Elektrospray İyonizasyon Kütle Spektrometrisi

Transkript

1 Hibrit Enstrumanlar Geleneksel MALDI-TOF kütle spektrometreleri, ayrıca, bir peptitin amino asitlerine ayrılması gibi fragmentasyon özellikleri de sağlayabilir. Bu ayrıca postsource decay yöntemi ile de yapılabilir. Fakat, fragmentlerine ayrılacak olan peptidin kütlesinin seçimi, yaklaşımın hassasiyeti ve MS/MS spektranın kalitesi, MS/MS spektranın rutin ve hızlı meydana getirilmesi için PSD nin kullanımını zor hale getirmektedir. Son zamanlarda, MALDI iynizasyonuna dayanan, yeni bir takım MS/MS yetenekli kütle spektrometreleri geliştirildi. Bu aletler MALDI iyonizasyon teknikleri ile çarpışmaindüklenmiş ayrışma ile iyonların fragmentlerine ayrılması tekniklerini birleştirir. Örneğin, son yıllarda geliştirilen Sciex firmasına ait MALDI-Pulsar şekil 1.10 da gösterilmiştir. Bu alet, isminden de anlaşılabileceği gibi, bir set dört uç ile takip edilen bir MALDI iyonizasyon ara yüzeyi ve bir çarpışma hücresi içermektedir. Birinci dört uçlu, iyon rehberi olarak kullanılır. Bunu yine bir iyon rehberi, bir başlangıç tarayıcısı veya ana iyon seçici olarak kullanılan ikinci bir dört uçlu takip eder. İlk dört uçluyu, çarpışma-indüklenmiş ayrışma ile iyonların fragmentlerine ayrılmasında kullanılabilen bir çarpışma hücresi takip eder. Çarpışma hücresinden sonra 45 lik açı ile bir çarpışma ızgarası yerleşmiştir ve bu ızgara iyonların yönünü bir reflektron ile donatılmış bir TOF kütle analizatörüne doğru çevirir. MALDI plakasından iyonların meydana gelmesi için bir çarpışma lazeri kulanılmasına rağmen, bu çarpışma lazeri gözlenen iyonların kütlelerinin doğrulanması ve zamanlamasının yapılması için kullanılmamaktadır. Bu dizaynda, örneğin iyonizasyonu, iyonların TOF tüplerine hızlandırılmasından ayrıdır. Ayrıca, birinci dört uçluda iyonların kinetik enerjisinin dağılmasını önleyen önemli bir soğutma bulunmaktadır. Böylece, plakaların geometrisi aletin kütle doğruluğunu etkilemez. Bu durum, plaka geometrisi ile ilgili büyük dikkat gerektiren geleneksel MALDI-TOF a göre önemli bir fark yaratır. Bu durum, dahili veya kapalı harici kalibrantların MALDI-Pulsar sisteminin kütle doğruluğunu devam ettirmek için gerekli olmadığı anlamına gelmektedir. Bu ayrıca tamamen farklı plaka dizaynlarının yapılabileceği anlamına gelmektedir.

2 Pulsar ayrıca, peptit seçimine ve çarpışma hücresinde çarpışma-indüklenmiş ayrışma ile etkili fragmentasyona da izin verir. Çarpışma-indüklenmiş ayrışma fragmentasyon özelliklerinin oluşturulması için, PSD den daha güvenilirdir. MALDI iyonizasyonu genelde +1 değerlikli peptitler sağlar. +1 yüklü iyonların fragmentasyonu, +2 ve +3 yüklü iyonlar için genelde elde edilenden daha düşük kalitede fragmentasyon örneği oluşturur. Sonuç olarak, bu hibrit yaklaşım, etkili fragmentasyon modeli ile, geleneksel MALDI-TOF a göre önemli avantajlar sunar. Ayrıca örneklerin hızlı görüntülenmesi ile de ESI-MS/MS yöntemine üstünlük sağlar. Elektrospray İyonizasyon Kütle Spektrometrisi Elektrospray iyonizasyonu, ayrıca, protein ve peptit karışımlarını kütle spektrometrisine sunmak için çok popüler bir yaklaşımdır. Tipik olarak, ESI, üçlü bir dört uçlu ile bir iyon tuzağının birleşmesinden veya bir dört uçlu-tof kütle spektrometrisi hibritinden oluşmaktadır. ESI çoğunlukla popülerdir, çünkü ESI, kütle spektrometrisi ile atmosferik basınç arasında doğrudan bir arayüzey sağlar. ESI, ayrıca HPLC, sıvı kromatografisi (LC) ve kapiller zone elektroforezi (CZE) gibi ayırma teknikleri ile de kolaylıkla birleştirilebilir veya örneklerin uzun süre demlenmesi için kullanılabilir. MALDI-Pulsar ın tanıtımına kadar, ESI temelli kütle spektrometreleri, MS/MS spektralarının meydana getirilmesi için varolan tek yaklaşımdı. Ayrıca, ESI, daha zengin bir MS/MS spektra sağlayan, daha fazla çeşitli yüklenmiş iyonlar sağlar. Prensip: Elektrospray iyonizasyonu, atmosferik basınç altında analitlerin, sıvı fazdan gaz fazına geçişine izin verir. Genel olarak, iyonizasyon işlemi, kütle spektrometrisinin girişi ile küçük bir tüpün ucu arasında elektriksel alan uygulanarak başarılır. Elektriksel alan, yüklü sıvıyı ucun sonunda bir koni oluşturması için zorlar. TAYLOR konisi adı verilen bu koni, yük/yüzey oranını azaltır. Koninin ucunda damlacıklar oluşur ve kütle spektrometresinin girişine doğru taşınır. Damlacıklar oluştuktan sonra ne olduğunun ve analitlerin gaz fazına geçişinin nasıl başarıldığının açıklanması için farklı teoriler ileri sürüldü. En popüler açıklama serbest bırakılan damlacıklar çözücü buharlaşmasının tekrarlayan sürecine girerler, böylece damlacıklar üzerlerindeki yük yoğunluğunu azaltmak amacıyla daha küçük damlacıklara ayrılabilir. Bu, çözücü kaybolana kadar, azalan boyutlarda çok sayıda damlacığın oluşmasına neden olur. Böylece analitler gaz fazında kalır. Ayrıca,

3 damlacıklar azalırken, damlacıklardaki ph düşer ve analitlerin protonlanmasını kolaylaştırır. Kütle Spektrometrisi ve Bilgi: ESI nın en önemli avantajı, kolaylıkla ayırma teknikleri ile birleştirilebilir olmasıdır. Bu avantaj, elektrospray kütle spektrometrisi ile birleştirilmiş ayırma teknikleri üzerine kurulu pek çok yöntemin geliştirilmesi ile yıllar boyunca örneklendirilmiştir. Uygulamaların çeşitliliği, ayırma teknikleri ve ESI den yararlanan kütle spektrometreleri karıştırılarak bu alanda yenilikler olarak sunulabilir. O yüzden, önümüzdeki birkaç bölümde biz, kendi sınırlamaları ile birlikte farklı kütle spektrometrelerini, özgül olarak proteomik için kullanılan farklı ayırma tekniklerini ve tandem kütle spekrometresinin oluşumunu tanıtacağız. Proteomikte Elektrospray İyonizasyondan Yararlanan Kütle Çözümleyicileri Geçtiğimiz 5 yıl boyunca çok sayıda ticari kütle spektrometreleri oldu. Bu durum, biyoteknoloji ve ilaç sektöründen etkilenen daha iyi ve daha yeni kütle spektrometrelerine olan talepten kaynaklanmaktadır. Kütle spektrometrelerinin sayısı ve onların proteomikte uygulanmasındaki karışıklığın artmasına rağmen, hala onların fonksiyonu, avantajları ve sınırlılıkları hakkında bir değerlendirme yapmak mümkündür. Üçlü Dörtuçlu Kütle Spektrometresi: Proteomik çalışmalarında kullanılan ilk kütle analizötörü üçlü dörtuçlu kütle spektrometresidir. Bir dörtuçlu kütle analizötörü eşit aralıklarla yerleştirilmiş 4 tane çubuk içerir. Bu çubuklar bir silindirin yüzeyinde bulunmaktadır. Mathieu eşitliği, bir elektriksel alanda yüklü bir molekülün hareketini tanımlar. Bu eşitlik ayrıca, üçlü dörtuçlu kütle spektrometresindeki yüklü moleküllerin hareketini tanımlamak için de kullanılabilir. Elektriksel alanlar sabit (doğrudan akım(dc)) veya değişken ( değişen akım(ac)) olabilir. Mathieu eşitliği DC ve AC alanlarını hesaba katar. Dörtuçlunun 3 fonksiyon için kullanılabileceği kombinasyonlar mümkündür. Bir DC ile radyo frekansı (RF) potansiyelinin kombinasyonu, özgül bir m/z oranını iletmek için, dörtuçluyu bir kütle filtresine çevirir. RF-tek şeklinin uygulanması dörtuçluyu bir iyon rehberi olarak atar. DC-tek şeklinin uygulanması ise dörtuçluyu bir mercek elementine çevirir. Her kütle için, RF genişliği, frekans ve Dc için bir bölge sabiti vardır. Böylece aletin çözünürlüğü ve iyon

4 transmisyonu (hassasiyeti) çok yakından ilgilidir. Çözünürlüğün artması transfer edilen iyonların sayısını düşürür. Dörtuçlunun çubuklarının şeklinin değiştirilmesi elektriksel alanı etkiler ve ayrıca çözünürlüğü düzeltebilir. Kütle filtresi şekli ve RF-tek şekli, dörtuçlunun en yaygın uygulamalarıdır. Ayrıca, pek çok üçlü dörtuçlular silindirik çubuklar kullanılarak basitçe üretilmektedir. Yakın zamanlarda, hiberbolik çubukların üretilmesi, düzgün çözünürlüğe izin vermiştir ve bu TSQ-kuantum (Therme-Finnigan) da açıklanmıştır: D 2 x/dt 2 +[a+bf (t)]x = 0 Bu eşitlikte α ve β sabit sayılardır ve f(t) zamanın sinusoidal fonksiyonudur. Bu eşitlik Mathieu eşitliği olarak adlandırılır. Bir dörtuçlu kütle analizötöründe sadece iki eksen yönü alan tarafından etkilenir. Üçlü dörtuçlu kütle spektrometresi, dedektöre doğru düz bir şekilde yerleşmiş birbirini takip eden 3 takım dörtuçlu içerir. Birinci ve üçüncü dörtuçluların fonksiyonu kütle filtresi gibi veya iyon rehberleri gibidir. İkinci dörtuçlu tipik olarak RF-tek şeklinde (örneğin iyon rehberi) işler ve gazın tanıtımına izin verecek şekilde değiştirilmiştir. İkinci dörtuçlu yüklü moleküllerin çarpışma-etkili ayrıştırılması için kullanılır. Dörtuçlu (q 0 ), çarpışma hücresi (q 1 ) ve dörtuçlu (q 2 ) kombinasyonu çeşitli deneylerin gerçekleştirilmesine imkan tanır. Üçlü dörtuçlu kütle spektrometresi ile çok sayıda deney yapılabilmesine rağmen, peptit tanımlanması için sadece 2 seri deney gerçekleştirilebilir. İlk deney, q 2 (DC ve RF) üzerindeki m/z oranını tararken, RF-tek modunda q 0 ve q 1 in çalıştırılmasını içerir. Bu şekilde,q2 sürekli m/z oranını tararken, q0 ve q1 pozitif yüklenmiş analitlerin geçmesine izin verir. Böylece proteolitik bir parçalamada bulunan pozitif yüklü iyonlar için bir MS spectra (m/z ye karşı sinyal) meydana getirilir. MS/MS olarak adlandırılan, ikinci takım deneyler, oluşan fragmentlerin ayrılması ile takip edilen bir iyon seçimi ve fragmentlemeyi içerir. Bu, geçmesi için seçilen iyonun çevresinde sadece dar bir m/z penceresine izin vermek için, q0 ın kütle filtresi olarak kullanılması ile başarılır. Merceklere uygulanan olasılıklar, q1 e giren elektronlara artan kinetik enerjinin sağlanması için değiştirilirken, az miktarda nötral gaz daha sonra q1 e eklenir. Küçük gaz molekülleri ile iyonlar ile çarpışır ve çarpışma etkili

5 ayrılma ile fragmentlerine ayrılır. Meydana gelen iyonlar daha sonra q2 ye gönderirlir. Sonuç, seçilen iyon fragmentasyon özelliklerini içeren MS/MS spektrumudur. Her iki deneyin (MS ve MS/MS) kombinasyonu peptitlerin belirlenmesine, seçilmesine ve fragmentlere ayrılmasına izin verir. Tiptik olarak, üçlü dörtuçlu kütle spektrometresi manuel olarak veya otomatik olarak MS ve MS/MS elde etme boyunca dönüşüm halindedir. Üçlü dörtuçlu kütle spektrometresinin proteomikte uygulanması, iyon tuzağı kütle spektrometresi ve hibrit kütle spektrometresi gibi daha hassas yöntemlerin ortaya çıkması ile yer değiştirmiştir. Çarpışma etkili ayrışma ile birlikte üçlü dörtuçlu kütle spektrometresinin avantajı, öncül iyonların etkili bir şekilde ürün iyonlarına çevrilmesidir. Üçlü dörtuçlu kütle spektrometresinin dezavantajları, düşük çözünürlüklü olması, kütle ayrımı (örneğin kütleye bağlı pik yüksekliği), dar pencere ve peptitlerin etkili ayrılması için çarpışma enerjisine bağlı yüksek kütle bağımlılığıdır. Genel olarak, MS düzeninde meydana getirilen bilgi, veritabanı erişimlerinde kullanmak için çok düşük çözünürlüktedir. Ayrıca, veri tabanı erişimi başarılamadığı zaman, proteinlerin yeterli de novo sekanslamasına izin verecek kütle doğruluğu genelde çok düşüktür. İyon Tuzağı Kütle Spektrometresi: Proteomik çalışmaları için tanıtılan ikinci analizötör, iyon tuzağı kütle spektrometresidir. İyon tuzağı kütle spektrometresi, tuzakta bulunan elektriksel alanın şekli ile tanımlanan bir boşlukta bulunan iyonların birikmesi için elektrotların kombinasyonundan faydalanır. Üçlü dörtuçlu kütle spektrometresine benzer olarak, iyon tuzağı kütle spektrometresi Mathieu eşitliğini takip eder. Elektrotların şekli ve elektriksel alanın tanımlanması sebebi ile tuzak üzerinde elde edilen çözünürlük geleneksel dörtuçlu aletler üzerinde elde edilenden daha yüksek olabilir. Bütün bir iyon tuzağı kütle spektrometresi şekil 1.12 de gösterilmiştir. İyon tuzağı kütle spektrometresi, bir kevgir ile takip edilen ısıtılmış paslanmaz çelik bir kapiller, bir iyon rehberi, iyon tuzağı ve bir dedektör içerir. Tüm bu parçalar vakum altında bulunur. İyon rehberleri, ikili fonksiyona sahiptir; iyon tuzağı boyunca iyonları yönlendirmek ve tuzağın içine iyonların girişini sağlamak. Tuzakta bulunan iyonların sayısı, kritiktir ve kontrol edilmeye ihtiyaç duyar. Diğer taraftan, aletin performasının bozulmasına neden olan, boşluk yüklemesi (space charging)

6 olarak adlandırılan olay meydana gelebilir. İyon optiği iyonların tuzağa verilmesinin kontrolü için kullanılır. Optiklere uygulanan polaritenin tersine çevrilmesi, iyonları yollarından ayırır ve iyonların tuzağa girmesini önler. Gerçekte, bir iyon tuzağından tarama en azından iki deney içerir. Birinci deneyde, iyonun kısa bir patlaması, tuzağa enjekte edilir ve sonra detektöre fırlatılır. Dedektör tarafından elde edilen sinyal, boşluk yüklemesinden kaçnılabilecek maksimum enjeksiyon zamanının otomatik olarak hesaplanmasında kullanılır. Daha sonra, hesaplanan enjeksiyon zamanı için, iyon optikleri iyonların tuzağa enjekte edilmesine açılır. Tuzağa enjekte edilen iyonlar durağan değildir fakat bir boomerang şekline benzeyen bir orbitale sahiptir. İyonların m/z oranına bağlı olarak, orbit tuzakta daha az veya daha fazla boşluk işgal edecektir. Yeterli iyon biriktiğinde, halka elektroda uygulanan RF genişliği değiştirilerek, iyonlar sıralı olarak tuzaktan fırlatılır. Bu, iyonları tuzağın merkezinde ileriye fırlatarak, özgül iyonların orbitallerinde dengesizlikler oluşturur. En sonunda da detektöre doğru fırlatma noktası çizer. Yüksek m/z iyonları yüksek RF genişliği ihtiyaç duyarken, düşük m/z iyonları daha düşük bir RF genişliğine fırlatılır. Tipik olarak, RF genişliği iyi tanımlanmış analitler kullanılarak kalibre edilir. İyon fırlatılması ve iyon fragmentasyonu, rezonans uyarımı ile başarılabilir. Bu yaklaşım, iyonun eksenel kinetik enerjisini arttırmak ve orbitin eksenel boyutunu arttırmak için, iyonların orbitlerinde bir rezonans efektinin oluşturulması ile başarılabilir. Rezonans uyarımı küçük bir DC voltajının sonuç elektrotlarına uygulanması, aynı zamanda halka elektroda bir RF in uygulanması ile başarılabilir. Bu seçilmiş iyonların kinetik enerjisinde toplu bir artışa neden olur, böylece kararsız orbit ve fırlatmaya sebep olur. Ayrıca, artan kinetik enerji, tuzağa az miktarda inert gazın verilmesi ile seçilen iyonları fragmentlerine ayırmak üzere yönlendirilir. İyon tuzağı kütle spektrometresinin MS düzeninde çalışması, iyonların zamanlı enjeksiyonunu takiben otomatik kazanç kontrolü için hızlı bir tarama ve en sonunda iyonların tuzaktan başarılı bir şekilde fırlatılması için RF akımının taranmasını içerir. En son sonuç, daha sonra kalibrasyon ile m/z e çevrilebilecek olan alt eksenelde RF genişliği ile birlikte bir MS spektrumudur. İyon tuzağı kütle spektrometresinin MS/MS düzeninde çalışması, otomatik kazanç kontrolü için hızlı bir enjeksiyon/fırlatma, küçük gaz molekülerinin varlığında seçilen

