ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Yasemin KAYA SEYHAN BARAJ GÖLÜ NDEN İZOLE EDİLEN ENTEROBACTERIACEAE GRUBU BAKTERİLERDE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİĞİ VE PLAZMİD PROFİLLERİNİN BELİRLENMESİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SEYHAN BARAJ GÖLÜ NDEN İZOLE EDİLEN ENTEROBACTERIACEAE GRUBU BAKTERİLERDE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİĞİ VE PLAZMİD PROFİLLERİNİN BELİRLENMESİ Yasemin KAYA YÜKSEK LİSANS BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez././2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza. Prof. Dr. Sadık DİNÇER DANIŞMAN İmza. Doç Dr. Hatice GÜVENMEZ ÜYE İmza Doç. Dr. Hüseyin ERTEN ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza-Mühür Bu çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: FEF2007YL6 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ SEYHAN BARAJ GÖLÜ NDEN İZOLE EDİLEN ENTEROBACTERIACEAE GRUBU BAKTERİLERDE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİĞİ VE PLAZMİD PROFİLLERİNİN BELİRLENMESİ Yasemin KAYA ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Sadık DİNÇER Yrd. Danışman Yrd. Doç. Dr. Fatih MATYAR Yıl : 2009 Sayfa: 58 Jüri : Prof. Dr. Sadık DİNÇER Doç. Dr. Hatice GÜVENMEZ Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Bu çalışmada Seyhan Baraj Gölü den izole edilen Enterobacteriaceae grubu 88 bakteri suşunun çoklu antibiyotik dirençliliği (MAR) belirlenmiştir. İzolatların plazmidleri izole edilerek her bakteriye ait plazmid profili belirlenmiştir. İzolatlardan MAR indeksi 1 olan tek bir bakteri belirlenmiş ve bu suş Escherichia coli olarak tanımlanmıştır. İzolatlardan 14 tanesinin MAR indeksinin olduğu belirlenmiştir. Plazmid izolasyonunda 40 izolatın (% 45.5) plazmid içerdiği belirlenmiştir. Antibiyotik sayılarının plazmid ile ilşkilerine bakıldığında 7 antibiyotiğe karşı dirençli olan Escherichia coli suşunda hiç plazmid DNA bandı gözlenmemiştir. Tek antibiyotiğe dirençli olan diğer bir Escherichia coli suşunda ise toplam 7 plazmid DNA bandı olduğu belirlenmiştir. Beş farklı antibiyotiğe dirençli olan yine bir diğer Escherichia coli suşunda ise 14 plazmid DNA bandı gözlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Enterobacteriaceae, Seyhan Baraj Gölü, Antibiyotik Dirençliliği, Plazmid izolasyonu, Elektroforez I

4 ABSTRACT M.Sc. THESIS ANTIBIOTIC RESISTANCES OF ENTEROBACTERIACEAE ISOLATED FROM SEYHAN DAM AND DETERMINATION OF PLASMID PROFILE Yasemin KAYA DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUE OF NATURAL APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Sadık DİNÇER Co. Supervisor Assoc. Asist. Prof. Dr. Fatih MATYAR Year : 2009 Pages: 58 Jury : Prof. Dr. Sadık DİNÇER Assist. Prof. Dr. Hatice GÜVENMEZ Assist. Prof. Dr. Hüseyin ERTEN In this study, Multiple antibiotic resistance was determined 88 Enterobacteriaceae strains which were isolated from Seyhan Dam. Plasmids of these strains were isolated and each of these strains plasmide profile was determined. MAR index of one strain was determined to be 1 and this strain was identified as Escherichia coli. MAR index of 14 strains in total 88 isolates were determined to be It was determined that 40 isolates contain plasmid in 88 total isolates. It were seen that relationship with antibiotic count and plasmid profile, Escherichia coli, which was resist to 7 antibiotic, has not any plasmid. But another strain of Escherichia coli, which was resist to 1 antibiotic, has contain total 7 plasmid bands. Moreover, the other Escherichia coli strain resist to 5 antbiotics. But it has 14 plasmid bands. Key Words: Enterobacteriaceae, Seyhan Dam, Antibiotic Resistance, Plasmid isolation, Electrophoresis. II

5 TEŞEKKÜR Çalışmalarım esnasında her türlü desteğini ve yardımını esirgemeyen, bilgi ve deneyimleriyle bana yol gösteren danışman hocam Prof. Dr. Sadık DİNÇER e ve ikinci danışmanım olan Yrd. Doç. Dr. Fatih MATYAR a teşekkürlerimi bir borç bilirim. Tezimin deney ve yazım aşamalarında benden yardımlarını esirgemeyen bütün bölüm hocalarıma teşekkür ederim. Çalışmam boyunca benden desteklerini esirgemeyen Dr. Osman GÜLNAZ a, Arş. Gör. Ayşenur KAYA ya, Uzman Biyolog Emel KARADENİZ e, Uzman Biyolog Esen BİLGİN e, Uzman Biyolog Sinem BALCI ya ve aynı laboratuarı paylaştığım bütün arkadaşlarıma teşekkür ederim. Bugüne kadar beni destekleyen, çalışmalarım boyunca maddi ve manevi desteklerini benden esirgemeyen annem Nadire UÇAK, babam Hikmet Öner UÇAK a ve değerli eşim Ömer KAYA ya teşekkürlerimi bir borç bilirim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ..I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR III İÇİNDEKİLER...IV ÇİZELGELER DİZİNİ...VI ŞEKİLLER DİZİNİ... VII 1. GİRİŞ Antibiyotikler Penisilinler Sefalosporinler Karbapenemler Tetrasiklinler Aminoglikozitler Antibiyotiklere karşı direnç gelişimi Bakteriyel Ekstra Kromozomal Genetik Elamanlar F faktörleri F Col plazmidleri (Kolisinojenik faktörleri) R plazmidleri-rtf faktörleri Staphylococcus plazmidleri Virülans plazmidleri Mikroorganizmalar Arası Genetik Madde Aktarımı Transformasyon Konjugasyon Transdüksiyon Agaroz Jel Elektroforezi Çalışmanın Amaçları ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL ve METOD IV

7 3.1. Materyal Bakteri Suşları Kullanılan Besiyerleri LB (Luria-Bertoni) Buyyon PCA Agar Kullanılan Çözeltiler Plazmid izolasyon Kiti X TBE (Tris-Borik asit-edta) Solüsyonu Agaroz jel (%1) 70 ml Örnek Yükleme (Loading Buffer) Tamponu Yürütme Tamponu 1x Stok Boyama Solüsyonu (Staining) (Ethidium Bromür) Boyayı Geri Alma Solüsyonu Metod Örnek Toplama İstasyonlarının Özellikleri Çoklu Antibiyotik Direnci (MAR) İndeksi Bakterilerden Plazmid İzolasyonu Agaroz Jelin Hazırlanması ve Örneklerin Jele Uygulanması DNA'nın Ethidium Bromid ile Boyanması BULGULAR ve TARTIŞMA Bakterilerin Antibiyotik Dirençlilik Profillerinin Çıkarılması Çoklu Antibiyotik Dirençliliği (MAR) İndeksi Plazmid Profillerinin Analizi SONUÇ ve ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Örnek toplama istasyonlarının özellikleri (Balcı, 2007) Çizelge 4.1. Bakterilerin gösterdikleri dirençlilik dağılımları (Balcı, 2007) Çizelge 4.2. Bakterilerin MAR indeksi Çizelge 4.3. Bakterilerin MAR indeksi Çizelge 4.4. Bakterilerin MAR indeksi Çizelge 4.5. Bakterilerin MAR indeksi Çizelge 4.6. Bakterilerin MAR indeksi Çizelge 4.7. Bakterilerin MAR indeksi VI

9 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Örnek toplama istasyonları Şekil 4.1. Bakterilerin agaroz jel elektroforez sonuçları Şekil 4.2. Bakterilerin agaroz jel elektroforez sonuçları Şekil 4.3. Bakteilerin agaroz jel elektroforez sonuçları Şekil 4.4. Bakterilerin agaroz jel elektroforez sonuçları Şekil 4.5. Bakterilerin agaroz jel elektroforez sonuçları Şekil 4.6. Bakterilerin agaroz jel elektroforez sonuçları Şekil 4.7. Bakterilerin agaroz jel elektroforez sonuçları Şekil 4.8. Bakterilerin agaroz jel elektroforez sonuçları VII

