Feyza Tufan Yüksek Lisans Öğrencisi Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Fen Bilimleri Enstitüsü İstanbul Üniversitesi

Transkript

1 BİTKİLERE GEN TRANSFERİNDE KULLANILAN DOĞRUDAN YÖNTEMLER Feyza Tufan Yüksek Lisans Öğrencisi Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Fen Bilimleri Enstitüsü İstanbul Üniversitesi

2 İÇERİK Mikroenjeksiyon Makroenjeksiyon Kimyasal Yöntemlerle Gen Transferi Lipozomlarla Gen Transferi Elektroforez Mikrolazer Polen Tüpü Yolu İle Gen Transferi Zigotik Embriyoya DNA Emdirilmesi Silikon Karbid Fiberler Aracılı DNA Transferi Sonikasyon Desikasyon Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 2

3 MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ En kesin biçimde hücrenin istenilen bölmesine DNA nın enjeksiyonu Mikroenjeksiyon, mikroskop altında, kapiller mikropipet aracılığıyla nükleus veya sitoplazma içerisine DNA nın aktarımı Hedef; protoplastlar, izole edilmiş hücreler, kallus, meristemler, zigotik ve mikrospor türevli proembriyolar gibi çok hücreli dokular Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 3

4 MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ Aktarım sırasında hücreler sabitlenmelidir: Vakum yoluyla hücreleri tutan tutucu pipetin kullanımı Hücrelerin poli-l-lisin kaplı cama bağlanması Hücreleri agaroz, agar veya sodyum alginat içine koymak Bu çözümlerin hiçbirinin kullanışlılığı kanıtlanmamıştır (Poli-L-lisin bazı türler için toksik olabilir. Toksisiteden sakınmak için agaroza konulabilir ama agoroz çok ince bir tabaka olsa bile manüplasyon alanında görünebilirliği azaltır). Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 4

5 MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ Bu işlem, mikromanipulatör gerektirir: DNA mikromanipülatör sistemine bağlı kapiller mikropipet aracılığıyla doğrudan hücrenin çekirdeğine aktarılır (Mikropipet aracılığıyla genetik materyali içeren sıvının çıkışı için hidrostatik basınç kullanılır). Mikropipetin hareketi mikroskopla görsel olarak kontrol edilir. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 5

6 MİKROMANİPÜLATÖR SİSTEM ŞEMASI: (1) Inverted mikroskop (2) Su basınçlı mikromanipülatör kumandası (3) Mikroenjektör (4) Hareketli masa (5) Uzaktan kontrollü, su basınçlı mikrosürücü (6) Yardımcı hafif ağırlıklı manipülatör (7) Mikroiğne tutucu (8) Video kamera için yaklaştırıcı mercek Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 6

7 MİKROMANİPÜLATÖR Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 7

8 MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 8

9 MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ Bu yöntem ilk olarak 1980 yılında başarılı bir şekilde uygulandı. Capecchi, kültüre edilmiş memeli hücrelerinin hem sitoplazma hem de nükleusu içerisine DNA yı mikroenjekte etti. DNA nın doğrudan nukleus içine mikroenjeksiyonu, sitoplazma içi enjeksiyondan daha yüksek seviyede gen ekspresyonuyla sonuçlandı yılında, Gordon ve ark, transgenik fare üretmek için plazmid DNA sını döllenmiş fare oositlerinin pronükleusu içerisine mikroenjekte etti. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 9

10 MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ Mikroenjeksiyon çoğunlukla hayvan hücrelerinin transformasyonunda kullanılır. Bu yöntemi bitki hücrelerine uygulamak hayvan hücrelerine uygulamaktan daha zordur: Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 10

11 MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ Bitki hücreleri hücre duvarı içerir (Kalın tabaka lignin ve selüloz içermesi nedeniyle mikroiğnelerle aktarımı zorlaştırır). Protoplastın (enzimatik veya mekanik yollarla hücre duvarı uzaklaştırılmış bitki hücresi) mikroenjeksiyonu teorik olarak bu kısıtlandırmayı ortadan kaldırır. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 11

