Yedinci Ulusal Kimya Mühendisliği Kongresi, 5-8 Eylül 2006, Anadolu Üniversitesi, Eskişehir BT 04

Transkript

1 Yedinci Ulusal Kimya Mühendisliği Kongresi, 5- Eylül, Anadolu Üniversitesi, Eskişehir BT AYÇIÇEĞI KABUĞU HEMISELÜLOZIK HIDROLIZATINDAN PICHIA STIPITIS MAYASI İLE ETANOL ÜRETIMINE, FARKLI ZEHIR GIDERME ÖN İŞLEMLERININ VE PROSES KOŞULLARININ ETKISI M.Telli Okur 1, N.Eken Saraçoğlu Gazi Üniversitesi, Mühendislik ve Mimarlık Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 57, Maltepe, Ankara 1 e-posta : mtelli@gazi.edu.tr e-posta : nsarac@gazi.edu.tr ÖZET Bu çalışmada, ayçiçeği tohum kabuğu hidrolizatından etanol eldesi Pichia stipitis NRRL Y- 71 mayası kullanılarak araştırılmıştır.,7 M H SO ile hazırlanmış olan hidrolizat 3 C deki çalkalamalı kap deneyleri ile fermente edilmiştir. Deneylerin ilk bölümünde, farklı zehir giderme ön işlemlerinin hidrolizatın fermente edilebilirliği üzerine etkileri, ph iken araştırılmıştır. Hidrolizata uygulanan zehir giderme ön işlemlerinin, fermantasyon performansı birbirine yakın olmasına rağmen, hidrolizata uygulanan CaO ile aşırı muamele+ sodium sülfitle ön işlem metodu en iyi zehir giderme metodudur. Deneylerin ikinci bölümünde ise zehir giderme ön işlemi görmüş hidrolizatın fermantasyonuna çalkalama hızının (7-13 rpm) ve başlangıç ph ının (5,5-7) etkisi incelenmiştir. En yüksek alkol konsantrasyonu olan 11 g/l değerine, g/l indirgen şeker içeren hidrolizatın başlangıç ph ı ve rpm karıştırma hızı ile çalışıldığı zaman elde edilmiştir. Bu koşullarda alkol verimi,3 g/g ve alkol üretim hızı,5 g/lsaat dır. Anahtar Kelimeler: Ayçiçeği kabuğu, etanol, fermentasyon, ph, çalkalama hızı 1.GİRİŞ Son yıllarda petrol fiyatlarının artması ve fosil yakıt kaynaklarının azalmaya başlaması, lignoselülozik maddelerden, etil alkol üretimine olan ilgiyi arttırmıştır [1]. Yenilenebilir enerji kaynaklarından etanol üretim prosesinin atmosfere net karbondioksit ilavesinin olmaması ile etanol ün emisyonunun petrolünkinden daha düşük olması gibi özellikler etanol ü çevreye karşı yararlı bir enerji kaynağı yapmaktadır [].Lignoselülozik maddeler bol ve ucuz hammadde kaynağı [3] oluşturmalarına rağmen etanol üretimi için mevcut prosesler son derece kapsamlı ve maliyetlidir []. Lignoselülozik maddeler temel olarak selüloz, hemiselüloz, ligninden oluşmaktadırlar []. Hemiselülozik ve selülozik kısımlar glukoz, mannoz, galaktoz, ksiloz ve arabinozdan oluşan monosakkaritleri içerirler ve bileşimleri tamamen hammaddenin doğasına bağlıdır [5]. Lignoselülozik yapının bozunması sırasında hidrolizat, sadece fermente edilebilir şekerleri içermez, bu arada geniş bir aralıkta mikroorganizmayı inhibe edici bileşik de oluşur. Bu bileşikler seyreltik asitler, furfural, hidroksimetilfurfural ve fenolik bileşiklerdir [,]. Lignoselülozik maddelerden etanol üretimi, hemiselüloz yapının seyreltik asit hidrolizi ile ksiloza bozunması ve daha sonra mayalar yardımıyla fermantasyon işlemi gerektirir (7). Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis ve Candida shehatae mayaları ksilozu oldukça iyi bir verimle etanole dönüştürürler (). Aynı zamanda glikozu da metabolize etme yeteneği, Pichia stipitis in lignoselülozik kaynaklı ortamların değerlendirilmesinde iyi bir seçenek olmasını sağlamaktadır [].

