bags and then the samples transferred to the Research Laboratory, Faculty of Fisheries, Akdeniz University. Samples taken from the oysters, average weight of 55.6 g (10 oysters), were inoculated on TCBS and Sea Water agar and then incubated at 25 ± 2 o C for hours. The bacteria grown on plates were subcultured by using Brain Heart Infusion agar (BHIA) supplemented with 1.5% NaCl. Nine Vibrio strains were isolated. The isolated bacteria were identified as Vibrio vulnificus by using API 20 NE rapid identification kit. Keywords: Pearl oyster, Pinctada radiata, Vibrio vulnificus, Api 20NE GİRİŞ İnci istiridyeleri olarak bilinen bir grup türün dahil olduğu Pteriidae familyası (Bivalvia; Pterioida) üç cinsi içermektedir. Bu cinsler sırası ile Pteria Scopoli, 1777, Pinctada Röding, 1798 ve Electroma Stolicka, 1871 dir. Pteriidae familyasına dahil olan Pinctada radiata (Leach, 1814), İndo Pasifik kökenli bir tür olup, Antalya Körfezinde bol miktarda bulunmaktadır (Doğan ve Nerlović, 2008; Gökoğlu ve ark., 2007). Bu tür 1869 yılında Süveyş Kanalı nın açılmasıyla Akdeniz e girerek ilk kez 1899 yılında Kıbrıs Adasında saptanmıştır. Günümüzde ise P. radiata nın Doğu Akdeniz de yayılım gösterdiği bildirilmiştir (Göksu ve ark., 2002). Ülkemizde bu türle ilgili olarak yetiştiriciliği, avcılığı ve biyolojisi gibi konularda çalışmalar yapılmıştır (Gökoğlu ve ark., 2007; iğitkurt ve Lök, 2007; Göksu ve ark., 2005; Göksu ve ark., 2002). İstiridyeler beslenme aktiviteleri esnasında deniz suyunu filtre ederler. Filtre ederken, vücutlarında Vibrio spp. gibi bakterileri de biriktirirler. İstiridyelerde Vibrio türü patojen 2

3 bakterilerin varlığı gerek insan sağlığı açısından gerekse uluslararası ticarette ciddi bir öneme sahiptir (Barakat, 2009). Vibriolar, Gram negatif bakteri türleri olup, deniz ve acı su çevrelerinde yaygın olarak bulunurlar (Hervio Heath ve ark., 2002). Vibrio türlerinden Vibrio vulnificus, planktonik deniz bakterisi olup insan ve hayvanlar için patojeniktir (Vinogradov ve ark., 2009). Bu bakteri türü istiridye, midye gibi kabuklu su ürünlerinden, balık ve sudan yaygın olarak izole edilir (Harwood ve ark., 2004; Ripabelli ve ark., 2003). V. vulnificus un farklı biyotipleri mevcuttur. Biyotip 1 insan enfeksiyonları ile alakalı olup, sudan ve kabuklu su ürünlerinden de izole edilmektedir. Biyotip 2 nin ise sadece yılan balıkları için patojenik olan suşları içerdiği bildirilmiştir (Biosca ve ark., 1993). Bununla birlikte, yılları arasında, İsrail de yumuşak doku enfeksiyonu ve baktereminin etkeni olarak yeni bir biyotip, V. vulnificus biyotip 3 tanımlanmıştır (Zaidenstein ve ark., 2008). Su ürünleri yetiştiriciliği sistemlerinde ciddi kayıplara neden olan bakteriyel patojenlerin sayılarındaki artış, balık ve diğer sucul hayvan hastalıklarının teşhisi için hızlı yöntemlerin geliştirilmesini gerekli kılmıştır. Rutin bakteriyolojik yöntemler, kolaylıkla kültürü yapılabilen patojenlerin tespiti için uygun olmakla birlikte, bu yöntemler zaman tüketicidir. Bu sebepten dolayı API 20 E, API 20 NE ve Biolog GN gibi ticari olarak mevcut hızlı tanı kitleri geliştirilmiştir (Papovic ve ark., 2007; Croci ve ark., 2007; Korun ve Timur, 2005; Adams, 2004; Korun, 2004). Bu çalışmanın amacı; Antalya Körfezi Maden Koyundan temin edilen inci istiridyesi, Pinctada radiata dan izole edilen şüpheli Vibrio suşlarına API 20 NE hızlı tanı kiti uygulanarak suşların tanımlamasını yapmaktır. MATERAL VE ÖNTEM İstiridyeler (Pinctada radiata) Çalışmada kullanılan istiridye örnekleri (P. radiata) Antalya Körfezi Maden Koyunda bulunan ticari bir levrek ve çipura işletmesinin mooring sistemlerinden scuba dalışı ile toplanmıştır (Şekil 1). Daha sonra istiridyeler, içerisinde buz akülerin bulunduğu taşıma kabı ile vakit kaybetmeden Akdeniz Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Araştırma Laboratuarına getirilmiştir. İstiridyelerin ortalama ağırlığı 55.6 g olup, istiridyelerin alındığı suyun fiziksel ve kimyasal özellikleri aşağıda verilmiştir: sıcaklık ( C): 25.5, oksijen (mg/lt): 9.39, ph: 8.38, sekidiski (m): 18. 3

