BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Ümit ZAN ESMERON (ROCURONIUM BROMÜR) UN İNSAN PERİFERAL LENFOSİTLERİNDE IN VITRO GENOTOKSİK ETKİLERİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2007

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ESMERON (ROCURONIUM BROMÜR) UN İNSAN PERİFERAL LENFOSİTLERİNDE IN VITRO GENOTOKSİK ETKİLERİ Ümit ZAN YÜKSEK LİSANS BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez././ 2007 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle Kabul Edilmiştir. İmza. Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ DANIŞMAN İmza. Prof.Dr.Rüştü HATİPOĞLU ÜYE İmza. Doç.Dr.Eyyüp RENCÜZOĞULLARI ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza-Mühür Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ ESMERON (ROCURONIUM BROMÜR) UN İNSAN PERİFERAL LENFOSİTLERİNDE IN VITRO GENOTOKSİK ETKİLERİ Ümit ZAN ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Yıl : 2007, Sayfa : 68 Jüri : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Doç.Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Bu çalışma, genel anestezide kas gevşetici olarak kullanılan Esmeron un genotoksik etkiye sahip olup olmadığını insan periferal lenfositlerinde in vitro kardeş kromatid değişimi, kromozom aberasyonu ve mikronukleus testleri ile araştırmak amacıyla yürütülmüştür. Bu çalışmada insan periferal lenfositleri 60, 80, 100 µg/ml konsantrasyondaki esmeron ile 24 ve 48 saat muamele edilmiştir. Esmeron 24 ve 48 saatlik muamelelerde KKD yi uyarmadığı halde KA yı uyarmıştır. Proliferasyon indeksi (PI) ve Mitotik indeks i (MI) düşürmemiştir. Esmeron mikronukleus oluşumunu uyarmış, fakat nukleus bölünme indeksini (NBI) düşürmemiştir. Anahtar Kelimeler: Esmeron, İnsan periferal lenfositleri, Kardeş kromatid değişimi, Kromozom anormallikleri, Mikronükleus I

4 ABSTRACT MSc THESIS IN VITRO GENOTOXIC EFFECTS OF ESMERON IN HUMAN PERIPHERAL LYMPHOCYTES Ümit ZAN DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Year : 2007, Pages : 68 Jury : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Assoc.Prof.Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI The aim of this study was to determine possible genotoxic effects of esmeron, which is used as an anesthesia agent in general anesthesia, by using sister chromatid exchange (SCEs), chromosome aberration (CAs) and micronucleus (MN) tests in human peripheral lymphocytes. In the present study, the human peripheral lymphocytes were treated with three concentrations of esmeron (60, 80, 100 µg/ml) for 24 and 48 hours treatment periods. Esmeron increased the frequency of CAs but did not increase the frequency of SCEs. Esmeron didn t decrease the proliferation index (PI) and mitotic index (MI). And also esmeron stimulated the frequency of MN however, did not decrease the nuclear division index (NDI). Key Words: Esmeron, Human peripheral lymphocytes, Sister chromatid exchange, Chromosome aberration, Micronucleus II

5 TEŞEKKÜR Tez konumun belirlenmesi, yürütülmesi ve çalışmalarım boyunca beni yönlendiren, çalışmamı değerli kılan, öğrencisi olmaktan onur duyduğum Sayın Hocam Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım boyunca ilgi ve desteğini esirgemeyen, yardımlarını her zaman yanımda hissettiğim Sayın Hocam Doç.Dr.Eyüp RENCÜZOĞULLARI na sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Yardımlarından dolayı Sayın Hocam Doç. Dr. Hasan Basri İLA ya, Ar.Gör. Ayşe YAVUZ, Biyolog Semir CANIMOĞLU ve Biyolog Şebnem PARLAK a teşekkür ederim. Projemizi maddi yönden destekleyen Ç.Ü. Araştırma Fonu yöneticilerine de teşekkür ederim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ...I ABSTRACT...II TEŞEKKÜR...III İÇİNDEKİLER...IV SİMGELER VE KISALTMALAR...VIII ÇİZELGELER DİZİNİ...IX ŞEKİLLER DİZİNİ...X 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Anestezik İlaçlar İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Diazepam ile Yapılmış Olan Genotoksisite Çalışmaları Hexenal ile Yapılmış Olan Genotoksisite Çalışmaları Propofol ile Yapılmış Olan Genotoksisite Çalışmaları Sodyum Tiopental ile Yapılmış Olan Genotoksisite Çalışmaları Ketamin ile Yapılmış Olan Genotoksisite Çalışmaları Anestezik Gazlar İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Azot oksid İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Desflurane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Dioxychlorane ve Dioxyflurane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Divinil eter İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Enflurane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Etil Vinil Eter İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Fluroxene İle Yapılmış ve Genotoksisite Çalışmaları Halothane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Isoflurane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Kloroform İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Metoksiflurane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Sevoflurane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları...19 IV

7 Synthane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Trikloretilen İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Atık anestezik gazlarla Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları MATERYAL VE METOD Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları Kullanılan Kimyasal Maddeler Esmeron Kromozom Medyumu Mitomycin C (MMC) Kolşisin (Kolkisin) Hipotonik Eriyik Fiksatif Bromo-2 -deoxyuridine (BrdUrd) Sorensen Tamponu (Sorensen Buffer) Standart Saline Citrate (SSC) Eriyiği Giemsa Entellan Nitrik Asit (HNO 3 ) Kullanılan Deney Ekipmanları Hassas Terazi Santrifüj Mikroskop İnkübatör ph Metre Lamların Temizlenmesi Kardeş Kromatid Değişimini (KKD) (Sister Chromatid Exchange=SCE) ve Kromozom Anormalliklerini (KA) (Chromosomal Aberration=CA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İncelemeler...29 V

8 Kardeş Kromatid Değişimini (KKD) ve Kromozom Anormalliklerini (KA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi ve Preparatların Hazırlanması Preparatların Boyanması Mikroskobik İnceleme KKD ve Proliferasyon İndeksinin (PI) (Replikasyon İndeksi=RI) Saptanması (1). KKD Sayısının Saptanması (2). Proliferasyon İndeksinin (PI) (Replikasyon İndeksi=RI) Saptanması Kromozomal Anormallikler (KA) ve Mitotik İndeksin (MI) Saptanması (1). Kromozom Yapı ve Sayı Anormalliklerinin Saptanması (2). Mitotik İndeksin (MI) Saptanması Mikronukleus (MN) Sayısını Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İncelemeler Mikronukleus Sayısını Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi ve Preparatların Hazırlanması Preparatların Boyanması Mikroskobik İnceleme Mikroskopta Fotoğraf Çekme İstatistik Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi BULGULAR Esmeron un (Rocuronium bromür) Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) Üzerindeki Etkileri Esmeron un Yapısal Kromozom Aberasyonlarının (KA) Oluşumu Üzerindeki Etkileri...45 VI

9 4.3. Esmeron un DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkileri Esmeron un Mikronukleus (MN) Oluşumları ve Nukleus Bölünmesi Üzerindeki Etkileri TARTIŞMA Esmeron un KKD, KA ve MN Oluşumu Üzerindeki Etkileri SONUÇ VE ÖNERİLER...61 KAYNAKLAR...62 ÖZGEÇMİŞ...68 VII

