ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Hatice BİLİR EKBİÇ TRAKYA İLKEREN VE FLAME SEEDLESS ÜZÜM ÇEŞİTLERİNDE Co 60 VE KOLHİSİN KULLANILARAK MUTASYON VE POLİPLOİDİ OLUŞTURMA OLANAKLARI BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TRAKYA İLKEREN VE FLAME SEEDLESS ÜZÜM ÇEŞİTLERİNDE Co 60 VE KOLHİSİN KULLANILARAK MUTASYON VE POLİPLOİDİ OLUŞTURMA OLANAKLARI Hatice BİLİR EKBİÇ DOKTORA TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Bu tez 26/02/2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir Prof. Dr. Semih TANGOLAR Prof. Dr. Ahmet Can Ülger Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Danışman Üye Üye.. Prof. Dr. Sadettin GÜRSÖZ Üye. Yrd. Doç. Önder KAMİLOĞLU Üye Bu tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu çalışma, Çukurova Ünv. Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: ZF2006D33 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA TEZİ TRAKYA İLKEREN VE FLAME SEEDLESS ÜZÜM ÇEŞİTLERİNDE Co 60 VE KOLHİSİN KULLANILARAK MUTASYON VE POLİPLOİDİ OLUŞTURMA OLANAKLARI Hatice BİLİR EKBİÇ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. Semih TANGOLAR Yıl: 2010, Sayfa: 131 Jüri : Prof. Dr. Semih TANGOLAR Prof. Dr. Ahmet Can ÜLGER Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof. Dr. Sadettin GÜRSÖZ Yrd. Doç. Dr. Önder KAMİLOĞLU Çalışmada, Trakya İlkeren ve Flame Seedless çeşitlerinde, in vitro ve in vivo denemeleriyle poliploidinin oluşturulmasına neden olan en uygun kolhisin dozu, uygulama süresi ve şekli ile Co 60 ın % 50 ve daha az düzeyde fiziksel zarar ile kontrolden olumlu yönde farklılıkların oluşumuna neden olan en etkili dozu araştırılmıştır. Çalışmada Co 60 gama ışınımının 15, 25, 35 ve 45 Gy dozları denenmiştir. In vivo kolhisin uygulamasında sürgün uçları % 0.5, % 0.75 ve % 1 lik kolhisin çözeltisine batırılmış pamuklara sarılarak 1, 3 ve 5 gün; in vitro denemelerinde ise mikro çelikler % 0.3, % 0.6 ve % 0.9 dozlarındaki kolhisin çözeltilerinde 1, 3 ve 5 saat süreyle tutulmuştur. In vivo ve in vitro uygulamalarında 45 Gy Co 60 dozunun öldürücü etki gösterdiği belirlenmiştir. Gama ışınım dozlarının artışına bağlı olarak gözlerin kabarma, uyanma ve sürme süresinde kontrole göre gecikme meydana gelmiştir. Çeliklerde canlılık oranı bakımından ED 50 değeri Trakya İlkeren çeşidi için Gy; Flame Seedless çeşidi için ise Gy arasında değişmiştir. Artan gama ışınım dozları her iki çeşitte yaprak ve kök sayısının azalması ile sürgün ve kök uzunluğu kısalmasına neden olmuştur. 35 Gy Co 60 ışınım dozu yapraklarda küçülme ve dişliliğin kaybolması şeklinde anormalliklere sebep olmuştur. Denenen gama ışınım dozları stoma yoğunluğu, genişliği ve uzunluğu ile kromozom sayısı bakımdan farklılığa neden olmamıştır. In vivo kolhisin denemesinde Trakya İlkeren çeşidi için % 1; Flame Seedless çeşidinde ise % 0.75 ve % 1 dozlarının sürgün uçlarının tamamının kurumasına neden olduğu saptanmıştır. Her iki çeşitte canlı sürgün ucu oranı açısından kontrole en yakın sonuçlar % 0.5 lik kolhisin dozunun 1 ya da 3 günlük sürelerle uygulanmasından elde edilmiş; Trakya İlkeren çeşidinde % 0.75 lik dozun 3 ve 5 gün süreyle uygulanmasında ise canlılık oranının % 50 nin altına düştüğü gözlenmiştir. Kolhisin uygulama doz ve sürelerinin artışına bağlı olarak her iki çeşitte yaprak alanı ve sürgün uzunluğu değerlerinde ve stoma sayısında azalma; stoma genişliği ve uzunluğunda artış saptanmıştır. Trakya İlkeren çeşidinde % 0.9 dozundaki kolhisinde 3 ve 5 saat; Flame Seedless çeşidinde ise 5 saat süreyle tutulan mikro çeliklerin tamamının kuruduğu saptanmıştır. Anahtar Kelimeler: Asma, mutasyon, gama ışınımı, kolhisin, poliploidi I

4 ABSTRACT PhD THESIS POSSIBILITIES TO GENERATE MUTATION AND POLYPLOIDY USING CO 60 AND COLCHICINE IN TRAKYA ILKEREN AND FLAME SEEDLESS GRAPE CULTIVARS. Hatice BİLİR EKBİÇ DEPARTMENT OF HORTICULTURE INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Semih TANGOLAR Year: 2010 Pages: 131 Jury : Prof. Dr. Semih TANGOLAR Prof. Dr. Ahmet Can ÜLGER Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof. Dr. Sadettin GÜRSÖZ Asst.Prof.Dr. Önder KAMİLOĞLU The study was carried out in Trakya Ilkeren and Flame Seedless grape cultivars to experiment the optimum doses, duration and application method of colchicine and comparing to the control plants 50% and less damaging doses of Co 60 resulting in polyploidy by in vitro and in vivo techniques. In the study 15, 25, 35 and 45 Gy doses of Co 60 sourced gamma irradiation were investigated. In the in vivo experiments control (distilled water), 0.5%, 0.75% and 1% of colchicine doses were applied using soaked cotton by colchicine solutions to the shoot tips during 1, 3 and 5 days. In vitro colchicine experiment was carried out by staying the micro cuttings in 0.3%, 0.6% and 0.9% colchicine solutions during 1, 3 and 5 hours. In vivo and in vitro Co 60 application experiments showed that 45 Gy dose of Co 60 had lethal effect. Duration of bud break and shooting were late depending on the increasing of Co 60 doses. ED 50 values of Co 60 gamma irradiation were found and Gy in Trakya Ilkeren and Flame Seedless cultivars respectively. Increasing doses of gamma irradiation resulted in less leaf and root number and shortening in shoot and root length in both cultivar. Moreover 35 Gy dose of Co 60 caused the abnormalities by small leaf size and lose of leaf toothy. Gamma irradiation doses had no effect on the density and dimension of stomata and chromosome numbers of the cultivars. The 1% colchicine dose in Trakya Ilkeren and 0.75% and 1% doses in Flame Seedless caused the desiccation in shoot tips in the in vivo colchisine treatments. In both cultivars 1 and 3 days duration of 0.5% colchicine treatment gave the most similar results to the control in terms of alive shoot tip. Vitality rates decreased below 50% in Trakya Ilkeren by 3 and 5 days treatments of 0.75% colchicine application dose. Depending on the colchicine dose and duration leaf area, shoot length and stomata density values decreased and stomata dimension increased in both cultivars. Colchicine treatment by 0.9% during 3 and 5 days in Trakya Ilkeren and 5 day in Flame Seedless caused to the micro cuttings dry. Key Words : Grapevine, mutation, gamma irradiation, colchicine, polyploid II