7 iyonun bir rezonans uyarımını takiben, iyonların zamanlı enjeksiyonu ve istenmeyen iyonların fırlatılması (önceden seçilmiş bir kütle penceresi hariç) ve sonunda tuzaktan fragmentlere ayrılmış iyonların başarılı bir şekilde fırlatılması için RF akımının taranmasını içerir. En son sonuç bir MS/MS spektrumudur. İyonların fragmentasyonu çarpışma etkili ayrışma ile elde edilmesine rağmen MS/MS spektrumunun kalitesi, bir üçlü dörtuçlu kütle spektrometresinden farklıdır. Bu, sadece seçilen iyonların RF e ve rezonans uyarımına duyarlı olması gerçeği ile açıklanabilir. Bu sayede, bir fragmentasyon meydana geldiğinde, sonuç fragmentleri farklı m/z oranlarına sahiptir ve RF/rezonans uyarımına görünmezdir. Bu, üçlü dörtuçlular için geçerli değildir, çünkü meydana gelen tüm yüklü fragmentler hala hızlanan voltaja maruz kalır ve çarpışma etkili ayrışmaya geçmek için gerekli yeterli kinetik enerjiyi kazanabilirler. İyon tuzağı kütle spektrometresi, özellikle otomasyon, hassasiyet ve fiyat düzeyi bakımından protein uygulamalarında geniş oranda kabul görür. MS düzeninde elde edilen bilgi, sadece peptit kütleleri üzerine kurulu protein tanımlaması için yetersizdir. Fakat, MS/MS spektradan elde edilen bilgi, genelde veritabanı erişimi ile proteinlerin tanımlanması için yeterlidir. Ayrıca peptitlerin de novo sekaslaması, düşük çözünürlük ve MS/MS düzeninde daha az kütle kesimi sebepleri ile iyon tuzağı kütle spektrometresinde zordur. Yakın zamanlarda, yeni linear tarzda iyon tuzağı kütle spektrometreleri tanımlanmıştır. Bunlar, geleneksel tuzaklara göre, daha iyi hassasiyet ve çözünürlük gibi daha geniş dinamik aralığa izin veren, daha geniş bir tuzak boşluğu sunar. Ayrıca, bu aletlerin bazıları, tuzak olarak veya üçlü dörtuçlu kütle spektrometresi (QTrap from MDS-Sciex) olarak çalıştırılabilir. İyon Hızlandırıcı Kütle Spektrometresi: Üçüncü analizötör iyon hızlandırıcı Fourier değişimi kütle spektrometresidir (Comisarow and Marshall, 1974). En basit düzeyde, bu analizötör bir iyon tuzağı kütle spektrometresidir. Tipik olarak, bir iyon rehberi ve sonunda da süper iletken bir mıknatıs içinde yer alan bir Fourier değişim hücresi ile takip edilen bir iyon tuzağı içerir. İyon tuzağı kütle spektrometresinde olduğu gibi, iyon rehberinin amacı iyonları odaklamak ve onları Fourier değişim hücresine taşımaktır. Bazı düzenlerde, iyon rehberinden ayrıca iyonların biriktirilmesi ve seçilmesinin gerçekleştirilmesinde de yararlanılır. Bir fragmentlenmiş dörtuçlunun

8 onları tuzağa atmadan önce kullanılması buna örnek olarak verilebilir. Süper iletken mıknatısı kullanmanın amacı hücrenin tuzak bölgesinde tek bir manyetik alan sağlamaktır. Hücre kendisi, birbirine bakan iki dedektör elektrottan oluşan bir kutu, birbirine bakan başka bir takım RF elektrodu ve tuzak plakaları içeren üçüncü bir set oluşturur. Hızlandırıcıda, iyonlar, tuzağa ilerlemeden önce, süper iletken mıknatıs tarafından oluşturulan önemli halka alanlardan geçmek zorundadır. Fourier değişim hücresine giren iyonlar manyetik alan ve tuzak plakalar tarafından yakalanır. Ayrıca, tuzakta iyonlar sadece halkasal orbitallere sınırlanacaktır. Özgül bir kütle ve yüke sahip olan her iyonun farklı bir hızlandırıcı frekansı vardır ve bu aşağıdaki eşitlik ile tanımlanır: w = βzm -1 Bu eşitlikte, w hızlandırıcı frekansıdır, birimi saniyedeki radyandır. β, manyetik alan kuvvetidir, birimi tesladır. Z, yüktür. M ise iyonun kütlesidir. Bu eşitlik sadece iyonlar orbitlerde olduğu zaman geçerlidir. Fakat iyonlar kendiliğinden orbitlere geçmez. Hücrelerin karşılıklı elektrotlarına, iyonların hızlandırıcı frekansına karşılık gelen bir salınımlı elektriksel alan uygulanması ile hızlandırıcı bir rezonans indüklenebilir. Bu hızlandırıcı rezonans iyonların yükselen halkasal bir orbitale gitmesine neden olur. Kısa bir süre sonra elektriksel alan kapanır ve iyonlar m/z oranları ve manyetik alan tarafından belirlenen kararlı bir orbite ulaşır. Kararlılaşma ve farklı halkasal orbitlerin çözünürlüğü, süper iletken bir mıknatıs tarafından oluşturulan çok homojen bir manyetik alana ihtiyaç duyar. Tipik olarak, hızlandırıcı rezonans, sinüs dalga sinyal sağlayıcısı tarafından sağlanır. Farklı m/z oranlarına sahip iyonlar farklı rezonans frekanslarına sahiptir ve bu iyonlar sadece elektrotlara doğru rezonans frekansı verildiğinde hızlanacaktır. Orbitlerdeki iyonlar elektrotlar ile geçilir ve imaj akım adı verilen, elektrotta küçük fakat saptanabilir bir akıma neden olurlar. Hareketin sonucu iyon orbitlerinin frekansı ile birlikte alternatif bir akımdır. Ayrıca, imaj akımının genişliği orbitlerdeki iyonların sayısına orantılıdır. Küçük AC sinyalini daha büyük ve kolay sinyale çevirmek için bir amplifikasyon sistemi kullanılır.