10 SİMGELER VE KISALTMALAR BrdUrd : 5 - Bromo 2 - Deoxyuridine CA : Chromosome Aberration CHO : Chinese Hamster Ovary dt : Deoxytimidin du : Deoxyuridine DNA : Deoksiribonukleik Asit HNO 3 : Nitrik Asit KA : Kromozomal Anormallik KCl : Potasyum klorür KKD : Kardeş Kromatid Değişimi MI : Mitotik İndeks MMC : Mitomycin C MN : Mikronukleus NaCl : Sodyum klorür NBI : Nukleus Bölünme İndeksi PI : Proliferasyon İndeksi RI : Replikasyon İndeksi rpm : Round (Rotor) Per Minute SCE : Sister Chromatid Exchange SCD : Sister Chromatid Differentiation SSC : Standart Saline Citrate UV : Ultraviyole VIII

11 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1. Değişik Dozda Esmeron (Rocuronium bromür) ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Ortalama KKD Sayısı...44 Çizelge.4.2. Değişik Dozda Esmeron ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Yapısal Kromozom Anormallikleri ve Anormal Hücre % si...46 Çizelge 4.3. Değişik Dozda Esmeron ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş İnsan Periferal Lenfositlerinde PI ve MI...52 Çizelge 4.4. Değişik Dozlarda Esmeron ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş İnsan Periferal Lenfositlerinde Mikronükleuslu Binükleer Hücre Yüzdesi ve Nükleus Bölünme İndeksi...54 IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Kardeş Kromatid Değişiminin Olduğu ve Olmadığı Durumun Şematik Olarak Gösterilmesi...32 Şekil 3.2. Deoxytimidin (dt), Bromodeoxyuridin (BrdUrd) ve Deoxyuridin (du) in Kimyasal Yapıları...33 Şekil 3.3. BrdUrd in DNA Yapısına Girmesi ile 1., 2. ve 3. Mitoz Bölünmeyi Geçiren Hücrelerin Ayırt Edilmesinin Şematik Olarak Açıklanması...35 Şekil 3.4. Birinci Mitoz Bölünmeyi Geçiren Hücreye Ait Kromozomlar. x Şekil 3.5. İkinci Mitoz Bölünmeyi Geçiren Hücreye Ait Kromozomlar.x Şekil 3.6. Üçüncü Mitoz Bölünmeyi Geçiren Hücreye Ait Kromozomlar.x Şekil 3.7. Bir Nükleuslu Hücre...41 Şekil 3.8. İki Nükleuslu Hücre...41 Şekil 3.9. Üç Nükleuslu Hücre...42 Şekil Dört Nükleuslu Hücre...42 Şekil 4.1. Farklı Dozlarda Esmeron ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde KKD/Hücre...45 Şekil 4.2. Farklı Dozlarda Esmeron ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Yapısal KA...46 Şekil 4.3. Esmeron İle Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Kromatid Kırığı (100 µg/ml, 48 saat, ) ( 1000)...47 Şekil 4.4. Esmeron ile Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Kromatid Kırığı (60 µg/ml, 48 saat, ) ( 1000)...47 Şekil 4.5. Esmeron İle Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Kromatid Kırığı (100 µg/ml, 48 saat, ) ( 1000)...48 X

13 Şekil 4.6. Esmeron İle Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Kromatid Kırığı (100 µg/ml, 24 saat, ) ( 1000)...48 Şekil 4.7. Esmeron ile Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Kromatid Kırığı (80 µg/ml, 48 saat, ) ( 1000)...49 Şekil 4.8. Esmeron ile Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Kromozom Kırığı (100 µg/ml, 24 saat, ) ( 1000)...49 Şekil 4.9. Esmeron ile Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Kromozom Kırığı (80 µg/ml, 48 saat, ) ( 1000)...50 Şekil Esmeron ile Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Fragment (100 µg/ml, 24 saat, ) ( 1000)...50 Şekil Esmeron ile Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Endoreduplikasyon (60 µg/ml, 48 saat, ) ( 1000)...51 Şekil Farklı Dozlarda Esmeron ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Proliferasyon İndeksi...52 Şekil Farklı Dozlarda Esmeron ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Mitotik İndeks...53 Şekil Farklı Dozlarda Esmeron ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde MN li Binükleer Hücre %si...54 Şekil Esmeron ile Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Bir Mikronükleus İçeren Binükleer Hücre (60 µg/ml, 48 saat, ) ( 1000)...55 Şekil Esmeron ile Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Farklı Büyüklükte İki Mikronükleus İçeren Binükleer Hücre (100 µg/ml, 24 saat, ) ( 1000)...55 Şekil Esmeron ile Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Bir Mikronükleus İçeren Binükleer Hücre (80 µg/ml, 24 saat, ) ( 1000)...56 Şekil Farklı Dozlarda Esmeron ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde NBI...56 XI

14 1. GİRİŞ Ümit ZAN 1. GİRİŞ Kas gevşetici ilaçların anesteziye girişi, Güney Amerika yerlilerinin zehir olarak oklarının ucuna sürdükleri kürarın, nöromusküler blok oluşturucu etkilerinin öğrenilmesi ile başlar. Fransız fizyolog Claude Bernard, yılları arasında doğrudan kas uyarısı yardımıyla, kürarın etki mekanizmasının ilkelerini aydınlattı. Böylece nöromusküler bloğun kantitatif olarak ölçülmesinin temelleri atılmıştır. Kürar, ilk kez 1942 yılında Harold Griffith tarafından klinikte uygulanmıştır (Işık, 1996). Anesteziyi uygulamada kullanılan üç ana ilaç grubu; kas gevşeticiler, analjezikler ve hipnotiklerdir (Işık, 1996). Ayrıca İnhalasyon (nefes yoluyla alınan) anestezikleri dediğimiz anestezik gazlar da kullanılmaktadır. Kas gevşetici ilaçlara endotrakeal entübasyonun (hava yoluna yapay solunum yapılabilmesi için tüp takılması) ve cerrahi girişimin yapılabilmesi ve bunun yanı sıra kontrollü solunumun rahatça uygulanabilmesi için gereksinim duyulur. Dengeli anestezi uygulamasının temel unsurlarından biri olan kas gevşeticiler, tek reseptöre spesifik ilaç olup periferde impuls iletimini sağlayan reseptörler üzerine doğrudan etki ederler (Işık, 1996). Aynı zamanda kas gevşeticiler, anestezinin diğer unsurlarını oluşturan hipnotik ve analjezik gereksinimini de azaltmaktadır. Kas gevşeticilerin tanımlanmasında, kas gevşetici ilacın varılmak istenen bir hedefi vardır. Bu da şu şekilde tarif edilebilir: İdeal bir kas gevşetici güçlü olmalıdır, depolarizasyon (sinir uyarısı) oluşturmamalı, kardiyovasküler yan etkileri olmamalı, etkisi hızlı başlayıp birikim etkisine neden olmadan etkisi çabuk ortadan kalkmalıdır. Metabolize edilmeleri sonucunda inaktif ve toksik olmayan metabolitlere dönüşmeli, eliminasyonları böbrek ve karaciğer fonksyonlarından bağımsız olmalıdır (Işık, 1996). Kas gevşeticiler kan-beyin bariyerini geçemediklerinden santral sinir sistemi üzerine etkileri bulunmamaktadır. Suda erirler, glomerüler filtrasyon ile atılırlar ve reabsorbe olmazlar. Bu özellikleri yukarıda bahsedildiği gibi kan-beyin bariyerini ve plasenta gibi lipofilik membranları geçmelerine engel olur (Işık, 1996). Kas gevşeticiler etki mekanizmalarına göre iki ana grupta toplanırlar: 1

15 1. GİRİŞ Ümit ZAN A. Depolarizan Blok Yapan Ajanlar Sinirler, kasla temas ettikleri yerlerde nöromüsküler bağlantı ya da motor son plak adını verdiğimiz bir yapı oluştururlar. İşte burada bu depolarizan kas gevşetici ilaçlar asetilkolin gibi depolarizasyon (impuls, uyarı) yaparlar. Ancak asetilkolinesteraz tarafından parçalanmadıkları için oluşturdukları depolarizasyon asetilkoline göre daha uzun süreli olur. Bu süre içinde sinir yolu ile gelen uyarıya kas lifi cevap vermez. Süksinilkolin ve dekametonyum bu şekilde etki eder (Işık, 1996). B. Non-Depolarizan Kas Gevşeticiler Bu ajanlar ise sinir ile kasın birleşme noktasının membranındaki kolinerjik nikotinik reseptörler için asetilkolinle rekabete girerler. Reseptörlerle reversibl olarak birleşerek asetilkolinin reseptörlerle birleşmesini önlerler. Böylece asetilkolinin kas son plağı üzerindeki depolarizan etkisini azaltır veya tamamen engellerler. Bu ilaçlar reseptörlerle reversible olarak birleşirler, doğal olarak reseptördeki etki yerlerinden ayrılır ve tekrar birleşirler. Bu arada reseptörün serbest kaldığı anda asetilkolin reseptörü etkileyebilir. Bu çalışmada test maddesi olarak kullanılan esmeron (rocuronium bromür), steroidal nondepolarizan bir kas gevşetici olup, etki süresi de orta derecededir. Kimyasal olarak vecuroniumun 3-hidroxy metabolitinin bir türevidir (Işık, 1996). Metabolizması ve eliminasyonu karaciğer ve böbrekler yolu ile olmaktadır. Hayvan çalışmalarında daha çok safra yollarının kullanıldığı gösterilmiştir. Metaboliti, 17-deasetilrocuronium un etkisi rocuroniumun 1/5 i kadardır. Büyük dozlarda vagalitik etkisi (vagus sinirinin uyarılması sonucu kalp hızı ve kan basıncının artması) olan rocuronium, çocuklarda ve yaşlılarda etki farklılığı göstermektedir. Rocuronium, halothan ve fentanil uygulanan anestezide kardiyovasküler sisteme etkisi olmamaktadır. Arttırılan dozlarda kalp hızında hafif artış yapmasına karşılık histamin salınımına neden olmadığı bildirilmiştir. Sezaryen olgularında 0.6 mg/kg rocuroniumun anne ve bebekte kardiyovasküler sistem üzerine yan etkisi olmadığı ve bu dozun sezaryende güvenle kullanılabileceği önerilmektedir. 2

16 1. GİRİŞ Ümit ZAN İnsan hayatının her aşamasında karşılaşabileceği anestezik maddeler ve onunla birlikte kullanılan kas gevşeticilerin genotoksik risk taşıyıp taşımadığının araştırılması gerekir. Perry ve Evans (1975) tarafından mutajen ve kanserojenlerin kardeş kromatid değişimi (KKD) (Sister Chromatid Exchange=SCE) ve kromozom aberasyonunu (KA) (Chromosomal Aberration=CA) uyardıklarının saptanmasından sonra, KKD ve KA testleri mutajen ve kanserojenlerin kısa sürede belirlenmesi amacıyla kullanılmaya başlanmıştır. Genotoksisitenin belirlenmesinde kullanılan bir başka metod mikronükleus (MN) testidir. Mikronükleus hücre bölünmesinin anafaz evresinde kromozomların geri kalmasından ya da asentrik kromozom fragmentlerinden kaynaklandığı gibi, multipolar anafaz ve telofaz da mikronükleus oluşumuna sebep olmaktadır (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 1995). Uzun zamandan beri uygulanan sitogenetik bir teknik olan MN testi mitoz bölünme geçiren tüm bitki, hayvan ve insan hücrelerinde, fiziksel ve kimyasal ajanların meydana getirdiği genotoksik etkilerin belirlenmesinde güvenli olarak kullanılmaktadır. Anestezide kullanılan bazı ilaçlarla ilgili yapılan genotoksisite çalışmaları şunlardır. Waskell (1978), salmonella-sıçan karaciğer mikrozomal testini kullanarak daha çok solunum yolu anestezikleri ve birkaç metabolitlerinin mutajenitesi ile ilgili bir çalışma yapmıştır. Çalışmasında, hem bir sedatif hem de Trikloretilen in metaboliti olan Kloral hidrat ın zayıf bir mutajen olduğunu saptamıştır. Test edilen diğer bileşimler olan Halothane, Isoflurane, Metoksiflurane, Diazepam ve Chlordiazepoxide in de mutajenik olmadığını saptamıştır. Klimova ve Paskevich (1984), anestezik ilaçlardan barbitüratlar grubuna dahil olan hexenal ve sodyum thiopental in in vitro koşullarda kontrol grubuna oranla, kromozom aberasyonu frekansını iki misli arttırdığını ve bu etkinin doza bağlı olmadığını bulmuşlardır. In vivo koşullarda ise kromozom aberasyonu frekansının, sodium thiopental kullanımından sonra kontrol düzeyinde iken, hexenal kullanımından sonra önemsiz bir artış gösterdiğini bulmuşlardır. Husum ve ark. (1985a), Diazepam ın tek ve büyük bir dozu ile tedavi edilen hastalardan alınan periferal lenfosit kültüründe KKD testi kullanılarak, Diazepam ın 3

17 1. GİRİŞ Ümit ZAN mutajenik potansyelini araştırmışlardır. Bu araştırmada 18 i erkek, 16 sı da kadın olmak üzere ameliyat olacak 34 kişinin periferal lenfositleri incelenmiş ve diazepam ameliyat günü 0.2mg/kg dozunda oral yolla hastalara verilmiştir. Operasyondan 2-5 saat öncesi ve sonrasında kan örnekleri alınarak periferal lenfositler incelenmiştir. Araştırıcılar, Diazepam ın sigara içen ve içmeyen hastalarda KKD yi arttırmadığını ve bundan dolayı da Diazepam ın bu teste göre mutajenik bir etkisinin olmadığı kanısına varmışlardır. Huong ve ark. (1988), diazepam veya kimyasallar ile kendini zehirleyen hamile bayanların lenfositlerinde KKD ve KA testlerini kullanarak sitogenetik etkilerini araştırmışlardır. Bu çalışmada kendini zehirleyen 18 hamile olan ile 16 hamile olmayan kadınların lenfositleri incelenmiş ve hamile olmayan 31 kişi de kontrol amacıyla kullanılmıştır. Elde ettikleri sonuçları, hamile olmayan bayanların sonuçları ile karşılaştırmışlardır. Çalışma sonucunda her iki testte de kontrole kıyasla bir artış saptanmıştır. Benzodiazepin ilaç grubuna dahil olan Diazepam, epilepsi tedavisinde anksiyetenin (kaygı) giderilmesi ve sedasyonun (hastanın sakinleştirilmesi) sağlanması amacıyla kullanılan bir ilaçtır. Leal Garza ve ark. (1998), bu ilacın mutajenik aktivitesini incelemek amacıyla farelerin kemik iliği hücrelerinde KKD ve MN analizi yapmışlardır. 60 fare (30 erkek ve 30 dişi ) 12 şerli gruplar halinde sınıflandırılmıştır. 12 tanesi kontrol, diğer 12 tanelik fare grubu da pozitif kontrol olarak gruplandırılmıştır. Kontroldeki farelere fizyolojik tuz enjekte edilmiştir. Pozitif kontrol olarak 0.5 mg/kg Mitomycin C kullanılmıştır. Bunun dışında da diazepam enjekte edilen ve yine 12 fareden oluşan üç grup daha oluşturulmuştur. Bu gruplardan birincisine 0.1 mg/kg, ikincisine 0.2 mg/kg, sonuncusuna da 0.4 mg/kg diazepam enjekte edilmiştir. Yapılan çalışmalar, kontrole kıyasla tüm dozlarda MN lu eritrosit oranının anlamlı bir artış gösterdiğini ortaya koymuştur. KKD sonuçlarında ise 0.2 mg/kg ve 0.4 mg/kg lık dozlarda kontrole kıyasla belirgin bir artış olduğu gözlenmiştir. Sonuç olarak Diazepam ın fare kemik iliği hücrelerinde mutajenik ve genotoksik etkileri gözlenmiştir ve bu ilacın insan sağlığı için de bir risk faktörü olabileceği vurgulanmıştır. 4