12 MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ Bununla birlikte vakuol birçok hidrolaz ve toksik bileşik içermesi nedeniyle vakuolden sitoplazmaya hidrolazlar ve diğer toksik bileşenlerin ayrılması protoplastın hızlı ölümüne neden olabililir. Mikroenjeksiyondan önce protoplast yaşayabilirliği için hiçbir önemi olmayan vakuolleri uzaklaştırmak mümkün olmasına karşın, onların kaybı bitkinin bölünme ve rejenerasyon yeteneğini anlamlı derecede azaltır. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 12

13 MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ 1986 yılında Crossway ve ark. tarafından tütün protoplastlarında sitoplazmik aktarıma karşı nükleus içine aktarımın etkinliği incelendi. Nuklear mikroenjeksiyonda entegrasyon sıklığı %14, sitoplazmik mikroenjeksiyonda %6 bulundu. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 13

14 MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ Bitki hücrelerinin hücresel fonksiyonlarının ve plastid fizyolojisinin çalışılması için güçlü bir araç olmuştur. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 14

15 MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ GFP kodlayan DNA nın soğan hücresi içerisine aktarımı. Enjeksiyondan 2 gün sonra yeşil boya görülebilir. Yabancı DNA nın soğan genomu içerisine başarılı şekilde aktarımı Patates kallus hücresi içerisine mikroenjeksiyon Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 15

16 MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ Tütün yaprak kloroplastına GFP nin mikroenjeksiyonu Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 16

17 MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ OLUMLU YÖNLERİ DNA nın bitki hücresi içerisine doğrudan ve kesin aktarımı (Görsel kontrol olanağı) DNA miktarı kontrol edilebilir Genellikle, yüksek transformasyon etkinliği (%14-66) (Enjeksiyonun gerçekleştirildiği tüm hücreler DNA içerir, bununla birlikte transforme olan hücrelerin sayısı sınırlıdır.) İşaret genleri yoluyla transformantların seçimindan kaçınılır Çeşitli hücre ve dokularda kullanılabilir Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 17

18 MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ OLUMSUZ YÖNLERİ Kavramsal olarak, mikroinjeksiyon en basit gen aktarım yöntemi olmakla birlikte uygulaması zordur. Yöntem çok yavaş - Tek seferde tek bir hücreye aktarım Zahmetli - Çalışan kişinin el becerisini ve deneyimini gerektirir. Pahalı mikromanipulatör gerektirir Tek bir hücreden bitkinin rejenerasyonu Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 18

19 MAKROENJEKSİYON Aktarılmak istenen DNA yı taşıyan plazmid solüsyonunun fideciklere enjeksiyonu ile gen aktarımı 1987 yılında Pena ve ark. çavdarın (Secale cereale) olgunlaşmamış çiçek meristeminin altındaki gövde bölgesine nptii işaret geni enjekte edilmiştir ve enjeksiyon yapılmış bitkiden elde edilen tohumlar kanamisine direnç bakımından seçilmişlerdir. Bu yöntem, diğer tahıllarda başarılı olarak uygulanamamıştır. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 19

20 KİMYASAL YÖNTEMLERLE GEN TRANSFERİ En geniş çapta kullanılan kimyasal Polietilen glikol (PEG) dür. PEG iyonik olmayan ve suda çözünebilen bir polimerdir. PEG gibi kimyasal maddeler protoplastların plazma membranının geçirgenliğini geri dönüşümlü olarak arttırabilir. Bu sayede, DNA nın nukleus içine girmesi ve genom içerisine entegre olması gerçekleşir. (PEG ayrıca, lipozom alınımını teşvik eder ve elektroporasyonun etkinliğini artırır.) Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 20

21 KİMYASAL YÖNTEMLERLE GEN TRANSFERİ PEG aracılı transformasyon; İzole edilen protoplastlar aktarılmak istenen DNA ile karıştırılır ve ardından divalent katyon içeren bir tamponda çözünmüş olan %14-20 PEG eklenir ve daha sonra bu karışım inkübe edilir (Protoplastlar divalent katyonların yokluğunda kararsızdırlar). Protoplastlar yıkanır ve daha sonra kültürleme için petri kaplarına aktarılır. (Birçok çalışmada, PEG aracılı transformasyonda Ca+2 ve Mg+2 etkinlikleri karşılaştırmış, Mg+2 daha üstün bulunmuştur.) Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 21

