ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Ahmet KAYRALDIZ SODYUM METABİSÜLFİT İN SIÇAN KEMİK İLİĞİ HÜCRELERİNDE İN VİVO GENOTOKSİK ETKİLERİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2005

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SODYUM METABİSÜLFİT İN SIÇAN KEMİK İLİĞİ HÜCRELERİNDE İN VİVO GENOTOKSİK ETKİLERİ Ahmet KAYRALDIZ DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez 12 / 9 / 2005 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oy Birliği / Oy Çokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza İmza İmza Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI DANIŞMAN ÜYE ÜYE İmza Doç. Dr. Gökhan CORAL ÜYE İmza.. Yrd. Doç. Dr. Hasan Basri İLA ÜYE Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Ana Bilim Dalında Hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Tez Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FBE D. 36 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA TEZİ SODYUM METABİSÜLFİT İN SIÇAN KEMİK İLİĞİ HÜCRELERİNDE İN VİVO GENOTOKSİK ETKİLERİ Ahmet KAYRALDIZ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Yıl : 2005, Sayfa: 67 Jüri : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Doç. Dr. Gökhan CORAL Yrd. Doç. Dr. Hasan Basri İLA Bu çalışmanın amacı, gıdalarda antimikrobial madde olarak kullanılan Sodyum Metabisülfit (SMB) in sıçan kemik iliği hücrelerinde in vivo genotoksik etkilerini araştırmaktır. Bu çalışmada SMB, intraperitonal (ip) uygulamada anormal hücre yüzdesini (AH) ve KA/hücre genel olarak tüm muamele sürelerinde (6, 12, 24 Saat) ve konsantrasyonlarda (250, 500, 750 ve 1000 mg/kg vücut ağırlığı (v.a.)) kontrole göre önemli ölçüde arttırmıştır. Ancak bu artış pozitif kontrol (Ethyl Carbamate) kadar olmamıştır. SMB, 6 saatlik muamele süresinde mitotik indeksi (MI) sadece 750 ve 1000 mg/kg v.a. dozlarda kontrole nazaran önemli derecede düşürürken, bu düşüş 12 ve 24 saatlik muamele sürelerinde ise tüm konsantrasyonlarda önemli derecede bulunmuştur. SMB, gavage (gv) uygulamada anormal hücre yüzdesini (AH %) ve KA/hücre sayısını 6 saatlik muamele süresinin tüm konsantrasyonlarında hem kontrol hem de pozitif kontrole göre önemli ölçüde arttırmamıştır. Halbuki SMB, 12 saatlik muamele süresinde ve tüm konsantrasyonlarda AH % si ve KA/hücre sayısını kontrole göre önemli ölçüde artırmıştır. 24 saatlik muamele süresinde ise SMB, AH% si ve KA/Hücre sadece 750 ve 1000 mg/kg v.a. konsantrasyonlarda kontrole göre önemli ölçüde artırmıştır. SMB gavage uygulamada 6 saatlik muamele süresinde sadece 1000 mg/kg v.a. konsantrasyonunda MI pozitif kontrole nazaran düşürürken, 12 saatlik muamele süresinde 250 mg/kg v.a. konsantrasyonu hariç tüm konsantrasyonlarda, 24 saatlik muamele süresinde ise tüm konsantrasyonlarda MI i hem kontrol hem de pozitif kontrole nazaran önemli ölçüde düşürmüştür. Anahtar Kelimeler: Gıda Katkı Maddesi, Sodium Metabisülfit, In vivo Kromozom Aberasyonu, Sıçan I

4 ABSTRACT PhD THESIS IN VIVO GENOTOXIC EFFECTS OF SODIUM METABISULFIT ON BONE MARROW CELLS Ahmet KAYRALDIZ DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Year : 2005, Sayfa: 67 Jury : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Assoc. Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Assoc. Prof. Dr. Gökhan CORAL Asist. Prof. Dr. Hasan Basri İLA The aim of this study was to investigate the genotoxic effects of sodium metabisulphite (SMB), which is used as an antimicrobial substance in foods on bone marrow cells of rats. In this study, SMB increased the percentages of abnormal cells with chromosomal abnormalities and CA/cell in all the concentrations (250, 500, 750 and 1000 mg/kg body weight (b.w.)) and treatment periods (6, 12 and 24 h) when compared with control after intraperitonally administration. However, SMB did not increase the abnormallities as much as positive control (Ethyl Carbamate). SMB decreased the Mitotic Index (MI) at 750 and 1000 mg/kg b.w.concentrations for 6 hour treatment period while SMB decreased the MI in all the concentrations for 12 and 24 hours treatment periods when compared with control. SMB did not increase the percentage of abnormal cells and CA/cell in all the concentrations for 6h treatment period when compared with control and positive control in bone marrow cells of rats treated with SMB orally (gavage). However, SMB significantly increased the abnormallities at all concentrations for 12 hour treatment period when compared with control. At 24 hour treatment period, SMB increased the abnormalities only at 750 and 1000 mg/kg b.w. when compared with control. In all concentrations and treatment periods, SMB did not induced the abnormalities when compared with positive controls when orally administreted. SMB decreased the MI at 1000 mg/kg b.w. for 6 h treatment period when compared with positive control. At all concentrations for 12 h treatment period, SMB significantly decreased the MI when compared with control and positive control except 250 mg/kg b.w. In addition, SMB significantly decreased the MI at all concentrations for 24 h treatment period according to control and positive control. Key Words: Food Additive, Sodium Metabisulphite, In vivo Chromosomal Aberrations, Rat II

5 TEŞEKKÜR Tez konumun belirlenmesi, yürütülmesi ve çalışmalarım sırasında bana rehberlik eden, ilgi ve yardımlarını esirgemeyen Sayın Hocam Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ a, bana göstermiş olduğu sabır ve ilgiden dolayı Sayın Hocam Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI na sonsuz minnetlerimi sunarım. Genetik Laboratuarında birlikte çalıştığımız ve çalışmam esnasında benden yardımlarını esirgemeyen Sayın Hocam Yrd. Doç. Dr. Hasan Basri İLA ya, araştırma görevlisi arkadaşım Ayşe YAVUZ a, biyolog arkadaşlarım Mehmet ARSLAN ve Fatma Funda KAYA ya teşekkür ederim. Projemizi maddi yönden destekleyen Ç.Ü. Araştırma Fonu yöneticilerine de teşekkür ederim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR.... III KISALTMALAR... IV ÇİZELGELER DİZİNİ.... VI ŞEKİLLER DİZİNİ.... VII 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Asetik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Benzoatlarla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Bifenil, Sodyum Ortofenil Fenolle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Borik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Formaldehitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Formik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Laktik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Lizozimle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Malik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Nisinle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Nitrit ve Nitratlarla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Potasyum Bromatla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Propionic Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Sodyum Hipokloritle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Sorbatlarla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Sülfitlerle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Tiabendazolle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları MATERYAL VE METOD Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları Sodium Metabisülfite (SMB) Sodium Metabisülfite nin Kimyasal Özellikleri. 29 IV

7 Ethyl Carbamate (EC=Ürethan) Kolkisin Fizyolojik Çözelti Hipotonik Çözelti Fiksatif Sorensen Tampon Çözeltisi Giemsa Entellan Nitrik Asit Kullanılan Deney Ekipmanları Hassas Terazi Santrifüj Mikroskop İnkübatör Lamların Temizlenmesi Kromozom İncelemeleri İçin Deney Hayvanlarına SMB ve EC nin Verilmesi, Preparatların Hazırlanması ve Boyanması Deney Hayvanlarına SMB nin ve EC nin Verilmesi İntraperitonal Yolla (ip) SMB nin ve EC nin Deney Hayvanlarına Uygulanması Gavage Yoluyla (gv) SMB nin ve EC nin Deney Hayvanlarına Uygulanması Kromozom İncelemeleri İçin Preparatların Hazırlanması Preparatların Boyanması Mikroskobik İncelemeler Kromozom Anormalliklerinin (KA) (Chromosome Aberration=CA), Mitotik İndeksin (MI) Saptanması Kromozom Anormalliklerinin Saptanması Mitotik Indeksin (MI) Saptanması Mikroskopta Fotoğraf Çekme İstatistik Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi.. 36 V

8 4. BULGULAR SMB nin Sıçanlara İntraperitonal Yolla Enjekte Edilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Kemik İliği Hücrelerinde Anormal Hücre Yüzdesi (Kromozom Anormalliğine Sahip Hücre Yüzdesi), KA/Hücre Oranı ve Mitotik İndeks SMB nin Sıçanlara Gavage Yoluyla Verilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Kemik İliği Hücrelerinde Anormal Hücre Yüzdesi (Kromozom Anormalliğine Sahip Hücre Yüzdesi), KA/Hücre Oranı ve Mitotik İndeks SMB nin Sıçanlara Gavage Yoluyla ve İntraperitonal Yolla Verilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Kemik İliği Hücrelerinde Oluşan Anormal Hücre Yüzdesi, KA/Hücre Oranı ve Mitotik İndekslerin Karşılaştırılması TARTIŞMA SMB nin Sıçan Kemik İliği Hücrelerinde Kromozom Aberasyonu Oluşumu Üzerine Etkileri ve Sitotoksiditesi SMB nin Sıçan Kemik İliği Hücrelerinde Kromozom Aberasyonu Oluşumu Üzerine Etkileri SMB nin Hücre Bölünmesi Üzerine Etkisi SONUÇ VE ÖNERİLER.. 56 KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ VI

9 KISALTMALAR B Kromatid Kırığı B Kromozom Kırığı F Fragment KD Kromatid Değişimi KKB Kardeş Kromatid Birleşmesi DS Disentrik Kromozom T Translokasyon P Poliploid BrdUrd 5 -Bromo-2 -Deoxyuridine AH Anormal Hücre KA Kromozomal Anormallik MI Mitotik İndek RI Replikasyon İndeksi va Vücut Ağırlığı CAC FAO nun Gıda Komisyonu WHO Dünya Sağlık Teşkilatı FAO Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Teşkilatı JECFA Birleşik Gıda Katkı Uzmanları Alt Komitesi NOEL Bir Kimyasal Maddenin Hayvanlara Zarar Vermeyen Dozu ADI Bir Kimyasal Maddenin İnsanın Ömrü Boyunca Vücut Ağırlığının mg ı Başına Aldığında Zarar Vermeyen Dozu ML ADI Miktarının İzin Verilen En Yüksek Dozu SMB Sodyum Metabisülfit HGPRT Hipoksantin Guanozin Fosforibozil Transferaz IP İntraperitonal Uygulama GV Gavage Uygulama EC Ethyl Carbamate (=Ürethan) DNA Dezoksiribonukleik Asit KCI Potasyum Klorür VII

10 KKD NaCI SCE SSC SU Gy SMART ICR LD 50 CA SE Kardeş Kromatid Değişimi Sodyum Klorür Sister Chromatid Exchange Standart Saline Citrate Sister Union Gray Wing Spot testi Bir Tür Fare Bir Kimyasalın Kullanılan Deneklerin Yarısını Öldüren Toksik Dozu Chromosome Aberration Standart Hata VIII

11 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1. SMB nin Sıçan Karın Zarına (İntraperitonal Olarak) Enjekte Edilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Sıçan Kemik İliği Hücrelerinde Rastlanan Kromozom Anormallik Çeşitleri, Anormal Hücre Yüzdesi, KA/hücre ve Mitotik İndeks. 39 Çizelge 4.2. SMB nin Ağız Yoluyla (Gavage Yoluyla) Verilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Sıçan Kemik İliği Hücrelerinde Rastlanan Kromozom Anormallik Çeşitleri, Anormal Hücre Yüzdesi, KA/hücre ve Mitotik İndeks.. 45 Çizelge 4.3. SMB nin Sıçanlara Gavage Yoluyla ve İntraperitonal Yolla Verilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Kemik İliği Hücrelerinde Saptanan Anormal Hücre Yüzdesi, KA/Hücre Sayısının ve Mitotik İndekslerin Karşılaştırılması.. 50 IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Sodyum Metabisülfit in Açık Formülü.29 Şekil 4.1. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 12 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde anormal hücre yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi.40 Şekil 4.2. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 12 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde KA/hücre nin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi. 40 Şekil 4.3. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde anormal hücre yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi.. 41 Şekil 4.4. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde KA/hücre nin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi.. 41 Şekil 4.5. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde MI nın doza bağlı azalmasını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi...42 Şekil 4.6. Kardeş Kromatid Birleşmesi (KKB) (1000 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 24 saatlik muamele süresi, Intraperitonal Uygulama, ).X Şekil 4.7. Fragment (F) (750 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 12 Saatlik muamele süresi, İntraperitonal Uygulama, ).X X

13 Şekil 4.8. Kromatid Değişimi (KD) (500 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 24 Saatlik muamele süresi, İntraperitonal Uygulama, ).X Şekil 4.9. Gavage yoluyla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde anormal hücre yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi...46 Şekil Gavage yoluyla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde KA/Hücre nin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi 46 Şekil Gavage yoluyla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde MI nın doza bağlı azalmasını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi.47 Şekil Kardeş Kromatid Birleşmesi (KKD) (1000 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 12 saatlik muamele süresi, Gavage Uygulama, ).X Şekil Kromatid Kırığı (B ) (750 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 24 saatlik muamele süresi, Gavage Uygulama, ).X Şekil Kromatid Değişimi (KD) (500 mg/kg vücut ağırlığı, 12 saatlik muamele süresi, Gavage Uygulama, ).X XI

14 1. GİRİŞ Ahmet KAYRALDIZ 1. GİRİŞ Günümüzde 2 milyon çeşitten fazla kimyasal madde çeşitli amaçlar için kullanılmakta ve bu sayıya her yıl yeni kimyasal madde eklenmektedir (Ağüloğlu ve Ortakaya, 1992). 20. yüzyılın başlarında çoğu doğal kaynaklı olmak üzere birkaç bin kimyasal madde kullanılmaktayken bu maddelerin kullanımı özellikle 1940 lardan sonra hızla artmıştır yılında 7 milyon ton/yıl olan dünya kimyasal madde üretimi, 1985 yılında 250 milyon ton/yıl a yükselmiştir. Bugün bu rakam 400 milyon ton/yıl a ulaşmıştır (Karakaya, 2005). Kimyasal maddelerin yoğun ve nispeten kontrolsüz olarak kullanılmaya başlandığı yıllarda yapılan hatalardan insan sağlığı ve çevre zarar görmüştür. Gerek kimyasal maddelerin her alanda yoğun olarak kullanılmaya başlanması, gerekse kontrolsüz kullanımın yarattığı ciddi sağlık ve çevre sorunları, toplumlarda kimyasal madde kullanımına karşı oluşan korku ve tepkinin nedenidir. Kimyasalların insan sağlığı üzerindeki etkileri devamlı tartışma konusu olmaktadır. Toplumlarda en önemli sağlık göstergesi doğuştan yaşam beklentisi olarak da tanımlanan ortalama yaşam süresidir yılında Dünya'da ortalama yaşam süresi iki cinsiyet ortalaması olarak 30 yıl iken, 1997 yılında 63 yıla yükselmiştir. Bu rakamlar ABD'de 1900 ve 1997 yılları için 49 ve 77'dir. Bu gelişmede başta ilaçlar ve suyun mikropsuz hale getirilmesinde kullanılan kimyasallar olmak üzere, insanlara kimyasalların da yardımıyla yeterli ve kontaminasyondan korunmuş gıdaların temin edilebilmesinin de önemli payı vardır. Ancak, bu değerlendirmeden kimyasalların insan sağlığı ve çevre için zararsız olduğu anlamı çıkartılmamalıdır. Kimyasal maddelerin rastgele kullanımı insan sağlığı ve çevre için büyük tehdittir. Özellikle 1960'lardan sonra toksikoloji bilimindeki hızlı gelişmenin yanısıra, kimyasal maddeler için risk yönetimi uygulamalarının geliştirilmesi, güvenli kimyasal kullanım olanağını getirmiştir. Günümüzde ilaç, gıda katkı maddesi, kozmetik, tarım ilacı, endüstri kimyasalı olarak kullanılan birçok kimyasalın insan sağlığı ve çevreye olan etkisi ayrıntılı olarak incelenmekte olup, insan sağlığı ve çevre üzerinde kabul edilemez ölçüde risk taşıyanların kullanımına izin verilmemektedir (Karakaya, 2005). 1

15 1. GİRİŞ Ahmet KAYRALDIZ Gıda katkı maddeleri, gıdalarda mikrobiyolojik bozulmayı önleme ve dayanıklılığı arttırma, besleyici değeri koruma, teknolojik işlemlere yardımcı olma, renk, görünüş, lezzet, koku gibi duyusal özellikleri düzeltme gibi pek çok amaçla katılan maddelerdir. Gıda katkı maddelerinin kullanılması ile ilgili tarihsel gelişmeler incelendiğinde, M.Ö yıllarında et ürünlerini kürlemede tuzdan yararlanıldığı, M.Ö. 900 yıllarında ise tuz ve odun tütsüsünün gıda saklama yöntemleri olarak kullanıldıkları görülmektedir. Ortaçağlarda etlere koruyucu amaçla tuz ve tütsünün yanısıra katılan nitratın etin rengini olumlu yönde değiştirmek ve çürümeyi önlemek amacıyla kullanıldığı bilinmektedir. M.Ö.50. yılda baharatlardan lezzet verici olarak yararlanılmış, gıda boyaları ise günümüzden yaklaşık 3500 yıl kadar önce Mısırlılar tarafından renklendirici amaçla kullanılmışlardır. 19yy. daki hızlı şehirleşmenin paralelinde katkı maddelerinin kullanımları, özellikle gıdaları bozulmalara karşı koruma amacıyla yaygınlaşmış olup, günümüzde ise bu maddeler gelişen gıda teknolojisinin vazgeçilmez bir parçasını oluşturmuşlardır (Altuğ, 1999). Tüketicilerin bilinçlenmeleri paralelinde de katkı maddelerinin özellikleri ve sağlıkla olan ilişkileri gıda satın almada dikkati çeken ve özen gösterilen bir konu haline gelmiştir. Katkı maddesi ve sağlık ilişkisinde şüpheler özellikle 3 konuda yoğunlaşmış olup, bunlar şunlardır: Katkı maddelerinin kimyasal yapıda olmaları, E numaraları ile ifade edilmeleri, Allerji yapmaları Gıda biliminde kimyasal madde kavramı içinde hava, su, tuz ve laboratuvarda sentezlenen kimyasallar gibi değişik maddeler yer almaktadır. Bu maddeler arasında yukarıda belirtilen ve gıdanın yapısında doğal olarak bulunan maddeler dışında, gıdalara istenilmeden bulaşan kontaminant niteliğindeki maddeler ve gıdaya belirli amaçlar için istenilerek katılan katkı maddeleri yer almaktadır. Kontaminant, gıdalarda istenilmeyen iz elementler, aflatoksinler, nitrozaminler vb. gibi oldukça 2

16 1. GİRİŞ Ahmet KAYRALDIZ toksik maddeler olup, gıdalara bulaşma yollarının önlenmesi için çeşitli çalışmalar yapılmakta ve gıdalarda bulunabilecek sınırları yasalarla belirlenmektedir. Gıda katkı maddeleri ise gıdalara istenilerek katılan maddeler olup, bu maddelerin özellikleri ve gıdalarda kullanım sınırları Dünyada uluslararası düzeyde araştırmalarla ele alınan bir konudur. Bu amaçla Dünya Sağlık Teşkilatı (WHO) ve Gıda Tarım Örgütü (FAO) nün oluşturduğu gıdalarla ilgili komisyon (CAC) ve bu kuruluşun gıda katkı maddeleri ile alt komitesi olan Birleşik Gıda Katkı Uzman Komitesi (JECFA) katkı maddelerinin insan sağlığı açısından güvenilirliği konusunda çalışmalar yapmakta ve belirli dozlarda kullanımında sakınca olmadığı belirlenen maddelerle ilgili listeler hazırlanmaktadır. JECFA komisyonunda görev alan tarafsız uzmanlar gerçekleştirdikleri uzun süreli ve detaylı toksikolojik değerlendirmeler sonucunda, sözkonusu katkı maddesinin deney hayvanlarına zarar vermeyen dozunu (NOEL) saptamaktadır. Bu değer, insanlar için bir ömür boyu vücut ağırlığının mg başına alındığında zararlı etki yapmayacak doza (ADI) çevrilirken güvenlik faktörü olan 100 rakamına bölünmektedir. Bu verilere dayanarak hazırlanan listelere katkının ADI değeri ve bu değer esas alınarak değişik gıdalarda izin verilecek maksimum miktarları (ML) belirtilmekte, sakıncalı olabilecek maddeler (Butter Yellow, Hidrojen Peroksit, vb.) liste dışı bırakılmaktadır. CAC tarafından önerilen listeler Avrupa Topluluğu (EC) tarafından da benimsenmiş olup, bu topluluğun da benzer listeleri mevcuttur. Dünyadaki çeşitli ülkeler listeleri esas alarak kendi ülkelerinde kullanımına izin verilen katkı maddelerinin listelerini düzenlemektedirler. Ülkemizde de kullanımı uygun görülen gıda maddeleri CAC ve EC tarafından oluşturulan listelerden titizlikle seçilmektedir (Altuğ, 1999). Bazı kişiler bazı katkı maddelerine karşı allerjik reaksiyonlar gösterebilirler, ancak allerji durumlarının çilek, yumurta, kakao, çikolata hatta süt gibi pek çok doğal gıdaya karşı oluştuğu da bilinen bir gerçektir. İngiltere'de yapılan bir çalışmada katkı maddesi kullanımı ile olan allerjik reaksiyonların populasyonun yalnızca % 0.1 inde görüldüğünü ortaya çıkarmıştır. Ayrıca değişik ülkelerdeki yönetmeliklerde allerji yapabilen tartrazin, sunset yellow, kükürtdioksit gibi katkı içeren gıdaların etiketlerinde ikaz ibaresi bulundurulmasının öngörüldüğü bilinmektedir. 3

17 1. GİRİŞ Ahmet KAYRALDIZ Bu bilgilerden de anlaşılacağı gibi ülkemizde katkı maddeleri konusu, dünyadaki tüm gelişmiş ülkelerde olduğu gibi titizlikle ele alınmakta ve yasal kuruluşlarca denetlenmektedir. Kullanımına izin verilen katkı maddelerinin denetiminde değerlendirilmesi gereken en önemli iki husustan birincisi bu maddelerin gıda saflığında olmaları, diğeri ise gıdalarda izin verilen sınırı aşmamaları gerektiğidir. Bu denetim ise ancak ülkede etkin bir kontrol sisteminin kurulması ile gerçekleşebilir. Gerek katkı maddeleri kullanımında, gerekse genel anlamda gıda tüketiminde Toksikoloji biliminin öncülerinden Paracelcus ( ) un "Her madde toxindir, ancak toxin ile ilacı birbirinden ayıran dozdur" ifadesi de unutulmamalıdır (Altuğ, 1999). Gıda katkı maddelerini şu şekilde sınıflandırmamız mümkündür 1.Kaliteyi koruyarak raf ömrünü uzatanlar (Koruyucular) a. Antimikrobiyaller (nitrit, benzoik asit, sorbik asit, kükürt dioksit sodium metabisulfite...) b. Antioksidanlar (Butylated Hydroxyanisole, Butylated Hydroxytoluene, propil gallat...) 2. Hazırlama ve pişme özelliğini geliştirenler a. ph ayarlayıcılar (asetik asit, propionik asit, kalsiyum karbonat...) b. Topaklanmayı önleyenler(magnezyum oksit, magnezyum karbonat, silikon dioksit...) c. Emülsiyon yapıcılar (lesitin, mono ve digliseritler...) d. Stabilizörler, kıvam arttırıcılar ( kalsiyum asetat, kalsiyum karbonat...) 3. Aroma, lezzet,tad ve renk geliştiriciler a. Lezzet vericiler (aroma maddeleri) b. Lezzet arttırıcılar (Monosodium Glutamate, inisitol) c. Renklendiriciler (tartrazin, kurkumin,annotto, β-karoten...) 4

18 1. GİRİŞ Ahmet KAYRALDIZ d. Yapay tadlandırıcılar (aspartam, sakarin, asesulfam K, neoherperidin DC...) Bu çalışmada kullanılan Sodyum Metabisülfit (SMB) de bir gıda katkı maddesidir. Gıda katkı maddelerinin genotoksik etkiye sahip oldukları da bir çok farklı test sistemiyle araştırılmıştır (Karakaya, 1999). Abe ve Sasaki (1977) kültür edilmiş Chinese hamster hücrelerini 30 farklı kimyasala maruz bırakmışlar ve potassium sorbate ve sodium benzoate nin Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) ve Kromozomal Aberasyonları (KA) artırdığını bildirmişlerdir. Bir başka çalışmada Nagao ve ark. (1977) lizozim in Salmonella typhimurium un TA100 ve TA98 suşları için mutajen olduğunu bildirmişlerdir. Ishidate ve Odashima (1977) in vitro kromozomal aberasyon testi kullanarak aralarında yiyecek katkı maddelerinin de bulunduğu 134 çeşit kimyasal maddenin mutajenitesini incelemişlerdir. İncelenen bu 134 kimyasal maddeden bakteriler için mutajen olan hemen hemen hepsinin KA testinde de pozitif sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Yine Ishidate ve ark. (1984) Japonya da kullanılmakta olan 190 sentetik kökenli, 52 doğal kökenli gıda katkı maddesinin genotoksiditesini in vitro Chinese hamster fibroblast kültürlerinde kromozom aberasyonu ve Salmonella typhimurium da Ames testi ile araştırmışlar, bu çalışma sonucunda bu maddelerden yalnızca 14 tanesinin Ames testinde pozitif sonuç verdiğini, 54 tanesinin de kromozomal anormallik testinde pozitif sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Ancak bunlardan 11 tanesinin (fast gren, hidrojen peroksit, potasyum bromat, sodyum klorit, sodyum hipoklorit, sodyum nitrit, kakao ve karamel) hem KA testinde hem de Ames testinde pozitif sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Njagi ve Gopalan (1982) Vicia faba kök ucu hücreleri ile yapmış oldukları çalışmada sodyum sulfite ve sodyum benzoate nin dozunun artmasına bağlı olarak kromozomal anormalliklerde bir atış olduğunu, ayrıca interfazda kromatin erozyonuna neden olduklarını bildirmişlerdir. Hasegawa ve ark. (1984) sorbik asit ve onların potasyum ve sodyum tuzlarının kültüre edilmiş Chinese hamster V79 hücrelerinde kardeş kromatid değişimi ve gen mutasyonlarını arttırdığını bildirmişlerdir. Luca ve ark (1987) in vivo ve in vitro denemelerle sodyum nitrit in mutajenitesini araştırmışlar ve nitritin anormal metafaz 5

19 1. GİRİŞ Ahmet KAYRALDIZ hücrelerinin oranını seçilen 3 türde de (sıçan, fare ve tavşan) önemli derecede arttırdığını bildirmişlerdir. Mukherjee ve ark. (1988) akut olarak sodyum nitritin ve sorbik asitin, tek başlarına ve karışım halinde fare kemik iliği hücrelerine olan etkilerini araştırmışlar ve kontrol ile kıyaslandığında sorbik asitin en yüksek üç konsantrasyonda KKD frekansını önemli ölçüde arttırdığını, sodyum nitritin ise seçilen tüm dozlarda KKD frekansını arttırdığını bildirmişlerdir. Kombinasyon halinde verildiklerinde ise KKD frekansı ayrı ayrı verildiklerinden iki kat fazla olmuştur. Munzer ve ark. (1990) potasyum sorbat ve sodyum sorbat ın genotoksisitesini Ames testi, Chinese hamster ovaryum hücrelerinde HGPRT enzimi geninde gen mutasyonu ve kardeş kromatid değişimi testlerini, sıçan ve Chinese hamster kemik iliği hücrelerinde mikronukleus testlerini kullanarak test etmişler, her iki kimyasalın in vitro testlerde bir genotoksidite göstermediğini, in vivo testlerde ise bu katkı maddelerin taze hazırlanmış eriyiklerinin hiçbir klastojenik etki göstermemesine karşılık, bekletilmiş eriyiklerinde klastojenik bir etkiye sahip olduklarını bildirmişlerdir. Çalışmamızda kullandığımız sodyum metabisülfit (SMB) antimikrobiyal madde olarak bisküvitlerde, çukolatalarda, şekerlerde, salam ve sucuklarda, şarap, şampanya, vs. gibi alkollü içeceklerin bir çoğunda kullanılmaktadır. Tarım Bakanlığı SMB nin kullanılabilecek en yüksek dozunun 300 µg/ml olması gerektiğini bildirmişlerdir (Tarım Bakanlığı Gıda Kodeksi, 1997). SMB suda çözündüğünde sodyum bisülfit ve sülfür dioksite dönüşmektedir. Bisülfit in genotoksik etkilerini araştırmak amacıyla bugüne kadar birçok çalışma yapılmıştır. Meng ve Zhang (1992) bisülfit in (HSO 3 ) insan periferal lenfositlerinde mikronükleus oluşumunu, ayrıca kardeş kromatid değişimini ve kromozomal anormallikleri arttırdığını bildirmişlerdir. Bir diğer çalışmada Meng ve Zhang (1999) bisülfit in CHO AS52 hücrelerinde guanin fosforibozil transferaz (GPT) geninde mutasyonu arttırdığını saptamışlardır. Ayrıca Pagano ve Zeiger (1987) bisülfit in ph 5-6 da Salmonella typhimurium un TA1535 ve TA97 suşları için zayıf mutajen olduğunu ancak TA1537 ve TA1538 suşları içinse mutajen olmadığını bildirmişlerdir. 6

20 1. GİRİŞ Ahmet KAYRALDIZ Rencüzoğulları ve ark. (2001a) Allium cepa L. kök ucu hücrelerinde SMB nin tüm konsantrasyon ve muamele sürelerinde MI i düşürdüğünü, mitotik anormallikleri de doza bağlı olarak arttırdığını bildirmişlerdir. Aynı araştırma grubu (Rencüzoğulları ve ark. 2001b) SMB nin tüm konsantrasyon ve muamele sürelerinde insan periferal lenfositlerinde kardeş kromatid değişimi ve kromozomal aberasyonları doza bağlı olarak arttırdığını, buna karşılık mitotik indeksin ve replikasyon indeksinin doza bağlı olarak düştüğünü bildirmişlerdir. Yukarıdaki çalışmalardan da görüldüğü gibi SMB nin in vivo genotoksik etkisiyle ilgili herhangi bir çalışma yapılmamıştır. İşte bu çalışmanın amacı sıçan kemik iliği hücrelerinde SMB nin in vivo genotoksik etkiye sahip olup olmadığını kromozom aberasyonu (KA) testi ile araştırmaktır. 7

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gıdalardaki katkı maddeleri ve gıdaların sterilizasyonunda kullanılan maddelerle yapılmış olan genotoksidite ve toksidite çalışmalarını aşağıdaki şekilde açıklayabiliriz Asetik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Et ve et ürünlerinde, süt ürünlerinde, meyve ve sebze konservelerinde koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Morita ve ark. (1990), Chinese hamster ovaryum K1 hücrelerini kullanarak asetik asit in klastojenik aktivitelerinin medyumun ph ile olan ilişkisini test etmişlerdir. Bu çalışmaya göre, bu asitin mm lık konsantrasyonunun başlangıç ph ı 6 veya daha aşağı olan besiyerlerinde kromozomal aberasyonlarını hem S9 bulunan hem de bulunmayan ortamlarda uyardığı bildirilmiştir. Bu asitin mm lık konsantrasyonunun ph 5.7 veya daha aşağıdaki medyumlarda da toksik olduğu saptanmıştır Benzoatlarla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Benzoatlar, muz, kek, hububat, çikolata, soslar, katı ve sıvı yağlar, meyankökü, margarin, mayonez, süt tozu, patates tozu ve kuru maya gibi bazı gıdaların işlenmesi sırasında gıda koruyucusu olarak kullanılır. Abe ve Sasaki (1977), kültüre edilmiş Chinese hamster hücrelerini 33 çeşit farklı kimyasala maruz bırakarak, kardeş kromatid değişimi ve kromozomal anormalliklerini incelemişlerdir. Bu çalışmalar sonucunda potasyum benzoat ve sodyum benzoat ın kardeş kromatid değişimi ve kromozomal anormalliklerinin frekansında önemli bir artışa neden olduğu saptanmıştır. Ishidate ve Odashima (1977), kültüre edilmiş Chinese hamster hücrelerinde aralarında gıda katkı maddelerinin de bulunduğu 134 çeşit kimyasalın genotoksik etkisini incelemişler ve sodyum benzoat ile potasyum benzoat ın kromozom 8

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ anormalliği testinde pozitif sonuç verdiğini, ancak kesin bir yargı için ilave testlerin yapılması gerektiğini bildirmişlerdir. Tohda ve ark. (1980), insan lenfoblastoid hücreleri için 30 mmol/litre konsantrasyonundaki benzoik asit in sitotoksik etkili olduğunu bildirmişlerdir. Sato ve ark. (1987), benzoik asit, vanilin, vanilik asit, ferulik asit ve resorkcinol maddelerinin herhangi bir mutajenik etkiye sahip olmadıklarını bildirmişlerdir. Vernole ve ark. (1987) ve Vernolle ve ark. (1988) benzoik asit in potasyum tuzlarının insan periferal lenfositlerinde KKD ve KA üzerine etkilerini araştırmışlar ve benzoik asit in potasyum tuzunun ne KKD yi nede KA yı arttırmadığını saptamışlardır. Zeiger ve ark. (1988) Salmonella typhimurium un TA97, TA98, TA100, TA1535 ve TA1537 suşlarında sodyum benzoat ın 5000µg/plate in üzerindeki dozlarda sitotoksik etkili olduğunu bildirmişlerdir. Kuboyama ve Fujii (1992), bir gıda katkı maddesi olan benzoik asitin Salmonella /mikrozom testinde TA100 suşu için zayıf mutajen olduğunu bildirmişlerdir. Nair (2001), sıçan ve fare ile yapmış oldukları in vivo çalışmada sodyum benzoat ın sıçanlarda ve farelerde herhangi bir toksisite göstermediğini bildirmiştir Bifenil, Sodyum Ortofenil Fenolle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Taze meyve ve sebzelerde, daha çok narenciyelerin yüzey uygulamalarında koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Sasaki ve ark. (1997), oral olarak verdikleri ortho-phenylphenol (2000mg/kg), biphenyl (2000 mg/kg) ve tiabendazol (200 mg/kg) ün genotoksiditesini in vivo olarak alkaline jel elektroforez tekniğiyle (comet testi) göstermeye çalışmışlardır. Bu çalışma sonucunda ortho-phenylphenol, biphenyl ve tiabendazol ün mide, karaciğer, böbrek, idrar yolları ve akciğerde DNA hasarını arttırdığı ortaya çıkmıştır. 9

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Sasaki ve ark. (2002), gıda sektöründe kullanılan 39 farklı kimyasalı farelere oral yolla verip 8 farklı (mide, barsak, akciğer, böbrek, idrar torbası, karaciğer, beyin ve kemik iliği) organda comet assay deneyini kullanarak genotoksiditelerini saptamaya çalışmışlardır. Bu çalışma sonucunda biphenyl, sodium o-phenylphenol ve tiabendazol ün sindirim sistemiyle ilgili organlarda DNA hasarını uyardığı saptanmıştır Borik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Et ve balık konservelerinde ve havyarda antimikrobiyal ajan olarak kullanılmaktadır. Uluslararası Toksikoloji Programı (1987), borik asit in Chinese hamster ovaryum hücrelerinde KKD ve KA yı etkilemediğini, Salmonella /mikrozom testinde de mutajen olmadığını bildirmiştir. Odunola (1997), borik asit in E. coli PQ37 de β-galaktozidaz sentezini ortamda S9-Mix bulunduğunda ve bulunmadığında önemli ölçüde arttırdığını saptamıştır. Dönbak ve ark. (2002), borik asit in Allium cepa L. kök ucu hücrelerinde c- mitoz u hafif bir şekilde artırdığını ve ayrıca mitotik aktiviteyi düşürdüğünü saptamışlardır. Arslan (2004), borik asit in insan periferal lenfositlerinde kromozomal aberasyonları 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde, KKD yi ise sadece 48 saatlik muamele süresinde doza bağlı bir şekilde arttırdığını bildirmiştir. Ayrıca, bu çalışmada borik asit in gerek 24 saatlik gerekse 48 saatlik muamele sürelerinde MI ve RI nin doza bağlı bir şekilde düştüğü kaydedilmiştir. 10