10 1. GİRİŞ Yasemin KAYA 1.GİRİŞ Mikroorganizmalar değişen çevre koşullarına hızla uyum sağlayabilme yeteneklerine sahip yeryüzünün en eski canlılarıdır (Demirtürk ve Demirdal, 2004). Akuatik çevrelerde bakteriler ekosistemin doğal bir parçasıdır (Robinson ve Tuovinen, 1984). Yüzey sularına fekal bakteri bulaştıran kirliliğin kaynağının bilinmemesi, tanımlanmasının güç olduğu ispatlanmıştır (Hagedorn ve ark., 1999). Kirlilik kaynağının bilinmesi su kalitesinin normal haline gelmesine yardım edebilir, su havzasına ayrılan nutrientlerin miktarını azaltabilir ve kontamine olmuş sulara maruz bırakılmasından dolayı ortaya çıkan bulaşıcı hastalıkların tehlikesi azaltılabilir (Hagedeorn ve ark., 1999). İnsanların günlük yaşam gereği harcadığı ve kullanım sularının oluşturduğu atık sular, çeşitli şekillerde yerleşim birimlerinden çevre sularına katılmaktadırlar. Bu nedenle sucul ortamlar, katılan suların içerdiği kirlilik etkenlerine bağlı olarak organik ve inorganik maddeler tarafından kirletilmektedir (Karayakar ve ark., 2004). Akuatik alan üzerinde etkili olan çevresel faktörlere göre bakterilerde meydana gelen değişiklikler, ekosistem ve insan sağlığı ile ortamın ekonomik kullanılabilirliğinde olumsuzluklara yol açar (Robinson ve Tuovinen, 1984). Atık suların herhangi bir arıtma işlemi uygulanmadan çevre sularına katılımı, içerdikleri organik maddelerin mikroorganizmalarca parçalanması sonucu çevre sularında doğal yaşam koşullarının bozulmasına neden olurken içerdikleri çeşitli toksik maddeler ve patojen mikroorganizmalar nedeniyle de insan sağlığı açısından da önemli tehlikeler oluşturur (Karayakar ve ark., 2004). Özellikle evsel atıklar, R-plazmidi taşıyan ve çoğunluğu insan barsak florasından kaynaklanan bakteriler içerir. Bu bakterilerde antibiyotiklere dirençlilik kazandıran R-plazmidleri yaygın olarak bulunduğundan, atık suların çevre sularına deşarjı, bu tip dirençli bakterilerin çevreye yayılmasına neden olmaktadır (Karayakar ve ark., 2004). Antibiyotik çağından önce izole edilip saklanan bakterilerde direnç faktörlerinin bulunmadığı ve bugün pratikte kullanılan hemen hemen tüm antibiyotiklere bu bakterilerin duyarlı oldukları kanıtlanmıştır (Doğancı, 2001) 1

11 1. GİRİŞ Yasemin KAYA Bakteriler çevresel değişikliklere çok çabuk cevap verebildiklerinden, bu yetenekleri akuatik ekosistemde köklü değişikliklere yol açabilmektedir (Giuliano, 2003). Bu özellikleri geliştirilen her yeni antibiyotiğe direnç geliştirebilmelerine de yol açmakta ve infeksiyonlarla mücadelede en önemli engel olan antibiyotiklere direnç sorunu ortaya çıkmaktadır (Vahaboğlu, 2004). Son yıllarda antibiyotiklere karşı giderek artan direnç sorunu tüm dünyayı tehdit eder hale gelmiştir (Akçam ve ark., 2004). Bugün için ise klinik önemi bulunan bakterilerde antibiyotik dirençliliği ile ilgili 100 den fazla gen bulunduğu bilinmektedir. Bir diğer yönden dirençlilik yayılabilir bir özelliktir ve oluştuktan sonra, büyük bir hızla sadece aynı tür ve cinsler içinde değil, plazmid ve transpozonlar gibi aktarılabilir genetik materyallerle diğer bakterilere de geçebilmektedir (Doğancı, 2001) Antibiyotikler İnfeksiyon etkeni olan mikroorganizmalara karşı etkin bir mücadele yapılması eski çağlardan beri tıbbın en önemli amaçlarından biri olagelmiştir (Baştürk, 2005). Tedavi amaçlı olarak doğal yollardan elde edilen bitkiler ve özütleri kullanılmakta iken bu durum 1908 de Paul Ehrlich in bazı bakteriler üzerine kesin olarak zararlı, konak hücreye ise daha az zararlı bazı kimyasal maddeleri bilimsel metodlarla araştırıp ortaya koymasına kadar sürmüştür (Baştürk, 2005). İlk defa İskoç bakteriyolog Alexander Fleming in 1929 da gözlediği ve 1940 yılında Chain ve Flarey in Penicillium notatum un salgılarından elde ettiği ve penisilin adını verdikleri ilacın birçok mikroba öldürücü etkide bulunmasının keşfedilmesi bir devrim olmuştur. İnfeksiyon hastalıklarının tedavisinde antibiyotikler son 50 yılda son derece faydalı olmuşlar ve eskiden öldürücü olduğu bilinen pek çok hastalığın tedavisi için vazgeçilmez unsurlar haline gelmişlerdir (Berzeg, 2005). Antibiyotikler, bazı bakteri ve mantar türü mikroorganizmalar tarafından üreme ortamlarında oluşturulan ve başka mikroorganizmalar için mikrobiyostatik ya da mikrobisid etki gösteren ve sağaltımda kullanılan maddelerdir (Bilgehan, 1994). 2

12 1. GİRİŞ Yasemin KAYA İkinci Dünya Savaşı sırasında savaşla ilişkili yaraların sekonder bakteriyel infeksiyonların ve pnömoni, sepsis gibi sistemik infeksiyonların tedavisinde başarıyla kullanılarak, enfeksiyonlara bağlı ölümler azaltılmıştır (Tanır ve Göl, 1999) Penisilinler Yapılarındaki etkinlikleri için esas oluşturan beta-laktam halkası nedeniyle beta-laktam antibiyotikler olarak adlandırılırlar. Bakterilerde hücre duvarı sentezini seçici olarak inhibe ederler. Penisilinler en yüksek etkiyi aktif olarak çoğalan bakteriler üzerinde gösterirler; bölünmeyen bakterilerde etkileri ya çok azdır ya da hiç yoktur. Bakterisid etkilidirler (Strohl ve ark., 2006) Sefalosporinler Cephalosporicum acremonium isimli bir mantardan elde edilen sürekli geliştirilerek antibakteriyel tedavide yaygın kullanılan antibiyotik türlerinden biridir (Öncül, 2002). Gerek yapısal gerekse işlevsel olarak penisilinlere çok yakın betalaktam antibiyotikler olup bakterisid etkilidirler (Strohl ve ark., 2006). Bakterisid etkilerini penisilinlerde olduğu gibi hücre duvar sentezinde rolü olan PBP (penisilin bağlayıcı protein) leri inhibe ederek ve otolitik enzimleri aktive ederek gösterirler (Öncül, 2002). Bunlar, bazı bakteriler tarafından üretilen beta-laktamaz enzimlerinin inaktive edici etkilerine karşı daha dayanıklıdırlar. Sefalosporinler birinci, ikinci, üçüncü ve dördüncü kuşak olarak sınıflandırılırlar (Strohl ve ark., 2006) Karbapenemler Beta laktam grubu antibiyotiklerden olan karbapenemler, bugüne kadar geliştirilen en geniş spektrumlu antibiyotiklerdir. Hem gram-pozitif hem de gramnegatif aerob ve anaerob bakterilere etkilidir. Klinik kullanımda bulunan iki üyesi 3