4 Bakteriyolojik Çalışma Canlı istiridyelerden (Şekil 2) 10 tanesi bakteriyolojik çalışma için kullanılmıştır. İstiridye örneklerinin dış yüzeyindeki debris, musluk suyu altında giderildikten sonra istiridyeler filtreden geçirilerek sterilize edilen deniz suyu ile yıkanmıştır. ıkama sonrası, istiridyelerin kabukları steril makas ve pens kullanılıp açılarak viseral kitleden pamuklu eküvyon çubukları ile sıvı örneği alınmış ve seri sulandırmaları hazırlanmıştır. Her bir sulandırmadan TCBS ve Denizsuyu agara (5 g tryptone, 3 g yeast extract, 3 ml glycerol, 15 g agar, 1 litre % 28 lik deniz suyu) ekimleri yapılmıştır (Boetcher ve ark., 1999; Boetcher ve Ruby, 1990). Ekim yapılan besiyerleri 25 ± 2 C de saat süre ile inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonucunda besiyerinde gelişme gösteren bakteri kolonilerinden alt kültürler hazırlanarak saflaştırma yapılmıştır. Saflaştırma sonrası, bakteri kolonileri Gram reaksiyonu, hareketlilik, O/F, katalaz ve sitokrom oksidaz yönünden incelenerek, izole edilen bakteri suşlarına API 20 NE hızlı tanı kiti deniz bakterileri için modifiye edilerek kullanılmıştır (Croci ve ark., 2007; Whitman, 2004). Bakteri suşları API veri tabanı (Apilab Plus; versiyon 3.3.3; BioMérieux) na göre tanımlanmıştır. Şekil 1: Scuba dalışı ile istiridyeler (Pinctada radiata) in toplanması. 4

5 A B Şekil 2: Çalışmada kullanılan Pinctada radiata örneği. A: P. radiata nın dıştan görünümü, B: P. radiata nın iç organlarının görünümü BULGULAR İnci istiridyesi izolatları (9 izolat) Vibrio cinsinin özelliklerini göstermiştir. Bakteri hücreleri hafif kıvrık, çomak şekilli ve Gram negatifti. Suşlar fakültatif anaerop olup, anaerobik şartlarda glukozdan asit ürettiler. Tuzsuz besiyerlerinde gelişme göstermediler. Bakteri suşları sitokrom oksidaz ve katalaz pozitiftiler. Simmon s sitrat negatif olup, TSI besiyerinde H 2 S oluşturmadılar. Bakteriler Deniz suyu agar üzerinde yuvarlak, opak, krem renkli kolonileri oluşturdular. Suşlar 24 saat sonra TCBS besiyerinde yeşil renkli koloni meydana getirdiler. Tüm suşların indol üretimleri pozitif olup, %5 koyun kanı içeren kanlı vasatta β hemoliz gösterdiler. İzolatlar O/129 Vibriostat testine (150µg/disk) hassastılar (Tablo 1). API 20NE hızlı tanı kiti uygulanan bakteri suşlarının 24 ve 48 saatlik değerlendirmesi sonucunda suşların nümerik kodları tespit edilerek, , , olmak üzere 3 farklı kodu vermiştir. Suşlar, API veri tabanına göre Vibrio vulnificus olarak tanımlanmıştır (Tablo 2). 5

6 Tablo 1. İnci istiridyesi Pinctada radiata dan izole edilen bakteri suşlarına ait test sonuçları Suşlar Testler Gram Boyama Hareketlilik Oksidaz Katalaz O/F H2S üretimi Simmon s sitrat TCBS de gelişme F + +, F + +, F + +, F + +, F + +, F + +, F + +, F + +, F + +, 4 C de gelişme 30 C de gelişme NaCl e gereksinim Β Hemoliz D glukozdan asit üretimi D glukozdan gaz üretimi İndol O/129 Vibriostat (150µg/disk) : negatif; +:pozitif; F: Fermentatif; : eşil; H: Hassas 6