18 1. GİRİŞ Ümit ZAN Yin ve ark. (1998), Diazepam ın aneugenik potansyelini belirlemek için, farelerin oositlerini in vitro koşullarda bu ilaca maruz bırakmışlardır. 5 µg/ml ve 25 µg/ml lik diazepam dozları kullanılmıştır. İğ oluşumu, hücre siklusunun ilerlemesi, kromozom davranışları ve mitokondrilerin dağılımı kromozomal aberasyonların kriterleri olarak ele alınmıştır. Çalışma neticesinde Diazepam ın mayoz bölünmede gecikmeye ve aneuploidiye neden olduğunu saptamışlardır. Ibrulj ve Nefic (1999), Diazepam ın genotoksik etkilerini insan kan lenfositlerinden hazırlanan kültürlerde araştırmışlardır. Neticede Diazepam ın lenfositlerin mitotik aktivitelerini azalttığını, sayısal kromozomal aberasyonlara (daha çok hipodiploidi) neden olduğunu ve sitotoksik etki gösterdiğini saptamışlardır. Görülen etkilerin frekansı ve anlamlılığı ile test edilen konsantrasyonların yoğunluğu arasında korelasyon olduğunu vurgulamışlardır. Karahalil ve ark.(2005), diazepam ve propofol anestezik ilaçların açık kalp cerrahisi boyunca kullanıldıklarında herhangi bir genotoksik etkileri olup olmadığını KA testi ile saptamaya çalışmışlardır. 45 hastadan anesteziden önce ve sonra olmak üzere kan örnekleri alınarak kültürler hazırlanmıştır. Sonuç olarak periferal kan lenfositlerinde herhangi bir kromozomal aberasyona neden olmadıklarını saptamışlardır. Görüldüğü gibi ameliyatlarda kas gevşetici ilaç olarak kullanılan esmeron (rocuronium bromür) un genotoksik etkiye sahip olup olmadığı şimdiye kadar araştırılmamıştır. Bu çalışmada, Esmeron un genotoksik etkiye sahip olup olmadığı insan periferal lenfositlerinde in vitro kardeş kromatid değişimi (KKD), kromozom aberasyonu(ka) ve mikronukleus(mn) testleri ile araştırılmıştır. 5

19 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Anestezi uygulamasında kullanılan ilaçlar (analjezikler, kas gevşeticiler ve hipnotikler) ve anestezik gazlarla ilgili daha önce yapılan genotoksisite çalışmaları aşağıdaki şekilde özetlenebilir Anestezik İlaçlar İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Diazepam ile Yapılmış Olan Genotoksisite Çalışmaları Waskell (1978), salmonella-sıçan karaciğer mikrozomal testini kullanarak daha çok solunum yolu anestezikleri ve birkaç metabolitlerinin mutajenitesi ile ilgili bir çalışma yapmıştır. Çalışmasında, hem bir sedatif hem de Trikloretilen in metaboliti olan Kloral hidrat ın zayıf bir mutajen olduğunu saptamıştır. Diazepam ın ise mutajenik olmadığını saptamıştır. Husum ve ark. (1985a), Diazepam ın tek ve büyük bir dozu verilen hastalardan alınan periferal lenfosit kültüründe KKD testi kullanılarak, Diazepam ın mutajenik potansiyelini araştırmışlardır. Bu araştırmada 18 i erkek, 16 sı da kadın olmak üzere ameliyat olacak 34 kişinin periferal lenfositleri incelenmiş ve diazepam ameliyat günü 0,2mg/kg dozunda oral yolla hastalara verilmiştir. Operasyondan 2-5 saat öncesi ve sonrasında kan örnekleri alınarak periferal lenfositler incelenmiştir. Araştırıcılar, Diazepam ın sigara içen ve içmeyen hastalarda KKD yi arttırmadığını saptamışlar ve bundan dolayı da Diazepam ın bu teste göre mutajenik bir etkisinin olmadığı kanısına varmışlardır. Huong ve ark. (1988), diazepam veya kimyasallar ile kendini zehirleyen hamile bayanların lenfositlerinde KKD ve KA testlerini kullanarak sitogenetik etkilerini araştırmışlardır. Bu çalışmada kendini zehirleyen 18 hamile ile 16 hamile olmayan hastanın lenfositleri incelenmiş ve hamile olmayan 31 kadın da kontrol amacıyla kullanılmıştır. Elde ettikleri sonuçları, hamile olmayan bayanların sonuçları ile karşılaştırmışlardır. Çalışma sonucunda her iki testte de kontrole kıyasla bir artış saptanmıştır. Leal Garza ve ark. (1998), Diazepam ın mutajenik aktivitesini incelemek amacıyla farelerin kemik iliği hücre kültürlerinde KKD ve MN analizi yapmışlardır. 6

20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN 60 fare (30 erkek ve 30 dişi ) 12 şerli gruplar halinde sınıflandırılmıştır. 12 tanesi negatif kontrol, diğer 12 tanelik fare grubu da pozitif kontrol olarak gruplandırılmıştır. Negatif kontroldeki farelere fizyolojik tuz enjekte edilmiştir. Pozitif kontrol olarak 0.5 mg/kg Mitomycin C kullanılmıştır. Bunun dışında da diazepam enjekte edilen ve yine 12 fareden oluşan üç grup daha oluşturulmuştur. Bu gruplardan birincisine 0.1 mg/kg, ikincisine 0.2 mg/kg, sonuncusuna da 0.4 mg/kg diazepam enjekte edilmiştir. Yapılan çalışmalar, kontrole kıyasla tüm dozlarda MN lu eritrosit oranında anlamlı bir artış gösterdiğini ortaya koymuştur. KKD sonuçlarında ise 0.2 mg/kg ve 0.4 mg/kg lık dozlarda negatif kontrole kıyasla belirgin bir artış olduğu gözlenmiştir. Sonuç olarak Diazepam ın fare kemik iliği hücrelerinde mutajenik ve genotoksik etkileri gözlenmiştir ve bu ilacın insan sağlığı için de bir risk faktörü olabileceği vurgulanmıştır. Yin ve ark. (1998), Diazepam ın aneugenik potansyelini belirlemek için, farelerin oositlerini in vitro koşullarda bu ilaca maruz bırakmışlardır. 5 µg/ml ve 25 µg/ml lik diazepam dozları kullanılmıştır. İğ oluşumu, hücre siklusunun ilerlemesi, kromozom davranışları ve mitokondrilerin dağılımı kromozomal aberasyonların kriterleri olarak ele alınmıştır. Çalışma neticesinde Diazepam ın mayoz bölünmede gecikmeye ve aneuploidiye neden olduğunu saptamışlardır. Ibrulj ve Nefic (1999), Diazepam ın genotoksik etkilerini insan kan lenfositlerinden hazırlanan kültürlerde araştırmışlardır. Neticede Diazepam ın lenfositlerin mitotik aktivitelerini azalttığını, sayısal kromozomal aberasyonlara (daha çok hipodiploidi) neden olduğunu ve sitotoksik etki gösterdiğini saptamışlardır. Görülen etkilerin frekansı ve anlamlılığı ile test edilen konsantrasyonların yoğunluğu arasında korelasyon olduğunu vurgulamışlardır. Karahalil ve ark.(2005), anestezik ilaç olarak açık kalp cerrahisi boyunca kullanıldıkları Diazepam ın herhangi bir genotoksik etkisi olup olmadığını KA testi ile saptamaya çalışmışlardır. 45 hastadan anesteziden önce ve sonra olmak üzere kan örnekleri alınarak kültürler hazırlanmıştır. Sonuç olarak periferal kan lenfositlerinde Diazepam ın herhangi bir kromozom aberasyonuna neden olmadığını saptamışlardır. 7