13 1. GİRİŞ Yasemin KAYA imipenem ve meropenemdir. Streptomyces cattleya dan (bir toprak mantarı) üretilen tienamisin bu grubun ilk etken maddesidir (Öncül, 2002) Tetrasiklinler Tetrasiklinler, aminoglikozitler ve makrolitler gibi bazı antibiyotikler, yapısal olarak memeli ribozomlarından farklı alt birimlerden oluşan bakteri ribozomlarını hedef alan etki mekanizmalarına sahiptirler. Tetrasiklinler, bakterilerde ribozomların 30S alt birimine bağlanarak bakterilerde protein sentezini inhibe ederler. Bunlar geniş spektrumlu antibiyotikler olup bakteriyostatik etki gösterirler (Strohl ve ark., 2006) Aminoglikozitler Aminoglikozitler, bakterilerde protein sentezini engellerler. Duyarlı bakterilerde oksijene bağımlı bir sistemle hücre içine alınırlar. Tüm aminoglikozitler bakterisid etkilidir. Sadece aerob bakterilere etkilidirler (Strohl ve ark., 2006) Antibiyotiklere Karşı Direnç Gelişimi Antibiyotik direnci; bir mikroorganizma türünün bazı suşlarının antibiyotikten etkilenmemesi ya da antibiyotiğe duyarlı bir suşun çeşitli direnç mekanizmalarından biri ile dirençli hale dönmesi olarak tanımlanır (Demirtürk ve Demirdal, 2004). Antimikrobik kemoterapötik maddeler günümüzde etki mekanizmalarına göre 5 gruba ayrılır; 1. Hücre duvarı sentezini inhibe edenler 2. Sitoplazmik membranın yapı ve fonksiyonunu inhibe edenler 3. Protein sentezini inhibe edenler 4. Kimyasal yapılarındaki benzerlik dolayısı ile bakteri metabolizmasını bozanlar 4

14 1. GİRİŞ Yasemin KAYA 5. Nükleik asit sentezini inhibe edenler (Baştürk, 2005). Kazanılmış antibiyotik direnci, ya mikroorganizma kromozomunda oluşan mutasyonlarla ya da dirençli bir mikroorganizmanın direnç genini duyarlı mikroorganizmalara aktarması ile ortaya çıkar. Enterobacteriaceae üyelerinde görülen direncin en önemli kaynağı (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp.) beta-laktamaz enzimlerdir. Beta-laktamazlar en çok gram-negatif bakteriler tarafından sentezlenen, dizi analizleri benzediği için penisilin bağlayıcı proteinlerden türediğine inanılan ve beta-laktam halkası taşıyan antibiyotiklere karşı dirence neden olan enzimlerdir. Bazı mikroorganizmalar beta-laktamazları doğal kromozomal bir enzim olarak salgılarken bazıları bakteriler arasında aktarılabilen plazmidler aracılığı ile salgılanmaktadır (Demirtürk ve Demirdal, 2004). Direnç sorununu aşacak antibiyotiklerin geliştirilmesinin direnç gelişimine göre daha yavaş olması ve önemli miktarda ekonomik kaynak gerektirmesi konunun önemini ortaya koymaktadır. Ayrıca, bugün için Enterococcus, Staphylococcus gibi bazı bakterilerin neden olduğu infeksiyonların varolan antibiyotiklerin hiçbiri ile tedavi edilememesi potansiyel bir tehlikedir (Tanır ve Göl, 1999). Beta-laktam antibiyotiklerini hidrolize eden ve inaktif hale getiren betalaktamaz üretimi, başta Enterobacteriaceae üyeleri olmak üzere birçok bakteri türünün en önemli direnç mekanizmalarından birisidir. Sayıları 350 ye ulaşan betalaktamazlardan yaklaşık 150 tanesi geniş spektrumlu beta-laktamazlar olup plazmidik özellikleri nedeniyle bakteriler arasında aktarılabilirler (Akçam ve ark., 2004). Tatlı su sistemleri, zayıf karakterli ve antibiyotik dirençliliğe katkısı az olarak bilinen bakteri populasyonlarını içerir. Bunun yanında birçok tatlı su sisteminde fekal bakteriler önemli bir sayısal varlığa sahip değildir. Çevresel dirençlilik havuzu hangi mükemmeliyet derecesi ile ölçülürse ölçülsün fekal orjinli bakteriler dışında kalanlar da hesaba katılmalıdır (Jones, 1986) Bakteriyel Ekstra Kromozomal Genetik Elemanlar Yapılan yoğun çalışmalar, 1940 lı yılların ortalarından itibaren bakterilerin de yüksek organizmalar gibi genetik materyale sahip olduğunu ve bakterilerin gen 5

15 1. GİRİŞ Yasemin KAYA transfer mekanizmalarını ortaya koymuştur. Bakteriler aseksüel olarak ürer ve ortadan ikiye bölünme sırasında belirli karakterler nesilden nesile geçer. Bu özellikler kromozom üzerindeki genler aracılığıyla aktarılır (Akan, 1992). Kromozom dışında, bakterilerin içinde bulunan, DNA yapısında içinde bulunduğu hücreye bazı önemli özellikler kazandıran ve bu özellikleri genetik kontrol altında tutan elementlere plazmid denilmektedir. Plazmidler çift iplikli DNA molekülünden yapılmış, sitoplazma içinde dairesel yapıda bir uçları ile bakteri sitoplazmasının bir noktasına bağlanmış şekilde, bakteri kromozomundan ayrı olarak replike olabilen bakteri kromozomundan daha küçük genetik elementlerdir (Bilgehan, 2002). Plazmidler antimikrobiklere ve ağır metallere direnç genleri yanında değişik virulans faktörlerini de taşıyabilirler. R-plazmidi denen direnç plazmidleri bir veya daha çok sayıda antibiyotiğe karşı direnç genlerini taşımaktadır. Direnç plazmidleri diğer duyarlı bakterilere transdüksiyon, transformasyon ve konjugasyon olaylarıyla geçerek direnç gen paketini aktarır ve böylece direncin yayılmasına neden olur (Gür, 1994). Plazmid büyüklüklerinin 1-2 milyon dalton arasında değişebildiği belirtilmektedir (Olgun ve Topal, 1999). Plazmidlerin hepsi kendini replike edebilme yeteneğinde olup, üzerinde 1-2 veya daha fazla gen taşıyabilirler. Plazmidlerin bazıları bakteriden bakteriye kendinin transferini sağlayacak transfer genleri taşırlar. Bu tip plazmidlere konjugatif plazmidler denilmektedir. Bu tür genleri bulundurmayan plazmidlere ise konjugatif olmayan plazmidler denilmektedir. Plazmidler kromozom dışında sitoplazmada serbest halde bulunabileceği gibi bakteri kromozomuyla bütünleşmiş halde epizomik olarak da bulunabilir. F plazmidleri özelikle konjugasyon olaylarında bulundukları hücreye erkeklik ve dişilik özelliği kazandırır. F plazmidi bulunan bakterilere verici (erkek), F plazmidi bulunmayan bakterilere alıcı (dişi) bakteriler denilmektedir. Plazmidler taşıdıkları dirençlilik genlerini bir bakteriden başka bir bakteriye plazmidlerin aktarılması yolu ile taşımaktadırlar (Akman, 1983; Bilgehan, 2002). Plazmidlerin bir genom olmaları bulundukları bakterilerde bazı genetik olayların kontrolünü yapma özelliği vermektedir. Bazı plazmidlerin hücredeki 6

16 1. GİRİŞ Yasemin KAYA fonksiyonları bilinmeyebilir bu tür plazmidlere gizli plazmidler (Cryptic plazmid) denilmektedir. Plazmidler bir bakteride kendiliğinden oluşabildiği gibi bir başka bakteriden aktarılma yolu ile meydana gelebilirler. Bir plazmid hücrede kendiliğinden kaybolabileceği gibi kimyasal ve fiziksel yollarla da yok olabilirler (Bilgehan, 2002). Bilinen başlıca plazmidler şunlardır: 1. F faktörleri (Fertilite=Cinsel=Seks faktörleri) 2. F faktörleri 3. Col plazmidleri (Kolisinojenik faktörleri) 4. R plazmidleri-rtf faktörleri 5. Stafilokok plazmidleri 6. Virülans plazmidleri F Faktörleri Kromozom dışında bağımsız olarak bulunabildiği gibi kromozomla bütünleşmiş olarak da (epizomik durum) bulunabilmesi, bakteride cinsel olarak verici (erkek) hücre olma özelliğini kontrol altında tutması ve bakteriden bakteriye aktarılması gibi özellikleri vardır F Faktörleri Kendi genleri ile bakteriye ait genleri taşıyan F faktörleridir. Bu durum hfr bakterilerde F faktörü epizomik durumdan bağımsız duruma geçerken beraberinde bakteri DNA sından bazı genleri de kendine yapışmış olarak alabildiği durumlarda gözlenir. F faktörünü taşıyan bakteriye F-prime ya da F hücresi denir Col Plazmidleri (Kolisinojenik Faktörleri) Koli basillerinin bazı kökenlerinde yine başka koli basillerini eriten maddeleri (kolisin) oluşturma özellikleri hücrelerin içinde bulunabilen DNA yapısında ve tipik 7