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ 2.5. Formaldehitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Provolon peynirinde koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Basler ve ark. (1985), S9 mix ve sıçan hepatositlerinin bulunduğu ve bulunmadığı in vitro ortamlarda kardeş kromatid değişimi üzerinde formaldehit in etkisini Chinese hamster V79 hücre kültürlerinde araştırmışlardır. Araştırıcılar, S9 mix in bulunmadığı ortamlarda formaldehit in kardeş kromatid değişimini toksik olmayan dozlarda doza bağlı olarak arttırdığını, S9 mix ve sıçan hepatositleri gibi bir metabolik aktivatörün varlığında ise kardeş kromatid değişimini arttırmadığını saptamışlardır Formik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Gazlı içecekler, meyve ve sebze konservelerinde koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Morita ve ark. (1990), Chinese hamster ovaryum K1 hücrelerini kullanarak formik asit in klastojenik aktivitelerinin medyumun ph sı ile olan ilişkisini test etmişlerdir. Bu çalışmaya göre bu asitlerin her birinin ayrı ayrı mm konsantrasyonunun başlangıç ph ı 6 veya daha aşağı olan besiyerlerinde kromozomal aberasyonlarını hem S9 mix bulunan hem de bulunmayan ortamlarda uyardıkları bildirilmiştir. Bu asitin mm konsantrasyonlarının ph 5.7 veya daha düşük ph lı medyumlarda da toksisite gösterdiği saptanmıştır. Al-Tarazi ve Alshawabkeh (2003), propionik asit ve formik asit in karışım halinde Salmonella pullorum üzerinde inhibisyon etkisini araştırmışlar ve karışım halinde propionik asit-formik asit karışımının kültürdeki koloni sayısında kontrole göre önemli derecede bir azalmaya neden olduğunu saptamışlardır. 11

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ 2.7. Laktik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Meyve ve sebze konserveleri, reçel, marmelatlar ve şekerlemelerde koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Morita ve ark. (1990), Chinese hamster ovaryum K1 hücrelerini kullanarak laktik asit in klastojenik aktivitelerinin medyumun ph sı ile olan ilişkisini test etmişlerdir. Bu çalışmaya göre bu asitin mm konsantrasyonlarının başlangıç ph ı 6 veya daha aşağı olan besiyerlerinde kromozomal aberasyonlarını hem S9 bulunan hemde bulunmayan ortamlarda uyardıkları bildirilmiştir. Bu asitin mm ı ph 5.7 veya daha aşağıdaki medyumlarda da toksik oldukları saptanmıştır Lizozimle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Olgunlaştırılmış peynirde koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Nagao ve ark. (1977), lizozim in memeli metabolik aktivasyon sistemli in vitro ortamda Salmonella typhimurium un TA100 ve TA98 suşları için mutajenik olduğunu bildirmişlerdir Malik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Şekerleme, şerbet, şuruplar, dondurmalar ve gazsız içeceklerde koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Fiume (2001), çeşitli dozlarda malik asiti sıçan, fare ve tavşanların besinlerine katarak toksiditesini araştırmıştır. Bu çalışma sonucunda malik asit in herhangi bir toksisiteye neden olmadığı, sadece yüksek konsantrasyonlarda hayvanlarda çok düşük oranlarda kilo kaybına neden olduğu saptanmıştır. 12

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Nisinle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Süt ürünlerinde, konserve meyve ve sebzelerde antimikrobiyal madde olarak kullanılmaktadır. Murinda ve ark. (2003), bir koruyucu madde olan nisin in yüksek derecede bakteriostatik olduğunu ve memeli hücreleri için de toksik olduğunu bildirmişlerdir Nitrit ve Nitratlarla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Nitrit ve nitratlar hem koruyucu olarak hem de renklendirici ve lezzet arttırıcı olarak kullanılır. Nitrat ve nitritler özellikle sosis, salam gibi et ürünlerinde ve süt ürünlerinde bulunur. Kodama ve ark. (1976), kültüre edilmiş fare FM3A kanser hücre hattının çeşitli dozlardaki sodyum nitrit ile muamelesi sonucunda incelenen hücrelerin %80 ninde kromozomal aberasyon olduğunu bildirmişlerdir. Ishidate ve Odashima (1977), kültüre edilmiş Chinese hamster hücrelerinde aralarında gıda katkı maddelerinin de bulunduğu 134 çeşit kimyasalın genotoksik etkisini incelemişler ve sodyum nitrat ve sodyum nitrit in kromozom testinde pozitif sonuç verdiğini, ancak kesin bir yargı için ilave testlerin yapılması gerektiğini bildirmişlerdir. Tsuda ve Kato (1977), kültüre edilmiş Chinese hamster hücrelerini çeşitli dozlardaki sodyum nitrit ile muamele etmişlerdir. Bu çalışma sonucunda in vitro da sodyum nitrit in endoredublikasyonu ve kromozomal anormallikleri arttırdığı saptanmıştır. Inui ve ark. (1979), Syrian golden hamster ları sodyum nitrit in farklı dozları ile bir hafta süreyle oral uygulama ile muamele etmişler, bu süre sonunda uterustaki embriyonik hücreleri izole ederek bu hücrelerde mikronükleus oluşumu, kromozomal anormallikler ve morfolojik anormalliklere bakmışlardır. Bu çalışma sonucunda sodyum nitrit in doza bağlı olarak mikronükleus oluşumunu arttırdığı, fakat kromozomal anormalliklerde bir artışa neden olmadığı ayrıca bu uygulama sonunda hücrelerde morfolojik anormalliklerin de meydana geldiği bildirilmiştir. 13