2 Yedinci Ulusal Kimya Mühendisliği Kongresi, 5- Eylül, Anadolu Üniversitesi, Eskişehir Lignoselülozik bir madde olarak ayçiçeği tohum kabuğu, fermentasyon yoluyla şeker üretiminde, bazı kimyasallara ve değerli bileşiklere dönüşümde oldukça ucuz bir kaynaktır [9]. Ayçiçeği kabukları %39 oranında indirgen şeker içermesi nedeniyle lignoselülozik bir hammadde olarak kullanılması yeni bir alternatif oluşturmaktadır. Ayçiçeği tohum kabuğu yıllık bir bitkidir ve her yıl ülkemizde yaklaşık 95 ton ayçiçeği üretilmektedir. Bunun yaklaşık 55 tonu yağ fabrikası sıkım artığı olarak ayrılmakta ve bu sıkım artıkları yakıt olarak ve hayvan yemi olarak kullanılmaktadır []. Bu çalışmada ayçiçeği tohum kabuğu hemiselüloz hidrolizatının Pichia stipitis mayası ile etil alkol üretiminde kullanım olanakları amaçlanmıştır. Ayçiçeği tohum kabuğu hemiselülozik hidrolizatının Pichia stipitis ile fermente edilebilirliğine farklı zehir giderici ön işlemlerin etkisi incelenmiştir. Ayrıca fermantasyon ortamının başlangıç ph ve çalkalama hızının ayçiçeği tohum kabuğu hidrolizatının alkole fermantasyonuna etkileri de çalkalamalı kap deneyleri ile araştırılmıştır.. MATERYAL VE METOD.1. Mikroorganizma ve Büyüme ortamı Deneylerde kullanılan Pichia stipitis (NRRL-Y-71)(CBS-5773) mayası liyofiliz halinde United States Department of Agriculture dan temin edilmiştir. Pichia stipitis mayası, bileşimi ; 3 gl -1 yeast ekstrakt, 3 gl -1 malt ekstrakt, 5 gl -1 pepton, gl -1 ksiloz ve gl -1 agar olan eğik agar ortamında 3 o C de - gün süre ile büyüme için bekletilmiştir. Daha sonra ml hacmindeki büyüme ortamına eğik ağardan mikroorganizma aşılaması yapılmıştır. Büyüme ortamının bileşimi: gl -1 üre, 1 gl -1 KH PO, 1.1 gl -1 Na HPO, gl -1 maya özütü, 5 gl -1 D-ksiloz (ph=.5) ve eser miktarda CaO, ZnO, FeCl 3.H O, MgO, CuSO. 5H O, CoCl. H O, H 3 BO 3 ve HCl den oluşmuştur [11]. Maya aerobik olarak 5 rpm magnetik karıştırıcıda, 3 o C sıcaklıkta büyütülmüş ve 7. saatte büyüme ortamından fermantasyon hacminin (135 ml) % si oranında fermentasyon ortamına aşılanmıştır.. Ayçiçeği Tohum Kabuğu Hidrolizatının Hazırlanması Antakya yöresindeki bir yağ fabrikasının sıkım artığı olan ayçiçeği tohum kabukları çekiçli bir değirmende öğütülüp elek analizine tabi tutularak,71-1 mm boyut aralığındaki bölümü hidrolizat deneyleri için kullanılmıştır. Hemiselüloz hidrolizatı su banyosunun içine daldırılmış 1 litre hacmindeki cam bir reaktörde rpm karıştırma hızında hazırlanmıştır. Kullanılan cam reaktör, 1 cm çapında ve cm yüksekliğinde olup kapaklıdır ve kapak kısmına bir geri soğutucu takılmıştır. Cam reaktör karıştırıcı bir motor yardımıyla cam bir karıştırıcı pervane tarafından karıştırılmıştır. 