17 1. GİRİŞ Yasemin KAYA plazmid niteliği gösteren elementler tarafından sağlanır. Bu elementlere col plazmidleri adı verilir R Plazmidleri-RTF Faktörleri Bakterilerde antibiyotiklere ve kemoterapötik ilaçlara karşı ekstra kromozomal dirençliliğin bakteriden bakteriye aktarılmasını yöneten kromozom dışı elementlerin bulunduğu belirlenmiştir. Bu faktörlere kısaca RTF (rezistans transfer faktörü) adı verilir. Bakteri hücresi içinde çembersel ya da düz olarak bulunurlar (Bilgehan, 1994). Bakteri kromozomu ile de integre olabilirler (Arda, 1995). RTF faktörü bulunduran bakterilerden bu faktörü olmayanlara kemoterapötiklere karşı direnç genlerinin aktarılması, bu faktörlerin kontrolü altında yapılır (Bilgehan, 1994). R faktörleri iki bölümden oluşurlar. Biri konjugasyonu ve aktarılmayı yöneten transfer faktörü (TF) ve diğeri de çeşitli ilaçlara karşı dirençliliği tayin eden rezistanslık faktörü (RF) veya R determinanttır. Bu faktörler birbirinden bağımsız olarak aktarılabilirler. Eğer RF transfer edilirse alıcı hücre ilaçlara karşı dirençli hale gelir. Ancak, RF nin, TF olmadan tek başına aktarılması olanaksızdır. Bu nedenle RF nin aktarılması diğer mekanizmalar tarafından yönetilir. R faktörünün bir kısmı, zamanla, spontan olarak veya antibiyotik baskısının kalkması sonu, konakçı bakteriden ayrılabilir. Spontan kaybolmalarda R faktörünün, kromozomla aynı anda bölünerek kardeş hücrelere aktarılması da rol oynar. Mutasyonlar sonu da, antibiyotiklere karşı dirençlilik oluşabilmektedir. Ancak, bu tarz rezistanslık, ekstrakromozomal değil, kromozomaldir. Bazı durumlarda, yabancı DNA segmentleri hücrelere girer ve kromozomla da birleşebilir ve mutasyonlara yol açabilir (Arda, 1995) Staphylococcus Plazmidleri İçerdikleri plazmidler yönünden Staphylococcus bazı değişik durumlar göstermektedirler. Genellikle bu plazmidler tek genli plazmidler olup, sık sık bakteri kromozomu ile bütünleşebilme ve yine ayrılma özelliği gösterebilirler. Bu plazmidler 8

18 1. GİRİŞ Yasemin KAYA bakteriyofajlar aracılığı ile transdüksiyon yoluyla bir bakteriden diğerine aktarılırlar. Bilinen Staphylococcus plazmidlerinin başlıcaları penisilinaz plazmidleri, tetrasiklin plazmidleri, kloramfenikol plazmidleri, neomisin, kanamisin plazmidleridir (Bilgehan, 1994) Virülans Plazmidleri Bakterilerin sahip oldukları virülans faktörlerin bir kısmı kromozomlarında kodlanmasına karşın bazıları da plazmid orjinlidir (Arda,1995). Virülans plazmidleri bakterilerin virülansını etkilerler (Bilgehan, 1994) Mikroorganizmalar Arası Genetik Madde Aktarımı Mikroorganizmalar arasında gerek in vitro ve gerekse in vivo koşullarda gen veya genetik madde aktarımı meydana gelmektedir. Mikroorganizmalar arasında genetik madde aktarımı beş farklı tipte meydana gelmektedir. Bunlar; 1- Transformasyon 2- Konjugasyon 3- Transdüksiyon 4- Elektroporasyon 5- Protoplast füzyon Bu gen transfer mekanizmalarının bazı ortak özellikleri bulunmaktadır (Akan, 1992). 1. Genellikle verici hücre diye adlandırılan ana hücrenin kromozom parçalarının alıcı hücre diye adlandırılan yavru hücreye transfer edilmesi, 2. Alıcı hücrenin kromozomunun homolog bölgelerinin verici kromozomunun parçaları ile çiftleşmesini üstlenmesi, 3. Çiftleşme sonunda vericinin genetik materyalinin genellikle haploid rekombinantlar oluşturmak için alıcı kromozomunda alleik materyalin yerine geçmesi (buna replacement integration denir), 9

19 1. GİRİŞ Yasemin KAYA 4. Bazı özel durumlarda plazmid veya bakteriyofaj gibi genetik elementlerin genetik materyalin tümüne sahip karma bir molekül oluşturmak için bakteri kromozomu ile rekombine olabilmesi (bu tip rekombinasyon ise additive recombination diye adlandırılır) dir (Akan, 1992) Transformasyon Verici bir hücre tarafından ortama salınan erimiş haldeki çıplak DNA nın alıcı bir hücre tarafından alınması sonucu meydana gelen gen transferine transformasyon adı verilir. Streptococcus pneumonia,bacillus subtilis, Neisseria spp ve Haemophilus influenza gibi bazı bakteriler diğer bakterilerin erimesi ile çevreye yayılan solubl DNA yı kolaylıkla alırlar. E. coli ve Pseudomonas aeruginosa gibi bazı bakteriler ise yüksek konsantrasyondaki kalsiyum ve magnezyum gibi divalent katyonlarda tutulduklarında yabancı DNA yı alabilirler (Akan, 1992) Konjugasyon Bir bakteriye ait genetik maddenin (DNA), aynı cins içinde bulunan veya aynı türden diğer mikroorganizmaya direk temas veya seks pilusları aracılığı ile transfer edilmesine konjugasyon denir. Konjugasyon olayı bazı transfer genler tarafından gerçekleştirilmektir. Bu konuda bilinen en iyi örnek E. coli deki F- faktörünü (fertilite faktörü) kodlayan seks pilusu gen transferinde bir köprü görevindedir (Ippen-Ihler ve Minkley, 1986). Konjugasyon plazmidle ilişkili olarak 10-8 de 1 e kadar olan bir sıklıkla değişebilmektedir. Ayrıca herhangi bir plazmidin transfer sıklığı çevresel faktörlerle de ilişkilidir (Singleton ve Anson, 1985). Konjugasyon ile genlerin aktarımının doğal ortamlarda, karasal ortamlarda ve sucul ortamlarda gerçekleştiği bilinmektedir (Dinçer, 1994). 10