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN Hexenal ile Yapılmış Olan Genotoksisite Çalışmaları Klimova ve Paskevich (1984), anestezik ilaçlardan barbitüratlar grubuna dahil olan hexenal ın insan periferal lenfosit kültürlerinde in vitro koşullarda kontrol grubuna oranla, kromozom aberasyonu frekansını iki misli arttırdığını ve bu etkinin doza bağlı olmadığını bulmuşlardır. In vivo koşullarda ise kromozom aberasyonu frekansının, hexenal kullanımından sonra önemsiz bir artış gösterdiğini bulmuşlardır Propofol ile Yapılmış Olan Genotoksisite Çalışmaları Tomioka ve Nakajo (2000), Propofol ün Chinese hamster yumurtalık hücrelerinde in vitro koşullarda KKD yi uyarmadığını saptamışlardır. Karahalil ve ark.(2005), anestezik ilaç olarak açık kalp cerrahisi boyunca kullanıldıkları Propofol ün herhangi bir genotoksik etkisi olup olmadığını KA testi ile saptamaya çalışmışlardır. 45 hastadan anesteziden önce ve sonra olmak üzere kan örnekleri alınarak kültürler hazırlanmıştır. Sonuç olarak araştırıcılar Propofol ün periferal kan lenfositlerinde herhangi bir kromozom aberasyonuna neden olmadığını saptamışlardır Sodyum Tiopental ile Yapılmış Olan Genotoksisite Çalışmaları Klimova ve Paskevich (1984), anestezik ilaçlardan barbitüratlar grubuna dahil olan sodyum thiopental in in vitro koşullarda kontrol grubuna oranla, kromozom aberasyonu frekansını iki misli arttırdığını ve bu etkinin doza bağlı olmadığını bulmuşlardır. In vivo koşullarda ise kromozom aberasyonu frekansının, sodium thiopental kullanımından sonra kontrol kadar olduğu saptanmıştır Ketamin ile Yapılmış Olan Genotoksisite Çalışmaları Adhvaryu ve ark. (1986), barbitürat ilaç grubundan olmayan anestezik ajan Ketamin in, Chinese hamster yumurtalık hücrelerinde genotoksik potansiyelini belirlemek amacıyla KKD testi yapmışlar ve sonuç olarak bu ilacın in vitro koşullarda genotoksik olduğunu saptamışlardır. 8

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN 2.2. Anestezik Gazlar İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Azot oksid İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Grant ve ark. (1977), solunum yolu anestezikleri olan Azot oksid in kromozomal anormallikler üzerine etkisini Vicia faba (bakla) bitkisinin kök ucu hücrelerinde araştırmışlardır. Bu ajanın mitotik indekste geçici bir artış sağladığı ve anormal hücre sayısını arttırdığını saptamışlardır. Görünen bu anormalliklerin de anestezik ajanların iğ faaliyetleri üzerine olan etkisi ile ortaya çıktığını vurgulamışlardır. Fakat araştırıcılar bu anestezik ajanın kromozom mutasyonuna neden olmadığını belirlemişlerdir. Husum ve Wulf (1980), ameliyathane personellerinin lenfositlerinde KKD ni araştırmışlardır. Azot oksit gibi atık anestezik gazlara uzun süre maruz kalan insanlarda KKD nin artmadığını saptamışlardır. Kundomal ve Baden (1985), Drosophila melanogaster de eşeye bağlı resesif letal mutasyon analizi ile solunum yolu anesteziklerinin mutajenitesini araştırmışlardır. Yaptıkları çalışma sonucunda Azot oksid in test edilen konsantrasyonlarda resesif letal mutasyonu uyarmadığını saptamışlardır. Baden ve Kundomal (1987), Halothane, Enflurane ve Isoflurane ın Azot oksid varlığında mutajenik potansyellerini Drosophila melanogaster de araştırmışlardır. Resesif letal mutasyonları genetik indikatör olarak kullanmışlardır. Netice olarak Halothane ın Azot oksid varlığında resesif letal mutasyonların oranında doza bağlı bir artışa neden olduğunu belirlemişlerdir. Fakat ne Enflurane ne de Isoflurane nın, Azot oksid varlığında mutajenik bir etkiye sahip olmadığını saptamışlardır. Karelova ve ark. (1992), anestezi çalışanlarının periferal lenfositlerinde KKD ve KA testlerini kullanarak Azot oksid anestezik gazının genotoksik etkisini araştırmışlardır. Aynı zamanda bu kişilerin idrarının da mutajenik potansyelini Salmonella typhimurium un TA98 ve TA100 suşlarını kullanarak Ames testi ile araştırmışlardır. Periferal lenfositlerin sitogenetik analiz neticesinde, Azot oksid e maruz kalan çalışanlarda kontrolle kıyaslandığında hem KA lı anormal hücrelerin 9

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN hem de KKD nin anlamlı bir artış gösterdiğini saptamışlardır. İdrarın mutajenite testinde ise negatif sonuç elde edilmiştir. Hoerauf ve ark. (1999), Isoflurane ve Azot oksid in ameliyathanede çalışan personeller üzerindeki genetik zararlarını, mikronukleus sayısı ve kardeş kromatid değişimine bakarak araştırmışlardır. Yaptıkları çalışma sonucunda, mikronukleus sayısında kontrole kıyasla önemli olmayan bir artış, kardeş kromatid değişiminde ise kontrole kıyasla önemli bir artış gözlemişlerdir. Bunun yanı sıra günde sigara içen bir bireyle karşılaştırıldığında, bu kardeş kromatid değişiminin düşük bir oran olduğunu ortaya koymuşlar ve her iki testteki artışın nedeninin daha çok araştırılması gerektiğini vurgulamışlardır. Pasquini ve ark. (2001), Azot oksid e maruz kalan ameliyathane çalışanlarından 46 anestezistin periferal kan lenfositlerinde kardeş kromatid değişimi ve mikronükleus oluşumunu incelemişlerdir. Neticede erkek anestezistlerde kontrole oranla düşük frekansta bir kardeş kromatid değişiminin arttığını belirlemişlerdir. Mikronükleus frekansının da kadınlarda belirli bir derecede yüksek olduğunu fakat erkeklerde böyle bir durumun gözlenmediğini saptamışlardır. Ayrıca araştırıcılar mikronükleus frekansının artışına bakıldığında bu gaza maruz kalan bayan anestezistlerde genotoksik riskin daha muhtemel olduğunu bildirmişlerdir. Lewinska ve ark. (2005), ameliyathanede çalışan hemşirelerin periferal kan lenfositleri üzerinde yaptıkları çalışmada Azot oksid in mikronükleus frekansı üzerine etkisini ve hangi tip kromozomal zarara (klastojenik veya aneugenik) neden olduğunu araştırmışlardır. Bu çalışmada, kontrole oranla mikronükleus sayısının anlamlı bir artış gösterdiği saptanmıştır. Fakat bu artışın da istatistiksel olarak küçük bir artış olduğunu ve Azot oksid in kesin olmamakla beraber pro-aneugenik etkiye sahip olduğunu bildirmişlerdir Desflurane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Karpinski ve ark. (2005), solunum yolu anesteziği olan Desflurane nın insan periferal lenfositlerinde in vitro genotoksik etkisini araştırmışlardır. Desflurane ın genotoksik etkisini, genotoksik ajan olduğu kanıtlanmış olan Halothane ın genotoksisitesi ile comet testi kullanarak karşılaştırmışlardır. Sonuç olarak 10

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN Desflurane a maruz kalan hastalar veya çalışanlar üzerinde bu ajanın daha az zararlı bir etkiye sahip olduğunu saptamışlardır. Akın ve ark. (2006), yaptıkları çalışmada, anestezide solunum ajanı olarak kullanılan Desflurane nin genotoksik aktivitesini, kardeş kromatid değişimi üzerine olan etkisine bakarak, insan periferal lenfositlerinde anestezi süresince ve sonrasında araştırmışlardır. Çalışma sonucunda araştırıcılar Desflurane nin kardeş kromatid değişimini arttırdığını ve bu ajanın genetik zararlara yol açabileceği kanısına varmışlardır Dioxychlorane ve Dioxyflurane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Baden ve ark. (1982), solunum yolu anestezikleri olan Dioxychlorane ve Dioxyflurane nın mutajenitelerini belirlemek amacıyla, Salmonella typhimurium un TA1535 ve TA100 mutantlarını kullanmışlar, araştırıcılar yaptıkları bu çalışmada söz konusu anestezik ajanların her ikisinin de mutajenik olmadığını saptamışlardır Divinil eter İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları White ve ark.(1979), solunum yolu anesteziği olan Divinil eter in kardeş kromatid değişimi üzerine olan etkisini ve karsinojenik potansyellerini çalışmışlardır. Kanserojenitenin genetik indikatörü olarak Ames testini kullanmışlar ve bu ajanın bakterilerde mutasyona neden olmadığını bulmuşlardır. Halbuki, Chinese hamster yumurtalık hücrelerinde Divinil eter in KKD ni arttırdığını saptamışlardır Enflurane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Baden ve ark. (1977), Salmonella typhimurium un histidin bağımlı iki farklı suşunu (TA 1535 ve TA 100) kullanarak Enflurane ın mutajenik etkisini araştırmışlardır. Netice olarak Enflurane ın mutajenik olmadığını ortaya koymuşlardır. White ve ark. (1979), Enflurane ın kardeş kromatid değişimi üzerine olan etkisini ve karsinojenik potansyellerini çalışmışlardır. Kanserojenitenin genetik indikatörü olarak Ames testini kullanmışlar ve bu gazın bakteriyel mutasyona neden 11

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN olmadığını saptamışlardır. Aynı araştırıcılar Chinese hamster yumurtalık hücrelerinde Enflurane in KKD sayısını arttırmadığını saptamışlardır. Land ve ark. (1981), Enflurane a maruz bırakılan farede spermlerindeki morfolojik değişimleri inceleyerek yaptıkları çalışmada Enflurane in kontrole kıyasla anormal spermatozoidlerin oranını, istatistiksel anlamda önemli derecede arttırmış olduğunu saptamışlardır. Husum ve ark. (1981), Enflurane anestezisinden sonra insan lenfositlerinde KKD ni incelemişlerdir. Bu incelemeler neticesinde in vivo koşullarda enflurane a anestezik konsantrasyonlarda (%1) kısa dönem maruz kalan insan lenfositlerinde mutajenik etkiye dair herhangi bir belirti olmadığına karar vermişlerdir. Kundomal ve Baden (1985), Drosophila melanogaster de eşeye bağlı resesif letal mutasyon analizi ile solunum yolu anesteziklerinin mutajenitesini araştırmışlardır. Yaptıkları çalışma sonucunda Enflurane nın test edilen konsantrasyonlarda mutajenik etkileri olmadığını saptamışlardır. Trudnowski ve ark. (1987), Enflurane in mutajenik potansiyelinin Chinese hamster akciğer hücrelerinde, kardeş kromatid değişimi aracılığı ile araştırdıkları bir çalışma yapmışlardır. Chinese hamster akciğer hücreleri enflurane ile oksijen karışımı, %5 karbon dioksit ve nitrojene maruz bırakılmışlardır. Kontroller ise oda havasına ve %5 karbon dioksite maruz bırakılmıştır. Muamele grubunun KKD sayısı kontrollerle karşılaştırıldığında önemli bir fark olmadığı gözlenmiştir. Baden ve Kundomal (1987), Enflurane in Azot oksid varlığında mutajenik potansyellerini Drosophila melanogaster de araştırmışlardır. Resesif letal mutasyonlarını genotoksik risk indikatörü olarak kullanmışlardır. Bu gazın Azot oksid varlığında mutajenik bir etkiye sahip olmadığı saptanmıştır. Pasquini ve ark. (2001), daha çok Enflurane ve Azot oksid e maruz kalan ameliyathane çalışanlarından 46 anestezistin periferal kan lenfositlerinde kardeş kromatid değişimi ve mikronükleus oluşumunu incelemişlerdir. Neticede erkek anestezistlerde kontrole oranla düşük frekansta bir kardeş kromatid değişiminin artışını gözlemlemişlerdir. Mikronükleus frekansının da kadınlarda belirli bir derecede yüksek olduğunu fakat erkeklerde böyle bir durumun gözlenmediğini saptamışlardır. Ayrıca araştırıcılar mikronükleus frekansının artışına bakıldığında 12

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN gazlara maruz kalan bayan anestezistlerde genotoksik riskin daha muhtemel olduğunu bildirmişlerdir Etil Vinil Eter İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları White ve ark.(1979), Etil vinil eter in genotoksisitesini kardeş kromatid değişimi ve ames testi ile araştırmışlardır ve bu gazın bakterilerde mutasyon meydana getirmediğini bulmuşlardır. Halbuki etil vinil eter Chinese hamster yumurtalık hücrelerinde KKD yi uyarmıştır Fluroxene İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Baden ve ark. (1977), Salmonella typhimurium un histidin bağımlı iki farklı suşunu (TA 1535 ve TA 100) kullanarak Fluroxene in mutajenik etkisini araştırmışlardır. Araştırıcılar Fluroxene in yüksek bir mutajenik ajan olduğunu ve ameliyathane çalışanları ile hastalar için tehlikeli bir ajan olabileceğini bildirmişlerdir. White ve ark.(1979), solunum yolu anesteziklerinin kardeş kromatid değişimi üzerine olan etkisini ve karsinojenik potansyellerini çalışmışlardır. Karsinojenitenin genetik indikatörü olarak Ames testini kullanmışlar ve kullanılan anestezikler arasında sadece Fluroxene nin bakteriyel mutasyona neden olduğunu saptamışlardır. Bir diğer çalışmada da, Chinese hamster yumurtalık hücrelerinde KKD testi ile Fluroxene nin genotoksik etkisini araştırmışlar ve bu ajanın KKD yi arttırdığını saptamışlardır. Kundomal ve Baden (1985), Drosophila melanogaster de eşeye bağlı resesif letal mutasyon analizi ile solunum yolu anesteziklerinin mutajenitesini araştırmışlardır. Yaptıkları çalışma sonucunda Fluroxene in doza bağlı olarak önemli derecede resesif letal mutasyona neden olduğunu saptamışlardır Halothane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Baden ve ark. (1976), Halothane in mutajenitesini in vitro mikrobiyal test sistemi ile, Salmonella typhimurium un mutantlarında (TA98 VE TA100) 13