5 TEŞEKKÜR Danışman hocam Sayın Prof. Dr. Semih TANGOLAR a tez konumun belirlenmesi ve yürütülmesi aşamalarında bana sağladığı olanaklardan ve her türlü yol gösterici yardımlarından dolayı sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Yine tezimin her aşamasında, özellikle laboratuvar çalışmalarında destek sağlayan ve her türlü yardımlarını gördüğüm Tez izleme komitesi üyesi Sayın hocam Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA ya içtenlikle teşekkür ederim. Tezimin yürütülmesi sırasındaki değerli katkılarından dolayı Tez izleme komitesi üyesi Sayın hocam Prof. Dr. Ahmet Can ÜLGER e teşekkür ederim. Doktora tezimin sitolojik incelemeleri kapsamında bana sağladığı laboratuvar olanakları ile değerli bilgi ve düşünceleri nedeniyle Sayın Prof. Dr. Sinan ETİ ye teşekkür ederim. Tezimin kromozom sayımı kısmında göstermiş olduğu değerli yardımlarından dolayı eşim Sayın Yrd. Doç. Dr. İdris Ercan EKBİÇ e teşekkürlerimi sunarım. Araştırmamın sağlıklı koşullar altında yürütülmesi hususunda sağlamış oldukları kurum olanakları nedeniyle Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölüm Başkann Sayın Prof. Dr. Turgut YEŞİLOĞLU na teşekkürlerimi sunarım. Tezimin yürütülmesi ve tamamlanması aşamalarında verdikleri manevi destek için başta kardeşim Ar. Gör. Hacer BİLİR arkadaşlarım Dr. Ali SABIR, Ar. Gör. Songül ÇÖMLEKÇİOĞLU ve diğer tüm arkadaşlarıma teşekkür ederim. Ayrıca, her konuda en yakın destek ve yardımlarını gördüğüm başta annem, babam ve eşim ile tezimin yazım aşamasında göstermiş olduğu sabırlı davranışları için canım oğlum Emir Yasin EKBİÇ e teşekkür ederim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR III İÇİNDEKİLER IV ÇİZELGELER DİZİNİ XI ŞEKİLLER DİZİNİ... XV 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fiziksel Mutagen Uygulamaları Kimyasal Mutagen Uygulamaları Ploidi Düzeyinin Belirlenmesi MATERYAL ve METOD Materyal Denemede Yer Alan Çeşitlerin Özellikleri Trakya İlkeren Flame Seedless Deneme Alanı Toprağının Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri Deneme Alanı İklim Özellikleri Metod In vivo Denemeleri Co 60 Uygulaması Yapılan Odun Çeliklerinin Perlit Ortamına Dikim Sonrası İncelemeleri (1). Odun Çeliklerinde Canlılık Oranı (%) (2). Gözlerin Kabarma Süresi (gün) (3). Gözlerin Uyanma Süresi (gün) (4). Gözlerin Sürme Süresi (gün) (5). Yaprak Sayısı (adet) (6). Sürgün Uzunluğu (cm) (7). Kök Sayısı (adet) ve Uzunluğu (cm).. 31 IV

7 (8). Yaprak Alanı (cm 2 ) (9). Morfolojik İncelemeler (10). Stoma Sayısı (adet/mm 2 ) (11). Stoma Genişliği ve Uzunluğu (µm) (12). Kromozom Sayımı Co 60 Uygulaması Yapılan Odun Çeliklerinin Aşılama Sonrası İncelemeleri (1). Aşı Tutma Oranı (%) (2). Fenolojik Gözlemler (2).(a). Aşılanan Gözlerin Kabarma Süresi (gün) (2).(b). Aşılanan Gözlerin Uyanma Süresi (gün) (2).(c). Aşılanan Gözlerin Sürme Süresi (gün) (2).(d). Dallarda Uyanma Süresi (gün) (2).(e). Dallarda Tam Çiçeklenme Süresi (gün) (2).(f). Dallarda Ben Düşme Süresi (gün) (2).(g). Dallarda Olgunluk Süresi (gün) (3). Pomolojik Analizler (3).(a). Salkım Ağırlığı (g) (3).(b).Salkım Genişliği ve Uzunluğu (cm) (3).(c). Tane Ağırlığı (g) (3).(d). Tane Hacmi (ml) (3).(e). Tane Genişliği ve Uzunluğu (mm). 38 V

8 In vivo Koşullarda Sürgün Uçlarına Kolhisin Uygulaması (1). Sürgün Ucu Canlılık Oranı (%) (2). Yaprak Alanı (cm 2 ) (3). Sürgün Uzunluğu (cm) (4). Stoma Sayısı (adet/mm 2 ) (5). Stoma Genişliği ve Uzunluğu (µm) (6). Flow Sitometri Yoluyla Ploidi Analizi Kolhisin Uygulaması Gören Sürgünlerden Alınan Gözlerin Yaşlı Omcalar Üzerine Aşılanması (1). Aşı Tutma Oranı (%) (2). Fenolojik Gözlemler (2).(a). Uyanma Süresi (gün) (2).(b). Tam Çiçeklenme Süresi (gün) (2).(c). Ben Düşme Süresi (gün) (2).(d). Olgunluk Süresi (gün) (3). Pomolojik Analizler (3).(a). Salkım Ağırlığı (g) (3).(b). Salkım Genişliği ve Uzunluğu (cm) (3).(c). Tane Ağırlığı (g) (3).(d). Tane Hacmi (ml) (3).(e). Tane Genişliği ve Uzunluğu (mm) In vitro Denemeleri Mikro Çeliklere Co 60 Uygulaması (1). Canlılık Oranı (%) (2). Kabarma Süresi (gün) (3). Uyanma Süresi (gün) (4). Sürme Süresi (gün).. 46 VI

9 Mikro Çeliklere Kolhisin Uygulaması (1). Canlılık Oranı (%) BULGULAR ve TARTIŞMA In vivo Denemelerine Ait Bulgular Odun Çeliklerinin Co 60 Uygulaması Sonrası Perlit Ortamına Dikimlerinden Elde Edilen Bulgular Odun Çeliklerinde Canlılık Oranı (%) (1). Trakya İlkeren Çeşidinde Co 60 Uygulama Dozları (Gy) ile Canlı Çelik Oranı (%) Arasındaki Regresyon Bulguları (2). Flame Seedless Çeşidinde Farklı Co 60 Uygulama Dozları (Gy) ile Canlı Çelik Oranı (%) Arasındaki Regresyon Bulguları Gözlerin Kabarma Süresi (gün) Gözlerin Uyanma Süresi (gün) Gözlerin Sürme Süresi (gün) Yaprak Sayısı (adet) Sürgün Uzunluğu (cm) (1). Trakya İlkeren Çeşidinde Co 60 Uygulama Dozları (Gy) ile Sürgün Uzunluğu (cm) Arasındaki Regresyon Bulguları (2). Flame Seedless Çeşidinde Co 60 Uygulama Dozları (Gy) ile Sürgün Uzunluğu (cm) Arasındaki Regresyon Bulguları Kök Uzunluğu (cm) (1). Trakya İlkeren Çeşidinde Co 60 Uygulama Dozları (Gy) ile Kök Uzunluğu (cm) Arasındaki Regresyon Bulguları (2). Flame Seedless Çeşidinde Co 60 Uygulama Dozları ile Kök Uzunluğu Arasındaki Regresyon Bulguları 65 VII

10 Kök Sayısı (adet) (1). Trakya İlkeren Çeşidinde Co 60 Dozları (Gy) ile Kök Sayısı (adet) Arasındaki Regresyon Bulguları (2). Flame Seedless Çeşidinde Co 60 Uygulama Dozları (Gy) ile Kök Sayısı (adet) Arasındaki Regresyon Bulguları Yaprak Alanı (cm 2 ) Morfolojik İnceleme Bulguları Stoma Sayısı (adet/mm 2 ) Stoma Genişliği ve Uzunluğu (µm) Kromozom Sayımı Bulguları Odun Çeliklerine Co 60 Uygulamasını Takiben Aşılama Uygulaması Bulguları Aşı Tutma Oranı (%) Fenolojik Bulgular (1). Gözlerin Kabarma Süresi (gün) (2). Gözlerin Uyanma Süresi (gün) (3). Gözlerin Sürme Süresi (gün) (4). Uyanma Süresi (gün) (5). Tam Çiçeklenme Süresi (gün) (6). Ben Düşme Süresi (gün) (7). Olgunluk Süresi (gün) Pomolojik Bulgular (1). Salkım Ağırlığı (g) (2). Salkım Genişliği (cm) (3). Salkım Uzunluğu (cm) (4). Tane Ağırlığı (g) (5). Tane Hacmi (ml) (6). Tane Genişliği (mm) (7). Tane Uzunluğu (mm).. 84 VIII