20 1. GİRİŞ Yasemin KAYA Transdüksiyon Bir bakteriyofaj aracılığı ile bir bakteriden diğerine genetik materyal aktarılması olayına transdüksiyon denir (Bilgehan, 1994). Gram-negatif ( Salmonella sp., E. coli, Shigella sp., Proteus sp. vs) ve grampozitif mikroorganizmalarda (Staphylococcus sp., basiller, vs) bu tarz gen transferine rastlanmaktadır. Bakterilerde transdüksiyon doğal ortamlarda, karasal ortamlarda ve sucul ortamlarda gerçekleşebilmektedir (Arda, 1995) Agaroz Jel Elektroforezi DNA molekülünün analizlerinde çok çeşitli yöntemler kullanılmakla beraber bunların arasında en yaygın ve sık kullanılanı, agaroz jel elektroforezidir. DNA nın elektroforetik analizinin temeli, DNA molekülünün elektriksel alanda jel içerisinde hareketine dayanmaktadır. Jel elektroforezinde ayırıcı ortam agar veya agaroz olabilir. Bazı durumlarda agaroz-poliakrilamid karışık jel sistemleri kullanılsa da en yaygın kullanılan agaroz jel sistemidir. Agaroz kırmızı bir alg türü olan Agar agar dan elde edilen lineer bir polisakkarittir. Sıcak suda çözünerek jel haline geçer. Polimerleşmede polisakkaritler arasında hidrojen bağlarının kurulmasıyla jel yapısı meydana gelir. Ticari olarak üretilen agarozların saflık dereceleri farklı olmaktadır. Kullanılan agarozun saflık derecesine göre DNA molekülünün jeldeki göç hızı etkilenmektedir. Kimyasal yapısı değiştirilerek düşük sıcaklıklarda eriyebilen agaroz tipleri de elde edilmiştir. Bu tip agarozların ayırım özellikleri oldukça fazladır ve DNA jelden geri kazanılacaksa bu tip agaroz kullanımı uygundur. Agaroz konsantrasyonu % değiştirilerek jelin por çapı ayarlanabilir. Bu sayede küçük DNA fargmentleri için yüksek, büyük DNA fragmentleri için düşük agaroz konsantrasyonu kullanılarak DNA molekülünün daha rahat yürümesi sağlanabilir. Bir DNA molekülünün agaroz jelde görünür hale gelmesi için ethidium bromürün DNA bağları arasına bağlanarak 300 veya 360 nm deki UV ışığını absorblaması sonucu floresan etki göstermesi ile olur. Bu etki 11

21 1. GİRİŞ Yasemin KAYA DNA konsantrasyonuna bağlı olarak az veya kuvvetli olabilir (Olgun ve Topal, 1999) Çalışmanın Amaçları Günümüzde çevre kirliliği giderek artmakta ve çözülmesi gerekli olan bir problem halini almaktadır. Çevre kirliliğinde önemli bir boyutu daha çok endüstriyel faaliyetler alsa da ilaçların çevreye verdiği zararlar ve bunun sonucunda oraya çıkan çevre kirliliği de önemli bir sorunu ortaya çıkarmaktadır. İlaç kullanımında en önemli grubu antibiyotikler oluşturmaktadır. Bakteriyel infeksiyonların tedavisinde kullanılan antibiyotiklerin bilinçli ve bilinçsiz olarak çevreye verilmesi ve bakterilerde bu antibiyotiklere karşı çeşitli direnç mekanizmalarının gelişmesine neden olmaktadır. Bu çalışmada; Seyhan baraj gölünden izole edilen, Enterobacteriaceae grubu bakterilerin antibiyotiklere karşı dirençlilik profillerinin belirlenmesi ve bu bakterilerde antibiyotik dirençliliklerinin kromozomal veya plazmid kökenli olup olmadıklarının belirlenmesi amaçlanmıştır. 12

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Yasemin KAYA 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Grabow ve arkadaşları (1975), R-faktörlerinin epidemiyolojisi, antibiyotik dirençliliğinin tipleri ve R-faktörlerinin orijinleri ile su kalitesi arasındaki ilişkiyi detaylı olarak araştırıp, yüzey ve kanalizasyon sularının enterik rezervuarı şeklinde davrandıklarını ve suların kanalizasyon suları ile kontamine olması neticesinde R- faktörlerinin geniş çaplı alanlara yayıldıklarını bildirmişlerdir. Cooke (1976), kanalizasyon suları ile kontamine olmuş deniz suyundan izole ettikleri koliform bakterilerde yüksek frekansta çoklu antibiyotik dirençliliğinin geliştiğini tespit etmişleridir. Stewart ve Koditsihek (1980), deniz suyundan izole ettikleri bakterilerle Escherichia coli nin laboratuar suşları arasında, antibiyotik direçliliğinin transfer edilebildiğini ortaya koymuşlardır. Bell ve arkadaşları (1980), Red Nehri nden izole ettikleri fekal koliformların 12 antibiyotiğe karşı, Salmonella izolatlarının ise %18 nin bir veya daha fazla antibiyotiğe karşı dirençli olduklarını saptamışlardır. Casawell ve Philips (1981), Klebsiella pneumoniae suşlarının transfer edilebilir antibiyotik dirençliliğinin önemli bir kaynağını oluşturduklarını, 1970 li yıllarda çok antibiyotiğe dirençli Klebsiella pneumoniae suşlarının salgın halinde çeşitli hastane infeksiyonlarına sebep olduklarını gentamisin ve sefalotin dirençliliğinin plazmidler aracılığı ile edilebildiğini bildirmişlerdir. Knothe ve ark., (1983), sefalosporin dirençliliğinin plazmid kökenli olduğunu ve Klebsiella pneumoniae suşlarından izole edilen plazmidin, sefotaksim, sefuroksim diğer sefalosporinler, penisilinler ve gentamisin dirençliliğini hassas suşlara aktarabildiğini bildirmişlerdir. sefotaksim ve diğer son kuşak beta-laktam antibiyotik dirençliliklerinin Escherichia coli bakterisine çok kolay aktarabildiğini belirtmişlerdir. Kryalikovya ve arkadaşları (1984), Yugoslavya da atık suların deşarj edildiği bir nehirden izole ettikleri Enterobactericeae üyelerinin gentamisine dirençli suşlar olduğunu tespit etmişlerdir. 13

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Yasemin KAYA Finch ve Smith (1987), bazı antibiyotiklere karşı simultan dirençlilik gelişiminin, plazmidler tarafından meydana getirildiğini bildirmişlerdir. Büscher ve arkadaşları (1987), kliniksel Enterobacter cloacae izolatlarının çeşitli beta-laktam grubu antibiyotiklere karşı direnç geliştirdiklerini ve betalaktamaz ürettiklerini tespit etmişlerdir. Rinker ve arkadaşları (1988), ABD de Monacacy nehrinden aldıkları numunelerden izole ettikleri 24 adet örneğin 22 sinde beş veya daha fazla antibiyotiğe dirençli gram-negatif bakteri tespit etmişlerdir. Çetin ve arkadaşları (1999), hastane infeksiyonu etkeni olarak izole edilen Enterobacteriaceae ailesinden 117 gram-negatif bakteri suşunun 38 inde (%32.5) GSBL saptanmıştır. 51 Klebsiella pneumoniae suşunun 24 ünde (%47), Escherichia coli suşunun altısında (%15.8), 9 Enterobacter aerogenes suşunun dördünde, 7 Enterobacter cloacea suşunun birinde, bir Citrobacter freundii ve bir Enterobacter sakazakii suşunda GSBL oluşumunu gözlemişlerdir. Çalışma sonucunda denenen suşlara en etkili antibiyotikleri karbapenem grubunun oluşturduğunu ve bunları kinolon ve aminoglikozidlerin izlediğini saptamışlardır. Mathew ve arkadaşları (1999), domuzlardan izole edilen Escherichia coli nin farklı yaşlarda ki domuzlar arasında antibiyotik kullanım derecesine bağlı olarak Echerichia coli nin gösterdiği antibiyotik dirençliliğini farklı düzeylerde belirlemişlerdir. Go-Ni-Urriza ve arkadaşları (2000), İspanya da evsel ve endüstriyel atık suların deşarj edildiği Arga nehrinden izole ettikleri Enterobacteriaceae sp. suşlarının %72 sinin, Aeromonas sp. suşlarının ise %20 sinin nalidiksik asite karşı dirençli olduğunu tespit etmişleridir. Enterobacteriaceae sp izolatlarının tetracycline %24.3, beta-laktamlara %20.5 dirençli oldukların, Aeromonas sp izolatlarının ise tetrasikline %27.5, co-trimoksazole %26.6 dirençli bulmuşlardır. Cesur ve arkadaşları (2001), yaptıkları çalışmada yatan hastalara ait idrar örneklerinden izole edilen Escherichia coli, Klebsiella türleri ve Pseudomonas aeruginosa suşlarının antibiyotiklere duyarlılıklarını izlemişler ve suşlarda ampisilin ve trimetoprim/ sulfametoksazole direnç oranını yüksek bulmuşlardır. 14