9 Gerçekte, bir zamanda sadece bir iyon yakalanıp tespit edilse idi, bu diğerlerine göre faydasız bir yaklaşım olacaktı. İyon hızlandırıcı düzenin başlangıcında, iyonlar bireysel olarak tespit ediliyordu fakat bu, tüm bir MS taraması için 20 dakikayı alacaktı. Eğer tüm iyonlar kendi orbitlerine hızlandırılabilseydi, hepsi m/z oranlarına bağlı bir rezonans frekansına sahip olacaktı. O yüzden, indüklenen akım, kendi frekanslarındaki iyonlar tarafından indüklenen tüm akımların bir bileşimi olacaktı. Açıkça, bu, bileşimden her bir sinyali ayırmak için Fourier dönüşüm analizi tarafından ele alınabilen, bir sinyal süreci problemidir. Bugün, Fourier dönüşüm kütle spektrometresi (FTMS) spektraları hızla tüm iyonları hızlandırmak için RF akımı alanları ile birlikte tüm iyonları aktive ederek gerçekleştirilir. Geçici imaj akımı (m/z oranının oranının çokluğuna bağlı olarak) birikir ve MS spektrumu Fourier dönüşümü ile yeniden düzenlenir. FTMS aleti, çözünürlük ve hassasiyete göre temel seçim olmasına rağmen, proteomikte henüz geniş bir kabul görmemiştir. Geçmişte bir çok hücre iyon ışınının tanımlanmış bir fraksiyonunu yakalamak üzere dizayn edilmiştir. Bu hücrenin dinamik aralığının sınırlandığı anlamına gelmektedir. Hızlandırıcıdan önce fragmentlenmiş dörtuçlular kullanılarak iyonların enjeksiyonu ile ve iyonların yakalanması ile, iyon ışını içindeki iyon yoğunluğunu arttırmak için metodlar geliştirilmiştir. Tekrar başa çıkılması gereken, boşluk yüklenmesinden kaçınırken saptama için yeterli iyona sahip olmaktır. Bir çok gerçek örnekte bu değer ppm seviyesinde olmalıdır. FTMS aletlerinin fiyatı ve sağlamlığı önemli konulardır. Fakat MS düzeninde elde edilen bilgi, yalnızca gerçek peptit kütleleri üzerine kurulu protein tanımlaması için genellikle yeterlidir. MS/MS düzeninden elde edilen bilgi veritabanı erişimleri veya proteinlerin de novo sekanslaması için kullanılabilir. Fakat, tuzakta çarpışma etkili ayrışma ile MS/MS fragmentlerinin oluşumu FTMS de daha yavaştır ve bu durum FTMS yi hızlı analizlerin kullanımında imkansız kılar. Şimdiye kadar, iyonların yüzeysel seçimi ve fragmentasyonunu birleştiren hibrit enstrumanlar geliştirildi. Örneğin, bir FTMS ile birleştirilen bir hibrit linear iyon tuzağı, Thermo-Finnigan, geliştirilmiştir. Bu yaklaşımın amacı, hızlı fragmentasyon ve peptitlerin analizidir. Linear tuzakta fragmentasyon gerçekleşirken, FTMS deki uzun iyon tuzağı soğumasını beklemeye ihtiyaç yoktur. Diğer tip hibrit FTMS ler, IonSpec and Bruker tarafından tanıtılmıştır.

10 Hibrit Kütle Spektrometreleri: Diğer bir tip analizötör hibrit dörtuçlu TOF kütle spektrometresidir. Puslar kütle spektrometresi Sciex e ait ve Micromass e ait Qtof kütle spektrometresi hibrit enstrumanlara iki örnektir. ESI dan yararlanan Pulsar, daha önce MALDI-Pulsar olarak tanımlananla aynıdır. ESI dan yararlanan Pulsar, MALDI kaynağı yerine ESI kaynağı kullanır. Pulsar aletinin tanıtımı için lütfen MALDI kısmına bakınız. ESI-MS/MS e Peptit Karışımlarının Sunulması İçin Teknikler MALDI-TOF kütle spektrometresi, proteinlerin tanımlanması için kesinlikle highthroughput bir tasarımdır. Peki o zaman niye kullanışsız lower-throughput ESI yaklaşımlarına itimat ediyoruz? ESI çarpışma etkili ayrışma ile etkili bir şekilde fragmentlere ayrılan çoklu yüklenmiş peptitler sağlar. MALDI-TOF, çarpışma etkili ayrışma mümkün olduğu zaman bile, fragmentlenmesi daha zor olan tekli yüklenmiş peptitler sağlar. Ayrıca, ESI demleme ve konsantrasyon/ayırma teknikleri ile kolaylıkla birleştirilebilir. Bu nedenle, protein kesiminin etkili analizi için demleme ve ayırma teknikleri üzerine, geçtiğimiz yıllarda çok çabalar harcandı. Bu teknikler, hassasiyet, kontaminasyon, MS/MS spektranın kalitesi ve üretilen iş açısından farklılıklar göstermektedir. Önümüzdeki birkaç bölümde örnek hazırlanmasına farklı yaklaşımlardan ve onların dezavantajlarından ve avantajlarından bahsedeceğiz. Sürekli-Infüzyon ESI-MS/MS: Geçtiğimiz 10 yıl içinde düşük seviyedeki protein parçalarının analizinde ESI uyumlu olmuştur. Geleneksel elektrospray yaklaşımlarının hacim ve akış deteksiyonunu, ayrılmış proteinlerin blotlama ve jel kesimi ile elde edilen hacmi ve konsantrasyonu ile uyumlu yapmak temel amaçtır. Parçalamanın son hacmi düşük µl seviyesinde iken, geleneksel elektrospray dengede olmak için µl/dakika akış hızı gerektirir. Bu yüzden, düşük akış hızlı elektrospray yöntemler geliştirmek yönünde çabalar artmıştır. Mikroelektrospray ( nl/dakika), nanoelectrospray (1-100 nl/dakika), ve picoelectrospray (<1 nl/dakika) yöntemleri geliştirildi. Bu yöntemlerin hepsi, püskürteçin iç ve dış çapını küçülterek, genelde akış gerekliliğinin düşürülmesini sağlarlar. Bu yeni elektrospray yaklaşımlarının ortaya çıkması, daha uzun analitik zaman pencereleri, daha iyi