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN araştırmışlardır. Halothane ve onun bir metaboliti olan trifloroasetik asidin mutajenik olmadığını ortaya koymuşlardır. Grant ve ark. (1977), solunum yolu anesteziği olan Halothane ın kromozomal anormallik üzerine etkilerini Vicia faba (bakla) bitkisinin kök ucu hücrelerinde araştırmışlardır. Bu ajanın mitotik indekste geçici bir artış sağladığı ve anormal hücre sayısını arttırdığını saptamışlardır. Görünen bu anormalliklerin Halothane ın iğ faaliyetleri üzerine olan etkisi ile ortaya çıktığını vurgulamışlardır. Fakat araştırıcılar bu anestezik ajanın kromozom mutasyonuna neden olmadığını belirlemişlerdir. Garro ve Phillips (1977), Halothane ın metaboliti olan 2-bromo-2-kloro-1,1- difloroetilen in Salmonella typhimurium da hem nokta hem de çerçeve kayması mutasyonuna neden olduğunu saptamışlardır. Waskell (1978), salmonella-sıçan karaciğer mikrozomal testini kullanarak daha çok solunum yolu anestezikleri ve birkaç metabolitlerinin mutajenitesi ile ilgili bir çalışma yapmıştır. Araştırıcı bu çalışmada Halothane ın mutajenik olmadığını belirlemiştir. Kramers ve Burm (1979), Drosophila melanogaster de Halothane in mutajenik olup olmadığını araştırmışlardır. Eşeye bağlı resesif letal mutasyonun indüksyonunu, genetik zararların indikatörü olarak kullanmışlardır. Sonuç olarak çalışılan koşullarda Halothane in zayıf bir mutajenik aktiviteye sahip olduğunu saptamışlardır. Edmunds ve ark.(1979), Halothane in volatil metabolitlerinin mutajenik etkilerini çalışmışlardır. Çalışma Ames testi ile yapılmış olup sonuç olarak, Halothane in metabolitlerinden olan CF3CH2Cl (2-kloro-1,1,1-trifloroetan) ve CF2CBrCl (2-bromo-2-kloro-1,1-difloroetilen) nin mutajenik olmadıklarını belirlemişlerdir. Fakat diğer bir metabolit olan CF2CHCl (2-kloro-1,1- difloroetilen) nin de çok zayıf bir mutajenik özelliğe sahip olduğunu saptamışlardır. Bununla birlikte uzun süreli maruz kalmalarda etkinin nasıl olduğu tam anlamıyla bilinememiştir. White ve ark.(1979), solunum yolu anesteziklerinin kardeş kromatid değişimi üzerine olan etkisini ve karsinojenik potansyellerini çalışmışlardır. Kanserojenitenin genetik indikatörü olarak Ames testini kullanmışlar ve Halothane in bakteriyel 14

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN mutasyona neden olmadığını ortaya koymuşlardır. Chinese hamster yumurtalık hücrelerinde de genotoksik etkilerini araştırmışlar ve bu ajanın KKD yi uyarmadığını belirlemişlerdir. Husum ve Wulf (1980), ameliyathane personellerinin lenfositlerinde KKD ni araştırmışlardır. Halothane ve azot oksit gibi atık anestezik gazlara uzun süre maruz kalan insanlarda KKD nin artmadığını saptamışlardır. Basler ve Rohrborn (1981), Halothane ın genotoksik etkisini in vivo koşullarda KA, MN, KKD ve dominant letal mutasyon testleri ile araştırmışlardır. Chinese hamsterler 3 saat süre için %1 oranında, 3 saat süre için %2 oranında veya 24 saat boyunca % 0.5 oranında Halothane a maruz bırakılmalarından sonra kemik iliği hücrelerinde KA frekansında artış olmadığı saptanmıştır. KKD analizinde de 3 saat süre için %1 veya 12 saat süre için % 0.5 lik Halothane a maruz bırakılan hamsterlerin kemik iliği hücrelerinde KKD nin uyarılmadığını belirlemişlerdir. Çalışma sonucunda 16 günlük embriyoların karaciğer hücrelerinde monosomik ve trisomik hücreler gözlenmemiştir. Dominant letal mutasyon oranında ve mikronukleus sayısında da herhangi bir artış gözlenmemiştir. Araştırıcilar bu bilgiler ışığında in vivo koşullarda Halothane in genotoksik risk taşımadığına karar vermişlerdir. Husum ve ark. (1981), Halothane anestezisinden sonra insan lenfositlerinde KKD ni incelemişlerdir. Bu incelemeler neticesinde in vivo koşullarda Halothane a anestezik konsantrasyonlarda (%1) kısa dönem maruz kalan insanların lenfositlerinde mutajenik etkiye dair herhangi bir belirti olmadığına karar vermişlerdir. Kundomal ve Baden (1985), Drosophila melanogaster de eşeye bağlı resesif letal mutasyon analizi ile solunum yolu anesteziklerinin mutajenitesini araştırmışlardır. Yaptıkları çalışma sonucunda Halothane ın doza bağlı olarak önemli derecede resesif letal mutasyona neden olduğunu saptamışlardır. Husum ve ark. (1985b), ortopedi ameliyatı olacak olan ve sigara içen hastalarda, Halothane ın kardeş kromatid değişimi testi aracılığı ile genotoksik potansyelini araştırmışlardır. Çalışma sonucunda sigara içen hastaların lenfositlerinde kardeş kromatid değişiminin uyarılmadığını saptamışlar ve bu nedenle Halothane ın herhangi bir genotoksik etkisinin olmadığı sonucuna varmışlardır. 15

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN Baden ve Kundomal (1987), Halothane in Azot oksid varlığında mutajenik potansiyellerini Drosophila melanogaster de araştırmışlardır. Resesif letal mutasyonları genetik indikatör olarak kullanmışlardır. Netice olarak Halothane ın Azot oksid varlığında resesif letal mutasyonların oranında doza bağlı bir artışa neden olduğunu belirlemişlerdir. Karelova ve ark. (1992), anestezi çalışanlarının periferal lenfositlerinde KKD ve KA testlerini kullanarak anestezik gazların (halothane ve azod oksid) genotoksik etkilerini araştırmışlardır. Aynı zamanda bu kişilerin idrarının da mutajenik potansiyelini Salmonella typhimurium un TA98 ve TA100 suşlarını kullanarak Ames testi ile araştırmışlardır. Periferal lenfositlerin sitogenetik analizi neticesinde, gazlara maruz kalan çalışanlarda kontrolle kıyaslandığında hem KA lı anormal hücrelerin hem de KKD nin anlamlı bir artış gösterdiğini saptamışlardır. İdrarın mutajenite testi de negatif olarak sonuçlanmıştır. Georgieva ve ark. (1993), daha önce ameliyat olmuş 7 hastadan alınan periferal lenfositlerde Halothane nın klastojenik aktivitesini araştırmışlardır. Lenfosit kültüründe KKD ve KA analizi yapılmıştır. Kan örnekleri ameliyattan önce, ameliyatın başında anestezi etkisini gösterir göstermez ve ameliyattan 24 saat sonra olmak üzere 3 defa alınmıştır. Yapılan testler neticesinde Halothane in klastojenik aktivitesinin çok düşük bir ihtimal olduğunu ortaya koymuşlardır. Robbiano ve ark. (1998), fare hücrelerinde solunum yolu anestezikleriyle yaptıkları deneyde, MN testini kullanarak bu ajanların genotoksik aktivitelerini araştırmışlardır. Sonuç olarak Halothane ile muamele edilen farenin hücreleri arasında binükleer olanların frekansında bir düşme olduğunu ve bunun nedeninin de hücre bölünmesi üzerindeki toksik etkilerinden kaynaklandığını ortaya koymuşlardır. Bu nedenlerden dolayı, bu ajanın fareler için potansiyel genotoksik aktiviteye sahip olduğu kanısına varmışlardır. Jaloszynski ve ark.(1999), commet testi ile Halothane ın insan periferal lenfositlerinde genotoksik etkilerini araştırmışlar ve çalışmaları sonucunda Halothane ın genotoksisitesinin yüksek olduğunu ve hücre ölümüne neden olduğunu saptamışlardır. 16