5mL hacminde,7 M H SO çözeltisi cam reaktöre konmuş ve sıcaklık 9 C ye gelince bu çözeltiye, 1/5 katı-sıvı oranında olacak şekilde g öğütülüp elek analizi yapılmış ayçiçeği tohum kabukları ilave edilmiştir. Yaklaşık 3,5 saatlik hidroliz işlemi sonunda elde edilen hemiselüloz hidrolizatı önce patiska bezden süzülerek posasından ayrılmış daha sonra filtre kağıdından süzülmüştür. Elde edilen ayçiçeği tohum kabuğu hemiselüloz hidrolizatına şeker analizi yapılarak 37 g/l konsantrasyonunda indirgen şekere sahip olduğu görülmüştür. Fermantasyon öncesi sentetik ksiloz ilavesi ile bu değer g/l ye tamamlanmıştır..3 Zehir Giderme Yöntemleri Ayçiçeği tohum kabuklarının asidik hidrolizi sırasında oluşan fermantasyon inhibitörlerini hidrolizat ortamından uzaklaştırmak için üç farklı zehir giderme metodu uygulanmıştır. CaO ile muamele: Hidrolizat C ye ısıtılarak bu sıcaklıkta 3 dakika bekletilmiştir. CaO kademeli olarak eklenerek ph= a çıkarılmış ve patiska bezden süzülerek posasından

3 Yedinci Ulusal Kimya Mühendisliği Kongresi, 5- Eylül, Anadolu Üniversitesi, Eskişehir ayrılmıştır. Daha sonra H SO ile ph= ya düşürülmüştür. Hidrolizat önce santrifüj edilmiş bunu takiben birde mavi banttan süzülmüştür. CaO ile muamele ve sodyum sülfit ilavesi: CaO ile aşırı işlem görmüş olan hidrolizata 3 g/l konsantrasyonunda Na SO 3 ilave edilmiştir. Son olarak hidrolizat santrifüj edilmiş ve mavi banttan süzülmüştür. CaO ile muamele ve aktif karbon ilavesi: CaO ile aşırı işlem görmüş olan hidrolizata 5 g/l konsantrasyonunda aktif karbon ilave edilmiştir. Son olarak hidrolizat santrifüj edilmiş ve mavi banttan süzülmüştür. Nötrleştirme: Hidrolizat C ye ısıtılarak bu sıcaklıkta 3 dakika bekletilmiştir. CaO kademeli olarak eklenerek ph= a çıkarılmıştır. Hidrolizat önce patiska bezden süzülerek posasından ayrılmış daha sonra santrifüj edilerek bunu takiben birde mavi banttan süzülmüştür..5 Fermantasyon Deneyleri Bütün deneyler, 5 ml lik erlenlere konulan 135 ml fermantasyon hacmindeki ortamların ağızları pamuk tıkaçla kapatılıp, sallamalı su banyosunda, 3 o C sıcaklıkta, 7 rpm karıştırma hızında ve ph iken gerçekleştirilmiştir. Ön işlem sonrası ortaya çıkan şeker kaybı nedeniyle, hidrolizat içine D-ksiloz ilave edilerek toplam indirgen şeker konsantrasyonu g/l ye tamamlanmıştır. Büyüme ortamından fermantasyon ortamına, fermantasyon hacminin % si kadar aşılama yapılmış olup başlangıçta biyokütle konsantrasyonu 3,5-3,7 g l -1 aralığında değişmektedir. Ayrıca kontrol deneyi olarak hidrolizat ile aynı değerde sentetik D-ksiloz içeren ortam, Pichia stipitis mayası ile benzer koşullarda fermente edilmiştir. Deneyler süresince alınan örneklerde, biyokütle, indirgen şeker ve etil alkol konsantrasyonları zamana karşı takip edilmiştir.. Analitik Metod Biyokütle konsantrasyonu, UV spektrofotometrede nm dalga boyunda absorbans ölçülerek belirlenmiştir. İndirgen şeker konsantrasyonu dinitrosalisilik asit kullanılarak saptanmıştır [1]. Etanol konsantrasyonu ise, dikromat oksidasyon yöntemiyle ölçülmüştür [13]. Ayrıca ürün verimi Y P/S (maksimum etanol / toplam harcanmış substrat) (g etanol / g substrat) ve Q P (g/lsaat) üretim hızı (maksimum etanol / zaman) olarak hesaplanmıştır. 