11 iyonlaşma ve kütle spaktrometresine daha iyi transferi sağlayarak protein parçalarının analizini büyük oranda kolaylaştırmıştır. Özellikle, nanoelektrosprayin düşük-akış gereksinimi, bir örneğin sürekli infüzyon temeline dayanan proteinlerin tanımlanması için hızlı bir şekilde çekici hale gelmiştir (Shevchenko et al., 1996a, 1996b, 1997). 1 µl den daha az miktardaki örnek için, 30 dakikadan 2 saate kadar bir analitik zaman elde edilebilir. Bu iyi kalitede bir MS spectra elde etmek, çok sayıda iyon elde etmek ve başarılı bir şekilde onların MS/MS spektrumunu oluşturmak için, oldukça zaman bırakacaktır. Ayrıca, nanoelektrospray tekniği geliştirildiğinde, bir çok kütle spektrometresi farklı deneylerin otomatik kontrolünü sağlamıyordu (örneğin; data bağımlı deneyler), böylece peptitlerin analizi için, sık sık tekrarlanan kullanıcı hataları ortaya çıkıyordu (Shevchenko et al., 1997). Bu, kütle spektrometreleri üzerinde, operatörün MS spektrumunu oluşturmalı ve yorumlamalı, MS spektrumunundan peptitleri seçmeli, kütle spektrometresini Sürekli- Infüzyon parçalamasına çevirmeli, ve sonra her iyon için parametreleri değiştirerek, başarılı bir şekilde iyonların MS/MS spektrumunu oluşturmalıdır. En tecrübeli kullanıcı için bile bu işlem bir peptit için 5-15 dakikayı alabilir. Sürekli akış infüzyon nanoelektrosprayinde, ilgilenilen peptit karışımı 1 mm çapındaki, gittikçe daralan, cam iğnenin içine pipet ile verilir. Ayrıca, iğneler, yüksek voltajın uygulandığı, altın gibi materyallerle kaplıdır (Şekil: 1.14). İğne, kütle spektrometresinin önüne yerleştirilmiştir ve az bir basınç uygulanır. Sonra, iğnenin ucu MS in ön plakasına dokundurularak açılır, böylece 1-10 µm arasında bir iç çap ve daha büyük bir dış çapa sahip bir açık uç elde edilir. Alternatif olarak, gittikçe azalan fakat kapanmayan bir nanoelektrospray iğnesi de satın alınabilir. Peptit karışımı, daha sonra sürekli olarak, gaz basıncı yardımıyla, iğnenin sonunda dağıtılır. Nanoelektrospray iğnesinin ucuna ulaşan peptit çözeltisi düşük akış hızında (az nanolitre/dakika) kütle spektrometrisine elektrospraylenir. 1 µl örneğin analizi yaklaşık 30 dakika ile 1.5 saat arasında gerçekleştirilir. ESI-MS/MS ile Birleştirilen Ayırma: Elektrospray iyonizasyonu ayırma teknikleri ile de birleştirilebilir. Bu çoğunlukla az miktardaki örnekler için ve kontamine olmuş örnekler için tercih edilir. Ayrıca, nanoelektrospray yaklaşımı kendine özgü yetenek gereksinimleri için otomasyondan kaçınırken, ayırma teknikleri kolaylıkla