7 Tablo 2: API 20NE test sonuçları (48 saat sonra yapılan değerlendirme sonucu) Suşlar * NO 3 * TRP * GLU ADH URE ESC GEL PNG GLU ARA MNE MAN NAG MAL GNT CAP ADI MILT CIT PAC OX * 24 saat sonra değerlendirilen testler; 1,2,4,5,7 nolu suşlar için Nümerik Kod: ; 3,8,9 nolu suşlar için Nümerik Kod: ; 6 nolu suş için Nümerik Kod: (Suşlar API veri tabanına göre Vibrio vulnificus olarak tanımlanmıştır). SONUÇ VE TARTIŞMA Ülkemizin su ürünleri ihracatının büyük bir kısmını taze soğutulmuş balıklar oluşturmakla birlikte, bu sırayı doğadan avcılık yolu ile temin edilen yumuşakçalar ve kabuklu su ürünleri izlemektedir (Civaner, 2005). Ülkemiz denizlerinde bulunan istiridye türlerinden, örneğin Avrupa istiridyesi, Ostrea edulis, inci istiridyesi, P. radiata nın kültürüne yönelik henüz ticari girişimler mevcut olmamakla birlikte, bu türlerin yetiştiriciliğine yönelik deneysel amaçlı çalışmalar yapılmıştır (Gökoglu ve ark., 2007; Uyan ve Aral, 2000). Mevcut çalışma ise inci istiridyelerinden izole edilen Vibrio suşlarını tanımlamaya yönelik bakteriyolojik bir çalışmadır. Bivalvler fakültatif anaerobik ve fermentatif Vibrio ve Aeromonas spp. suşlarını büyük miktarda içerirler (Kueh ve Chan, 1985). aptığımız çalışma sonucunda, istiridye örneklerinden izole ettiğimiz bakteri suşları; hareketli, hafif kıvrık çomak şekilli, Gram negatif, sitokrom oksidaz ve katalaz pozitif, fermentatif, TCBS besiyerinde gelişme gösterip, yeşil renkli koloni oluşturması ve O/129 vibriostat (150µg/disk) a hassasiyet göstermesi ile Vibrio cinsine ait olduğu bildirilen (Musa ve ark., 2008; Alsina ve Blanch, 1994) özellikleri taşıdığı tespit edilmiştir. Noguerola ve 7

8 Blach (2008) Vibrio vulnificus her 3 biyotipininde, %0 NaCl de üreme göstermediklerini, glukozdan gaz oluşturmadıklarını, arjinin dihidrolaz ve eskülin negatif ancak nitratı nitrite indirgediğini ve glukozdan asit oluştururken, arabinozdan asit üretimlerinin negatif olduğunu bildirmiştir. Ayrıca V. vulnificus biyotip 1 ve biyotip 2 Simmon s sitrat ve ONPG pozitif olup, biyotip 3 ise bu testlere negatif sonuç vermektedir (Noguerola ve Blanch, 2008). aptığımız çalışmada izole ettiğimiz ve API 20NE hızlı tanı kitini kullanarak Vibrio vulnificus olarak tanımladığımız bakteri suşlarının arjinin dihidrolaz negatif, indol ve ONPG pozitif, nitratı nitrite indirgeyip, arabinozdan asit üretmedikleri tespit edilmiştir. Ayrıca yapılan biyokimyasal çalışma sonucunda bakteri suşları sitrat ve indol pozitif olup, glukozdan asit üretip, gaz oluşturmamışlardır. Bununla birlikte, suşlar API 20NE kitinde sitrat testine negatif yanıt verirken, tüpte hazırlanarak gerçekleştirilen sitrat deneyinde ise pozitif sonuç vermiştir. Çalışma sonucunda elde ettiğimiz bulguların Noguerola ve Blach (2008), Alsina ve Blanch (1994) ın bulguları ile uyum gösterdiği tespit edilmiştir. API sistemleri çabuk ve uygulanabilirliğinin kolay olması gibi bazı avantajlara sahip olmasına karşın (Croci ve ark., 2007), bakteri suşlarını biyotip seviyesinde tespit edemediği anlaşılmıştır. KANAKLAR Adams, A., Immunodiagnostics in aquaculture. Bull Eur Ass Fish Pathol, 24(1): Alsina, M., Blanch, A.R., A set of keys for biochemical identification of environmental Vibrio species. J Appl Bacteriol., 215: Barakat, S., Mahmoud, M., Reduction of Vibrio vulnificus in pure culture, half shell and whole shell oysters (Crassostrea virginica) by X ray. Int J Food Microbiol, 130 (2): Boetcher, K.J., Ruby, E.G., Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J Bacteriol, 173(7): Boettcher, K.J., Barber, B.J., Singer, J.T., Use of bacterial agents to elucidate the etiology of juvenile oyster disease (JOD) in Crassostrea virginica and numerical dominance of an alfa Proteobacterium in JOD affected animals. Appl Environ Microbiol, 65(6): Biosca, E.G., Esteve, C., Garay, E., Amaro, C., Evalutation of the API 20E system for identification and discrimination of Vibrio vulnificus biotypes 1 and 2. J of Fish Diseases, 16:

9 Civaner, Ç., İGEME İhracaatı Geliştirme Etüd Merkezi. Croci, L., Suffredini, E., Cozzi, L., Toti, L., Ottaviani, D., Pruzzo, C., Serratore, P., Fischetti, R., Goffredo, E., Loffredo, G., Mioni, R. and Vibrio parahaemolyticus Working Group, Comparison of different biochemical and molecular methods for the identification of Vibrio parahaemolyticus. J Appl Microbiol,102: Doğan, A., Nerlović, V., On the occurence of Pinctada radiata (Mollusca: Bivalvia: Pteriidae), an alien species in Croatian Waters. Acta Adriat, 49(2): Gökoğlu, M., Gümüş, E., Kaya,., Balcı, B.A., İkiz, R., Banbul, Acar, B., Antalya Körfezinde inci istiridyesi (Pinctada radiata, Leach 1814) yetiştiriciliği için sistem tasarımı. XIV. Ulusal Su Ürünleri Sempozyumu, Eylül, Muğla. Göksu, M.Z.L., Çevik, F., Fındık, Ö., İnci İstiridyesi Pinctada radiata (Leach, 1814) için öldürücü klor konsantrasyonları. Turk J Vet Anim Sci, 26: Göksu, M.Z.L., Akar, M., Çevik, F., Fındık, Ö., Bioaccumulation of some heavy metals (Cd, Fe, Zn, Cu) in two bivalvia species (Pinctada radiata Leach, 1814 and Brachidontes pharaonis Fischer, 1870). Turk J Vet Anim Sci, 29: Harwood, V.J., Gandhi, J.P., Wright, A.C., Methods for isolation and confirmation of Vibrio vulnificus from oysters and environmental sources: A Review. Journal of Microbiol Methods, 59: Hervio Heath, D., Collwell, R.R., Derrien, A., Robert Pillot, A., Fournier, J.M., Pommepuy, M., Occurence of pathogenic vibrios in coastal areas of France. J Appl Microbiol, 92: Korun, J., Kültür levrek balıklarında (Dicentrarchus labrax L.) vibriosis ve pasteurellosisin bazı diagnostik kitler ve laboratuar yöntemleri ile teşhisi üzerine bir çalışma. İstanbul Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü. Doktora Tezi. 143 sayfa. Korun, J., Timur, G., The first pasteurellosis case in cultured sea bass (Dicentrarchus labrax L.) at low marine water temperatures in Turkey. Israeli Journal of Aquaculture Bamidgeh, 57 (3):

10 Kueh, C.S.W., Chan, K., Bacteria in bivalve shell with special reference to the oyster. J Appl Microbiol, 59: Musa, N., Wei, L.S., Wee,W., Leong, L.K., Shah, S.M., ing, T.H., Studies of phenotypic and numerical taxonomy of Vibrio spp. isolated from oyster, Crassostrea iredalei. World Journal of Agricultural Sciences. 4(2): Noguerola, I., Blanch, A.R., Identification of Vibrio spp. with a set of dichotomous keys. J Appl Microbiol, 105: Papovic, N.T., Coz Rakovac, R., Strunjak Perovic, I., Commercial phenotypic tests (API 20E) in diagnosis of fish bacteria: A Review. Veterinarni Medicina, 52 (2): Ripabelli, G., Samarco, M.L., McLauchlin, J., Fanelli, I., Molecular characterization and antimicrobial resistance of Vibrio vulnificus and Vibrio alginolyticus isolated from mussels (Mytillus galloprovincialis). System Appl Microbiol, 26: Uyan,O., Aral, O., A study on the possibilities of obtaining larva from native flat oysters (Ostrea edulis L.) living in the Black sea and larval metamorphosis stage. Turk J Zool, 24: Vinogradov, E., Wilde, C., Anderson, E.M., Nakhamchik, A., Lam, J.S., Rowe Magnus, D.A., Structure of the lipoposaccharide core of Vibrio vulnificus type strain Carbonhydr Res, 344(4): Whitman, K.A., Finfish and Shellfish Bacteriology Manual Techniques and Procedures. Blackwell Sciences, England. iğitkurt, S., Lök, A., İki farklı kollektör tipiyle inci istiridyesi (Pinctada radiata, Leach 1814) spatlarının İzmir Körfezi Urla Karantina Adası mevkiinden toplanması. XIV. Ulusal Su Ürünleri Sempozyumu, Eylül, Muğla. Zaidenstein, R., Sadik, C., Lerner, L., Valinsky, L., Kopelowitz, J., ishai, R., Agmon, V., Parsons, M., Bopp, C., Weinberger, M., Clinical characteristics and molecular subtyping of Vibrio vulnificus illnesses, Israel. Emerg Infect Dis, 14(12):