11 In vivo Koşullarda Sürgün Uçlarına Kolhisin Uygulaması Bulguları Canlı Sürgün Ucu Oranı (%) Yaprak Alanı (cm 2 ) Sürgün Uzunluğu (cm) Stoma Sayısı (adet/mm 2 ) Stoma Genişliği (µm) Stoma Uzunluğu (µm) Flow Sitometri Bulguları Kolhisin Uygulaması Sonrası Aşılama Bulguları (1). Aşı Tutma Oranı (%) (2). Fenolojik Bulgular (2).(a). Uyanma Süresi (gün) (2).(b). Tam Çiçeklenme Süresi (gün) (2).(c). Ben Düşme Süresi (gün) (2).(d). Olgunluk Süresi (gün) (3). Pomolojik Bulgular (3).(a). Salkım Ağırlığı (g) (3).(b). Salkım Genişliği (cm) (3).(c). Salkım Uzunluğu (cm) (3).(d). Tane Ağırlığı (g) (3).(e). Tane Hacmi (ml) (3).(f). Tane Genişliği (mm) (3).(g). Tane Uzunluğu (mm) In vitro Denemeleri Bulguları Mikro Çeliklere Co 60 Uygulaması Mikro Çeliklerde Canlılık Oranı (%) Kabarma Süresi (gün) Patlama Süresi (gün) Sürme Süresi (gün) 113 IX

12 Kolhisin Uygulaması Bulguları Mikro Çelikleri Kolhisin Çözeltisinde Bekletme Uygulaması (1). Mikro Çeliklerde Canlılık Oranı (%) SONUÇLAR ve ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ. 131 X

13 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Deneme Alanı Toprağının Bazı Fiziksel Özellikleri Çizelge 3.2. Deneme Alanı Toprağının Bazı Kimyasal Özellikleri. 26 Çizelge 3.3. Araştırma Yıllarına İlişkin ve Uzun Yıllık Ortalama Aylık İklim Verileri. 27 Çizelge 3.4. MS temel besin ortamının içeriği (Murashige ve Skoog, 1962) 45 Çizelge 4.1. Farklı Dozdaki Co 60 Uygulamasının Trakya İlkeren ile Flame Seedless Çeliklerinde Canlılık Oranları (%) Üzerine Etkisi Çizelge 4.2. Farklı Dozlarda Co 60 Uygulamasının Odun Çeliklerinde Gözlerin Kabarma Süresi (gün) Üzerine Etkisi Çizelge 4.3. Farklı Dozlarda Co 60 Uygulamasının Odun Çeliklerinde Gözlerin Uyanma Süresi (gün) Üzerine Etkisi Çizelge 4.4. Farklı Dozlarda Co 60 Uygulamasının Odun Çeliklerinde Gözlerin Sürme Süresi (gün) Üzerine Etkisi Çizelge 4.5. Farklı Dozdaki Co 60 Uygulamasının Trakya İlkeren Çeşidindeki Yaprak Sayısı (adet), Sürgün Uzunluğu (cm) Üzerine Etkileri. 60 Çizelge 4.6. Farklı Dozdaki Co 60 Uygulamasının Flame Seedless Çeşidi Çeliklerinde Yaprak Sayısı (adet), Sürgün Uzunluğu (cm) Üzerine Etkileri 60 Çizelge 4.7. Farklı Dozdaki Co 60 Uygulamasının Trakya İlkeren Çeşidi Çeliklerinde Kök Uzunluğu (cm) ve Kök Sayısı (adet) Üzerine Etkileri. 67 Çizelge 4.8. Farklı Dozdaki Co 60 Uygulamasının Flame Seedless Çeşidi Çeliklerinde Kök Uzunluğu (cm) ve Kök Sayısı (adet) Üzerine Etkileri Çizelge 4.9. Farklı Dozdaki Co 60 Uygulamasının Trakya İlkeren ve Flame Seedless Çeşitlerinin Yaprak Alanları Üzerine Etkisi (cm 2 ) Çizelge Trakya İlkeren Çeşidinde Farklı Co 60 Dozlarının Stoma Sayısı (adet/mm 2 ), Genişliği (µm) ve Uzunluğu (µm) Üzerine Etkisi.. 73 XI

14 Çizelge Flame Seedless Çeşidinde Farklı Co 60 Dozlarının Stoma Sayısı (adet/mm 2 ), Genişliği (µm) ve Uzunluğu (µm) Üzerine Etkisi. 74 Çizelge Farklı Dozdaki Co 60 ile Işınlamayı Takiben Gözlerdeki Aşı Tutma Oranları (%) Çizelge Trakya İlkeren Çeşidinde Farklı Co 60 Dozlarının Salkım Ağırlığı (g), Salkım Genişliği (cm), Salkım Uzunluğu (cm), Tane Ağırlığı (g), Tane Hacmi (ml), Tane Genişliği (mm) ve Tane Uzunluğu (mm) Üzerine Etkisi Çizelge Flame Seedless Çeşidinde Farklı Co 60 Dozlarının Salkım Ağırlığı (g), Salkım Genişliği (cm), Salkım Uzunluğu (cm), Tane Ağırlığı (g), Tane Hacmi (ml), Tane Genişliği (mm) ve Tane Uzunluğu (mm) Üzerine Etkisi.. 86 Çizelge Trakya İlkeren Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Canlı Sürgün Ucu Oranı Üzerine Etkisi (%) Çizelge Flame Seedless Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Canlı Sürgün Ucu Oranı Üzerine Etkisi (%) Çizelge Trakya İlkeren Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Yaprak Alanı Üzerine Etkisi (cm 2 ) Çizelge Flame Seedless Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Yaprak Alanı Üzerine Etkisi (cm 2 ) 90 Çizelge Trakya İlkeren Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Sürgün Uzunluğu Üzerine Etkisi (cm). 91 Çizelge Flame Seedless Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Sürgün Uzunluğu Üzerine Etkisi (cm). 92 Çizelge Trakya İlkeren Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Stoma Sayısı (adet/mm 2 ) Üzerine Etkisi Çizelge Flame Seedless Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Stoma Sayısı Üzerine Etkisi (adet/mm 2 ) Çizelge Trakya İlkeren Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Stoma Genişliği Üzerine Etkisi (µm) Çizelge Flame Seedless Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Stoma XII

15 Genişliği Üzerine Etkisi (µm) Çizelge Trakya İlkeren Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Stoma Uzunluğu Üzerine Etkisi (µm) Çizelge Flame Seedless Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Stoma Uzunluğu Üzerine Etkisi (µm) Çizelge Trakya İlkeren Çeşidinde Farklı Doz ve Sürelerdeki Kolhisin Uygulamasını Takiben Aşılanan Gözlerdeki Aşı Tutma Oranları (%) Çizelge Flame Seedless Çeşidinde Farklı Doz ve Sürelerdeki Kolhisin Uygulamasını Takiben Aşılanan Gözlerdeki Aşı Tutma Oranları (%) Çizelge Trakya İlkeren Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Tam Çiçeklenme Süresi Üzerine Etkisi (gün) 103 Çizelge Trakya İlkeren Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Ben Düşme Süresi Üzerine Etkisi (gün) Çizelge Trakya İlkeren Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Olgunluk Süresi Üzerine Etkisi (gün) Çizelge Sürgün Uçlarına % 0.5 Dozundaki Kolhisinin 5 Gün Süreyle Uygulanmasının Salkım Ağırlığı (g), Salkım Genişliği (cm) ve Uzunluğu (cm) Üzerine Etkileri Çizelge Sürgün Uçlarına % 0.5 Dozundaki Kolhisinin 5 Gün Süreyle Uygulanmasının Tane Ağırlığı (g), Tane Hacmi (ml), Tane Genişliği (mm) ve Uzunluğu (mm) Üzerine Etkileri Çizelge Farklı Dozdaki Co 60 Işınım Kaynağının Trakya İlkeren Çeşidi Mikro Çeliklerinin Kabarma, Patlama, Sürme Süreleri (gün) ile Canlı Mikro Çelik Oranları (%) Üzerine Etkisi Çizelge Farklı Dozdaki Co 60 Işınım Kaynağının Flame Seedless Çeşidi Mikro Çeliklerinin Kabarma, Patlama, Sürme Süreleri (gün) ile Canlı Mikro Çelik Oranları (%) Üzerine Etkisi Çizelge Trakya İlkeren Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Canlılık Oranı (%) Üzerine Etkisi XIII

