Doğrudan gen aktarım teknikleri

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "Doğrudan gen aktarım teknikleri"

Fidan Tarcan
7 yıl önce
İzleme sayısı:

1 Doğrudan gen aktarım teknikleri

2 Niçin gen aktarımı Tarımsal üretim Kaliteli ürün Dayanıklı çeşit

3 Klasik ıslah & genetik mühendisliği Tarımsal üretimi artırmak

4 Gen aktarımının diğer hedefleri Tahılların besin kalitesinin artırılması ve gıda dışındaki sektörler için hammadde olarak kullanılan nişasta, protein ve yağ kalitesinin geliştirilmesi Bitkilerin sekonder metabolitler, antibiyotikler ve aşılar gibi ilaç endüstrisinde kullanılan değerli maddeleri bol miktarda üretmeleri Toprak su, ışık ve gübre gibi ucuz gereksinimleri nedeniyle mikroorganizmalar veya hayvan hücrelerine alternatif olarak yabancı kaynaklı genlerin aktarılmasıyla,bitkilerde heterolog proteinlerin üretimi

5 Gen aktarımının prensibleri

6 Klasik ıslah Seleksiyon Doku kültürü in vitro suz seleksiyon in vitro lu seleksiyon

7 Fonksiyonel olarak belirlenmiş doğal yada sentetik nükleik asit dizilerinin bitki hücrelerine genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak aktarılmasıdır. Genetik transformasyon insersiyon Yabancı nükleik asit molekülü entegrasyon ekspresyon taşınması

8 Genetik transformasyonda kullanılan alıcı hücreler Başarılı bir genetik transformasyon, aktarılacak geni kabul edip sonra bölünme ve değişme ile tam bir bitki haline gelebilecek hedef hücrelere bağlıdır. Doku kültürü teknikleri kullanılarak, yaprak, gövde, hipokotil, kotiledonlar, embriyolar, üreme hücreleri yada kallus, süspansiyon ve protoplast kültürüne ait hücreler 1. Alıcı hücrelerin fizyolojisi (totipotent) transformasyon ve rejenerasyon için bir bitki hücresinin yeterlilik göstermesi, bitkinin genotipine,fizyolojik durumuna ve gelişim evresine bağlıdır. 2. somaklonal varyasyon: rejenerasyon sürecinde hücrelerin genetik stabilitelerinin bozulması ve genetik varyasyonun oluşmasıdır.

9 promotor Seçici işaret gen Transgenik bitki Raportör gen

10 Aktarılan nükleik asit moleküllerinin özellikleri Bitkilere aktarılan nükleik asit molekülleri basit yapıdadırlar. Genellikle aktarılacak DNA parçası, aktarılmak istenen gene ilave olarak promotorlar Markör geni Raportör gen Bitkiye akatarılmak istenen genin bu gerekli dizileri içerecek hale getirilmesi için öncelikle in-vitro rekombinasyon teknikleri kullanılarak uygun düzenlemeler yapılır.

11 Promotorlar Bitki virüs veya bakteri kökenli olabilirler. Bazıları konstitütif (sürekli), bazılarıda doku- veya organa spesifik etkiye sahiptirler veya ifadeleri çevre koşullarından başlatılır. En yaygın kullanılan promotor CaMV-35S dır.

12 Seçici işaret genleri Bir gen aktarımı çalışmasında transformatların yabancı DNA yı almamış doku veya hücrelerden ayırt edilebilmesi için aktarılan DNA da seçici işaret genlerinin bulunması lazım nptii Neomisin fosfotransferaz kanamisin neomisin paramomisin G418 Hpt veya aphiv- Higromisin fosfotransferaz higromisin Herbisit Bar- Fosfonotrisin asetil transferaz - fosfonitrisin

13 Raportör genler Ürünü bir enzim olmalı ve konakta endojen aktiviteye sahip olmamalı. Gen veya gen ürünleri genetik ve biyokimyasal olaral iyi karakterize edilmiş olmalı. Gen ürünü farklı fizyolojik koşullarda stabil olmalı. Enzimatik aktivite kolaylıkla saptanabilmeli ve ölçülebilmeli. Ifadesi gen aktarımı yapılmış hücrelerde kolaylıkla gözlenebilen bir fenotipik değişikliğe neden olmalıdır.