3. DENEYSEL SONUÇLAR VE TARTIŞMA Bu çalışmada ayçiçeği tohum kabuğu hemiselülozik hidrolizatından etanol üretimi olanakları Pichia stipitis NRRL Y-1 kullanılarak araştırılmıştır. Bu amaçla elde edilen hidrolizata CaO ile aşırı muamele, CaO ile aşırı muamele+sodyum sülfitle işlem, CaO ile aşırı muamele + aktif karbonla işlem ve CaO ile ph = ya titrasyon ön işlemleri uygulanmıştır. farklı zehir giderme ön işlemi uygulanmış olan hidrolizat P.stipitis mayası ile çalkalamalı kaplarda fermente edilmiştir. Ayrıca hidrolizat içerisindeki indirgen şeker konsantrasyonuna eşdeğer konsantrasyonda sentetik ksiloz içeren ortamda da kontrol amaçlı fermantasyon işlemi gerçekleştirilmiştir (Çizelge 1). Farklı zehir giderme ön işlemlerinin biyokütle büyümesine, indirgen şeker konsantrasyonuna ve etanol üretimine etkileri Şekil 1 de görülmektedir. Literatürde yapılan bazı çalışmalarda o C sıcaklıkta, CaO ile ph a aşırı titrasyon ön işlemi için gerekli olan CaO miktarının oda sıcaklığındaki işlemlere oranla daha az olduğu, uçucu bileşiklerin tamamen giderildiği ve furfural ve hidroksimetil furfural bileşiklerinin konsantrasyonlarının daha fazla düşürüldüğü belirtilmektedir [1, 15]. Ön işlem sırasında hidrolizata eklenen CaO miktarındaki artma, şeker içeriğinin azalmasına neden olmaktadır [1,15,1]. Bu amaçla CaO ile ph a aşırı titrasyon ön işlemi için işlem sıcaklığı C ve gerekli CaO miktarı yapılan ön denemeler sonucu seçilmiştir. CaO ile ph a aşırı titrasyon ön işleminden önce hidrolizattaki toplam indirgen şeker konsantrasyonu

4 Yedinci Ulusal Kimya Mühendisliği Kongresi, 5- Eylül, Anadolu Üniversitesi, Eskişehir Biyokütle (g/l) 1 1 A Zaman(saat) Kontrol CaO ph= CaO ph=+s.sülfit CaO ph=+a.karbon CaO ph= Biyokütle (g/l) rpm rpm 13 rpm Zaman (g/l) A Toplam İndirgen Şeker(g/L B Kontrol CaO ph CaO ph +s.sülfit CaO ph +A.karbon CaO ph Zaman(g/L) Toplam İndirgen Şeker (g/l 5 3 B 7 rpm rpm 13 rpm Etanol (g/l) 15 Kontrol CaO ph= CaO ph= + s.sülfit CaO ph= + A.k CaO ph= C Etanol (g/l) 1 7 rpm rpm 13 rpm C Zaman (g/l) Şekil 1 Zehir giderme metotlarının (A) biyokütle büyümesi,(b)toplam indirgen şeker, (C) etanol konsantrasyonuna etkisi Şekil Çalkalama hızının (ph=) (A) biyokütle büyümesi, (B) toplam indirgen şeker, (C) etanol konsantrasyonuna etkisi g/l iken CaO ile ph a aşırı titrasyon ön işleminin sonunda 9 g/l ye düşmüştür ve bu düşüşün hem zehir giderme ön işlemi sıcaklığına ve hemde eklenen CaO miktarına bağımlı olduğu yapılan ön denemeler sonucunda görülmüştür. Zehir giderme işlemlerinde 9 dakikalık ön işlem süresi sonunda kayıp olan şeker oranının % -5 arasında değiştiği gözlenmiştir. Tablo 1 de görüldüğü gibi elde edilen en yüksek alkol konsantrasyonu,51 g/l, en iyi üretim hızı, g/lsaat CaO ile ph a aşırı titrasyon + Sodyum sulfite ön işlemi görmüş hidrolizatın fermantasyonu ile elde edilmiştir. Bu şekilde elde edilen en yüksek alkol konsantrasyonu kontrol deneyinin yaklaşık %5 si kadardır.