22 KİMYASAL YÖNTEMLERLE GEN TRANSFERİ Önemli parametreler: Karışımdaki PEG konsantrasyonu Kullanılan tuzların bileşimi ve konsantrasyonu Solüsyonun ph sı Yabancı DNA nın konsantrasyonu Kullanılan DNA molekülünün formu ve boyutu Bitki türü Kültürleme koşulları Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 22

23 KİMYASAL YÖNTEMLERLE OLUMLU YÖNLERİ: GEN TRANSFERİ Basit bir yöntem Birçok örneğe eşzamanlı uygulama Ucuz (Pahalı olmayan ekipman) Geniş çapta bitki türlerine kolayca uygulanabilir OLUMSUZ YÖNLERİ: Protoplastların kullanımını gerektirdiği için elverişsizdir (Protoplastların yaşayabilirliği düşük) Düşük transformasyon etkinliği (%1-2) Rejenerasyon güçlüğü Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 23

24 LİPOZOMLARLA GEN TRANSFERİ Lipozomlar; yapay olarak üretilen çift tabakalı fosfolipid kürecikleri 1960 lı yıllarda keşfedildi. Fosfolipid molekülleri sulu ortamda kendiliğinden lipozomları oluşturur. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 24

25 LİPOZOMLARLA GEN TRANSFERİ Lipozomların farklı materyalleri kapsüle etme yetenekleri ve lipozom teknolojisindeki gelişmeler, aktif ajanların hücre içerisine alınımında lipozomların kullanılmasında bir artışa yol açmıştır (antikanser ilaçları, aşı adjuvanı, antienfektif ajanlar; gen aktarımı) (Lipozomların hücrelerle füzyonu PEG gibi kimyasallarla teşvik edilir ) Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 25

26 LİPOZOMLARLA GEN TRANSFERİ Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 26

27 LİPOZOMLARLA GEN TRANSFERİ DNA taşıyan lipozomların bitki protoplastlarının hücre zarı ile füzyonu sonucu bitkilere gen aktarımı gerçekleşebilmektedir. Lipozomların hücre zarı ile füzyonu ve endositoz sayesinde DNA molekülünün hücre içine alınımı gerçekleşir. Lipozom aracılı transformasyon, transformasyon karşımında katyonlar gibi pozitif yüklü ajanlar veya katyonik lipozom preparatları kullanılarak gerçekleştirilir. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 27

28 OLUMLU YÖNLERİ: LİPOZOMLARLA GEN TRANSFERİ DNA nın lipozomlar tarafından korunması nedeniyle büyük boyutlu plazmidlerin (19 kb den büyük) entegrasyonu etkin biçimde gerçekleşir. DNA/RNA nın nükleaz sindiriminden korunması (kapsüllenme yoluyla) Düşük hücre toksisitesi Düşük maliyet Çeşitli bitki hücre tiplerine uygulanabilir. OLUMSUZ YÖNLERİ: Zahmetli ve düşük etkinlikli Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 28

29 ELEKTROFOREZ DNA nın taşınmasına neden olan ve analitik amaçlarla kullanılan bir yöntemdir. Bununla birlikte, 1980 li yıllarda arpa tohumlarıyla yapılan çalışmalarda elektroforez yöntemiyle hücre duvarından genlerin geçişi sağlanmıştır. Platin elektrodlarla delinmiş arpa tohumlarının CaMV promotörü ve bakteriyel - glukuronidaz geni taşıyan pbi221 plazmid DNA sıyla elektroforez transformasyonu sonrasında çimlenen embriyolarda - glukuronidaz etkinliği saptandı (Rejenerasyon problemi meydana gelmedi). Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 29

30 ELEKTROFOREZ Elektroforez aracılı transformasyonun etkinliği birçok faktöre bağlıdır: Elektrik alanın parametreleri (En sık kullanılan parametreler: 15 dk, 0.5 ma amper ve 25 mv voltaj) Elektroforez süresine Elektroforez tamponunun içeriğine Embriyo dokusunun fizikokimyasal özelliklerine Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 30

31 ELEKTROFOREZ Elektroforez transformasyonu, birçok bitkinin tohumlarında ve kallus parçalarında etkin bir yöntemdir. Elektroforez, basit ve göreceli ucuz maliyete karşılık muamele edilen embriyoların zayıf yaşayabilirliği nedeniyle bitki transformasyonunda yaygın olarak kullanılmamaktadır. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 31