14 Gen aktarım metodları Fiziksel Kimyasal Biyolojik BİTKİ Mikroenjeksiyon Biyolistik - gene gun/ particle bombardment Elektroporasyon Silica/carbon fibers Lazer mediated PEG DEAE-dextran Calcium phosphate Artificial lipids Proteins A. Tumefaciens A. Rhizogenes

15 Transformation Plants - physical methods Microinjection Electroporation Biolistics - gene gun Silica/carbon fibers Lazer mediated SAT

16 Microinjection of GOI

17 This electroporator is for low-current applications such as those using small electrodes

18 BiYOLİSTİK / PARTİKÜL BOMBARDIMANI

20 Biological Transformation Agrobacterium tumefaciens & Agrobacterium rhizogenes

22 Agrobacterium Agrobacterium (disease symptomology and host range) A. radiobacter - avirulent species A. tumefaciens - crown gall disease A. rhizogenes - hairy root disease B. rubi - cane gall disease C. vitis - galls on grape and a few other plant species Otten et al., 1984

23 Cellular process of Agrobacterium host interaction Tzvi Tzfira and Vitaly Citovsky, 2002, Trends in Cell Biol. 12(3),

27 Transgenik bitkilerin üretimi Istenilen genin klonlanması DNA segmentinin yerleşmesi seçici marker eklemek Bitki hücrelerine geni aktarmak Transgenik bitkileri seçmek Rejenerasyon

28 T 0 bitkilerin analizi Morfoloji Fizyoloji VERİM GUS expression Gen expression Seçici markörle doğrulama, Negative & Positive kontrol

29 Gen aktarım yöntemlerinin karşılaştırılması: Agrobacterium avantaj: -yüksek derecede etkinlik -Uzun DNA dizilerinin aktarılabilmesi - çoğunlukla tek yada az sayıda T-DNA entegrasyonu -Uygulama için özel bir donanıma ihtiyaç yoktur. dezavantaj: - sınırlı konukçu alanı - genetik bilginin sadece T-DNA aracılığıyla aktarımı

30 KİMYASAL YÖNTEMLER VE ELEKTROPORASYON: avantaj: -Basit kullanım -tek denemelerde birçok örneğe uygulanabilirlik - kimyasal yöntemler için özel bir donanıma ihtiyaç yoktur. dezavantaj: - aktarılan DNA da yüksek derecede yeni düzenlemeler görülmesi ve çok sayıda kopyanın entegrasyonu - Kimyasal yöntemlerle transgenik bitki üretimi için protoplast kültürü ve rejenerasyon sistemlerinin kurulması -somaklonal varyasyonda artış

31 Mikro-enjeksiyon: avantaj: dezavantaj: -genotipden bağımsız olarak kullanım -çok çeşitli hedef ve dokulara uygulanabilirlik - uygulamada görsel kontrol olanağı - kompleks ve pahalı donanım gereksinimi - başarı için deneyim gerekliliği

32 Biyolistik: avantaj: -genotipden bağımsız olarak kullanım -farklı hedef ve dokulara uygulanabilirlik - transgenik tahıl elde etmek için güçlü yöntem olması dezavantaj: - kompleks ve pahalı donanım gereksinimi - aktarılan DNA da yüksek derecede yeni düzenlemeler görülmesi ve çok sayıda kopyanın integrasyonu

33 Golden rice contains increased levels of pro-vitamin A. Traditional rice is white (a). The prototype of golden rice was developed in 2000 and is a light yellow color (b). It contains 1.6 mg/g of carotenoid. In 2005, new transgenic lines were developed that dramatically increased the amount of carotenoid synthesized, making the rice a deep golden color (c). This latest form contains 37 mg/g of carotenoid, of which 84% is b-carotene trial

Benzer belgeler

TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİYE GİRİŞ

TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİYE GİRİŞ Bitki Doku Kültürü Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TB101 Çiğdem Yamaner (Yrd. Doç. Dr.) 4. Hafta (08.10.2013) ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü