Prof. Dr. Murat KARTAL

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİYTEKNLJİ ENSTİTÜSÜ TEMEL BİYTEKNLJİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYTEKNLJİK YÖNDEN ÖNEMLİ TIBBİ BİTKİLER VE BİTKİSEL ÜRÜNLERDE KALİTENİN BELİRLENMESİ Selin IŞIK Danışman Öğretim Üyesi Prof. Dr. Murat KARTAL ANKARA 2010

2 ÖZET Biyoteknolojik Yönden Önemli Tıbbi Bitkiler Ve Bitkisel Ürünlerde Kalitenin Belirlenmesi Bu çalışmada Silybum marianum tohumlarının doku kültürü ile kallusları üretilmiş ve kallusların esktraksiyonu sonucunda elde edilen ekstreler YBSK ile analiz edilmiştir. leuropein tayini ile ilgili olarak yaptığımız çalışmada farklı bölgelerden alınan lea europaea (zeytin yaprağı) örneklerinin Avrupa Farmakopesi ne göre ekstraksiyonu yapılarak, elde edilen ekstreler yine Avrupa Farmakope sinde belirtilen yöntemle analiz edilmiştir. Camellia sinensis analizinde ise atıklarının değerlendirilmesi amacıyla ÇAY-KUR işletmelerinden alınan çay odası atıkları ve fırın lifleri Soxhlet apareyi kullanılarak su ile ekstre edilmiştir. Daha sonra elde edilen kuru tozdaki kateşin varlığı ve miktarı HPLC yöntemi kullanılarak standart yeşil çay yaprak ekstresi ile karşılaştırılmıştır. Elde edilen ekstrede kateşin türevi bileşikler yüksek oranda saptanmıştır. Sonuçlar değerlendirildiğinde; çayın işlenmesi sırasında oluşan fabrika atıklarının değerlendirilerek çay yaprak ekstresi elde edilebileceği, ilaç, gıda ve kozmetik endüstrisinde değerlendirilerek ekonomiye kazandırılabileceği kanısına varılmıştır. Kurutulmuş ve öğütütülmüş Melissa officinalis ve Rosmarinus officinalis yapraklarının Avrupa Farmakopesi nde belirtilen yöntemler çerçevesinde ekstraksiyonu yapılmış ve elde edilen bu ekstreler UV spektrofotometresi kullanılarak yine Avrupa Farmakopesi nde belirtilen yöntemler dahilinde rozmarinik asit yüzdesi analiz edilerek sonuçlar değerlendirilmiştir. Anahtar Sözcükler: Kalite, Analiz, Biyoteknolojik bitkisel ürünler, Tıbbi Bitkisel ürünler

3 ABSTRACT Quality Control of Herbals and Herbal Products on Biotechnologically Important Medicinal Plants In this study, callus tissues of the Silybum marianum seeds are produced with cell culture and the extracts which are obtained from extraction of Silybum marianum callus tissues, were analyzed by HPLC. Analysing of lea europaea, olive leaves which are taken from different regions were extracted by according to the European Pharmacopeiae and the extracts were analyzed by the HPLC with the method indicated in European Pharmacopeiae. Camellia sinensis analysis, tea room wastes and oven fibers taken from ÇAY-KUR management with the aim of recycle tea wastes extracted with water using soxhlet aparey. The presence and amount of catechin in dry powder compared with standardized green tea extract by HPLC. In this extract catechin derivatives compounds determined in high rates. When the results were evaluated; tea leaves extract can obtained from factory waste formed during the proccessing of tea, and also these wastes can be used in food, drug and cosmetic industry, in this way they may contribute to the economy. Dried and powdered Melissa officinalis and Rosmarinus officinalis leaves are extracted according by specified methods of European Pharmacopeia and these extracts rosmarinic acid percentage were analysed with UV Spectrophotometer by using European Pharmacopeia. Key words: Quality, Analysis, Biotechnological herbal products, Herbal medicinal products

4 ÖNSÖZ Tez konumu belirleyen ve çalışmalarımın her aşamasında beni destekleyen ve hiçbir yardımını esirgemeyerek bana hocalıktan ziyade ağabeylik yapan çok değerli hocam sayın Prof. Dr. Murat KARTAL a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Doku kültürü çalışmalarımda benden yardımlarını esirgemeyen Zonguldak Karaelmas Üniversitesi ndeki hocam sayın Dr. Hatice ÇÖLGEÇEN e teşekkür ederim. YBSK hakkında bana bildiğim her şeyi öğreten çok değerli arkadaşım Uzm. Ecz. Mahmoud ABUASAKER e teşekkür ederim. Hayallerimi ve ideallerimi gerçekleştirmem uğruna benden hiçbir desteği esirgemeyen annem Aysel AKBAŞ a, babam Şehmuz AKBAŞ a ve kardeşlerim Seda ile Esra ya sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Son olarak tez çalışmalarım yüzünden sergilediğim stresli yapıya büyük bir sükunetle katlanan ve benden hiçbir desteğini esirgemeyen hayat arkadaşım, biricik eşim sayın Serhat IŞIK a teşekkürü bir borç bilirim.

5 İÇİNDEKİLER KABUL VE NAY ÖZET ABSTRACT ÖNSÖZ İÇİNDEKİLER ÇİZELGELER DİZİNİ KRMTGAMLAR DİZİNİ ŞEKİLLER DİZİNİ i ii iii iv v vi vii viii 1. GİRİŞ AB Ülkelerinde Tıbbi Bitkisel Ürünlerle İlgili Harmonizasyon Çalışmaları Bitkisel Drog Tanımı Bitkisel Drog Preparatı Tıbbi Bitkisel Ürün Ekstre Tanımı ve Ekstrelerin Sınıflandırılması Bitkisel Ekstrelerin İçerdiği Bileşiklerin Bilinen Etkilerine göre Sınıflandırılması Standardize Ekstreler Miktarı Ayarlanmış Ekstreler Diğer Ekstreler Standardizasyon Kullanılan Bitkilerin Etken Bileşiklerinin Analiz Yöntemleri Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi (YBSK / HPLC) Sıvı Kromotografisi- Kütle Spektrometresi (SK-KS/LC-MS) Sprey Dryer KURAMSAL TERİLER Kaynak Özetleri Çalışması Yapılan Bitkiler Hakkında Genel Bilgiler Silybum marianum L Tarihçesi Bitkinin Sistemetikteki Yeri Asteraceae (Compositae) familyası 20

6 Silybum cinsi Silybum marianum L Kimyasal Bileşikler Flavonolignanlar Sabit Yağlar Diğer Bileşikler Melissa officinalis L Melissa officinalis Genel Bilgi Bitkinin Sistematikteki Yeri Labiatae (Lamiacea) Familyası Melissa Cinsi Melissa officinalis Fitokimyasal Çalışmalar Uçucu Bileşikler Fenolik Bileşikler Triterpenik Asitler Camellia sinensis L Camellia sinensis Genel Bilgi Theaceae Familyasının Botanik Özellikleri Camellia L. Cinsinin Botanik Özellikleri Camellia sinensis (L.).Kuntze Bitkisinin Botanik Özellikleri Kimyasal Bileşikler Flavonoitler Rosmarinus officinalis L Rosmarinus officinalis L. Hakkında Genel Bilgi Labiatae (Lamiacea) Familyası Botanik Bilgi Rosmarinus Cinsi Rosmarinus officinalis Kimyasal Özellikleri lea europaea L. (Zeytin Yaprağı) lea europaea L. Hakkında Genel Bilgi lea europaea L. Bitkisinin Sistematikteki Yeri lea L. Cinsinin Genel Özellikleri 50

7 lea europaea L. Türünün Özellikleri lea europaea L. Bitkisinin Kimyasal Bileşenleri Sekoiridoitler Triterpenler Fenolik Asitler ve Türevleri Fenolik Alkoller ve Türevleri Flavonoitler Uçucu Bileşikler Diğer Bileşikler MATERYAL VE METT Silybum marianum L Doku Kültürü İçin Hormonsuz MS rtamının Hazırlanması ph Ayarlaması MS rtamında Kullanılan Majör Tuzlar ve Hazırlanışı MS rtamında Kullanılan Minör Tuzlar ve Hazırlanışı MS rtamında Kullanılan Demir Stok ve Hazırlanışı MS rtamında Kullanılan Vitamin Stok ve Hazırlanışı Tohum Ekimi Kültür İçin Hormonlu MS rtamların Hazırlanışı Bitki Büyüme Hormonları Stoklarının Hazırlanışı ph Ayarlaması Eksplant Ekimi YBSK ile Silybum marianum L. Doku Kültürlerinin Analizi Doku Kültürlerinin Ekstrelerinin Hazırlanması Hesaplama Formülü lea europaea L Zeytin Yapraklarından Ekstrelerin Eldesi Hazır Zeytin Yaprağı Preparatlarından Ekstrelerin Eldesi Standart Çözeltilerinin Hazırlanması YBSK ile leouropein Analizi Hesaplama Formülü Camellia sinensis L Camellia sinensis Bitkisinin Yapraklarından Çay Yaprak Ekstresi Hazırlanması 83

8 Spray Dryer Kullanılarak Standart Çay Yaprak Ekstresinden Kuru Toz Eldesi YBSK Yöntemi ile C. sinensis Ekstresinin Analizi Rosmarinus officinalis L Rosmarinus officinalis in UV Spektrofotometre Analizi Stok Çözeltinin Hazırlanması Karşılaştırma Çözeltisinin Hazırlanması Test Çözeltisinin Hazırlanması Hesaplama Formülü Melissa officinalis L Melissa officinalis in UV Spektrofotometre Analizi Stok Çözeltinin Hazırlanması Karşılaştırma Çözeltisinin Hazırlanması Test Çözeltisinin Hazırlanması BULGULAR Camellia sinensis L Spray Dryer Bulguları YBSK Bulguları lea europaea L leuropein Standardının Kromotogram Alanları ve rtalamaları Zeytin Yapraklarından Elde Edilen Ekstrelerin Analiz Sonuçları Hazır Preparatlardan Elde Edilen Ekstrelerin Analiz Sonuçları YBSK Analiz Sonuçlarının Kromotogramları Silybum marianum L Rosmarinus officinalis L Melissa officinalis L TARTIŞMA SNUÇ VE ÖNERİLER 101 KAYNAKLAR 102 ÖZGEÇMİŞ 108

9 ÇİZELGELER Çizelge 1. Çay yaprağının kimyasal bileşimi 39 Çizelge 2. Farklı çay tiplerinin fenolik madde kompozisyonu 40 Çizelge 3. Davis e göre lea europea varyetelerinin ayırıcı özellikleri 52 Çizelge 4. Majör tuzların stok miktarları 73 Çizelge 5. Minör tuzların stok miktarları 73 Çizelge 6. Demir ortamının hazırlanması için gereken maddelerin miktarları 74 Çizelge 7. Vitamin stokunun hazırlanması için gereken maddelerin miktarları 74 Çizelge 8. Büyüme hormonlarının ortamlara göre eklenme miktarları 76 Çizelge 9. Avrupa Farmakopesi 6.0 da belirtilen gradient yönteme göre mobil faz değişimi 78 Çizelge 10. Hazırlanan 5 ortama ait meristemlerin ağırlıkları 80 Çizelge 11. leuropein analizi için gradient yönteme göre mobil faz değişimi 82 Çizelge 12. Camellia sinensis analizi için gradient yönteme göre mobil faz değişimi 84 Çizelge 13. Yeşil çay ekstresinin Sprey Dryer ile eldesi sırasında yapılan denemeler 88 Çizelge 14. leuropein analiz sonuçları 91 Çizelge 15. Zeytin yapraklarından elde edilen ekstrelerin analiz sonuçları 92 Çizelge 16. Hazır preparatlardan elde edilen ekstrelerin analiz sonuçları 92 Çizelge 17. Silybum marianum doku kültürlerinin analiz sonuçları 96 Çizelge 18..europaea bitkisinin yapraklarında belirlenen oleuropein miktarları 99

10 KRMTGRAMLAR Kromotogram 1. Standardize yeşil çay ekstresi YBSK kromotogramı 89 Kromotogram 2. Standardize yeşil çay ekstresine ait majör kateşin türevi bileşiğin UV spektrumu 89 Kromotogram 3. Çay artıklarından elde edilen ekstreye ait kromotogram 90 Kromotogram 4. Çay atıklarından elde edilen ekstreye ait majör kateşin türevi bileşiğinin UV spektrumu 91 Kromotogram 5. leuropein standardının YBSK kromotogramı 93 Kromotogram 6. Kilis zeytin örneğinin YBSK kromotogramı 93 Kromotogram 7. Kilis 2 yaş örneğinin YBSK kromotogramı 94 Kromotogram 8. Nizip zeytin örneğinin YBSK kromotogramı 94 Kromotogram 9. Gemlik zeytin örneğinin YBSK kromotogramı 95 Kromotogram 10. Kuzey Kıbrıs zeytin örneğinin YBSK kromotogramı 95

11 ŞEKİLLER Şekil 1. Basit bir Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi düzeneği 11 Şekil 2. Kütle Spektrometresinin çalışma prensibi 13 Şekil 3. Mini Spray Dryer genel görünümü 15 Şekil 4. Üç farklı çay çeşidinin sulu infüzyonları 36

12 1. GİRİŞ Tıbbi bitkiler ve onlardan hazırlanan preparatlar ilk çağlardan beri kullanılmakta ve kullanılmaya devam etmektedir. Tıbbi bitkilerden hazırlanan ve modern ilaç formları kullanılarak hazırlanan bu preparatlara günümüzde farklı ülkelerde bitkiseller, bitkisel ilaçlar, fitofarmasötikler, fitoterapötikler, ve geleneksel ilaçlar gibi farklı isimler verilmektedir. Ancak son zamanlarda Avrupa Birliği ülkelerinde ortak bir terim kullanmak amacıyla EMEA (Avrupa İlaç Değerlendirme Ajansı) tarafından bu tür ürünlere Herbal Medicinal Products (Tıbbi Bitkisel Ürünler) terimi kullanılması uygun bulunmuştur. Biz de bu terimi; bütün bitkisel ürünleri kapsadığı için daha çok kullanmayı tercih ettik. Ancak zaman zaman bitkisel ilaç terimi de kullanılan literatüre bağlı kalmak için kullanılmıştır (Kartal, 2004) lerin başında Dünya sağlık teşkilatı (WH) yaptığı bir araştırmada, dünya nüfusunun %80 inin temel sağlık gereksinmeleri için bitkisel ürünleri kullandığını bildirmiştir. Avrupa da bitkisel ürünlere olan ilginin artması AB ülkelerinde standartların uyumlaştırılması konusunu da gündeme getirmiştir. Bu konuda Mayıs 1997 den başlayarak; Avrupa Parlamentosu ve Avrupa Komisyonu; EMEA Bünyesinde Tıbbi Bitkisel Ürünler Çalışma Grubunu kurarak harmonizasyon çalışmalarının başlamasını sağlamıştır (Kartal, 2004). Tıbbi Bitkisel Ürünler en basit olarak şu şekilde tarif edilebilir: Bitkiler veya bitkilerin çeşitli kısımlarının, direkt olarak veya çeşitli işlemlerden geçirildikten sonra ticarete sunulmak üzere ambalajlanmış olan tıbbi ürünler veya farmasötik preparatlardır. Hastalıkları iyileştirmek, şiddetini hafifletmek, hastalıklardan korunmak, tedaviye yardımcı olmak veya teşhis amacıyla kullanılmaktadır (Kartal, 2004).

13 1.1. AB Ülkelerinde Tıbbi Bitkisel Ürünlerle İlgili Harmonizasyon Çalışmaları 20 Aralık 1995 de AB Bakanlar Konseyi; Avrupa Komisyonunu, AB içinde tıbbi bitkisel ürünlerin durumunu araştırması için görevlendirdi. Konseyin birinci amacı halk sağlığını korumak, bu alandaki endüstrinin gelişimini kolaylaştırmak ve AB içinde bu tıbbi ürünlerin serbeste dolaşımının gelişmesine yardımcı olmaktır (AEGSP, 1999). Mayıs Avrupa Parlamentosu ve Avrupa Komisyonu; EMEA Bünyesinde Tıbbi Bitkisel Ürünler Geçici Çalışma Grubunu kurdu (AEGSP, 1999). Şubat Tıbbi Bitkisel Ürünler Çalışma Grubu (HMPWP) EMEA da devamlı statü kazanmıştır. Eylül 2004 den itibaren Tıbbi Bitkisel Ürünler Çalışma grubu yerine Tıbbi Bitkisel Ürünler Komitesi EMEA bünyesinde oluşturulmuştur (Kartal, 2004) Bitkisel Drog Tanımı Droglar bitkisel ya da hayvansal organizmalardan veya çeşitli organların kurutulması sonucu elde edilirler. Bitkisel droglar; bitki, alg, mantar veya likenlerin bütün ya da parçalanmış kısımlarıdır. Farmasötik dilbilimcilere göre; bitkisel droglar kurutulmuş ya da işlenmiş farmasötik preparatların üretiminde kullanılan bitkiler ya da bitkilerin bir bölümüdür (European Pharmacopeia, 2002). Bitkisel droglar; başlıca, genellikle kuru formda bazen de taze, işlem görmemiş liken, mantar, alg, bitkilerin bir bölümü ya da bitkilerden parçalama veya kesme yoluyla elde edilirler (Gaedcke, Steinhoff, 2003).

14 Bitkisel drogların, ikili terim sistemine göre, botanik bilimsel isimler tarafından tanımlanırlar (cins, tür, varyete gibi) ( European Pharmacopeia, 2002) Bitkisel Drog Preparatı Bitkisel Drog Preparatı; Avrupa Farmokopesine göre tüm bitki veya bitki parçalarının; -Mekanik bir işleme tabii tutulmasıyla; (ufalama ya da toz etme) ya da, -Fiziksel bir işleme tabii tutulmasıyla; ekstraksiyon, distilasyon, sıkma, fraksiyonlama, saflaştırma, yoğunlaştırma veya fermantasyonla elde edilir. -Bitkisel drog preparatları; parçalanmış veya toz edilmiş bitkisel droglar, tentürler, ekstreler, uçucu yağlar, sıkılmış usareler ve işlenmiş salgı ürünleri (eksudatlar) dır (European Pharmacopeia, 2002) Tıbbi Bitkisel Ürün Tıbbi Bitkisel Ürün (Fitofarmaka); etkin maddelerinin yalnızca bir veya daha fazla sayıda bitkisel drogdan ya da bir veya daha fazla sayıda bitkisel drog preparatının oluşturduğu veya bir veya daha fazla sayıda bitkisel drog ve bitkisel drog preparatlarının kombinasyonundan oluşan tıbbi ürünlerdir (Gaedcke, Steinhoff, 2003).

15 Ambalajlanmış şekilde ticarete sunulan tıbbi ürünler veya farmasötik preparatlardır. Hastalıkları iyileştirmek, şiddetini hafifletmek, hastalıklardan korunmak, tedaviye yardımcı olmak veya teşhis amacıyla kullanılmaktadır ( Kartal, 2004). Digitoksin ve mentol gibi bitkilerden izole edilen saf bileşiklerden hazırlanan ilaçlar, homeopatik ürünler, tıbbi bitkisel ürün sayılmazlar (Gaedcke, Steinhoff, 2003) Ekstre Tanımı ve Ekstrelerin Sınıflandırılması Ekstraksiyon, bir ya da birkaç bileşiğin bulunduğu matrix içerisinden başka bir faza geçiş olayıdır. Materyalin tümü ekstraksiyon fazında çözünmez. Materyal gaz, sıvı ya da katı olabilirken, ekstraksiyon fazı ise genellikle sıvıdır ve bazen katı, süperkritik akışkan ya da nadiren gaz fazı olabilmektedir ( European Pharmacopeia, 2002 ). Ekstreler-Extracta: Ekstreler; sıvı (sıvı ekstreler ya da tentürler) yarı-katı (yumuşak ekstreler) ya da katı (kuru ekstreler) kıvamda preparatlardır. Bitkisel droglardan ya da genellikle kuru halde kullanılan hayvansal maddelerden elde edilirler. Hayvansal veya bitkisel droglardan elde edilen sıvı (sıvı ekstreler ve tentürler), yarı-katı (yumuşak ekstreler) veya katı (kuru ekstreler) yapıdaki preparatlardır, bu da solvanın tümü ya da bir kısmının uçurmasıyla elde edilmektedir (Gaedcke, Steinhoff, 2003).

16 Bitkisel Ekstrelerin İçerdiği Bileşiklerin Bilinen Etkilerine göre Sınıflandırılması Standardize Ekstreler Standardize ekstreler, terapiltik aktivitesi bilinen bileşiklerin istenen miktara ayarlanmasıdır. Ayarlama işlemi, düşük ya da yüksek oranda terapotik etkili bileşik/bileşikler içeren serilerin karıştırılması veya inert yardımcı maddelerle gerçekleştirilir. Standardize ekstrelere örnek olarak Sennae ve Belladon ekstreleri verilebilir (Gaedcke, Steinhoff, 2003) Miktarı Ayarlanmış Ekstreler Miktarı ayarlanmış ekstreler; farmakolojik etki ya da klinik etkiyi artırdığı kabul edilen bileşik/ler üzerinden standardizasyonun yapılmasıdır. Standardizasyon işlemi, sadece benzer spesifikasyonlara sahip ekstrelerin serilerinin karıştırılmasıyla yapılır. Miktarı belirlenmiş ekstrelere en tipik örnek Ginkgo biloba ekstresidir (Gaedcke, Steinhoff, 2003). Miktarı belirlenmiş ekstrelerde ayarlama farmakolojik veya klinik etkiyi artırdığı kabul edilen bileşik/ler üzerinden yapılmaktadır. Terapötik etkiden sorumlu bileşikler üzerinden ya da terapötik etkiyi artırdığı kabul edilen bileşikler üzerinden ekstrelerde ayarlamanın yapılmış olması tarafımızdan bir çeşit standardizasyon olarak kabul edildiğinden miktarı belirlenmiş ekstrelerden standardize ekstre olarak söz etmek daha doğru olacaktır (Gaedcke, Steinhoff, 2003).

17 Diğer Ekstreler Diğer ekstreler, etkili bileşenleri veya kabul edilen terapotik etkisi ile ilgili bileşikleri bilinmeyen ekstrelerdir. Bu ekstreler, kalite kontrol analizleri ve üretim yöntemleri esas alınarak ayarlanır (Gaedcke, Steinhoff, 2003). Bu durumda ekstredeki yapısı bilinen kimyasallar sadece kalite kontrol amacıyla kullanılabilirler. Örnek olarak Kediotu veya Isırgan kökü ekstreleri verilebilir (Başer, 2006) Standardizasyon Son yıllarda standardizasyonun evrensel kabul edilmiş bir açıklaması mevcut değildir. Ancak, temel olarak, ''standardizasyon'', bitkisel drog preparatlarının kalitesinin devamlılığının sağlanması için gerçekleştirilmesi gereken tüm ölçümleri kapsar. Örneğin Almanya da ''standardizasyon''; üretim işlemi sırasında yapılan tüm ölçümleri ve tekrarlanabilir kalitenin sağlanması için yapılan kalite kontrolleri tarif etmektedir (Gaedcke, Steinhoff, 2003). Standardizasyon, Bitkisel Drog Preparatının, etkisi bilinen bir madde veya madde grubunun belirlenmiş miktarının, eksipiyan katarak veya Bitkisel Drog ya da Drog Preparatıyla karıştırılarak ayarlanmasıdır (Başer,2006 ). Standardizasyon, tıbbi bitkisel ürünlerin etkisinin devamlılığı açısından, temel bir gerekliliktir. Bitkisel doğun aktif bileşenleri bilinse de bilinmese de, tıbbi bitkisel ürün olarak sonuçlanan her üretim işleminde standardizasyon önerilir. Bu standardizasyon,

18 -Bitkisel drog (Detaylı drog spesifikasyonu/monograf düzenlenmesi) -Kullanılan ekstraksiyon çözücüsü (tip ve konsantrasyonu) -Uygulanan ekstraksiyon/üretim işlemi (maserasyon, perkolasyon, etc.) -Üretim içi kontroller -Bitkisel drog preparatı (Detaylı ürün spesifikasyonlarının düzenlenmesi) Kalite kontrol yöntemleri uygulanması sonucu ekstrenin piyasaya sürülmesi standardizasyonun başarıyla gerçekleştiğini ve spesifikasyonlara uygun olduğunu kanıtlar. Günümüzde yetkili otoriteler tarafından ruhsat almış her tıbbi bitkisel ürünün standardize ekstre içerdiği kabul edilmektedir (Gaedcke, Steinhoff, 2003) Kullanılan Bitkilerin Etken Bileşiklerinin Analiz Yöntemleri Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi (YBSK / HPLC) Kromotografi bir karışımdaki bileşenlerin biri hareketli diğeri sabit iki faz arasındaki dağılım dengelerine dayanan analiz yöntemidir. Bileşenler hareketli faz tarafından sabit faz üzerinde sürüklernir. Hareketli faz ile etkileşimi fazla olan bileşenin sürüklenme hızı da fazladır ( Wilard ve ark., 1981). Kromotografik yöntemlerde hareketli faz gaz, sıvı ya da süperkritik akışkandır, sabit faz ise sıvı ya da katı olabilir. Kromotografinin sınıflandırılması ise hem hareketli faza (Sıvı kromotografisi-sk/lc) hem de sabit faza (dağılım ve adsorbsiyon kromotografisi) göre yapılabilir. Kromotografik yöntemlerde ayırım, sabit faz sıvı ise dağılım, katı ise adsorbsiyon prensibi üzerinde gerçekleşir. Bunu yanında hareketli faz ile sabit fazın birbirine nasıl temas ettirildikleri esas alınarak başka bir sınıflandırma da (Kolon Kromotografisi ve Düzlemsel Kromotografi) yapılabilir (Skoog ve ark., 1981).

19 YBSK sabit fazı içeren kolonda analizi yapılacak madde ya da karışımın yüksek bir basınçta hareketli faz (sıvı) ile sürüklenmesi prensibine dayanan kromotografik analiz yöntemidir. Analiz örneğini içeren sıvı çözelti sisteme enjeksiyon yoluyla uygulanır ve kolona hareketli fazın akışında çözünerek sürüklenir. Kolondan geçen madde ya da maddelerin çıkışı özel kimyasal ve/veya fiziksel etkileşimler neticesinde belli bir gecikme ile gerçekleşir. Bu gecikmeye retansiyon denir. Maddelerin kimyasal ve fiziksel davranış farkları retansiyon farkı oluşturur ve ayırımı sağlar (Meyer, 1999; Wilard ve ark., 1981). YBSK bütün analitik ayırma yöntemleri arasında en yaygın kullanılanıdır. Bunun nedenleri ise: Duyarlılığı olması Doğruluğu yüksek miktar tayinlerine kolayca uyarlanabilmesi Uçucu olmayan ve sıcakta kolayca bozunan maddelerin ayrılmasında uygun olması Sanayinin, birçok bilim dalının ve halkın birinci derecede ilgilendiği maddelere geniş bir şekilde uygulanabilirliğidir. YBSK nin uygulanabileceği maddelere örnek olarak amino asitler, proteinler, nükleik asitler, hidrokarbonlar, karbonhidratlar, terpenoidler, pestisitler, antibiyotikler, steroitler, metal organik türevler ve çeşitli inorganik bileşikler gösterebilir (Skoog ve ark., 1998). YBSK temel olarak şu kısımlardan oluşur: Rezervuar içinde hareketli fazın olduğu ve hareketli fazın pompa tarafından çekilerek sisteme yönlendirildiği ilk birimdir. Hareketli faz olarak kullanılacak çözücü ve çözücü karışımları sabit fazın ve analizi yapılacak maddelerin polaritesine göre seçilir.

20 Pompa, 0,1 ml/dak. ile 10 ml/dak. arasında sabit bir akış, bar civarında da basınç sağlamalıdır. İzokritik akış (hareketli faz bileşimi sabittir), gradient akış (akış zamana göre değişen çözücü bileşimi kullanılır) olmak üzere iki tip akış gerçekleştirebilirler. Enjeksiyon Birimi analiz örneğinin sisteme verildiği ve hareketli faz akışıyla birlikte kolona yönlendiği kısımdır. Enjeksiyon manuel ya da otomatik enjektörler ile gerçekleştirilir. Kolon sabit fazın bulunduğu ve ayrımın gerçekleştiği birimdir. YBSK kolonlarının çoğu 316- derece paslanmaz çelikten (östenit- krom- nikel- molibden çeliği) yapılmaktadır. Amerikan Demir ve Çelik Enstitüsü (American Iron and Steel Instutude (AISI)) standartlarına uygun olarak kimyasal korozyon ve normal YBSK basıncına dayanıklıdır. Kolon çapı 2-5 mm olanlar genellikle analitik amaçlarla kullanılmaktadır. 10 mm ile 24,5 mm arası çaptaki daha geniş kolonlar ise preparatif çalışmalarda kullanılır. Uzunluğu 5, 10, 15 ya da 25 cm olan kolonlar, 10 µm ve altı mikropartikül sabit faz kullanıldıysa tercih edilir. Kolon uzunluğu artınca retansiyon hacmi de artar bu da elüattaki pik konsantrasyonunu düşürüp tespit limitini zayıflatır. Bu nedenle preperatif amaçlarla uzunluğu 1 m ye kadar kolonlar ile çalışılır. Kolon dolguları normal faz ve ters faz olmak üzere iki temel gruba ayrılmaktadır. Normal faz YBSK (NP-HPLC) esası polarite farkı ile ayırım ve analiz olan iki sistemdir. Sabit fazı silika ya da alümina partiküller üzerine tutturulmuş su ya da trietilenglikol gibi oldukça polar maddeler oluşturmaktadır. Bu yöntem polar sabit faz ve non-polar hareketli fazdan meydana gelmektedir. Ters faz YBSK (RP-HPLC) ise adından da anlaşılacağı gibi; non-polar sabit faz ve polar hareketli fazdan oluşan YBSK sistemidir. Sabit faz olarak en çok kimyasal olarak bağlanmış oktadesilsilan (DS), 18 karbon atomlu n-alkan (C- 18) kullanılır. Dedektörün görevi, örnekteki bileşenlerden biri ayrılıp kolondan çıktığında tespit etmektir. Hareketli faz kompozisyonundaki değişimi fark eder, bunu konsantrasyonla orantılı elektriksel bir sinyale dönüştürür ve bu sinyallerden kromotogramı oluşturur.

21 Dedektör Türleri: UV Dedektörler o Sabit dalga boyunda o Değişken dalga boylarında o Diod-Array Dedektörler (DAD) Refraktif İndeks Dedektörler Floresans Dedektörler Elektrokimyasal Dedektörler Buharlaştırıcı Işık Saçılım (evaporative light scattering) Dedektörleri Kondüktivite Dedektörü Kaydedici dedektörden gelen sinyalleri kromotograma dönüştürerek kaydeder. Basit bilgisayar yazıcısından çok az karmaşık olabildikleri gibi gelişmiş yazılımlı bilgisayarlar ve bilgisayar programları da olabilirler (Meyer, 1999; Skoog ve ark., 1998; Willard ve ark., 1981). Şekil 1. Basit bir Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi düzeneği

22 YBSK çok sayıda analitik teknikle kombine edilerek kullanılabilir ancak bu tekniklerin içinde en önemlileri spektroskopik yöntemlerle birleştirilmiş olarak kullanılan YBSK uygulamalarıdır. YBSK nın birlikte kullabildiği başlıca spektroskopik yöntemler: UV spektrofotometresi (YBSK-UV/DAD) YBSK- NMR (nükleer manyetik rezonans) SK-KS (kütle spektrometresi) Sıvı Kromotografisi- Kütle Spektrometresi (SK-KS/LC-MS) Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi (YBSK/HPLC/LC) ve kütle spektrometresinin (KS/MS) bir arada kullanıldığı analiz yönteminin adıdır. SK-KS bileşenlerinden YBSK den önceki bölümde (Bkz ) bahsedilmiştir. Bu bölümde ise kütle spektrometrisi ve SK-KS yöntemi hakkında bilgi verilecektir. Kütle spektrometresi, halen kullanımda bulunan analitik yöntemler arasında en geniş uygulama alanına sahiptir. Maddenin elementel bileşiminin belirlenmesinde İnorganik, organik ve biyolojik moleküllerin yapılarının aydınlatılmasında Karmaşık karışımların kalitatif ve kantitatif analizlerinde Katı yüzeylerinin yapı ve bileşimlerinin aydınlatılmasında Bir örnekteki atomların izotopik oranlarının bulunmasında oldukça yararlı bir yöntemdir (Skoog ve ark., 1998).

23 Esas olarak; düşük basınçta, gaz haline dönüştürülmüş madde moleküller arası çarpışmalar en alt düzeyde olacak şekilde bir tüpten geçirilir. Ve bu moleküller enerji düzeyi ayarlanmış elektronlar tarafından bombardımana tutulur. Bu enerji molekülün iyonizasyon potansiyelini aştığında molekülden 1 elektron ayrılır ve + yüklü molekül oluşur ( m + : moleküler iyon; radikal halinde bir iyondur ve mol ağırlığı molekülün kendisiyle aynıdır). Bombardıman enerjisi artırıldıkça bu iyonlardaki enerji bağlara ulaşır ve bağı kopararak yeni bir + yüklü iyon (m + 1 ) ve yüksüz bir molekül (m 2 ) açığa çıkarır. Temel anlamda, kütle spektrometresi, analize konu maddeyi elektronlarla bombardıman eder ve sonucu, kütle/yük (m/z) oranlarına göre, pozitif iyon parçaları halinde kantitatif olarak kaydeder. Bu kayda da kütle spektrumu denir ( Gündüz, 1990; Skoog ve ark., 1998; Wilard ve ark., 1981). Kütle Spektrometreleri başlıca şu kısımlardan oluşur: Örnek girişi İyon kaynağı (İyonlaştırıcı) Kütle Ayırıcı Dedektör Kaydedici Sistem Şekil 2. Kütle Spektrometresinin çalışma prensibi

24 SK-KS yönteminde örnek girişi bir YBSK cihazına bağlanmıştır. Bağlantı sistemin anahtarı niteliğindedir ve bazı temel problemleri doğurur. Bunlardan birincisi YBSK da yüksek çözücü hacmi ile çalışılması ikincisi ise KS nin vakum gerektirmesidir. Bu problem, kolondan çıkan elüatın sadece küçük bir kısmının KS cihazına gönderilmesi ile giderilebilmiştir. Akış hızları µl/dak. olan mikro- gözenekli kolonların kullanılması ile YBSK doğrudan KS cihazına bağlanabilir (Skoog ve ark., 1998; Wilard ve ark., 1981). SK-KS de kullanılan İyon Kaynakları iki temel gruba ayrılır: Gaz Faz İyon Kaynakları o Elektron İmpakt (EI) o Kimyasal İyonizasyon (CI) Dezorpsiyon İyon Kaynakları o Elektronsprey İyonizasyon (ESI) o Termosprey İyonizasyon (TSP) o Hızlı Aton Bombardımanı (FAB) o Atmosferik Basınçta Kimyasal İyonizasyon (APCI) o Atmosferik Basınçta Fotoiyonizasyon (APPI) (Ardrey, 2003; Balogh, 2005) SK-KS iyonizasyon kaynakları yumuşak iyonizasyon kaynakları olarak adlandırılmaktadır. Bunun nedeni çok az bir parçalanmayla sadece birincil moleküleriyonların elde edilebilmesidir. Kütle ayırıcılar ( farklı kütle/ yük oranlarını ayırabilmek için kullanılan cihazlar) tek bir cihazda ardışık olarak da kullanılabilen tekniklerdir. SK-KS bileşik kütle ayırıcılar molekül ağırlığı yanında molekülün yapısı hakkında bilgi sağlanması yani daha fazla parçalanma sağlamak amacıyla kullanılmaktadır. Kütle spektrometresinde dedektörün görevi yüzeyinden bir iyon geçtiğinde ya da yüzeyine çarptığında oluşan akımı veya şarjı kaydetmektir. İyonlar tarafından dedektörde oluşan sinyal m/z olarak kaydedilir ve kütle spektrumu elde edilir.

25 Başlıca MS dedektörleri: Faraday Cup Dedektörleri Elektron Çoğaltıcılar Kanal Elektron Çoğaltıcılar Fotoğrafik Plaka Sintilasyon Tipi Dedektörler (Skoog ve ark., 1998; Wiilard ve ark., 1981) Sprey Dryer Spray Dryer ile kurutma, sıcak hava ile sıvının bir silindire atomize parçacıklar biçiminde verilmesini içerir. Kurutulan ürün çok kısa bir sürede ince taneler biçiminde kurutulur. Bir sıvı madde kurutulduğunda sprey kurutucu büyük önem arz eder. Havanın giriş sıcaklığı, sıvının akış hızı, atmosfer basıncı çözeltinin yoğunluğu çalışmanın verimini etkileyen parametrelerdir. Sıcak hava akımı, düşen damlalara paralel ya da karşıt akımlı olabilir. Kuruyan maddeler siklon türü ayırıcılar kullanılarak ve kendi ağırlıkları ile düşerek birikir. Şekil 3. Mini Spray Dryer genel görünümü (Analizler için BÜCHI Mini Spray Dryer B-290 kullanılmıştır)

26 2. KURAMSAL TERİLER 2.1. Kaynak Özeti Bu başlık altında, doğal olarak yetişen tıbbi bitkiler ile ilgili olarak Dünya ve Türkiye literatüründe yer alan, çalışma konusuyla doğrudan ilgili olan bazı önemli yayınlar, yazarlarının isimlerine göre alfabetik olarak düzenlenerek özetlenmiştir. Baytop (1972; 1985), Farmasötik Botanik, Farmasötik Botanik Uygulamaları adlı eserlerinde, ülkemizde doğal olarak yetişen ve eczacılıkta yararlı olan çok sayıda bitki taksonomik, botanik, morfolojik ve sistematik olarak tanıtılmıştır. Baytop (1963), Türkiye nin Tıbbi ve Zehirli Bitkileri adli kitabında yaklaşık 1000 takson, familyalarına göre tür düzeyinde yayılışları, kullanılan kısımları, kimyasal içerikleri ve kullanılış şekilleri ayrı ayrı belirtilmiştir. Bunlardan bir kısmınin halen terk edilmiş olduğu, ancak sadece halk tarafından ilaç olarak kullanıldığı, bunların da bir bütünlük oluşturması açısından listeye alındıkları belirtilmiştir. Eserde ayrıca, Türkiye nin yerli bitkileri yanında ülkemizde natüralize (doğallaşmış) olan bazı bitkilere de yer verilmiştir. Baytop (1984), Türkiye de Bitkilerle Tedavi (Geçmişte ve Bugün) adli eserinde ise önce binlerce yıldan beri kullanılan şifalı bitkilerin tarihsel gelişimi, çeşitli dillerde isimleri, yetiştirilmeleri, drogların hazırlanması, tıbbi bitkilerin kimyasal bileşimleri, etkileri ve kullanılış yöntemleri hakkında genel bilgiler verilmiştir. Eserin ana bölümde ise, Türkiye de kullanılan tıbbi bitkilerinin familyaları, botanik özellikleri, kimyasal bileşimleri, yöresel isimleri, kullanılış şekilleri konusunda bilgi verilmiştir. Ayrıca eserin sonunda 97 bitkinin resimleri verilmiş, tüm bitkiler tedavi etkilerine göre sınıflandırılmıştır. Eser Latince ve Türkçe indeksle sonuçlandırılmıştır. Baytop bu eserinde dünyanın tüm bitkilerinin sayısının yaklaşık arasında olduğunu, bunların yaklaşık türünün tıbbi amaçla kullanıldığını, Türkiye de ise ancak 500 kadar türün tedavide kullanıldığını belirtmiştir.

27 Chiej (1983), Medicinal Plants adlı yapıtında, birçoğu araştırma alanında da doğal olarak Bulunan 400 den fazla sayıdaki taksonları tıbbi özellikleri, botaniksel tanımları, habitatları, Kimyasal içerikleri ve bunların kullanımlarını özetlemiştir. Davis ( ) in 9 cilt ve bir de ekten oluşan 11 ciltlik Flora of Turkey and The East Aegean Islands adlı yapıtında tüm Türkiye florasının yanı sıra, Akdeniz Bölgesi nde yetişen çok sayıda takson örnekleri islenmiş ve bunların kare sistemine göre yaklaşık 900 cins ve e yakin taksonun botanik özellikleri, yayılışları, genel yayılışları, yetişme yeri özellikleri özetlenmiştir. Ekim vd. (1991), Türkiye nin Ekonomik Değer Taşıyan Geofitleri Üzerine Taksonomik ve Ekolojik Araştırmalar adlı yayında, doğal yetişme ortamlarından sökülerek yurt dışına satılan geofitlerin durumları araştırılmış, özellikle Galanthus ve diğer geofitlerin korunması için alınması gerekli önlemler üzerinde durulmuştur. Ilısulu (1992), İlaç ve Baharat Bitkileri adlı yayınında, ulusal ekonomimizde, halkımızın sağlık ve beslenmesinde, ayni zamanda endüstride önemli yer tutan ilaç, baharat ve keyif bitkilerinin alfabetik bir düzen içerisinde tanıtımı, özellikleri, yararlanılması, etken maddeleri, drogları, ekonomik değeri, yayılış alanları ve kültüre alınma olanakları konularında temel bilgiler verilmiştir. Jordan (1976) A Guide To Wild Plants isimli yapıtında Kuzey yarıküresinin, bu arada araştırma alanında da doğal olarak yetişen çok sayıda yenilebilen şifalı bitkiler ile zehirli bitkileri ayrıntılı olarak islemiştir. Koç (2002) un iki bölümden oluşan, Doğrudan, Doğadan Bitkilerle Sağlıklı Yasama adlı yapıtının birinci bölümünde beslenmenin temel esasları ile ilgili kısa bir özet bilgi verilmiş, İkinci bölümde ise 176 taksonun yetişme alanları, bitkisel özellikleri ve bitkilerden faydalanma yönleri açıklanmıştır.

28 2.2. Çalışması Yapılan Bitkiler Hakkında Genel Bilgiler Silybum marianum L Tarihçesi Silybum marianum Avrupa da ve Akdeniz ülkelerinde antik zamanlardan beri bilinmektedir. 1. yy da kullanımı kayıtlıdır. Silybum adı 1.yy da oluşmuştur. Hristiyanlığın erken dönemlerinde Meryem e adanmış ve Marian Thistle adıyla anılmıştır. Efsaneye göre Meryem bu bitkinin dalları altında dinlenip ve bir yandan da bebeği İsa yı emzirirken, sütünün bir damlası yapraklar üzerine düşmüş ve orada kalmıştır. Bitkinin yapraklarındaki beyaz izlerin bundan kaynaklandığına inanılır. Hatta bu yüzden John Eveleyn emziren bayanlarda bitkiyi süt arttırıcı olarak da önermiştir. Theopratus 4.yy da bu bitkiden Pternix adıyla bahsetmiştir. Dioscorides yılan ısırığında tedavideki değerinden bahsetmiştir, Pliny the Elder balla karıştırıldığında safra akışı üzerine arttırıcı etkisinden söz etmiştir, ki bu bitkinin karaciğer ile ilgili bir durumda kullanımına ilk referanstır ve bitkiyi Silybum adıyla ifade etmiştir. Roma ve Yunanistan da yaşlanmaya karşı kullanılmışsa da esas etkileri karaciğer koruyucu ve yenileyici olmasıdır. Almanya da Hildegarde el yazması eserinde bitkinin kullanımın açıklamış ve onu Venus-vehedistel olarak adlandırmıştır. John Gerard 16.yy İngiliz herbalistlerindendir ve bu bitkiyi melankoliden kurtulmak ve karaciğer şikayetleri için önermiştir. İngiliz herbalist Nicholas Culpeper 1650 de karaciğerde ve dalakta farklı olgularda kullanımından bahsetmiştir, sıtma ateşine etkili olduğunu gözlemiştir. Albrecht Von Haller 1744 de Medizinischen Lexicon adlı çalışmasında karaciğer için kullanımını anlatmıştır. Materia Medica da ayrıntılı olarak anlatılmıştır de Johannes Gottfried Rademacher önemli çalışmalara başlamıştır. 19.yy da halk arasında bu bitkiden varikoz venlerde, menstrüasyon şikayetlerinde, karaciğer tıkanıklıklarında, dalak ve böbrek problemlerinde yararlanılmıştır. Ayrıca yine 19.yy da Almanya da doktorlar bu bitkinin tohumlarından elde ettikleri ekstreyi sarılık ve diğer karaciğer şikayetlerinde kullanmışlardır da Alman bilim adamı H. Schultz tarafından tekrar araştırılmıştır. 20.yy başlarında bu bitki menstrüasyon problemlerinde, kolon düzensizliklerinde, karaciğer komplikasyonlarında ve safra taşlarında kullanılır olmuştur. 20.yy sonlarına doğru karaciğer toniği ve hazmı

29 kolaylaştırıcı olarak kullanılmıştır. Bitki hakkındaki kapsamlı araştırmalar bundan 30 yıl öncesine dayanmaktadır (Foster, 1990). Tohumdaki etken maddenin izole edilme çalışmaları 1958 de başlamıştır de H. Wagner tarafından silimarin elde edilmiştir baskısı Herbal Medicine de Rudolf Fritz Weiss ayrıntılı olarak bahsetmiştir. Washington daki ulusal eczacılık kütüphanesinde bununla ilgili 300 den fazla çalışma kataloglanmıştır. Planta Medica da 2000 yıldır kullanılan Silybum marianum için geçmişten geleceğe kutsanmış bitki diye söz edilmiştir (Foster, 1990). Homeopatik kullanımı peritonit, öksürük, varikoz ven, uterus tıkanıklığındadır den beri bilim adamları bu bitkinin flavonoit içerdiğinin farkındaydı, ancak 1960 larda Alman bilim adamları bir grup etken madde keşfetmiş ve bunların hepsine birden silimarin adını vermişlerdir. Almanya Sağlık Bakanlığı nın bünyesinde olan ve bitkisel ürünleri ruhsatlandıran Komisyon E ye göre meyve ve tohumun standardize ekstresi dispeptik şikayetler, iştah kaybı, toksik karaciğer problemleri ve hepatik sirozda endikedir, karaciğer sağlığı için etkili ve güvenlidir. Tentürü ve standardize olmayan ekstreleri safra kesesi problemleri, safra kesesi enflamasyonu ve hazımsızlıkta tavsiye edilmiştir (Sayed, 1980). Halk arasında astım, kanser, nezle, göğüs ağrısı, ödem, ateş, hepatit, kuduz, sarılık, vajinal problemler, malarya, sıkıntı, nezle, zatülcenp, spazm, dalak problemlerinde kullanılmaktadır (Aktay, 2000 ). Dünya genelinde kullanılan isimleri: Marian thistle, St Mary s thistle, Milk thistle, ur Lady s thistle, Holy thistle, Venus Thistle, Heal Thistle, Chouk Jmal Guandoule, Wond of God s Grace, Christ s Crown olarak sıralanabilir. Almanya da Mariendistel, Fransa da Chardon Marie, Çin de Shui Fei Ji adıyla bilinir (Foster,1990).

30 Türkiye de ise mübarek diken, akkız, deve dikeni, Meryem ana dikeni, yabani enginar, deve kengeli, sütlü kengel, kengel, kıbbun, şevkülmeryem gibi isimlerle bilinir (Tanker ve ark., 2004) Bitkinin Sistematikteki Yeri Bölüm: Spermatophyta Altbölüm: Angiospermae Sınıf: Dicotyledones Takım: Campanulales Familya: Asteraceae (Compositae) Cins: Silybum Tür: Silybum marianum L. (Davis, 1982 ) Asteraceae (Compositae) familyası Çoğu Asteraceae bitkisi otsu formdadır, nadiren de olsa çalı yada ağaç şeklinde de görülebilir. Yaprakları oppozit, alternan veya tamamen tabanda toplanmıştır. Çiçek durumu büyükçe bir kapitulumdur, tabanında involukrum taşır. Çiçekler erdişi, tek eşeyli, aktinomorf veya zigomorftur. Korolla beş petalli, simpetal, tüpsü veya dilsidir; stamenler beş adet ve singeziktir. varyum alt durumlu ve iki karpelli, tek ovüllüdür. Meyve özelliği akendir, çoğu zaman tepesinde papüs veya kaliks artığı taşır (Davis, 1982) Silybum cinsi İki yıllık, basit ama genelde dallanmış, bazal yapraklar rozet şeklinde yükselir. Yaprakları dikenli, kapitulum tek, homogam ve disk şeklindedir. İnvolukrum diken taşır. Çiçekleri

31 pembeden mora kadar değişir. Korolla derin ve eğik 5 lobludur. Filamentleri tüylü, monodelf akenleri sıkı, obovat, düz, tepeleri koniktir. Hilum bazal, papüsün dış tüyleri skabroz, içtekiler kısa ve kapiler şeklinde beyaz veya bej renktedir (Morazzoni ve Bombardelli, 1995) Silybum marianum L. Gövdesi köşeli, seyrek tüylü, 1-2 yıllık cm e kadar uzanan otsu bir bitkidir. Bitkiler hayat döngülerini erken filizlenip yeterince büyürlerse bir yılda tamamlar. Geç kış ve bahar fideleri iki yıllıktır. Filizlenme sonbahar ve ilkbaharda meydana gelir. Yağış düştükten sonra fide verimlidir. Kuraklığa dayanıklıdır, güneşli yerleri ve kayalı toprağı sever. Yaprakları büyük lanseolat, kesik, yuvarlaktır, 20 cm uzunluğa 10 cm genişliğe ulaşabilir. Tepede çentikli pinnatisekt, pennatifit, parlak yeşil renkli, beyaz damarlı, tüysüz, lobları kaba ve dikenlidir. Genç yapraklar oldukça yumuşaktır, sap yaprakları ise daha küçük ve az lobludur. Sapı sert ve siyahtır, enginara benzer ama yapraklarındaki beyaz lekeler karakteristiktir. Sap ve yaprak kırılınca sütsü salgı görülür. Çiçek durumu büyük bir kapitulumdur, 2-6 cm e kadar büyüyebilir. Çiçekler hermafrodit, parlak kırmızı-pembe veya eflatun-kahverengidir, borumsu ve yoğun dikenlidir. Çiçek açma zamanı mayıs-hazirandır, ağustosa kadar sürebilir, kışınsa rozet taşır. Her bir çiçek yaklaşık 190 tohum yapar, bu da her bitkide 6350 tohuma denk gelir. Meyveleri 7 mm uzunlukta, ağır, esmer-siyah renkli, obovoid, parlak, lekelidir. Sert, kısa, beyaz bir papüsü vardır, papüs tohumlar olgunlaştıktan sonra halka halinde düşer. Tohumlar 9 yıl süreyle kullanılabilir. Çoğalma da tohumlar yoluyla olur (Tanker ve ark., 2004).

32 Kimyasal Bileşikler Flavonolignanlar Silybum marianum tohumlarında bulunan flavonolignanlar terapötik etkiden sorumlu gruptur. Flavonolignanlar % 1,5-3 oranındadır. Flavanolignanlar taksifolol adı verilen flavanole koniferil alkol katılımıyla oluşur. Silimarin bazı flavanolignanlarla taksifololün bir karışımıdır. Silibin (silibinin), izosilibin (izosilibinin), silikristin, silidianin den oluşur ve silimarin olarak isimlendirilir. Bu yapı 1968 de aydınlatılmıştır (Tanker ve Tanker, 2001). Koniferil alkol Taksifolol Silibin

33 Silidianin Silikristin Standardize preparatlarda bu üç flavonolignan türevi maddenin oranı % oranındadır. Silibin % 50 lik oranla en fazla bulunan maddedir. Türkiye de yetişenlerde silimarin oranı %1 in üzerinde bulunmuştur. Denizli civarından toplananlarda ise bu oran %2 yi geçmektedir (Tanker ve ark., 2001). Tohumda silimarin konsantrasyonu yaprak ve meyveye oranla daha yüksektir (Brown, 1996; Blumenthal, 2000; James A. Duke, 1999). Silibin Silybum marianum tohumlarından elde edilen flavonolignanların temel izomeridir. Silibin insan karaciğeri mikrozomlarında depolandığında majör bir metabolit ile iki minör metabolite ayrılır. Kütle spektrometresi ile tanımlanan majör metabolit demetil silibindir.

34 Minör metabolitler ise mono-hidroksi ve di-hidroksi silibindir. Silimarin oranı tohum ve yaprakta daha yüksektir (Gunaratne ve Zhang, 2003; Bilia ve ark., 2002). Bitkinin toprak üstü kısımları kullanılarak etanol, metanol, asetonitril ve asetonla ekstraksiyon yapılmıştır. Silimarin miktarı etanollü ekstrede, silibin a ve b diasteroizomerleri ise metanollü ekstrede en yüksek oranda görülmüştür. Farklı bir çalışmada da sıcak su ile ekstraksiyon yapılmıştır. Sıcaklık arttıkça ekstraksiyon verimi artmaz, aksine bileşikler degredasyona uğrayabilir. Bu yüzden C arasında gerçekleştirilmiştir (Duan ve ark., 2004). 12 g Silybum marianum meyvesi ham ekstresinin su; metanol; etilasetat; n-hekzan (4: 3: 4: 1) solvan sistemi ile yüksek hızlı ters faz kromatografisi (HSRPC) ile ayırımı yapılmıştır. 1,37 g silikristin (% 93,1 saflıkta), 3,47 g silibin (%95,7 saflıkta ) ve 0,93 g izosilibin (%89,7 saflıkta) izole edilmiştir (Wallace ve ark., 2003). Silybum marianum flavanolignanları UV, NMR ve Kütle spektoskopisi ile incelenmiş ve silibin, silidianin, silikristin ve 2,3 dehidrosilibin bileşiklerinin yapısı tayin edilmiştir. 2,3 dehidrosilibin Rusya da yetişen bitkilerde gözlenmiştir (Wagner ve ark., 1986). Tohumlardaki diğer flavanolignanlar ise neosilihermin, desoksisilikristin, desoksisilidianin, siliandrin, silibinom, silihermin, 3-deoksilikristin, 2,3 dehidrosilikristin ve 2,3 dehidro silimarindir. Bitkide flavanolignan miktarının ekim ayında maksimum düzeyde olduğu tesbit edilmiştir (Wagner ve ark., 1986) Sabit Yağlar S.marianum tohumları %20-30 oranında sabit yağ içermekte olup; bu yağın %60 ı linoleik, % 30 u oleik ve % 9 u palmitik asittir (Wagner, 1986).

35 Diğer Bileşikler Bunların dışında bitkinin toprak üstü kısımlarında; alüminyum, ß-karoten, araşidik-beherik asit, manganez, fosfor, kalsiyum, krom, kobalt, demir, magnezyum, sodyum, çinko, potasyum, selenyum, fumarik asit, protein bulunmuştur (Blumenthal, 2000). Meyvede ise; apigenin, krizoeriol, eriodiktiol, naringenin bulunur (Bluemental, 2000). Tohum ayrıca % oranında protein, % 0,038 tokoferol, % 0,63 steroller (kolesterol, kampeterol, stigmasterol, sitosterol), müsilaj, dehidrokoniferilalkol, histamin, kemferol, kersetin,taksifolin, tiramin taşımaktadır (Josef Brindmann, 2000) Melissa officinalis L Melissa officinalis Genel Bilgi Melisa officinalis bitkisi İngilizce: Melisa, Balm, Sweet balm, Lemon balm, Cure-all; Almanca: Melisse, Zitronenkraut, Zitronenmelisse; Fransızca: Mélisse; Türkçe: Melisa, oğulotu, kovan otu, limon nanesi gibi isimlerle bilinmektedir. En sık kullanılan ğulotu ismindeki oğul erkek çocuk anlamında değil, kovanı bırakıp giden arı topluluğu anlamında kullanılmaktadır. Özellikle Trakya ve Batı Anadolu bölgesinde oğulotunun daha çok arıcılıkla uğraşan veya aile büyükleri arıcılık yapmış olan kişiler tarafından tanınmaktadır. Özellikle arıcılık yapanlar, oğulotunu oğul verme döneminde kullanmak üzere bahçelerinin bir köşesinde yetiştirdikleri, oğul arı ve topluluğunu ancak oğulotunun kokusuyla yakalayabildikleri ve bu şekilde kaçıp gitmelerini önledikleri bilinmektedir. Bitkinin Latince karşılığı Melisa da Yunanca arı- demek olup Türkçe karşılıkları ile birebir örtüşmektedir (Blumental, M ve ark. 2000).

36 Özellikle İstanbul ve çevresinde, drog alım satımı yapılan piyasada, oğulotu ve melisa farklı birer bitki olarak kabul edilmekte ve Lippia triphylla bitkisi hakiki melisa otu ismiyle satılmaktadır. Bu karışıklığın sebebi Lippia triphylla (Limon otu) yapraklarının morfolojik olarak oğulotu yapraklarına benzememesine rağmen uçucu yağının içerdiği sitral nedeniyle kuvvetli limon kokusunda olmasıdır ( Baytop, ve Tanker, 1998). Fransız halk hekimi Maurice Messegue oğulotunun ne gibi harikalar yaratacağını ilk anlayan Arap hekimleri bitkinin kalp güçlendirici, iç açıcı olup tüm yaşamsal organları güçlendirmeye, nevrasteninin, iç sıkıntılarının, sinirsel baş ağrılarının giderilmesine elverişli olduğunu ileri sürdüler demektedir. Melissa officinalis üzerine yapılan bir yüksek lisans tez çalışmasında Melissa officinalis in sulu ekstresinin, fenilefrin ile prekontrakte izole sıçan aortunda gösterdiği vazodilatör etki ve bu etkinin muhtemel mekanizmalarını incelemiş ve bu bitkinin kalp ve damar sağlığında çok yararlı bir fitofarmasötik ajan olabileceğini kanıtlamıştır ( Ersoy, 2009) Bitkinin Sistematikteki Yeri Melissa L. cinsi Spermatophyta bölümünün Angiospermae altbölümü, Dicotyledonae sınıfı, Lamiales takımı, Labiatae (Lamiaceae) familyası içerisinde yer almaktadır Labiatae (Lamiacea) Familyası Bu familya bitkileri otsu veya çalı formunda olup daha çok Akdeniz havzasında yayılış göstermektedir. Gövde 4 köşelidir. Yapraklar çoğunlukla basit, bazen parçalı, dekusat dizilişlidir. Çiçekler her nodusta vertisillastrum durumunda, zigomorf ve bilabiattır. Uçucu yağ taşıyan Labiatae tipi (sapı tek, başı 8 hücreli ve pul şeklinde) salgı tüyleri vardır. Çiçekler hermafrodit, kaliks 5 loblu, kalıcı, bazen bilabiattır. Korolla bilabiat, üst dudak bazen eksiktir.

37 Stamen 4 tane, çoğu zaman didinamdır, bazen 2 stamen bulunur. varyum 2 karpelli, 4 gözlü ve üst durumludur, her gözde 1 ovül bulunur, stilus ginobaziktir. Meyve 4 nukstan meydana gelen bir şizokarptır. Eczacılık ve parfümeride yararlanılan bitkileri nedeniyle önemli bir familyadır (Mill., 1982) Melissa Cinsi Melissa cinsi çok yıllık otsu bitkilerdir. Vertisillastrumlar az ya da çok çiçekli. Kaliks tubularkampanulat, iki dudaklı, üst dudak yassı ve üç kısa dişli ( Türkiye deki türlerde orta diş genellikle kısa sivri uç şeklinde), alt dudak iki dişlidir. Korolla tübü ortasına kadar kavisli olup iki dudaklıdır. Üst dudak düz veya başlık şeklini andırır biçimde, emarginat, alt dudak 3 lobludur. Stamen 4 tane, filamentler birbirine yaklaşmıştır. Meyvalar düzdür. Türkiye de bir Melissa türü doğal olarak yetişmektedir (Mill, 1982) Melissa officinalis Melissa officinalis cm veya daha uzun, dik, dallanmış, tüylü, çok yıllık otsu bir bitkidir. Yapraklar X mm, genişçe ovat, romboidal veya eliptik, kuneat-kordat, akut veya obtus, tabanı hariç derin krenat, uzun veya kısa ince tüylerle kaplı veya yarı çıplaktır. Vertisillastrumlar 4-12 çiçekli. Brakteoller yaprak biçiminde, dar ya da geniş ovat, 3-10 X 1,2-7mm. Kaliks 6-10 mm, kısa salgı tüyü veya uzun örtü tüyleri taşır, üst dudak 2-3 dişli, ortadaki diş çoğu kez kısa sivri uç şeklinde veya yoktur, alt dudağın dişleri dar triangularlanseolattır. Korolla (8-)9-14(-16) mm, bayazımsı açık sarı bazen açık leylak rengidir (Mill, 1982). Bitki Haziran-Eylül aylarında çiçeklidir. Deniz seviyedinden 1800 m ye kadar, orman açıklıkları, çalılıklar, makilikler, dere kenarları, boş araziler ve yol kenarlarında yetişmektedir. Melissa officinalis in Türkiye de aşağıdaki anahtar yardımıyla birbirinden ayrılan 3 alttürü bulunmaktadır.

38 1. Gövdede uzun tüyler yok, çok kısa, ince salgı tüyleriyle kaplı, yapraklar tabanda kuneat, kaliksin üst dudağının orta dişi genişçe triangular subspecies officinalis 1. Gövde çıplaktır ya da belirgin uzun tüyler vardır, yapraklar tabanda trunkat ya da subkordat, kaliksin üst dudağının orta dişi belirgin ya da kısa sivri uç şeklinde 2. Gövde ve yapraklar sık, uzun zayıf ya da sert-kısa tüylerle kaplıdır, az sayıda salgı tüyü vardır, kaliksin üst dudağının orta dişi kısa sivri uç şeklinde ya da yoktur subspecies altissima 1. Gövde ve yapraklar sık, uzun zayıf ya da sert-kısa tüylerle kaplıdır, az sayıda salgı tüyü vardır, kaliksin üst dudağının orta dişi oldukça belirgin ve triangular Subspecies inodora Bu üç alttürden yalnız subsp. officinalis limon kokulu olup tedavide kullanılmaktadır. Diğer 2 alttür kokusuz ya da fena kokulu oldukları için tedavi alanında kullanılmamaktadır ( Baytop., 1999) Fitokimyasal Çalışmalar Uçucu Bileşikler Melissa officinalis yapraklarındaki uçucu yağ miktarı bitkinin yetiştiği toprak ve iklim, yaprağın ilk ya da ikinci kesim olması gibi değişik faktörlere bağlı olarak % ,3 arasında değişmektedir. Eğer özel şartlarda ve uygun bir iklimde kültürü yapılırsa uçucu yağ oranı % 0,8 e kadar yükselmektedir (Wichtl., 1994).