32 MİKROLAZER Lazer ışığının hücre zarı ve duvarında delik oluşumuna yol açaması ile ortamdaki DNA nın hücre içerisine aktarımının gerçekleşmesi Olumsuz yönü; DNA nın hücre duvarına absorbsiyonu sonucu DNA nın hücre içerisine giremeyişi Diğer doğrudan yöntemlerin uygulanamayacağı durumlarda alternatif bir yöntem Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 32

33 POLEN TÜPÜ YOLU İLE GEN TRANSFERİ Tozlaşmanın ardından DNA nın kesilmiş stigma yüzeyine uygulanması ile gen transferinin gerçekleşmesi (DNA nın polen tüpünden geçerek ovule varması). İlk olarak pirinç transformasyonunda uygulandı (Oldukça yüksek sıklıkta transgenik bitki elde edildi). Sonraları, buğday, soya, Petunia hybrida ve karpuz gibi diğer türler için de kullanıldı. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 33

34 ZİGOTİK EMBRİYOYA DNA EMDİRİLMESİ İzole edilen embriyoların DNA solüsyonu ile muamelesi sonrasında DNA transferinin gerçekleşmesi Embriyoları izole etmek için uygulanan işlemlerin belirli ölçülerde hücrelere zarar vermesi ile DNA nın hücrelere girişinin kolaylaşması Yeterli düzeyde geçici gen anlatımı elde edilememiştir. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 34

35 SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ Silikon karbid sert seramik bir maddedir ve kırıldığı zaman kolayca keskin kenarlar oluşmaktadır. Silikon karbid fiberler µm uzunluğunda ve 0.6 µm çapında mikrofiberlerdir. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 35

36 SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ Bitki materyali (süspansiyon kültüründeki hücreler, embriyolar ve kalluslar gibi) DNA ve silikon karbit fiberler içeren tampon içerisine aktarılır ve daha sonra kuvvetli bir biçimde karıştırılır. Silikon karbid fiberler ve süspansiyon hücreleri arasındaki çarpışma sonucu fiberler hücre duvarına ve plazma membranına delik açılmasına neden olur ve böylece DNA nın hücre içerisine girişi sağlanır ve bitki hücrelerinin kararlı transformasyonu gerçekleşir. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 36

37 SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ Scanning elektron mikroskobu ile fiber muameli bitki hücrelerinde bu ince fiberlerin hücre duvarını penetre etme yeteneğini açıkıça gösterilmektedir. Embriyonik mısır kallusunun silikon karbid fiberler aracılı transformasyonunun Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 37

38 SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ 1994 yılında Frame; silikon karbid fiberler aracılığıyla embriyonik mısır süspansiyon kültürü hücrelerini bakteriyel bar ve gus genleri taşıyan plazmid DNA sıyla transforme etti. Transforme edilmiş hücreler bialafos herbisidi içeren besiyerinde seçildi. Analiz edilen tüm bialafos dirençli kallus hatlarında bar geninin girişi ve pat enziminin etkinliği onaylandı. Verimli transgenik mısır bitkileri rejenere edildi Herhangi bir türdeki transgenik bitki üretiminin ilk raporudur. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 38

39 SİLİKON KARBİD FİBERLER Fiberler aracılı mısır transformasyonu: ARACILI DNA TRANSFERİ (a) Işık mikroskobu altında, süspansiyon hücrelerinin silikon karbid fiberler aracılı transformasyonu (b) Transformasyondan sonra hücrelerde geçici GUS ekspresyonu (c) Bialafos dirençli kallus (d) Püskül oluşumu (e) Fiberler aracılı transforme edilen mısır bitkisi (f) Herbisit püskürtülmesinden 2 hafta sonra R1 soyu (Transforme olmamış kontrol bitkileri 4 gün içinde şiddetli nekrosis gösterdi ve kısa sürede öldü, transgenik bitkiler ise yeşil ve sağlıklı). Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 39

40 SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ Fiberler kullanılarak; Mısır, tütün, pirinç, buğday, Lolium multiflorum, Lolium perenne, Festuca arundinacea ve Agrostis stolonifera nın transformasyonu gerçekleşti. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 40