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Yasemin KAYA Karbapenemler, kinolonlar ile 3. ve 4. kuşak sefalosporinlerin suşlara en etkili antibiyotikler olduklarını bulmuşlardır. Otkun ve arkadaşları (2001), Salmonella typhimurium un klinik infeksiyonlardan izole edilen 75 suşun dirençlilik mekanizmasını araştırmışlar, üretilen 22 suşun 20 tanesinin aminoglikozitlere, 12 suşun ise trimethoprimsulfamethoksazol e karşı dirençlilik gösterdiğini belirlemişlerdir. Thimm ve arkadaşları (2001), atık sular ile sulanmış arazilerde bazı antibiyotiklere karşı dirençli olan Escherichia coli lere yüksek miktarda rastlamışlardır. Çiftçi ve arkadaşları (2003), yanık ünitesinde yatan hastaların yara ve kan kültürlerinde üreyen mikroorganizmalar ve bunların çeşitli antibiyotiklere duyarlılıklarını belirlemişlerdir. Hastaların toplam 108 kültüründen en sık izole edilen mikroorganizmalar, sıklık sırasıyla, Pseudomonas aeruginosa (50/%46.2), Acinetobacter spp. (24/%22.2) ve metisiline dirençli Stapylococcus aureus (9/%8) olarak tespit etmişlerdir. İzole edilen bakterilerde yüksek oranda ve çoklu antibiyotik direncini saptamışlardır. Aslım ve arkadaşları (2004), Türkiye deki farklı köy ve kasabalardan toplanan yoğurt örneklerinden 34 suş Streptococcus thermophilus olarak teşhis etmişlerdir. 34 S. thermophilus suşunun antibiyotik dirençlilikleri ve plazmid içeriklerini incelemişlerdir. Bir çok suş gentamisin (%79) ve penisilin G ye (%64) dirençlilik gösterdiğini belirlemişler, suşların %88 oranında tetrasikline, %94 oranında da kloramfenikole duyarlılık gösterdiğini tespit etmişlerdir. Plazmid DNA analizlerinde ise 7 suşun plazmid DNA içermediğini, plazmid DNA sı içeren suşlarda ise sayısının 1 ve 5 arasında, moleküler ağırlıklarının ise 1,88-19,89 kb arasında olduğunu tespit etmişlerdir. Bir veya hiç plazmide sahip olmayan suşların birçok antibiyotiğe duyarlı olduğunu belirlemişlerdir. Beş plazmid DNA ya sahip 3 suşun da bir çok antibiyotiğe dirençli olduğunu belirlemişlerdir. Karayakar ve arkadaşları (2004), Mersin kıyı şeridinden aldıkları su örneklerinden izole edilen Escherichia coli bakterilerinin, III. Kuşak antibiyotiklerden Sefazol (CF), Seftriakson (CRO) ve Sefizoks (ZOX)'a karşı doğal dirençlilik frekansları saptamışlardır. Doğal ve plazmide bağlı dirençlilik, en fazla 15

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Yasemin KAYA Sefazol (CF) antibiyotiğine karşı gelişirken bunu sırasıyla Sefizoks (ZOX) ve Seftriakson (CRO)'a karşı dirençliliğin izlediğini ortaya koymuşlardır. Yılmaz ve arkadaşları (2005), idrar yolu infeksiyonu etkenlerini ve bunların antibiyotiklere duyarlılıklarını saptamışlardır. İdrar örneklerinden sık izole edilen etkenler sırasıyla, Escherichia coli (%51.5), Klebsiella pneumoniae (%11) ve Enterococcus faecalis (%6.2) olarak bulmuşlardır. Poliklinik hastalarından izole edilen E. coli nin antibiyotik duyarlılığı seftriaksona %92.6, gentamisine %90.2, siprofloksasine %82.5, kotrimoksazole %47.4 olarak bulmuşlardır. Yatan hastalarda en etkili antibiyotikler E. coli için meropenem %98.9, imipenem %96.4, sefepim %95.7, amikasin %94.6, seftriakson %87, Klebsiella pneumoniae için meropenem %97.8, imipenem %96, amikasin %80.7, Acinetobacter baumannii için meropenem %85.8 ve imipenem %81 olarak bulmuşlardır. Erkan ve Vural (2006), Dicle Nehri nin hijyenik kalitesi üzerine yapmış oldukları çalışmada su numunelerini toplam mezofilik aerob bakteri, Enterobactericeae, koliform, Escherichia coli, Staphylococcus-Micrococcus, Staphylococcus aureus, küf-maya, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica ve anaerob bakteri sayısı yönünden incelemişler ve örneklerdeki koliform ve E.coli kontaminasyonunu sırasıyla, %100 ve %90 olarak bulmuşlardır. 16

26 3. MATERYAL ve METOD Yasemin KAYA 3. MATERYAL ve METOD 3.1. Materyal Bakteri Suşları Balcı (2007) tarafından Seyhan Baraj Gölü nden , , ve tarihlerinde, arazi üzerinde belirlenen 7 farklı istasyondan alınan su örnekleri laboratuara getirilip, bakteri izolasyon yöntemleri uygulanarak saf kültür halinde elde edilen, identifikasyonları ve antibiyogramları yapılan bakteri suşları çalışmamızda kullanılmıştır Kullanılan Besiyerleri LB (Luria-Bertoni) Buyyon (ph:7.5) LB buyyon izole edilen bakterilerin zenginleştirilmesi için kullanılmıştır (Manniatis ve ark., 1982). Bileşimi g/l Tripton 10 Maya 5 NaCl Plate Count Agar (PCA) PCA agar elde edilen bakteri suşlarının stok kültürünü yapmak için kullanılmıştır (Halkman, 1995). 17

27 3. MATERYAL ve METOD Yasemin KAYA Bileşimi Pepton Yeast extract D(+) Glukoz Agar g/l 5 g 2,5 g 1 g 12 g Kullanılan Çözeltiler Plazmid izolasyon Kiti Çalışmamızda kullandığımız bakteri suşlarının plazmidlerinin izolasyonunda hazır plazmid izolasyon kiti kullanılmıştır (Roche applied science high pure plazmid isolation kit. Cat no: ). Çalışmalarda kullanılan plazmid izolasyon test kiti içeriği aşağıdaki gibidir. (25 C) Süspansiyon Çözeltisi (25 ml): 50 mm Tris-HCl ve 10 mm EDTA, ph 8.0 RNase A (2,5 mg): Süspansiyon çözeltisi içerisinde çözdürülmüştür. Lizis Çözeltisi (25 ml): 0.2 M NaOH ve %1 SDS asetat, ph 4.2 Binding Buffer (25 ml): 4 M guanidin hidroklorit ve 0.5 M potasyum Yıkama Çözeltisi I: 5 M guanidin hidroklorit, 20 mm Tris-HCl, ph 6.6 (25 C). 33 ml. Yıkama çözeltisi I i kullanmadan önce içerisine 20 ml susuz etil alkol eklenmiştir. 18

28 3. MATERYAL ve METOD Yasemin KAYA Yıkama Çözeltisi II: 20 mm NaCl, 2 mm Tris-HCl, ph 7.5 (25 C). 10 ml. Yıkama çözeltisi II i kullanmadan önce çözelti içerisine 40 ml susuz etil alkol eklenerek hazırlanmıştır. Elusyon Çözeltisi (40 ml): 10 mm Tris-HCl, ph 8.5 (25 C) Filtrasyon Tüpü: 700 µl hacimli 50 tüp Toplama Tüpü: 2 ml lik 50 polipropilen tüp X TBE (Tris-Borik asit-edta) Solüsyonu Tris Borik Asit EDTA 21.6 g 11 g 1.86 g Tartılarak son hacim 200 ml olacak şekilde saf suda çözülür ve ph 8,3 e ayarlanır (Manniatis ve ark., 1982) Agaroz jel (%1) 70 ml Agaroz 10x TBE Solüsyonu Distile su 0,7 g 7 ml 63 ml ark., 1982). Agaroz, homojen bir karışım oluşuncaya kadar ısıtılarak eritilir (Manniatis ve 19