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Vachkova-Petrova (1979), sodyum nitrit ve basfungin in çeşitli dozlarını karışım halinde intraperitonal yolla sıçanlara vermişler ve basfungin in mutajenik etkisine sodyum nitrit in bir etkisinin olup olmadığını araştırmıştır. Bu çalışma sonucunda basfungin in tek başına yapmış olduğu etkinin karışım halinde verildiğinde de aynı şekilde devam ettiği saptanmıştır. Blitek ve ark. (1983), oxytetracycline ve potasyum nitrit in tek başlarına ve karışım halinde uygulandıklarında Salmonella suşları ve Swiss farelerindeki mutajenitesini araştırmışlar ve Salmonella/mikrozom testinde ne oxytetracyclin in nede potasyum nitrit in mutajenik olmadığını, karışım halinde bile tolere edilebilen dozlara kadar bir mutajenitenin olmadığı, oxcytetracycline ve potasyum nitrit in Swiss farelerinin kemik iliği hücrelerinde ayrı ayrı mikronükleus frekansını arttırdıklarını, karışım halinde ise nitrit oranının düşük olduğu konsantrasyonlarda frekansta bir artmanın olmadığı, nitrit in dozunun yükselmesi durumunda frekansın arttığını saptamışlardır. El Nahas ve ark. (1984), çok yaygın olarak kullanılan bir koruyucu madde olan sodyum nitrit in çeşitli konsantrasyonlarını gebe ve gebe olmayan albino sıçanların içme sularına karıştırarak vermişlerdir. Bu çalışma sonucunda sodyum nitrit in hem gebe hem de gebe olmayan sıçanların kemik iliği hücrelerinde kromozom anormalliklerini arttırdığı bulunmuştur. Ayrıca sodyum nitritin gebe sıçanların embriyolarının karaciğer hücrelerinde kromozomal anormalliklere neden olduğu bildirilmiştir. Ishidate ve ark. (1984), Japonya da hala kullanılmakta olan 190 sentetik kökenli, 52 doğal kökenli gıda katkı maddesinin mutajenitesini in vitro Chinese hamster fibroblast kültürlerinde kromozom aberasyonu ve Salmonella typhimurium da Ames testi ile araştırmışlardır. Araştırıcılar, bu çalışma sonucunda bu maddelerden yalnızca 14 tanesinin Ames testinde pozitif sonuç verdiğini, 54 tanesinin de kromozomal anormallik testinde pozitif sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Ancak, bunlardan 11 tanesinin (Fast green, hidrojen peroksit, potasyum bromat, sodyum klorit, sodyum hipoklorit, sodyum nitrit, kakao ve karamel) hem KA testinde hem de Ames testinde pozitif sonuç verdiğini bildirmişlerdir. 14

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Banerjee ve Giri (1986), sorbik asit in 30 günlük oral uygulama şeklinde tek başına ve sodyum nitritle birlikte, fare kemik iliği hücrelerindeki etkilerini incelemişlerdir. Bu çalışmaya göre sorbik asit in tek başına iğ iplikciğinin aktivitesini etkilediği, ancak kromozomlarda herhangi bir hasar oluşturmadığı, fakat nitrit in tek başına klastojenik olduğu, kombinasyon halinde verildiklerinde ise sinerjitik bir etkiye sahip olduğu bildirilmiştir. Krishna ve ark. (1987), sodyum nitrit ile nitroze edilmiş kömür tozunun oral yolla akut ve kronik uygulanmasından sonra fare kemik iliği hücrelerinde in vivo genotoksik etkilerini araştırmışlar ve nitrozlanmış kömür tozunun fare kemik iliği hücrelerinde genotoksik bir etkisinin olmadığını saptamışlardır. Luca ve ark. (1987), in vivo ve in vitro çalışmalarla sodyum nitrit in dişi sıçan, fare ve tavşandaki mutajenitesini araştırmışlardır. Kromozomal aberasyon çalışmaları sonucunda her üç türden sadece farede mikronükleus sayısında bir artışın olduğunu, her üç türde de kromozomal anormallik taşıyan metafazların oranının yüksek olduğunu saptamışlardır. Alavantic ve ark. (1988), dişi farelerin eşem hücrelerinde nitrit (60 ve 120 mg/kg/gün-14 gün boyunca) ve nitratların (600 ve 1200 mg/kg/gün-14 gün boyunca) in vivo genotoksik etkilerini zamansız DNA sentezi ve sperm anormallik testi kullanarak araştırmışlardır. Bu çalışmadan elde edilen sonuca göre bu iki madde ne zamansız DNA sentezini ne de sperm başı anormalliğini uyarmıştır. Mukherjee ve ark. (1988), sorbic asit ve sodyum nitrit in farklı konsantrasyonlarına maruz bırakılmış farelerde kardeş kromatid değişimi ve mikronükleus oluşumunu araştırmışlardır. Sodyum nitrit in uygulanan tüm dozlarda kardeş kromatid değişimini ve mikronükleus oluşumunu kontrol ile mukayese edildiğinde önemli ölçüde arttırdığını bildirmişlerdir. 1:1 oranında sorbik asitsodyum nitrit karışımının da sinerjitik bir etkiye sahip olduklarını bildirmişlerdir. Ohara ve ark. (1988), sodyum nitrit in mutajenik aktivitesini Salmonella typhimurium histidin reversiyon deneyleri ve rekombinasyon deneyiyle DNA hasar aktivitesini ölçmüşlerdir. Bu çalışmada sodyum nitrit in asidik ortamda triptofan ile reaksiyona girerek triprofanı mutajenik bir forma dönüştürdüğü saptanmıştır. 15

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Til ve ark. (1988), 6 haftalık sıçanlara sodyum nitrit in 100, 300, 1000 ve 3000 mg/litre konsantrasyonlardaki sodyum nitriti 13 hafta süresince ağız yoluyla vererek, sodyum nitrit in oral toksisitesini değerlendirmişlerdir. Bu çalışmaya göre en yüksek konsantrasyon olan 3000 mg/litre de dahi sıçan tükrük bezinde eser miktarda nitrite rastlanmış, ayrıca idrar yollarında da hiçbir olumsuz etkisinin olmadığını kaydetmişlerdir. Shimada (1989), 7 gün boyunca mg/l dozlarda sodyum nitriti oral yolla gebe ICR farelerine vermişler ve sodyum nitrit in embriyotoxic etkisini araştırmışlardır. Bu çalışma sonucunda embriyoda toksisite gelişimi açısından kontrol ile aralarında bir fark olmadığını belirtmişlerdir. Jonker ve ark. (1990), Wistar sıçanlarında sodium metabisülfit, mirex, loperamide, metaldehyde, stannus cloride, lysinoalanine ve potasyum nitritin karışım halinde oral toksisitesini araştırmışlardır. Bu amaçla bu maddelerin etki göstermemesi üzerine, minimum etkiyi gösterdiği dozlarını 4 hafta boyunca karışım halinde sıçanların içme sularına karıştırmışlardır. Bu çalışma sonucunda bu maddelerin minimum etkiyi gösterdiği dozlarda yani gıda sektöründe kullanılan dozlarının karışımlar halinde verildiğinde herhangi bir etkiye neden olmadığı saptanmıştır. Akın ve Sümer (1991), Salmonella/mikrozom testini kullanarak sıçan karaciğer fraksiyonunun (S9) bulunduğu ve bulunmadığı ortamlarda sodyum nitrit in mutajenitesini araştırmışlardır. Bu çalışmada sodyum nitrit Salmonella typhimurium un TA1535 suşu için mutajen, TA100 suşu için zayıf mutajen olduğu saptanmıştır. Prival ve ark. (1991), Amerika da kullanımına izin verilen 49 gıda katkı maddesinin mutajenitesini Salmonella typhimurium ve E. coli WP2 bakterilerini kullanarak saptamaya çalışmışlar ve çalışmaya göre 44 katkı maddesinin yapılan testler sonucunda mutajenik olmadığı, diğer 5 katkı maddesinin revertantların sayısında artışa neden olduğunu ve bunlardan yapısında histidin bulunan papain ve pepsin in sonuçlarının mutajeniteyi ispatlayacak oranda olmadığını, hidrojen peroksit ve potasyum nitrit in mutajenik olduğunu ve beta-karoten in durumunun şüpheli olduğunu belirtmişlerdir. 16