16 Çizelge Flame Seedless Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Canlılık Oranı (%) Üzerine Etkisi XIV

17 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Trakya İlkeren Çeşidinin Salkımı 24 Şekil 3.2. Flame Seedless ÇeşidininSalkımı 25 Şekil 3.3. Co 60 Uygulama Cihazının Görünümü Şekil 3.4. Işınlaması Yapılan Odun Çelikleri Şekil 3.5. Co 60 Uygulaması Sonrasında Perlit Ortamına Dikilen Odun Çeliklerinin Görünümü Şekil 3.6. Işınlama Yapılan Odun Çelikleri ve Aşılanmaları Şekil 3.7. Aşı Sonrasında Gözlerde Uyanma ve Sürme Şekil 3.8. In vivo Koşullarda Sürgün Uçlarına Kolhisin Uygulaması Şekil 3.9. Işınlaması Yapılan Tek Boğumlu Mikro Çeliklerin Görünümü 44 Şekil Mikro Çeliklerden Elde Edilen Sürgünlerin Köklendirme Ortamındaki Görünümü. 44 Şekil Kolhisin Çözeltisinin Filtre Kullanılarak Soğuk Sterilizasyonu Şekil 4.1. Co 60 Uygulaması Yapılan Trakya İlkeren Çeşidi Çeliklerinin Perlit Ortamındaki Sürme Durumları Şekil 4.2. Co 60 Uygulaması Yapılan Flame Seedless Çeşidi Çeliklerinin Perlit Ortamındaki Sürme Durumları Şekil 4.3. Trakya İlkeren Çeşidinde Co 60 Uygulaması ile Canlı Çelik Oranı Arasındaki Regresyon İlişki Grafiği (2007 ve 2008 Yılları) 52 Şekil 4.4. Flame Seedless Çeşidinde Co 60 Uygulaması ile Canlı Çelik Oranı Arasındaki Regresyon Grafiği (2007 ve 2008 Yılları) 53 Şekil 4.5. Farklı Dozdaki Co 60 Uygulamasının Trakya İlkeren Çeşidi Çelikleri ve Fidanlarının Sürgün Uzunluğu (cm) Üzerine Etkileri XV

18 Şekil 4.6. Farklı Dozdaki Co 60 Uygulamasının Flame Seedless Çeşidi Çelikleri ve Fidanlarının ve Sürgün Uzunluğu (cm) Üzerine Etkileri Şekil 4.7. Trakya İlkeren Çeşidinde Co 60 Uygulaması ile Sürgün Uzunluğu Arasındaki Regresyon İlişki Grafiği (2008 Yılı).. 62 Şekil 4.8. Flame Seedless Çeşidinde Co 60 Uygulaması ile Sürgün Uzunluğu Arasındaki Regresyon İlişki Grafiği (2007 ve 2008 Yılları) 63 Şekil 4.9. Trakya İlkeren Çeşidinde Co 60 Uygulaması ile Kök Uzunluğu Arasındaki 2008 Yılı Regresyon İlişki Grafiği Şekil Flame Seedless Çeşidinde Co 60 Uygulaması ile Kök Uzunluğu Arasındaki 2008 Yılı Regresyon İlişki Grafiği Şekil Trakya İlkeren Çeşidinde Co 60 Uygulaması ile Kök Sayısı Arasındaki 2008 Yılı Regresyon İlişki Grafiği. 68 Şekil Flame Seedless Çeşidinde Co 60 Uygulaması ile Kök Sayısı Arasındaki 2008 Yılı Regresyon İlişki Grafiği Şekil Trakya İlkeren Çeşidinin 15 Gy ve 25 Gy Co 60 ile Işınlanmış Çeliklerde Kontrol Uygulamasına Göre Köklerde Oluşan Farklılık Şekil Flame Seedless Çeşidinin 15 Gy, 25 Gy ve 35 Gy Co 60 ile Işınlanmış Çeliklerde Kontrol Uygulamasına Göre Köklerde Oluşan Farklılık Şekil Gy Co 60 Uygulaması Yapılan Flame Seedless Çeşidi Çeliklerindeki Yapraklardaki Morfolojik Farklılığın Görünümü XVI

19 Şekil Trakya İlkeren Çeşidi Stomalarının Mikroskobik Görünümü (Büyütme: 20x10).. 74 Şekil Şekil Flame Seedless Çeşidi Stomalarının Mikroskobik Görünümü (Büyütme: 20x10).. 75 Trakya İlkeren Çeşidinde Kontrol ile 15 Gy ve 25 Gy Co 60 ile Işınlanmış Çeliklerin Kromozomları (Büyütme: 100x10) Şekil Flame Seedless Çeşidinde Kontrol ile 15 Gy, 25 Gy ve 35 Gy Co 60 ile Işınlanmış Çeliklerin Kromozomlarının Görünümü (Büyütme: 100x10) Şekil Trakya İlkeren Çeşidinde Farklı Co 60 dozlarının Aşılama Yapılan Gözlerde Kabarma, Patlama ve Sürme Sürelerine (gün) Etkisi Şekil Flame Seedless Çeşidinde Farklı Co 60 dozlarının Aşılama Yapılan Gözlerde Kabarma, Patlama ve Sürme Sürelerine (gün) Etkisi Şekil Trakya İlkeren Çeşidinde Farklı Co 60 Dozlarının Uyanma, Tam Çiçeklenme, Ben Düşme ve Olgunluk Süresi Üzerine Etkisi (gün).. 81 Şekil Flame Seedless Çeşidinde Farklı Co 60 Dozlarının Uyanma, Tam Çiçeklenme, Ben Düşme ve Olgunluk Süresi Üzerine Etkisi (gün).. 81 Şekil Trakya İlkeren Çeşidinde 15 Gy Co 60 ile Işınlamanın Salkıma Olan Etkisi.. 85 Şekil Flame Seedless Çeşidinde 15 ve 25 Gy Co 60 ile Işınlamanın Salkımlara Olan Etkisi. 86 Şekil Şekil Uygulama Sonrası Canlı Kalan (solda) ve Ölen Sürgün Uçlarına (sağda) Ait Görünüm Trakya İlkeren Çeşidi Sürgün Uçlarında Kontrol Uygulaması Stomaları (Büyütme: 20x10) Şekil Trakya İlkeren Çeşidinde % 0.5 Kolhisinin 1 gün (A), 3 XVII

20 gün (B) ve 5 gün (C) Süreyle Uygulandığı Sürgün Uçlarında Stomalar (Büyütme: 20x10) Şekil Trakya İlkeren Çeşidinde % 0.75 Kolhisinin 1 gün (A), 3 gün (B) ve 5 gün (C) Süreyle Uygulandığı Sürgün Uçlarında Stomalar (Büyütme: 20x10) Şekil Flame Seedless Çeşidinde Kontrol (A) ve % 0.5 Kolhisinin 1 Gün (B), 3 Gün (C) ve 5 Gün (D) Süreyle Uygulandığı Sürgün Uçlarında Stomalar (Büyütme: 20x10) Şekil Şekil Trakya İkeren Çeşidinde Kolhisin Uygulaması Sonucu Elde Edilen Diploid (2x) Örnek Grafiği.. 99 Flame Seedless Çeşidinde Kolhisin Uygulaması Sonucu Elde Edilen Diploid (2x) ve Mikzoploid (2x+4x) Örnek Grafikleri. 99 Şekil Şekil Trakya İlkeren Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Uyanma Süresi Üzerine Etkisi (gün) 102 Flame Seedless Çeşidinde Kolhisin Uygulamasının Uyanma Süresi Üzerine Etkisi (gün) Şekil Mikro Çeliklerden Oluşan Sürgünlerde Kararma Şekil Değişik Dozlarda Co 60 ile Işınlaması Yapılmış Trakya İlkeren Çeşidi Mikro Çeliklerinde Sürgün Oluşumu Şekil Değişik Dozlarda Co 60 Işınlaması Yapılmış Flame Seedless Çeşidi Mikro Çeliklerinde Sürgün Oluşumu Şekil Değişik Dozlarda Kolhisin Çözeltisinde Bekletilen Mikro Çeliklere Ait Görünüm. 115 Şekil Trakya İlkeren Çeşidinin % 0.9 Kolhisin Dozunda 1 Saat Süreyle Tutulan Mikro Çelikten Süren Sürgün Şekil Flame Seedless Çeşidinin % 0.9 Kolhisin Dozunda 3 XVIII

21 Saat Süreyle Tutulan Mikro Çelikten Süren Sürgün XIX

22 1. GİRİŞ Hatice BİLİR EKBİÇ 1. GİRİŞ Dünya üzüm endüstrisinde, verim ve kalite bakımından üstün özellikte olan ve tüketicinin beğenisini kazanan çeşitler önemli yer tutmaktadır. Bu nedenle üzüm ıslahı çalışmalarında, farklı iklim ve toprak koşullarına iyi adapte olabilen, hastalık ve zararlılara dayanımı yüksek ve aynı zamanda verim ve kalite bakımından da üstün özelliklere sahip olan üzüm çeşitlerinin elde edilmesi amaçlanmaktadır. Ülkemizde bu amaçla yapılan çalışmalarda da klonal seleksiyon (Kiracı ve ark., 2002; Kader, 2005; Kader ve ark., 2005; Kader ve Öztürk, 2005; Yağcı ve ark., 2005) ve melezleme ıslahı yöntemleri kullanılarak (Uslu ve ark., 1995; Atak ve ark., 2005) bir çok çeşidin elde edildiği görülmektedir. Ekonomik değeri yüksek yeni çeşitlerin elde edilmesi amacıyla melezleme ve klonal seleksiyon gibi geleneksel ıslah metotları kullanılabilmesine karşın, asmanın heterezigotik yapısı ve melezleme ıslahıyla istenilenden çok sayıda özelliğin değişime uğraması gibi olumsuz bazı yönleri bulunmaktadır. Bununla birlikte mutasyon ıslahıyla adaptasyon yeteneği yüksek olan popüler çeşitlerin bir ya da bir kaç özelliği değiştirilerek yeni çeşit elde edilebilmektedir. Mutasyon, genetik segregasyon ya da rekombinasyon olmaksızın DNA dizinindeki kalıtsal değişiklikler olarak tanımlanmaktadır (Predieri, 2001). Genetik varyasyon fiziksel (X ve gama ışınımı gibi iyonize radyasyon) ve kimyasal (Etil metan sülfanat = EMS, Dietil sülfat = DES, Etilenimin = Eİ, kolhisin (colchicine)) mutagenlerle, spesifik uygulamalar ya da doku kültürü teknikleriyle elde edilmektedir. Mutasyon yoluyla bitki ıslahı, yaklaşık yıl öncesinde oldukça yoğun olarak kullanılmış ancak sonrasında bu yönde yapılan çalışma sayısında düşüş gözlenmiştir. Son yıllarda bitki ıslahında kaydedilen gelişmelere paralel olarak yeniden güncel hale geldiği gözlenmektedir (Donini, 1998; Van Harten, 1998; Predieri, 2001). Tarımda geçen yetmiş yıl içerisinde 2252 mutant çeşidin elde edildiği resmi olarak kaydedilmiştir (Maluszynski ve ark., 2000). Bu yolla en fazla çeşit üreten ülke Çin (% 26.8) olup bu ülkeyi Hindistan, Rusya, Hollanda, Amerika ve Japonya nın takip ettiği bildirilmiştir (Kunter Marasalı ve Değirmenci, 2007). 1

23 1. GİRİŞ Hatice BİLİR EKBİÇ Elde edilen çoğu mutant, ya doğrudan ticari çeşit olarak ya da ıslah çalışmalarında ebeveyn olarak kullanılmaktadır. Bu döneme kadar elde edilen 2252 mutantın % 70 i doğrudan ticari çeşit olarak kullanılmıştır. Doğal ya da değişik mutagenlerle elde edilen mutant çeşit sayısının fazlalığına rağmen meyvecilik ve bağcılıkta bugüne kadar sadece 48 mutant çeşidin elde edildiği bildirilmiştir (Ahloowalia ve ark., 2004). Mutasyon ıslahında doğrudan mutant çeşitlerin elde edilmesinde en fazla radyasyon uygulaması kullanılmakta olup günümüzde değişik amaçlarla kullanılan mutant çeşitlerin çoğu bu yolla edilmiştir. Radyasyon uygulamaları içinde ise gama ışınımının kullanım oranı % 64 düzeyindedir. Gama ışınım kaynağı olarak Cs 137 de kullanılabilmesine karşın şimdiye kadar yapılan çalışmaların çoğunluğunda Co 60 ın kullanıldığı belirlenmiştir (Ahloowalia ve ark., 2004). İyonize radyasyon grubunda olan gama ışınımı hücrede bol miktardaki su molekülünün ayrışmasına ve üç-dört atomdan meydana gelmiş oksijen içeren serbest radikallerin oluşuma neden olmaktadır. Oluşan serbest radikaller DNA zincirinin kırılması, DNA zinciri boyunca nükleotidlerin ayrışması ve hücre organellerinin parçalanması gibi hücresel düzeyde büyük hasarlar meydana getirmektedir. Hücrede meydana gelen bu hasarlar hücre bölünmesini engelleyerek büyümenin gerilemesine neden olmaktadır (Kaya, 2002). Bir gende mutasyon oluşturulması amacıyla gama ışınlarının kullanıldığı çalışmalarda (Bozhinova-Boneva, 1974; Lima da Silva ve Doazan, 1995; Marasalı ve ark., 2003; AiHong ve ark., 2005; Patil ve Patil, 2005) tane iriliği, tane dökümünün engellenmesi, hastalıklara dayanıklılık, olgunluk süresinin kısaltılması gibi özelliklerde değişimler meydana getirilmeye çalışılmıştır. Genel olarak meyve türlerinde olduğu gibi asmalarda da iki tip mutasyon tercih edilmektedir. Bunlardan biri omca ya da salkımın bazı karakterlerini etkileyen gen farklılıklarının oluşturulması, diğeri ise ploidi düzeyinin değiştirilmesidir. Poliploidi ıslahında, bir ya da daha fazla sayıda kromozom setine sahip bitkilerin elde edilmesi amaçlanmaktadır. Kromozom sayılarının katlanabileceği ilk kez 1937 yılında Blankeslee nin kolhisin (Colchicine) ile yaptığı denemelerde belirlenmiş olup daha sonraları bu amaçla Chloral hydrate, Sülfanilonide, Hexachlorocyclohexan, Acenaphtene gibi değişik kimyasal maddeler ve bitki 2

24 1. GİRİŞ Hatice BİLİR EKBİÇ büyümeyi düzenleyici maddeler kullanılmıştır (Düzgüneş ve Ekingen, 1974; Blanco, 2005). Kolhisin (C 22 H 25 O 6 ) Colchicum automnale L. isimli güz çiğdem bitkisinin köklerinden elde edilen alkoloid yapısında ve kuvvetli bir zehir olup renksiz, alkol, kloroform ve soğuk suda eriyen, sıcak suda ve eterde erimeyen bir maddedir (Genç ve Yağbasanlar, 1993). Kolhisinin uygulandığı dokuların hücrelerinde mitoz bölünmenin metafaz safhasında iğ ipliklerinin oluşumu engellenir ve replikasyona uğramış kromozomların kutuplara çekilmesini önlenerek, kromozom sayısının iki katına çıkmasını sağlanır (Köksal, 1999). Asmada değişik yollarla elde edilebilen poliploid bitkilerin gövdelerinin daha kalın, yapraklarının geniş ve koyu renkli, köklerinin ise güçlü ve diploidlere göre daha geniş yayılım gösterdiği, çiçek, polen ve tohumlarının ise diploidlere göre daha iri olduğu saptanmıştır (Motosugi ve ark., 2002 b). Üzüm şıra içeriklerinin de diploidlerle karşılaştırıldığında, daha yüksek olduğu bildirilmektedir. Tetraploid çeşitler, tane ve salkım iriliğinin yüksekliğinden dolayı (Luo ve ark., 1995; Notsuka ve ark., 2000) üzüm ıslahında önemli yer tutmaktadır. Tetraploid sofralık üzüm çeşitlerinin yetiştiriciliği özellikle Japonya da yoğun olarak yapılmaktadır. Bu ülkede V. vinifera x V. labruscana Bailey melezlenmesi sonucu oluşan Kyoho ve Pione çeşitleri toplam bağ alanlarının % 40 ını kaplamaktadır (Motosugi ve ark., 2002 b). Ancak mevcut tetraploid çeşitlerin verimlerinin düşüklüğü, zayıf gelişimi ve sürgünlerinin kırılgan olması nedeniyle mevcut tetraploid çeşitlerden farklı olarak yeni tetraploid çeşitlerin ıslahına yönelim bulunmaktadır. Aki Queen (Kyoho x Kyoho), Fujiminori (Ikawa 682 x Pione), çeşitleri de bu ülkede ıslah edilen diğer yeni tetraploid çeşitlerdendir (Park ve ark., 2002). Tetraploid üzüm ıslahına yönelik çalışmaların da Çin, Japonya ve Amerika da yoğunlaştığı ve daha çok uygun kolhisin dozu ve süresinin incelendiği saptanmıştır (Yamane ve Kurihara, 1980; Luo ve ark., 1995; Notsuka ve ark., 2000; Motosugi ve Motioko, 2001; Motosugi ve ark., 2002 b; Aihong ve ark., 2005). Kolhisin ve diğer mutagenlerin etkilerinin incelenmesinde daha çok aktif sürgün uçları ve odun çelikleri kullanılmaktadır. Mutasyon uygulamaları sonucunda bazen mutasyonun gelecek jenerasyona ulaştırılamadığı kimera adı verilen yapılar da 3

25 1. GİRİŞ Hatice BİLİR EKBİÇ oluşmaktadır (Bertsch ve ark., 2005). In vitro yöntemlerin kullanılması kimeraların oluşum sıklığını azaltabilmektedir (Pierik, 1989). Çalışmada, Trakya İlkeren ve Flame Seedless çeşitlerinde, in vitro ve in vivo denemeleriyle poliploid oluşturulmasına neden olabilecek en uygun kolhisin dozu, uygulama süresi ve şekli ile Co 60 ın % 50 ve daha az düzeyde fiziksel zarar ile kontrolden olumlu yönde farklılıklara neden olan en etkili dozunun belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaca yönelik olarak hem arazi hem de in vitro koşullarda farklı dozlarda gama ışınımları ile farklı doz ve sürelerde kolhisin uygulamaları gerçekleştirilmiştir. 4

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hatice BİLİR EKBİÇ 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Fiziksel Mutagen Uygulamaları Bozhirova-Boneva ve Kondarev (1973), 8 üzüm çeşidi ve 2 hibritin katlanmış olan tohumlarını 40 Gy den 300 Gy e kadar gama ışınımıyla radyasyona maruz bırakarak tohum ve sürgünler üzerine farklı gama dozlarının etkisini araştırmışlardır. Araştırıcılar 40 ile 80 Gy arasında ışınım dozunun optimum, 100 Gy gama dozunun ise öldürücü doz olduğunu; tohumlardan çimlenen çöğürlerin öldüğünü saptamışlardır. Çalışmada Mavrud, Nadzhim ve Rizimat çeşitlerinin dayanıklılık gösterdiği ancak çöğürlerin çok az bir kısmının canlı kaldığı belirlenmiştir. Bu üç çeşidin sürgünleri mutasyon amacıyla ışınıma maruz bırakıldıklarında 20 Gy gama ışınım dozunun en uygun doz olduğu görülmüş ve bazı morfolojik değişikliklerin elde edilebildiği tespit edilmiştir. Bozhinova-Boneva (1975), asma polenlerine gama ışınımı uygulamış ve polen çimlenmesi açısından 5-10 Gy gama ışınım dozlarının çimlenmeyi teşvik ettiğini; Gy dozlarının ise ıslaha yönelik materyallerin elde edilmesi bakımından olumlu sonuçlar verdiğini belirlemiştir. 200 Gy in üzerindeki ışınım dozlarının ise polenler için öldürücü olduğu saptanmıştır. Costacurta ve ark. (1978), gama ışınımının dört farklı üzüm çeşidi tohumlarının çimlenmesi üzerine etkisini inceledikleri çalışmada tohumları uygulama öncesi +4 0 C deki depolarda 0, 30, 60 ya da 90 gün boyunca muhafaza etmişler ve sonrasında 4 Gy/saat dozundaki gama ışınımına yarım saatten 2 saate kadar değişen sürelerde maruz bırakmışlardır. Çalışmada, bu uygulamaları takiben tohumların 22 ya da 27 0 C deki çimlenme süreleri grafiksel olarak gösterilmiştir. Çalışma sonucunda çeşitlerin uygulamalara olan yanıtının farklılık gösterdiği; geç olgunlaşan Raboso Piave çeşidine ait katlama yapılmayan tohumlarda çimlenme düzeyinin, ışınım uygulaması ve yüksek sıcaklıkla arttığı saptanmıştır. Erkenci çeşit olarak bilinen Tocai çeşidinin ise çimlenme düzeyinin oldukça düşük düzeyde kaldığı ve yalnızca uzun süreli katlamalarla çimlenme düzeyinin artırılabildiği belirlenmiştir. Araştırıcılar, yüksek dormansiye sahip olan Verduzzo Trevigiano çeşidinin ise 5

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hatice BİLİR EKBİÇ katlamaya olan yanıtının Merlot çeşidi tohumlarına göre daha olumlu olduğunu tespit etmişlerdir. Çalışmada genel olarak tüm çeşitlerin tohumlarının ışınıma olan yanıtlarının olumlu olduğu bildirilmiştir. Ponnuswami ve ark. (1991), 25 ile 45 cm uzunluğundaki Muscat çeşidi çeliklerini dikim öncesinde 0, 5, 10, 15, 20, 25 ya da 30 Gy dozlarındaki Co 60 ışınımına maruz bırakmışlardır. Gama dozunun artışına bağlı olarak uygulama yapılan çeliklerde sürme, canlılık oranı, sürgün uzunluğu, kök uzunluğu ve yaprak alanında azalmanın olduğu belirlenmiştir. Araştırıcılar, sürme oranı, canlılık oranı, sürgün uzunluğu ve kök uzunluğu açısından etkili mutasyon dozu (ED 50 ) değerinin 20 ve 25 Gy olduğunu saptamışlardır. Lima da Silva ve Doazan (1995), in vitro koşullarında kültüre alınan asma anaçlarının gama ışınımıyla mutasyonunu amaçladıkları çalışmalarında Fercal ve Gravesac Amerikan asma anaçlarının in vitro dan elde edilen tek gözlü çeliklerini kullanmışlardır. Kullanılan mikro çelikler 10 Gy den 60 Gy e kadar 10 ar birimlik aralıklarla değişen Co 60 dozlarına maruz bırakılmıştır. Deneme kapsamında incelenen parametrelerin tamamının 20 Gy ve üstündeki dozların uygulanmasıyla değiştiğini belirlemişlerdir. Çeşitlerin gama ışınımına olan hassasiyetleri farklı olmakla beraber Gravesac anacının 40 Gy dozuna kadar, Fercal anacının ise sadece 20 Gy e kadar olan ışınım dozlarına dayandığı saptanmıştır. Bu çalışmayla gama ışınım dozu artışının, in vitro da yetiştirilen bitkilerin canlılığını, köklenme ve gelişimi azalttığı tespit edilmiştir. Araştırıcılar in vitro da yetiştirilen Gravesac anacı bitkilerinin ikinci generasyonlarında büyüklük, yaprak şekli, gelişim, habitus ve klorofil II noksanlığındaki sıklık bakımından da değişiklikler gösterdiği saptanmıştır. Üçüncü generasyonda ise 30 Gy gama ışınımı sonrasında gelişim, kuru ağırlık, yaprak alanı ve stoma sayısı ile fotosentez oranı bakımından varyasyonlar elde edilmiştir. Araştırıcılar gama ışınımının in vitro da çeşitlilik oluşturmada etkili olduğunu ve daha ileriki safhada bunların serada testlemeye tabi tutulması gerektiğini bildirmişlerdir. Kuksova ve ark. (1997), in vitro yoluyla mutasyon ve somaklonal varyasyonu inceledikleri araştırmalarında Podarok Magaracha üzüm çeşidinin yaprak eksplantlarını somatik embriyogenesis yoluyla rejenere etmişlerdir. Rejenere olan 6

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hatice BİLİR EKBİÇ bitkilerde kök ucu kromozom sayımları gerçekleştirilmiş ve sonuçta 242 bitki arasında 6 bitkinin (% 2.5) tetraploid; kalanların ise diploid olduğu saptanmıştır. Rejenere olan bitkiler arasında kimerik ya da aneoploid bitki oluşumu saptanmamıştır. Gama ışınımıyla (5-100 Gy) tetraploid bitki ve embriyojenik kallus oluşumu artırılırken (% 7.6) bazı aneoploid bitkiler de elde edilmiştir. Araştırıcılar, bu çalışmada, kolhisin uygulamasının tetraploid bitki oluşumunda etkili olmadığını belirlemişlerdir. Charbaji ve Nabulsi (1999) Helwani ve Cabernet Franc üzüm çeşitleriyle 99 R ve 3309 C anaçlarının in vitro gelişimi üzerine düşük dozda verilen gama ışınımının etkisini araştırmışlardır. Çalışmalarında, sürgün uçları ve tek boğumlu çelikler, 60 gün süre ile DSD1 ortamında (Lima Da Silva ve Doazan, 1995) kültüre alınmış ve bunu takiben eksplantlara 0, 2, 5, 7 Gy dozlarında Co 60 uygulanmıştır. Uygulamalardan 5 Gy gama dozunun Helwani çeşidi ve iki anacın bitkilerinde kök sayısını artırdığı belirlenmiştir. Araştırıcılar kullanılan kültür çeşitlerinde kök uzunluğunun 2 ve 7 Gy dozlarındaki gama ışınımıyla kontrole göre artış gösterdiğini ve benzer sonuçların 99 R anacında 5 Gy dozu uygulamasında da tespit edildiğini gözlemişlerdir. Ayrıca 5 Gy ışınım dozunun 99 R anacının kuru ağırlığını artırdığı; benzer etkinin Helwani ve Cabernet Franc çeşitlerinde 2 ve 7 Gy gama dozlarından alındığı saptanmıştır. Araştırmada yaprak sayısının 5 ve 7 Gy uygulamasıyla artış gösterdiği belirlenmiştir. Çoban ve ark. (2002), Mevlana, Misket ve Pembe Gemre üzüm çeşitlerini kullanarak tek bir çelikten alınan her bir gözün gama ışınımına olan hassasiyetlerini ve canlılık oranlarını incelemiştir. Aynı çelikten olmasına rağmen her bir gözün radyasyona olan hassasiyetinin farklı olduğunu belirlemiştir. Çalışmada kullanılan 3.8 krad dozuna en hassas çeşit olarak Mevlana belirlenirken Pembe Gemre çeşidinin en dayanıklı olduğu saptanmıştır. Marasalı ve ark. (2003), Sultani Çekirdeksiz, Kalecik Karası ve Uslu üzüm çeşitlerinde mutasyon ıslahına yönelik olarak etkili mutasyon dozunun belirlenmesi amacıyla gerçekleştirdikleri çalışmalarında materyal olarak dinlenme dönemindeki tek gözlü çelikleri kullanmışlardır. Bu materyaller, 25, 30, 35, 40 ve 45 Gy dozlarında Co 60 gama kaynağında ışınlanmış ve sera koşullarında yetiştirilmişlerdir. 7

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hatice BİLİR EKBİÇ Araştırıcılar, M 1 V 1 generasyonundaki bireylerde 50. Gün sonrasında sürme oranı ve sürgün uzunluğunu incelemişlerdir. Çalışmada ölçümler regrasyon analizi yardımıyla değerlendirilerek ED 50 (Etkili Mutasyon Dozu) hesaplanmıştır. Araştırmada ED 50 değerini Kalecik Karası için Gy, Sultani Çekirdeksiz için Gy ve Uslu için Gy olarak saptamışlardır. Çalışmada ayrıca radyasyonun morfolojik etkisi de incelenmiş ve bu incelemeyle yapraklarda çatallanma, dişlilik yapısında farklılaşmanın yanı sıra klorofil mutasyonları da gözlenmiştir. Dardeniz ve Tayyar (2005), Çanakkale de gerçekleştirdikleri çalışmalarında 420 A ve 5 BB Amerikan asma anacı çeliklerinin göz uyanması ve gelişimi üzerine farklı dozdaki gama ışınlarının etkisini incelemişlerdir. Araştırıcılar her iki anaç için farklı gama ışınımlarının değişik gelişim parametreleri üzerine olan etkisini ve etkili bir mutasyon dozunu (ED 50 ) belirlemeye çalışmışlardır. Çalışma sonucunda yüksek gama dozlarının vejetatif gelişim üzerine etkisinin olumsuz olduğu saptanmıştır. Araştırıcılar, ED 50 dozunu 420 A anacı için Gy; 5 BB içinse Gy olarak tespit etmişlerdir. Patil ve Patil (2005), Anab-e Shahi üzüm çeşidinde fiziksel mutagenlerden gama ışınımı ile kimyasal mutagenlerden etil metanasülfat ın etkilerini araştırmışlardır. Denemeleri sonucunda düşük dozlarda kısa süreli mutagen uygulamalarından mutant canlılığı bakımından daha olumlu sonuçların alındığını belirlemişlerdir. Çalışmada meyve kalitesi yönünden yapılan incelemelerle salkım sayısı ve verim/omca açısından iki mutanttan en yüksek değerler elde edilmiştir. Bir mutantın belirgin olarak daha yüksek tane ağırlığı ve büyüklüğü gösterdiği; başka bir mutantın ise en yüksek düzeyde SÇKM içerdiği belirlenmiştir. Araştırıcılar uyguladıkları mutagenlerle elde ettikleri iki mutantın çekirdeksiz ya da tam gelişmemiş çekirdeklere sahip olduklarını belirlerlerken hastalıklara dayanım bakımından dört mutantın mildiyöye oldukça dayanıklı olduğunu; sekiz mutantın küllemeye oldukça hassasiyet gösterdiğini; bir mutantın da antraknoza karşı dayanıklı olduğunu belirlemişlerdir. Araştırıcılar bu çalışmayla bazı ümitvar mutantlar elde etmişler, bu mutantların Hindistan ın bağcılık yapılan değişik bölgeleri için önerilebilecek ticari özelliklere sahip olduklarını bildirmişlerdir. 8

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hatice BİLİR EKBİÇ Khawale ve ark. (2006), Pusa Seedless (Vitis vinifera L.) çeşidinde gama ışınımı kullanarak in vitro koşullarda mutasyon oluşturma ve elde edilen mutantların moleküler markörler ile belirlenmesi üzerine araştırma yürütmüşlerdir. Araştırıcılar bu amaca yönelik olarak mikro çelikleri 0, 5, 10, 20, 30, 40 ve 50 Gy dozlarında Co 60 ile ışınlamışlar ve ışınlanan bu bitkileri 200 mg/l aktif kömür ve 2.0 mg/l IBA (Indol butirik asit) içeren ½MS ortamında alt kültüre almışlardır. Çalışmada mikro çeliklerin canlılığı ve gelişimine dayalı olarak ED 50 dozu 10 Gy olarak bulunmuştur. 3 alt kültüre kadar çoğaltılan ve dışarı şaşırtılan olası mutantlar 76 RAPD primeri kullanarak incelenmiştir. Olası mutantların % 30 u morfolojik karakterlere dayalı olarak seçilmiş ve DNA ları izole edilmiştir. İncelemeye alınan mutant adaylarından 11 adeti (% 36.6), 7 adet RAPD primeri bakımından polimorfik bulunmuştur. Araştırıcılar, tanımlanan mutantları doku kültürü tekniğiyle klonlamış, dışarıya alıştırmış ve son olarak seraya transfer etmişlerdir. Bu çalışmaya dayanarak araştırıcılar özellikle çok yıllık meyve ağaçları için mutant adayların incelenmesinde moleküler markörlerin kullanılmasının süreyi kısaltma bakımından faydalı olacağını bildirmişlerdir. Kunter Marasalı ve Değirmenci (2007), Sultani Çekirdeksiz ve Kalecik Karası üzüm çeşitlerinde uyarılmış mutasyonun etkilerinin sitogenetik olarak belirlenmesi amacıyla yürüttükleri çalışmada 20, 25, 30, 40 ve 45 Gy gama ışınım uygulamasıyla elde ettikleri populasyonunu kullanmışlardır. Araştırıcılar, M 1 V 1, M 1 V 2 ve M 1 V 3 vejetasyonlarında morfolojik incelemeler sonucu seçilen mutant adaylarında sitolojik ve SSCP (Single Strand Conformation Polimorphism) markör aracılığıyla genetik polimorfizmi tanımlamaya çalışmışlardır. Araştırıcılar sitolojik incelemeler sonucunda her iki çeşitte diploid yapılı hücreler gözlemişlerdir. Sadece Sultani Çekirdeksiz çeşidinin 30 Gy uygulaması gören 34 nolu bireyde 2n diploid kromozom sayısında fazla ve ploid olduğu düşünülen hücre yapısını tespit etmişlerdir. Genetik tanımlama sonucunda ise vejetatif karakterlerden sorumlu 50 adet SSCP primeri kullanılarak ön deneme analizlerinde polimorfik olduğu belirlenen 15 adet SSCP primeri ile tamamlanan çalışmalar sonucunda mutant adayı bireylerle kontrol bitkileri arasında monomorfik band desenleri elde etmişler ancak çalışılan primerler ile polimorfizm sağlayamamışlardır. 9

31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hatice BİLİR EKBİÇ 2.2. Kimyasal Mutagen Uygulamaları Yamane ve Kurihara (1980), kolhisin kullanarak poliploidinin sağlanması amacıyla yaptıkları çalışma sonucunda Neo Muscat ın 4 ve Thompson Seedless çeşidinin ise 3 tetraploid formunu elde etmişlerdir. Bu amaca yönelik olarak yan gözler % 0.2 konsantrasyonundaki kolhisin solüsyonunda bekletilmiştir. Muscat Bailey B x Muscat of Alexandria, Neo Muscat çöğürleri ve Koshu Sanzyaku çeşitlerinde kotiledon safhasında % 0.2 kolhisin uygulamasıyla çok az miktarda tetraploid oluşumu sağlanmıştır. Çalışmada, hem yan göze hem de çöğürlere kolhisin uygulamalarıyla bazı materyallerde periklinal kimeraların oluştuğu ve çok miktarda da mikzoploidlerin (2x+4x) elde edildiği bildirilmiştir. Araştırmada Neo Muscat çeşidinden elde edilen tetraploid bitkilerin yaprak morfolojisi bakımından diploidlerden farklı olduğu; stoma büyüklüğü açısından diploidlerden % 40 oranında daha iri, birim alana düşen stoma sayısı açısından ise diploidlere göre yaklaşık % 40 oranında daha düşük miktarda olduğu tespit edilmiştir. Gogiava ve ark. (1981), mutasyonun oluşturulması amacıyla Rkatsiteli ve Saperavi üzüm çeşitlerinin tohum ve sürgünlerini N-nitroso-N-ethylürea (NEU), dimetil sülfat ve kolhisin le 6 farklı konsantrasyonda 2 farklı zamanda uygulamıştır. Araştırıcı, elde edilen çeşitliliğin, çeliklere yapılan mutagen uygulamalarıyla, tohumlara yapılandan daha yüksek olduğunu saptamıştır. Çeliklere % 0.1 konsantrasyonundan daha yüksek dozlarda uygulanan NEU uygulamasının göz uyanmasını geciktirdiği belirlenmiştir. % 0.4 konsantrasyonundaki NEU uygulamasının ise tüm çeşitler için yarı letal olduğu saptanırken Rkatsiteli çeşidinin Saperavi çeşidinden daha hızlı mutasyona uğradığı bildirilmiştir. Kuliev (1991), kolhisinin tetraploid bitki eldesinde kullanımı için Malakhati çeşidinin çimlenen tohumlarını 24, 48 ve 72 saat süreyle % konsantrasyonlardaki sıvı kolhisin çözeltisinde bekletmiş ve sonuçta elde edilen 4000 çöğür içinden 280 tanesinde morfolojik olarak değişmiş formlar elde etmiştir. Araştırıcı, bu elde edilen tetraploidlerin karakterizasyonunu da gerçekleştirmiş ve elde edilen bu mutantların bazılarında, çiçek yapılarının değiştiğini görmüştür. 10

32 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hatice BİLİR EKBİÇ Sonrasında elde edilen bu tetraploid bitkiler diploid ve diğer tetraploidlerle melezlenmiş ve 50 adet ümitvar hibrit elde edilmiştir. Luo ve ark. (1995), Hamburg Misketi çeşidinin tetraploid mutantlarını elde etmek amacıyla sürgün uçlarını % 0.2 dozundaki kolhisin çözeltisinde 45 gün süreyle tutmuşlardır. Araştırıcılar uygulamanın etkinliğini belirlemek amacıyla yaptıkları kromozomal incelemelerde kromozom sayısını 2n=4x=76 olarak belirlemişlerdir. Elde edilen tetraploidlerin özellikleri 3 generasyon boyunca değişmeden kalmış; tane renk ve kalitesinde değişim gözlenmezken tane iriliğinde artış saptanmıştır. Sarı ve Abak (1996), karpuzda yaptıkları araştırmalarında elde ettikleri haploid bitkilere in vitro koşullarda dört farklı sürede (1, 2, 4 ve 6 saat) ve 2 farklı dozda (% 0.5 ve % 1) kolhisin uygulaması yapmışlardır. Denemelerinde Sugar Baby, Halep Karası ve Crimson Sweet çeşitlerinin 3-4 haftalık mikro çeliklerini kullanmışlardır. % 0.5 dozundaki kolhisin uygulanan bitkilerin % 64 ü yaşamış ve % 56 sı gelişerek yeni bir bitki meydana getirmiştir. Kolhisinin % 1 dozundaki uygulamasında ise yaşama ve gelişme oranı % 40 olarak belirlenmiştir. Araştırmada bitki ölümlerine en fazla 6 saat uygulamasında rastlanmıştır. Çalışmada in vitro mikro çeliklerin % 0.5 lik kolhisin çözeltisinde 4 saat veya % 1 lik kolhisin çözeltisinde 2 saat tutulmasının haploid bitkilerden dihaploid elde edilmesi açısından en uygun olduğu belirlenmiştir. Araştırmada daha yüksek doz ve sürelerin bitkilerin kuruyarak ölmesine neden olduğu belirtilirken; düşük doz ve daha kısa sürelerin ise bitkilerin diploidleştirilmesi için yeterli olmadığı bildirilmiştir. Luo ve ark. (1997), Hamburg Misketi çeşidinde sürgün uçların 45 gün süreyle % 0.2 dozundaki kolhisin çözeltisinde tutulmasıyla elde edilen autotetraploid (2n=4x=76) asmalarda yaptıkları gözlemlerde salkımların diploid olanlarına göre % 63 daha iri olduğu ve 10 gün kadar daha erken olgunlaştığını belirlemişlerdir. Kalite özellikleri açısından ise çoğu özellik bakımından diploid salkımlarla benzerlik gösterdiğini ancak daha yoğun aromaya sahip olduğunu saptamışlardır. Araştırıcılar, elde edilen autotetraploid üzüm çeşitlerinin ticari olarak da kullanıldığını bildirmişlerdir. Notsuka ve ark. (2000), 29 diploid, 3 triploid ve 1 tetraploid üzüm tipinde in vitro kromozom katlaması amacıyla yetiştirilen mikro çelikleri kullanmışlardır. 11