5 Yedinci Ulusal Kimya Mühendisliği Kongresi, 5- Eylül, Anadolu Üniversitesi, Eskişehir Deney No Çizelge 1. Ayçiçeği tohum kabuğu hemiselülozik hidrolizatının P. stipitis ile alkol fermantasyonuna farklı zehir giderme metotlarının etkisi Zehir Giderme Metotları Ön işlemden sonra indirgen şeker (gl -1 ) Maksimum etanol (gl -1 ) Y P/S (g etanol/g toplam tüketilen şeker) 1 Kontrol I (sentetik ortam) CaO ile aşırı muamele CaO ile aşırı muamele + Na SO CaO ile aşırı muamele + Aktif karbon Nötrleştirme Q P (maks. etanol / zaman) (g (l h) -1 ) Çalışmanın bir sonraki aşamasında en yüksek fermantasyon performansı gösteren CaO ile ph a aşırı titrasyon + sodyum sülfit ön işlemi görmüş ayçiçeği tohum kabuğu hidrolizatı kullanılmıştır. Bu aşamada başlangıç ph ı 5,5-7 arasında ve çalkalama hızı 7-13 rpm aralığında değiştirilerek ayçiçeği kabuğunun P.stipitis ile fermantasyonu incelenmiştir.deneyler süresince alınan numunelerde zamana karşı biyokütle, alkol ve indirgen şeker konsantrasyonları belirlenmiştir (Şekil - 3). D-ksilozu fermente eden mikroorganizmalar az da olsa çözünmüş oksijene gereksinim gösterirler (). Çizelge ph iken çalkalama hızının 7, ve 13 rpm olduğu koşullardaki fermantasyon sonuçlarını göstermektedir. Bu koşullarda en yüksek alkol konsantrasyonu (11,g/L) ve alkol verimi (,3 g/g) çalkalama hızının rpm olduğu koşullarda elde edilmiştir. 13 rpm karıştırma hızında en yüksek üretim hızı (,75 g/g saat) elde edilmesine rağmen daha yüksek bir alkol konsantrasyonuna ulaşılamamıştır. Çizelge. Ayçiçeği tohum kabuğu hemiselülozik hidrolizatının Pichia stipitis le fermantasyonuna çalkalama hızının etkisi (ph=) Toplam indirgen şeker (g l -1 ) Çalkalama hızı (rpm ) Maksimum Etanol ( g l -1 ) Y P/S ( g g -1 ) Q P ( g g -1 h -1 ) Lignoselülozik hidrolizatların fermantasyonunda ortamın ph ı asetik asit nedeniyle oldukça önemlidir. Hidrolizat içinde hemiselülozdan gelen asetik asit, terpen, tannin gibi bileşikler bulunmaktadır. Asetik asit düşük ph değerlerinde inhibitor etkisi yapmaktadır. Bu nedenle hidrolizat ortamının ph değeri en az 5,5- ya arttırılarak fermantasyon işleminin gerçekleştirilmesi gerekmektedir (). Bu çalışmada ph 5,5, ve 7 olarak seçilmiştir. Elde edilen en yüksek alkol konsantrasyonu (11,g/L) ph iken elde edilmesine rağmen, ph 7 de de yüksek alkol konsantrasyonuna (, g/l) ulaşılmıştır (Çizelge 3).