29 3. MATERYAL ve METOD Yasemin KAYA Örnek Yükleme Tamponu Brom fenol mavisi % 0.25 Gliserol % ml saf suda çözülerek elde edilir (Manniatis ve ark., 1982) Yürütme Tamponu 1x 1982). 10x TBE tamponunun 10 kat sulandırılmasıyla elde edilir (Manniatis ve ark., Stok Boyama Solüsyonu Ethidium bromür Distile su 1 g 100 ml Boya tamamen çözündükten sonra koyu renkli şişede +4 C de saklanır (Manniatis ve ark., 1982) Boyayı Geri Alma Solüsyonu MgSO 4 Distile su 0.04 g 200 ml 200 ml distile su içerisinde MgSO 4 çözülmüştür. Elde edilen çözelti 1 mm MgSO 4 çözeltisidir. 20

30 3. MATERYAL ve METOD Yasemin KAYA 3.1. Metod Örnek Toplama İstasyonlarının Özellikleri Şekil 3.1. Örnek toplama istasyonları (Balcı, 2007) 21

31 3. MATERYAL ve METOD Yasemin KAYA Çizelge 3.1. Örnek Toplama İstasyonlarının Özellikleri (Balcı, 2007) İstasyonlar Birinci istasyon İkinci istasyon Üçüncü istasyon Dördüncü istasyon Beşinci istasyon Altıncı istasyon Yedinci istasyon Özellikleri Seyhan nehrinin ilk giriş noktasıdır. Seyhan nehrinin baraj suyuyla karıştığı nokta olup yeni yapılmış henüz kullanımda olmayan yerleşim yerlerinin bulunduğu istasyondur. Çakıt nehrinin baraja döküldüğü ilk noktadır. Çakıt nehrinin yerleşim yerlerine olan başlangıç noktasıdır. Çakıt ile Seyhan nehrinin baraj suyuyla birleştiği yerdir. İki su kaynağının gölün suyuyla karıştığı bölge, Adnan Menderes yarımadasının orta bölgesidir Suyun drenaj noktasına gittiği bölge, Kayıkhanenin karşısıdır Çoklu Antibiyotik Direnci (MAR) İndeksi Çoklu antibiyotik dirençliliği (MAR) indeksi test organizmalarının dirençli olduğu antibiyotik sayısının toplam denenen antibiyotik sayısına oranı ile hesaplanmaktadır. Çoklu antibiyotik dirençliliği (MAR) indeksi verilen populasyonlarda bakteri direnç yayılımını göstermektedir. Hesaplanan MAR indeksi sonucu eğer 0.2 den daha büyükse birkaç antibiyotiğin kullanıldığı ortam kökenli bakteri suşlarının varlığını gösterir (Ehinmidu, 2003) Bakterilerden Plazmid İzolasyonu 1. Plazmid izole edilecek mikroorganizmanın LB buyyon besiyerinde bir gecelik taze kültürü hazırlanarak bu kültürden 0.1 ml alınıp 10 ml lik LB buyyon besiyerine inokulasyonu yapılmıştır. 4-6 saat 37 C de üretildikten sonra, örneğin tamamı 100 ml lik LB buyyon besiyerine aktarılmış ve 2 saatlik inkübasyondan sonra ortama son konsantrasyon 170 µg/ml olacak şekilde chloramphenicol ilave edilerek bir gece üremeye bırakılmıştır. 2. Prosedüre başlamadan önce binding buffer buz üzerinde bekletilmiştir. 22

32 3. MATERYAL ve METOD Yasemin KAYA 3. Başlama materyalleri hazırlanır: Bakteri kültürünün ml si steril mikrosantrifüj tüplerine aktarılmış 6000xg de santrifüj edilmiştir. Bakteri hücreleri çökelti haline geldikten sonra üst faz atılmıştır. Çökeltinin üzerine 250 µl RNase A eklenmiş olan süspansiyon çözeltisi eklenmiştir. Bakteriyal pelet resüspanse edilmiştir. 4. Resüspanse edilmiş bakteri çökeltisine aşağıdaki maddeler sırasıyla uygulanmıştır. Tüplere 250 µl lizis çözeltisi eklenip, 3-6 defa yavaşça alt üst ederek karıştırılmıştır. 5 dakika C de inkübe edilmiştir. 5 dakikadan fazla inkübe edilmez. 5. Lize edilmiş solüsyona sırasıyla şu işlemler uygulanmıştır. Tüplere 350 µl soğutulmuş binding buffer eklendikten sonra tüpler yavaşça alt üst edilmiştir ve buz üzerinde 5 dakika bekletilmiştir. Buz üzerinde bekletildikten sonra yaklaşık olarak 10 dakika 13000xg de santrifüj edilir. 6. Santrifüj edildikten sonra; Bir filtrasyon tüpü bir toplama tüpü içerisine yerleştirilerek elde edilen bütün süpernatant filtrasyon tüpü içerisine aktarılmıştır. Bütün toplama tüplerinin içerisine yerleştirilmiş olan filtrasyon tüpleri mikrosantrifüj içerisine yerleştirilip, 1 dakika 13000xg de santrifüj edilmiştir. 7. Santrifüjden sonra; Toplama tüpünden filtrasyon tüpü taşınıp, toplama tüpü içerisindeki akışkan sıvı atılmıştır ve yeniden filtrasyon tüpü aynı toplama tüpü içerisine yerleştirilmiştir. Eğer bakteri kültürü yüksek miktarda nükleaz içeriyorsa isteğe bağlı yıkama adımı uygulanır, yoksa bir sonraki adıma geçilir. İsteğe bağlı yıkama adımı: Yüksek nükleaz aktivitesini preparasyondan elimine edilmiştir ve 500 µl yıkama çözeltisi-i filtrasyon tüpüne eklenmiştir. 1 dakika 13000xg de santrifüj edilir. 23

33 3. MATERYAL ve METOD Yasemin KAYA 8. Hücreleri yıkama: 700 µl yıkama çözeltisi-ii filtrasyon tüpüne eklenmiştir saniye 13000xg de santrifüj edilmiş ve toplama tüpü içerisine toplanan akışkan sıvı atılmıştır. 9. Akışkan sıvı atıldıktan sonra; Bütün filtrasyon tüpleri içerisine hiçbir madde eklenmeden ek olarak 1 dakika daha santrifüj edilmiştir. Ekstra santrifüj zamanı yıkama solüsyonunun kalıntısının taşınmasını sağlamak için yapılmıştır. 10. DNA yı elüt etmek için; Filtrasyon tüpleri 1,5 ml lik steril mikrosantrifüj tüplerinin içerisine yerleştirilerek, 100 µl elüsyon çözeltisi veya ddw (ph=8,0-8,5) filtrasyon tüplerinin içerisine aktarılmıştır ve 1 dakika 13000xg de santrifüj edilmiştir. 11. Mikrosantrifüj tüpü elde edilmiş plazmid DNA sını içermektedir C de veya daha sonra yapılacak analizler için (-15)- (-25) C de saklanmıştır Agaroz Jelin Hazırlanması ve Örneklerin Jele Uygulanması 1. % 1 lik jel hazırlamak için 0.7 g agaroz 7 ml 10x TBE tamponu ve 63 ml saf suda çözüldükten sonra ısıtılarak eritilmiştir. 2. Çözelti yaklaşık 40 C ye kadar soğutulup, 15x20x5 cm boyutlarındaki jel kutusuna dökülmüştür ve üzerine jel tarağı yerleştirilmiştir. 3. Jel tamamen donduktan sonra tarak dikkatlice ayrılmıştır µl lik miktarlarda DNA örnekleri alınarak 5 µl yükleme tamponuyla karıştırıldıktan sonra mikropipet ile örnek çukurlarına doldurulmuştur. 5. Separe edilen nükleik asitlerin moleküler ağırlıklarını belirlemek amacı ile jeldeki çukurlardan birine 3 µl marker DNA (Sıgma Lambda DNA Hınd III Digest Aqueous Solution) yüklenmiştir. 6. Jel agaroz aparatına yerleştirilmiştir. 7. Aparata jelin üzerini kaplayacak kadar yürütme tamponu konulmuştur. 10 V/ cm 2 voltaj uygulanarak 4 saat yürütme işlemi gerçekleştirilmiştir. Separasyon 24