12 otomatikleştirilebilir. Ayırma teknikleri analitleri kısa ve analitik pencerelere konsantre etmenin avantajını sunar. Nanoelektrospray tüm analitleri aynı anda kütle spektrometrisine sunarken, ayırma sistemleri analitleri sonradan kütle spektrometrisine sunar; fakat, bir analit için tüm kütle spektrometrisi ölçümleri yapılırken, her analit için çok dar bir analit penceresi (tipik olarak 1-30s) vardır. Otomatik Kütle Spektrometrileri: Açıkça, geleneksel nanoelektrospreylerde yapıldığı gibi, kütle spektrometrisinin manuel olarak tetiklenmesi, ayırma teknikleri ile birlikte mümkün değildir. O nedenle, otomatik bir kütle spektrometrisinden faydalanmak bu deneylerin başarısı için gereklidir. Bir set data bağımlı özellik ortaya çıkmıştır. (1) Kütle spektrometrisi eşik veya signal-to-noise oranına bağlı başlangıç iyonlarının otomatik seçimini sağlar. (2) n inci en şiddetli iyon, kullanıcı tarafından daha önce tanımlanan fragmentasyon için seçilebilir olmalıdır. (3) İyonların statik bir dışlama (exclusion) listesi önceden tanımlanmalıdır. Statik dışlama listesi, küme (cluster), tripsin otolitik peptitler ve diğer bilinen peptitler gibi kontaminantların dışlanmasına izin verir. (4) MS/MS spektra için m numaraları oluşturulan iyonlar, MS modundaki şiddetleri eşik değerinin altına düşene kadar ve bir zaman periyodu geçene kadar dinamik dışlama listesine eklenmelidir. İyonların dinamik dışlanması, bir sonraki MS/MS spektrası için, bir sonraki en şiddetli iyonların seçilmesine izin verir. (5) Dinamik izotop dışlanması, özellikle daha yüksek çözünürlükteki aletler için, ayrıca, önemli bir seçenektir. Bu özellik, bir MS/MS spektrumunun kazanılmasını tetiklemeyen bir iyondan izotop piklerini sağlar. (6) +1 iyonları gibi yük durumlarının dışlanması, uygun olabilir, çünkü, otomatik kütle spektrometrisi tipik olarak pek bilgilendirici olmayan +1 iyonlarının MS/MS spektrumunun meydana getirilmesinden kaçınır. (7) Fragmentasyon enerjisinin otomatik olarak seçimi, peptitlerin yeterli fragmentasyonu için önemli bir olaydır. Bir çok kütle spektrometrileri, peptitleri fragmentlerine ayırmak için, çarpışma bağımlı ayrışmadan faydalanmasına rağmen, kinetik enerjinin öncül iyona atfedildiği yollar farklıdır. Üçlü dörtuçlularda ve hibrit dörtuçlu TOF kütle spektrometrilerinde, fragmentasyon özelliği, sadece sınırlı bir kinetik enerji aralığında yeterlidir. Fazla enerji, öncüllerin içten fragmentasyonunu arttırır ve iyonların çarpışma hücresine doğru zayıf iletimine sebep olur, böylece zayıf kalitede bir MS/MS spektrumu ile sonuçlanır. O yüzden, çarpışma enerjisinin otomatik olarak ayarlanması, bu kütle spektrometrileri üzerinde çok önemli bir

13 özelliktir. Fragmentasyon özelliği, yeterli enerji sağlandığı sürece, iyon kapanı ve siklotron (ivme) kütle spektrometrileri üzerindeki kinetik enerjiye daha az hasastır. O nedenle, çarpışma hücresinin otomatik olarak ayarlanması iyon kapanı ve siklotron (ivme) kütle spektrometrilerinde daha az önemlidir. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)-MS/MS: HPLC, ESI kütle spektrometrisi ile birlikte analitlerin online olarak ayrılması için seçilen bir yöntem olmuştur (LaCourse, 2000). Ters faz düzeninde, HPLC analitleri onların hidrofobikliklerine göre konsantre eder ve ayırır. Peptitleri, HPLC ile bir kütle spektrometrisine sunmak için farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu yaklaşımların hepsi, C-18 gibi materyallerden yapılan bir HPLC kolonuna yüklenen ve onun üzerinde ayrılan genel peptit çözeltilerine sahiptir. Fakat bu yaklaşımlar, akış hızı, örnek yolları, sağlamlık ve hassasiyet açısından farklılık gösterir. Geleneksel HPLC: ESI-MS ile birleştirilen geneksel microbor HPLC, pikomolden daha yüksek protein seviyelerinin tanımlanması için iyi tasarlanmış bir yaklaşımdır. (Hunt et al., 1981, 1986; Gibson and Biemann, 1984). Microbore HPLC, genellikle düşük akış hızlı HPLC sistemine yerleştirilmiş, 0.3 mm çapındaki HPLC kolonu kullanılarak gerçekleştirilir. Bu kolonlar boyunca gerçekleştirilen akış hızları, tipik olarak düşük µl/dakika dır. 10 µl den daha az örnek alma yeteneğinde olan bir otomatik örnekleyici (autosampler) ile birleşme, işlemin otomasyonunu tamamlar. O nedenle bu otomatize edilmiş sistemde, protein parçalarının sıralı tanıtımı, ayrılması ve analizi rutin olarak gerçekleştirilebilir. Mikroflow HPLC: Kütle spektrometrisi, sabit akış hızı için, konsantrasyon bağımlı bir düzenek iken HPLC bir konsantre etme tekniğidir. O nedenle, kütle spektrometrisine sunulan örneklerin konsantre edilmesinin geliştirilmesi, daha iyi hassasiyet sağlar. Sınırlı miktarda analit olduğunda, konsantrasyonu düzeltmek için iki yaklaşım ele alınabilir. Birinci yaklaşım, ayırmayı düzeltmek ve elue edilen analitin pik genişliğini düşürmektir. Bu yaklaşım mantıklı olmasına rağmen, pratik olarak hassasiyette yeterli düzeltmeyi sağlamaz. İkinci yaklaşım, kolonun akış hızını ve boyutunu azaltmaktır.