6 Yedinci Ulusal Kimya Mühendisliği Kongresi, 5- Eylül, Anadolu Üniversitesi, Eskişehir Biyokütle (g/l) 1 A ph=5.5 ph= ph= Toplam İndirgen Şeker (g/l 5 3 B ph=5.5 ph= ph= C Etanol (g/l) ph=5.5 ph= ph=7 Şekil 3 ph ın ( rpm) (A) biyokütle büyümesi,(b)toplam indirgen şeker, (C) etanol konsantrasyonuna etkisi Çizelge 3. Ayçiçeği tohum kabuğu hemiselülozik hidrolizatının Pichia stipitis le fermantasyonuna ph ın etkisi ( rpm) Toplam indirgen şeker (g l -1 ) ph Maksimum Etanol ( g l -1 ) Y P/S ( g g -1 ) Q P ( g g -1 h -1 ) SONUÇLAR Bu çalışmada ayçiçeği tohum kabuğu hidrolizatının alkole fermantasyon koşulları araştırılmıştır. Ayçiçeği kabuğu hemiselülozik hidrolizatından Pichia stipitis mayası kullanılarak fermantasyonla etil alkol üretimi öncesi hidrolizata uygulanan CaO ile aşırı muamele + sodyum sülfit ilavesi ön işleminin diğer metotları oranla daha iyi olduğu görülmüştür. Bunun yanı sıra en uygun başlangıç ph değerinin olduğu ve en uygun çalkalama hızının rpm olduğu saptanmıştır. Sonuç olarak başlangıç ph ı da ve rpm karıştırma hızında 11 g/l alkol elde edilmiştir. Bu konsantrasyona karşılık gelen alkol verimi,3 g/g ve üretim hızı,5 g/lsaat tir. TEŞEKKÜR Bu çalışmanın yapılması sırasında desteklerinden ötürü TÜBİTAK a (Misag- 15 kodlu proje) teşekkür ederiz.

7 Yedinci Ulusal Kimya Mühendisliği Kongresi, 5- Eylül, Anadolu Üniversitesi, Eskişehir 5. KAYNAKLAR [1] Davis, L., Jeon, Y.J., Svenson, C., Rogers, P., Pearce, J., Peiris, P., 5. Evaluation of wheat stillage for ethanol production by recombinant Zymomonas mobilis, Biomass and Bioenergy, 9, [] Olsson, L., Hahn-Hagerdal, B., 199. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enzyme and Microbial Technology, 1, [3] Nigam, J.N.,. Bioconversion of water-hyacinth (Eichornia crassipes) hemicellulose acid hydrolysate to motor fuel ethanol by xylose-fermenting yeast, J. Biotechnology 97, [] Beyatlı, B., Biyoteknoloji ve Biyoprotein Üretimi, Kükem Derneği Bilimsel Yayınları, Ankara,199. [5] Telli Okur, M., Ayçiçeği tohum Kabuğu Hemiselüloz Hidrolizatının Alkole Fermantasyon Koşullarının ve Kinetiğinin İncelenmesi, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü,. [] Felipe, M.G.A., Vitolo, M., Mancilha, I.M., Silva, S.S., Fermentation of sugar Cane Bagasse hemicellulosic hydrolysate for xylitol production :Effect of ph, Biomass and Bioenergy,13, [7] Saraçoğlu-Eken, N., Arslan, Y.,. Comparison of different pretreatments in ethanol fermentation using corn cob hemicellulosic hydrolysate with Pichia stipitis and Candida shehatae. Biotechnol. Lett. (), [] Stanburry, P.F., Whitaker, A., Hall, S.J., Principles of Fermentation Technology, Elsevier Science Ltd., US, [9] (1.7.). [] Gerçel, H.F.,. Production and characterization of pyrolysis liquids from sunflower- pressed bagasse, Biores. Technol. 5, [11] Slininger, P.J., Bothast, R.J., Cauwenberge, J.E.V., Kurtzman, C.P., 19. Conversion of d-xylose to ethanol by yeast Pachysolen tannophilus, Biotechnol.Bioeng.,, [1] Miller, G.L., Use of dinitrosalicylic acid reagent for reducing sugar, Anal. Chem. 31, -3. [13] Hortwitz, W.(Ed.), Official Methods of Analysis of The Association of Official Analytical Chemists, Association of Official Analytical Chemists, Washington, 19. [1] Martinez, A., Rodriquez, M.E., York, S.W., Preston, J.F., Ingram, L.O.,. Effects of Ca(OH) treatments ("Overliming") on the composition and toxicity of bagasse hemicellulose hydrolysates, Bitechnol. Bioeng., 9, [15] Purwadi, R., Niklasson, C., Taherzadeh, M.J.,. Kinetic study of detoxification of dilute-acid hydrolysates by Ca(OH), Journal of Biotechnology, 11, [1] Nigam, J.N., 1. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. Journal of Biotechnology, 7, 17-7.