34 3. MATERYAL ve METOD Yasemin KAYA zamanını sonlandırmak için, yükleme tamponunda bulunan brom fenol mavisinin jelde katettiği mesafe bize yol gösterir DNA nın Ethidium Bromid ile Boyanması 1. Elektroforez işlemi tamamlanınca jel elektroforez aparatından alınıp boyama kabına konulmuştur ve jel üzerine 0.5 µg/ml konsantrasyonda ethidium bromid boyama solüsyonu konarak 45 dk. boyanmıştır. 2. Boyanın fazlası jeli 1 mm MgSO 4 solüsyonu ile 15 dk. muamele etmek suretiyle geri alınmıştır. 3. Jel daha sonra U.V. transillüminatör üzerine konarak fotoğrafları çekilmiştir (Manniatis ve ark., 1982). 25

35 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Yasemin KAYA 4. BULGULAR ve TARTIŞMA 4.1. Bakterilerin Antibiyotik Dirençlilik Profillerinin Çıkarılması Çizelge 4.1. Bakterilerin gösterdikleri dirençlilik dağılımları (Balcı, 2007) BAKTERİ NO ANTİBİYOTİKLER BAKTERİ ADI CRO 30 GEN 30 CZ 30 CEF 30 AMP 25 STR 10 µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml 1 E.coli H H H H R H H IPM 10 µg/ml 2 E.coli R H H H H H H 3 T.E H R H H H H H 4 T.E H H H H H R H 5 E.coli H H H R H H H 6 En.clo H H H H H H R 7 Citro. H H R H H H H 8 Kleb. R H H H H R H 9 En.clo H H H H H R R 10 E.coli H H H H R R H 11 E.coli R H H H H H R 12 E.coli H R R H H H H 13 E.coli H H H R H R H 14 En.aer H H R H H R H 15 En.clo H H R H R H H 16 T.E H H R H H H R 17 Citro. H H R R H H H 18 Citro. H H R R H H H 19 E.coli R H H H H R R 20 E.coli R H R H H H R 21 En.clo R H R R H H H 22 E.coli R H R R H H H 23 T.E H R R R H H H 24 T.E H H R R H R H 25 T.E H H R R H H R 26 T.E H H R H R H R 26

36 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Yasemin KAYA Çizelge 4.1. in devamı BAKTERİ NO ANTİBİYOTİKLER BAKTERİ ADI CRO 30 GEN 30 CZ 30 CEF 30 AMP 25 STR 10 µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml 27 En.clo R H R H H R H IPM 10 µg/ml 28 En.clo H H R H R R H 29 Kleb. H H R R H R H 30 Kleb. H H R R R H H 31 En.clo R H R H H R H 32 Citro. H H R R H H R 33 En.clo H H R R R H H 34 En.clo H H R H R H R 35 Citro. R H R H R R H 36 En.clo R H R H R R H 37 En.clo R H R R R H H 38 En.clo R H R R R H H 39 En.clo R H R R R H H 40 En.clo R H R R R H H 41 En.clo R H R R R H H 42 En.clo R H R R R H H 43 En.clo R H R R R H H 44 En.clo R H R R R H H 45 En.clo R H R R R H H 46 En.clo R H R R R H H 47 E.coli R R R R H H H 48 E.coli R R R R H H H 49 E.coli H R R R H R H 50 T.E R H R R H R H 51 E.coli R H R R H R H 52 T.E R H R R H R H 53 T.E R H R R H R H 54 T.E R H R R H R H 55 T.E R H R R H R H 56 T.E R H R R H R H 27

37 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Yasemin KAYA Çizelge 4.1. in devamı BAKTERİ NO BAKTERİ ADI CRO 30 µg/ml GEN 30 µg/ml ANTİBİYOTİKLER CEF 30 µg/ml CZ 30 µg/ml AMP 25 µg/ml STR 10 µg/ml IPM 10 µg/ml 57 En.clo R R R H R H H 58 E.coli R R R H R H H 59 En.clo R R R H R H H 60 En.clo R R R H R H H 61 Citro. H H R R R H R 62 En.clo R H R R R R H 63 E.coli R R R R R H H 64 E.coli R R R R R H H 65 En.clo R R R R R H H 66 En.clo R R R R R H H 67 T.E R H R R R R H 68 E.coli R H R H R R R 69 E.coli R H R R R R H 70 E.coli R H R R R R H 71 E.coli R H R R R R H 72 E.coli R H R R R R H 73 En.clo H H R H H H H 74 E.coli R R R R R R R 75 E.coli H H H R H H H 76 E.coli H R H H H H H 77 Citro. H H H H H R H 78 E.coli H H H H H H R 79 En.clo R R R R R H R 80 En.clo R R R R R H R 81 En.clo H H H H R H H 82 E.coli R H H H H H H 83 E.coli R H R R R R H 84 E.coli R H R R R R H 85 E.coli R H R R R R H 86 E.coli R H R R R R H 87 E.coli R H R R R R H 88 E.coli R H R R R R H CRO: Ceftriaxon, GEN: Gentamisin, CZ: Cefazolin, CEF: Cefuroksim, AMP: Ampicilin, STR: Streptomisin, IPM: Imipenem. E.coli: Escherichia coli, En.clo: Enterobacter cloacae, En.aer: Enterobacter aerogeneses, Kleb.: Klebsiella, pneumoniae, Citro.:Citrobacter freundii, T.E: Tespit Edilemedi, R: Dirençli, H: Hassas 28

38 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Yasemin KAYA Çalışılan bakteri suşlarında 33 bakteri suşunun Escherichia coli (% 37.5), 30 bakteri suşunun Enterobacter cloacae (% 34.1), 3 bakteri suşunun Klebsiella (% 3.4), 7 bakteri suşunun Citrobacter freundii (% 7.95), 1 bakteri suşunun Enterobacter aerogenesis (% 1.14) olduğu görülmüştür ve 14 bakteri suşunun (% 15.91) tanımlaması yapılamamıştır. Bu bakterilerin dirençlilik analizi yapıldığında bakterilerin antibiyotiklere karşı gösterdikleri dirençlilik düzeyleri şu şekilde gerçekleşmiştir. CRO antibiyotiğine karşı toplam 55 bakteri suşunda (% 62.5), GEN antibiyotiğine karşı toplam 18 bakteri suşunda (% 20.45), CZ antibiyotiğine karşı toplam 70 bakteri suşunda (% 79.5), CEF antibiyotiğine karşı toplam 54 bakteri suşunda (% 61.36), AMP antibiyotiğine karşı toplam 46 bakteri suşunda (% 52.27), STR antibiyotiğine karşı toplam 37 bakteri suşunda (42.05), IPM antibiyotiğine karşı toplam 16 bakteri suşunda (% 18.2) direnç gözlenmiştir. Seyhan baraj gölünden izole edilen 88 bakterinin kullanılan 7 antibiyotiğe karşı gösterdikleri direçlilikte bir bakterinin kullanılan tüm antibiyotiklere karşı dirençli olduğu görülmüştür. Benzer şekilde yapılan çalışmalarda kanalizasyon suları ile kontamine olmuş yüzey suyundan izole edilen fekal kökenli koliform bakterilerde yüksek frekansta çoklu antibiyotik dirençliliğinin olduğu belirtilmektedir (Cooke, 1976). Bell ve arkadaşları (1980), Red nehrinden izole ettikleri fekal koliformların 12 antibiyotiğe karşı dirençli olduklarını belirtmektedirler. Armstrong ve arkadaşları (1982), çeşitli içme suyu sistemlerindeki bakterilerde çoklu antibiyotik dirençliliğinin önemli derecede arttığını göstermişlerdir. Yaptığımız bu çalışmada farklı bölgelerden farklı zamanlarda izole edilen benzer özelliklere sahip olan Enterobacteriaceae grubu bakterilerin gösterdikleri antibiyotik dirençlilik düzeylerinin farklı olduğu görülmektedir. Çalışmamızda 14 bakterinin tek bir antibiyotiğe karşı direnç gösterdiği bunun yanında tek bir izolatın ise kullanılan tüm antibiyotiklere karşı dirençli olduğu görülmektedir. Bu durum Armstrong ve arkadaşlarının (1982) belirttiği gibi zamanla organizmaların multiple antibiyotik dirençliliğinin geliştiğini göstermektedir. Karayakar ve arkadaşları (2004), Mersin kıyı şeridinden aldıkları su örneklerinden izole edilen Escherichia coli bakterilerinin, III. Kuşak antibiyotiklerden Sefazol 29