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Sushko ve Malenchenko (1992), tek dozda (50 cgy) ve kesikli (25 cgy) olarak gama ışını-sodyum nitrit ( mg/kg) muamelesine maruz bırakılan fare spermatositlerinde hem kesikli hem de tek doz gama ışını uygulamalarında gama ışını ve sodyum nitrit in sinerjitik bir etki göstererek, resiprokal translokasyonda önemli bir artışa neden olduğunu kaydetmişlerdir. Ryu ve Lloyd (1995), sodyum nitrit ve diğer nitrozlu bileşiklerin metronidazole hassas Trichomonas vaginalis e olan etkisini araştırmışlar ve çalışma sonucunda 8 mm lık sodyum nitrit, 1.2 mm lık sodyum nitroprusside, Trichomonas vaginalis in üremesini durdurucu bir etkilerinin olduğunu bildirmişlerdir. Tohamy ve ark. (1996), sıçan kemik iliği ve karaciğer hücrelerinde sodyum nitratın oluşturduğu anormalliklere karşı soya fasülyesiyle beslemenin koruyucu bir etkisinin olup olmadığını araştırmışlardır. Bu çalışmaya göre soya fasülyesi ile beslenmenin nitrozaminlerin yol açabileceği genotoksik ve kanserojenik etkiye karşı bir koruyucu etkisinin olduğunu kaydetmişlerdir. Abuharfeil ve ark. (2001), sodyum nitrit in çeşitli konsantrasyonlarının insan kanından elde edilen doğal öldürücülerin (natural killer) anti-tümör aktivitesine olan etkilerini araştırmışlar ve çalışma sonucunda sodyum nitrit in WEHI-164 hücrelerine karşı doğal öldürücülerin anti-tümör aktivitesinde %25 ila %66 oranında bir azalmaya neden olduğunu, bu nedenle de sodyum nitrit in tümör oluşumunu teşvik edici bir etkisinin olabileceğini bildirmişlerdir. Ohsawa ve ark. (2003), dimetilamin, proline ve morfinle eş zamanlı olarak ayrı ayrı sodyum nitriti farelere ağız yoluyla vermişler ve farelerin organlarında görülen DNA zararlarını comet assay testi ile tespit etmişler. Yapılan bu çalışma sonucunda test edilen organlardan sadece karaciğer de DNA hasarları gözlenmiştir Potasyum Bromatla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Un beyazlatıcısı olarak kullanılmaktadır. Ishidate ve ark. (1984), Chinese hamster fibroblast hücrelerinde 190 sentetik, 52 doğal kökenli katkı maddesinin mutajenik etkiye sahip olup olmadıklarını kromozom anormalliği testi ve Salmonella typhimurium da Ames testi ile 17

31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ araştırmışlardır. Bu çalışmaya göre testlerde kullanılan toplam 242 katkı maddesinden 54 ü kromozomal anormallik testinde pozitif, 3 tanesi (erythorbic acid, chlorine dioxide ve pancar kırmızısı) Ames testinde pozitif, aralarında potasyum bromatında bulunduğu 11 tanesi ise hem Ames testinde hem de kromozomal anormallik testinde pozitif sonuç vermiştir Propionic Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Propionic asit, dilimlenmiş ve ambalajlanmış ürünlerde koruyucu ve antioksidant madde olarak kullanılmaktadır. Basler ve ark. (1987), bir koruyucu madde olan propionik asit in genotoksik aktivitesini E. coli DNA tamir deneyleri, SOS kromotesti, Salmonella /mikrozom testi, in vitro KKD testi ve in vivo mikronükleus testi kullanarak saptamaya çalışmışlardır. Bu çalışmada E. coli tamir testi haricinde tüm testlerde negatif sonuç bulunmuş ve propionik asitin mutajenik bir madde olmadığı bildirilmiştir. Surjan (1989), Drosophila melanogaster mozaik kanat testini kullanarak 16 çeşit kimyasalın mutajenitesini saptamaya çalışmıştır. Yaptığı çalışmaya göre testte kullandığı 16 kimyasaldan 14 nün testte negatif sonuç verdiğini, chlor-diaminotoluene ve sorbik asit in pozitif sonuç verdiğini, ayrıca propionic asit in tek başına mitotik rekombinasyona neden olduğunu bildirmiştir. Vorobjeva ve ark. (1991), propionik asit in Salmonella typhimurium un TA1535 suşu için mutajenik olan sodyum azid e karşı antimutajenik bir etkiye sahip olduğunu, yine Vorobjeva ve ark. (1993) propionik asit in Salmonella typhimurium un TA100 suşu için mutajenik olan 4-nitroquinoline-N-oxide kimyasalına karşı antimutajenik bir etkiye sahip olduğunu bildirmişlerdir. Philipose ve ark. (1997), propionik asit in türevleri olan ibuprofen, ketoprofen ve naproxen in mutajenitesini in vivo KKD ve Ames testleriyle araştırmışlar ve her üç türevin de mutajen olmadığını, fakat kemik iliği hücrelerinde KKD yi zayıf bir şekilde arttırdığını bildirmişlerdir. Al-Tarazi ve Alshawabkeh (2003), propionik asit ve formik asit in karışım halinde Salmonella pullorum kültüründe inhibisyon etkisini araştırmışlardır. Bu 18

32 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ çalışmadan elde ettikleri sonuca göre karışım halinde propionik asit-formik asitin kültürdeki koloni sayısında kontrole göre önemli derecede bir azalmaya neden olduğunu bildirmişlerdir Sodyum Hipokloritle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Kuru meyve ve sebzelerde sterilizasyon amaçlı kullanılmaktadır. Matsuoka ve ark. (1979), çevresel mutajen ve kanserojenleri göstermek için in vitro kromozomal aberasyon testlerinde içinde sıçan karaciğer mikrozom fraksiyonundan ibaret bir aktivasyon sisteminin de bulunduğu S9 mix kullanmışlardır. Bu çalışma sonucunda gıdaların sterilizasyonunda kullanılan sodyum hypoklorit in pozitif sonuç verdiğini göstermişlerdir Sorbatlarla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Et ve balık ürünlerinde koruyucu madde olarak kullanılmaktadırlar. Abe ve Sasaki (1977), Potasyum sorbat ın Chinese hamster hücrelerinde yüksek konsantrasyonda kardeş kromatid değişimini ve kromozomal aberasyonları arttırdığını bildirmişlerdir. Hasegawa ve ark. (1984), sorbik asit ve onların sodyum ve potasyum tuzlarının Chinese hamster hücrelerinde kardeş kromatid değişimi ve kromozomal aberasyonlarının oluşumu üzerindeki etkilerini araştırmışlardır. Bu çalışmaya göre sorbik asit ve onun potasyum ve sodyum tuzlarının kromozomal aberasyonları, kardeş kromatid değişimini ve gen mutasyonlarını arttırdığını saptanmıştır. Ayrıca, sodyum sorbat ın sorbik asit ve potasyum sorbata göre daha genotoksik olduğu bildirilmiştir. Banerjee ve Giri (1986), sorbik asiti (15 mg/kg) tek başına ve sodyum nitrit (7.5-1 mg/kg) ile karışım halinde 30 gün ağız yoluyla sıçanlara vermişler ve bu çalışmada sorbik asit in iğ iplikciği aktivitesini bozduğunu, ancak kromozomlarda hasara neden olmamasına karşın sodyum nitrit in tek başına klastojenik olduğunu 19