14 Örneğin bir HPLC kolonunun boyutunu 1 mm den 100 µm ye düşürmek, analitlerin konsantrasyonunu 100 kez arttırır. Bu düşük seviyedeki örnekler için çok cazip bir alternatiftir. Şunu akılda tutmak da önemlidir; HPLC teorisi enjekte edilen analitlerin hacim miktarının uygun bir şekilde düşürülmesini öngörür. Gerçekte, bu uyarıyı göz ardı etme yönünde ve düşük afinite analitlerini kaybetmek uğruna mümkün olduğunca çok hacimde örnek enjekte etme yönünde bir eğilim vardır. Çekici olmasına rağmen, düşük akışlı HPLC kolonları (<200 nl/min), geleneksel elektrosprayler ile doğrudan uyumlu değildir. Düşük akışlı HPLC ile geleneksel elektrospray arabiriminin, sheath sıvı kullanılarak, birleştirilmesine dair daha önceki girişimler başarılıydı. Fakat, onlar hassasiyetteki beklenen düzeltmeyi gerçekleştiremediler. Neyse ki, µ-hplc kolonları ile sağlanan düşük akış tekniği ile uyumlu mikroelektrospray arabirimleri geliştirildi ve bu, büyük oranda bu teknikten faydalanmayı arttırdı (Chervet et al., 1996; Yates et al., 1996). Kolonların Üretimi: Günümüzde, mikrokolonlar (150 µm iç çapında veya daha az) ticari olarak elde edilebilir; fakat, paketleme materyallerinin elde edilebilme aralığı ve bu kolonların fiyatları çoğunlukla sınırlıdır. O nedenle, hala in-house kolonlar üretmek yaygındır. Mikrokolonların üretilmesi için, iki standart teknik geliştirilmiştir. Birinci teknik, sabit bir iç çap ile birlikte capiller bir tüp içinde bir kolonun üretilmesidir. Bu dizaynda, küçük borosilikat boncuklar, boncukları tam bölenin içindeki kapiller ile vurularak, µm çapındaki kapiller tüpün sonunda kuru halde paketlenmiştir. Boncukları içeren uç, Bunsen bekinde hızlıca katılaştırılır. Bu küçük kapiller tüpün sonunda gözenek kızarıklıklarının oluşmasıyla sonuçlanır. Boncukları uygun bir şekilde katılaştırmak pratiklik gerektirir. Kolon için gerekli paketleme materyali bulamaç formundaki kapillerin diğer ucunda basınç kuvvetine uğrar. Bu, 100 psi ye kadar çıkan basınca sahip bombadan faydalanmayı gerektirir. Alternatif olarak, geniş hacimde bir birliğe kurulabilir ve bir HPLC pompası kullanılarak itilebilir. Kolon paketlemesi için gerekli süre gerçekleştirilene kadar, basınç çalıştırılır, daha sonra basınç yavaşça atmosferik basınca düşürülür. Basınç ayrıca, bir sonifikasyon banyosu içine paketlenmiş olan kolonun bir kısmının yerleştirilmesine yardım eder. Sonuç bir frit ile sonlanan paketlenmiş bir capiller (tipik olarak 5-10 cm) kolondur. Bu

15 yaklaşımın dezavantajı, bir mikroelektrospray iğnesi içememesidir. Tipik olarak, kolonun fritted ucu, bir mikro-esi iğnesine bağlı düşük ölü hacim birliğinin içine yerleşmiştir. Bant genişliğini azaltmak için, elektrospray meydana getirmek için, kapiller kolondan daha küçük bir iç çapa ve uçta azalan çapa sahip sahip kısa bir iğneden faydalanılır (Şekil 1.15). Kolon doğrudan, paketlenmiş kapiler yaklaşımın ölü hacim çıkışından kaçınmak için, mikroelektrospray iğnesi içinde oluşturulabilir. Bu, bazı türlerin bir fritini, bir mikroelektrospray iğnesinin ucunda üretilmiş olmasını gerektirir. Tipik olarak, µm çapındaki, 5-15 µm ile sonlanan bir iğne, kolonların üretimi için kullanılır. Bu iğneler, bir lazer pipet çekici kullanılarak gerdirilmiş kapiller bir tüpten yapılır. Sonra yeniden, iğne, ona bir ağırlık uygulanarak ve kapillerin bir bölümü ateş ile ısıtılarak, kapiller tüpü vertikal bir pozisyonda yerleştirerek, çekilebilir. İğnenin ucunda bir frit oluşturmak daha ilgi çekici olabilirken, bu her iki iğne çekme tekniğini de gerçekleştirmek sıkıcı olabilir. O nedenle en iyi alternetif, ucunda üretilmiş bir frite sahip mikroelektrospray iğneleri almak ve kolonu tercihen ters faz materyali ile paketlemektir. Paketli iğne, ayrıca nano-flow HPLC sistemine bağlı bir düşük ölü hacim birliği (low-dead-volume union) içine yerleştirilir (Şekil: 1.15) Kolonların üretimi için, daha ekzotik teknikler geliştirilmiştir (Şekil: 1.16). Özellikle, frit içermeyen kolonlar ters faz materyali içine paketlenmiştir. Bu, uzun iğnelerin çapını aşama aşama azaltarak veya farklı olarak kapiller tüpü çekerek bir isthmus yaratarak gerçekleştirilebilir (Martin et al., 2000). Bu iki metot, bir frit oluşturmadan iğnelerin paketlenmesine izin verir. Davis ve Lee (1998), 5µm ağzında bir laser-pulled microelectrospray iğnesi (150 µm iç çapnda) kullandılar ve bir parça silika kapiller [25µm i.d. 150µm outer diameter (o.d.)] ile birleştirilen iğne içine yerleştirildi. Kapillerin parçası iğne içinde mümkün olduğunca uzağa itildi ve membran frit ile desteklendi. Ters faz materyali bu fritin arkasında paketlendi. Bu yaklaşımlar, HPLC iğnesi üretimi için ilginç alternatifler olmasına rağmen, bunlar henüz yaygın uygulama görememişlerdir ve birkaç grubun kullandığı yöntemler olarak kalmıştır. Çok yakın geçmişte, kapiller tüp içinde durgun fazın doğrudan polimerizasyonu yolu ile üretilen monolitik kolonların ortya çıkışını gördük. Bu monolitik kolonlar, styrene veya divinylbenzen gibi bir polimer karışımının in situ polimerizasyonu ile elde edilir.

16 Polimerizasyon, ısısı kontrol edilen bir fırın içinde gerçekleştirilir. Monolitik kolonun avantajı, onun düşük multiple-path etkisidir. Bu etki, iyi bir sayıda teorik plaka ve iyi çözünürlükte kısa kolon yatağı sağlar. Geleneksel paketli kolonlar ile karşılaştırmalar, benzer ayırmaları göstermiştir. Monolitik kolonların diğer avantajları, geleneksel HPLC kolonlarına göre üretiminin kolay olmasıdır. Monolitik kolonların dezavantajı ise, dikkatle gerçekleştirilmesi gereken bir organik senteze gereksinim duymasıdır. O nedenle, bu yaklaşım kolonların in-house ve araştırma laboratuarları tarafından geniş üretimi için daha az uygundur.