41 SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ Bu yöntemin etkinliği: Fiberin boyutuna Vorteksleme parametrelerine Bitki materyaline Bitki hücrelerinin karakteristiğine Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 41

42 SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ OLUMLU YÖNLERİ Hızlı Kolay Ucuz yöntem Çeşitli bitki materyalleri için kullanışlı Hücre duvarını uzaklaştırmaya gerek yok Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 42

43 SİLİKON KARBİD FİBERLER ARACILI DNA TRANSFERİ OLUMSUZ YÖNLERİ Düşük transformasyon etkinliği Hücrelerde meydana gelen hasar rejenerasyon yeteneğini olumsuz etkiler. Laboratuvar çalışmaları sırasında çok fazla özenli önlem protokollerine uyma gereği vardır (Fiberleri solumak önemli solunum hastalıklarına neden olabilir). Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 43

44 SONİKASYON Ses dalgalarının hücreler arası ve hücre zarında boşluklar açarak serbest DNA parçalarının hücre içerisine girişini sağlayan bir yöntem Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 44

45 SONİKASYON 1990 yılında Joersbo ve Brunstedt tarafından rapor edildi: 35 S promotörüyle birleşen CAT (kloramfenikol asetil transferaz) geni içeren plazmidin varlığında 20 khz ultrasona kısa maruz bırakma uygulanması yoluyla şeker pancarı ve tütün protoplastlarına DNA girişi gerçekleşti. Hafif sonikasyon (20 KHz ultrason) DNA aktarımını kolaylaştırmak için kullanıldı. Bu yöntem, aynı materyal için elektroporasyon yönteminden daha üstün bulundu (Elektroporasyon sisteminden daha kolay bir yöntem). Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 45

46 DESİKASYON Dokuların: Önce soldurulması Daha sonra aktarılmak istenen DNA nın da bulunduğu bir ortamda tekrar su alımı DNA nın hücre içerisine aktarımı Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 46

47 SONUÇ Bitkilerde gen transferi, bazı özel gen dizilerinin bitki hücrelerine genetik mühendisliği yöntemleri kullanılarak aktarılmasıdır. Bu gen transfer yöntemleri, nükleik asitlerin sırasıyla bitki hücre duvarından, plazma ve nukleus zarından geçerek hücrenin canlılığına zarar vermeyecek şekilde geliştirilmiştir. Doğrudan gen transfer yöntemlerinin Agrobacterium sistemine göre üstünlükleri; çeşitli bitki türlerine uygulanabilmesi ve aktarılan genin anlatımının kısa bir süre içerisinde saptanabilmesidir. Bitkilere gen aktarımı ile; çeşitli çevresel baskılara, bakteriyel, viral ve fungal hastalıklara, herbisitler ve pestisitler gibi çeşitli kimyasal bileşiklere dayanıklılık özelliği kazandırılması Tahılların besin kalitesinin arttırılması, bitkilerin sekonder metabolitler, antibiyotikler ve aşılar gibi ilaç endüstrisinde kullanılan maddeleri bol miktarda üretmeleri Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 47

48 TEŞEKKÜR EDERİM. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 48

49 REFERANSLAR PETOLİNO, J.F., HOPKİNS, N.L., 2000, Whisker-mediated transformation of embryogenic callus of maize, Plant Cell Reports, 19: FRAME, B. R., 1994, Production of fertile transgenic maize plants by silicon carbide whisker-mediated transformation, The Plant Journal, 6(6), ÖZCAN, S.,BABAOĞLU, M., 2001, Bitki Biyoteknolojisi II, Genetik Mühendisliği ve Uygulamaları, Selçuk Üniversitesi Basımevi AHOKAS, E., 1989, Transfection of germinating barley seed electrophoretically with exogenous DNA, Theor Appl Genet, 77: LIU, Y., 2006, Ultrasound: Mechanical gene transfer into plant cells by sonoporation, Biotechnology Advances, TROJANOWSKA, M.R., 2002, Alternatıve methods of plant transformatıon-a short review, Cellular & Molecular Bıology Letters, Volume 7, pp MATHUR J., 1998, PEG-Mediated Protoplast Transformation with Naked DNA, Methods in Molecular Biology, Vol. 82. JOERSBO, M., 1990, Direct gene transfer to plant protoplasts by mild sonication, Plant Cell Reports (1990) 9: Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 49