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN Topouzova Hristova ve ark.(2006), commet testini kullanarak solunum yolu anestezik ajanı olan Halothane ın insandaki A549 akciğer epitel hücrelerinde DNA hasarlarına neden olduğunu saptamışlardır. Zarar görmüş hücrelerin büyük çoğunluğunun iyileşemediğini ve direkt olarak hücre ölümü gerçekleştiğini vurgulamışlardır Isoflurane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Baden ve ark. (1977), Salmonella typhimurium un histidin bağımlı iki farklı suşunu (TA 1535 ve TA 100) kullanarak Isoflurane in mutajenik etkilerini araştırmışlardır. Sonuç olarak Isoflurane in mutajenik olmadığını ortaya koymuşlardır. Waskell (1978), salmonella-sıçan karaciğer mikrozomal testini kullanarak daha çok solunum yolu anestezikleri ve birkaç metabolitlerinin mutajenitesi ile ilgili bir çalışma yapmıştır. Çalışmasında, Isoflurane in mutajenik olmadığını saptamıştır. White ve ark.(1979), Isoflurane in genotoksisitesini Chinese hamster yumurtalık hücrelerinde kardeş kromatid değişimi ve S. typhimurium da gen mutasyon testleri ile araştırmışlardır. Bu çalışmada bu anestezik maddenin genotoksik risk taşımadığını ve KKD yi de uyarmadığını saptamışlardır. Kundomal ve Baden (1985), Drosophila melanogaster de eşeye bağlı resesif letal mutasyon analizi ile Isoflurane in mutajenitesini araştırmışlardır. Yaptıkları çalışma sonucunda Isoflurane in test edilen konsantrasyonlarda mutajenik etkisi olmadığını saptamışlardır. Husum ve ark. (1985b), ortopedi ameliyatı olacak olan ve sigara içen hastalarda, Isoflurane in kardeş kromatid değişimi testi aracılığı ile genotoksik potansiyelini araştırmışlardır. Çalışma sonucunda sigara içen hastaların lenfositlerinde kardeş kromatid değişiminin uyarılmadığını saptamışlardır. Bu sonuçlar da Isoflurane in herhangi bir genotoksik etkisi olmadığını göstermektedir. Trudnowski ve ark. (1987), Chinese hamster akciğer hücrelerinde Isoflurane ın mutajenik potansyelinin kardeş kromatid değişimi testi ile araştırmışlardır. Chinese hamster akciğer hücreleri isoflurane ile oksijen karışımı, %5 karbon dioksit ve nitrojene maruz bırakılmışlardır. Kontroller ise oda havasına ve 17

31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN %5 karbon dioksite maruz bırakılmıştır. Muameleli grubun KKD sayıları kontrollerle karşılaştırıldığında önemli bir fark olmadığı gözlenmiştir. Baden ve Kundomal (1987), Isoflurane in Azot oksid varlığında mutajenik potansyellerini Drosophila melanogaster de araştırmışlardır. Resesif letal mutasyonları genetik risk indikatörü olarak kullanmışlardır. Netice olarak Isoflurane in Azot oksid varlığında mutajenik bir etkiye sahip olmadığı saptanmıştır. Jaloszynski ve ark.(1999), commet testi ile solunum yolu anestezikleri olan Isoflurane in insan periferal lenfositlerinde genotoksik etkilerini araştırmışlar ve çalışmaları sonucunda Isoflurane ın tamir edilebilir DNA zararlarına neden olduğunu belirlemişlerdir. Hoerauf ve ark. (1999), Isoflurane ve Azot oksid in ameliyathanede çalışan personeller üzerindeki genetik zararlarını, mikronukleus sayısı ve kardeş kromatid değişimine bakarak araştırmışlardır. Yaptıkları çalışma sonucunda, mikronukleus sayısında kontrole kıyasla önemli olmayan bir artış, kardeş kromatid değişiminde ise kontrole kıyasla önemli bir artış gözlemişlerdir. Bunun yanı sıra günde sigara içen bir bireyle karşılaştırıldığında, saptanan kardeş kromatid değişimi sayısının düşük olduğunu ortaya koymuşlar ve her iki testteki artışın nedeninin daha çok araştırılması gerektiğini vurgulamışlardır. Karabıyık ve ark.(2001), Isoflurane in insan lenfositlerinde genotoksik etkilerini comet testi ile karşılaştırmışlardır. Isoflurane altında anesteziye maruz kalan hastaların periferal lenfositleri anestezi öncesi, devamı ve sonrası süreçlerinde incelenmiş ve elde edilen sonuçlar bu gaza hiç maruz kalmayan kontrol grubunun periferal lenfositlerindeki sonuçlarla karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak anestezi süresince Isoflurane in DNA zararlarına yol açtığını saptamışlardır. Fakat bu zararların ameliyattan sonraki 50 gün içinde hücreler tarafından tamir edilebildiğini de vurgulamışlardır Kloroform İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları White ve ark.(1979), Kloroform un kardeş kromatid değişimi üzerine olan etkisini ve karsinojenik potansyelini araştırmışlardır. Kanserojenitenin genetik indikatörü olarak Ames testini kullanmışlar ve Kloroform un bakteriyel mutasyona 18

32 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN neden olmadığını ve Chinese hamster yumurtalık hücrelerinde de KKD yi uyarmadığını saptamışlardır. Land ve ark.(1981), solunum yolu anesteziği olan Kloroform a maruz bırakılan farede spermlerdeki morfolojik değişimleri inceleyerek yaptıkları çalışmada, Kloroform un kontrole kıyasla anormal spermatozoidlerin oranını, istatistiksel anlamda önemli derecede arttırmış olduklarını saptamışlardır Metoksiflurane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Grant ve ark. (1977), solunum yolu anesteziklerinden biri olan Metoksiflurane in kromozomal anormallik üzerine etkilerini Vicia faba (bakla) bitkisinin kök ucu hücrelerinde araştırmışlardır. Bu ajanın mitotik indekste geçici bir artış sağladığı ve anormal hücre sayısını arttırdığını saptamışlardır. Görünen bu anormalliklerin de anestezik ajanın iğ faaliyetleri üzerine olan etkisi ile ortaya çıktığını vurgulamışlardır. Fakat araştırıcılar Metoksiflurane in kromozom mutasyonuna neden olmadığını belirlemişlerdir. Baden ve ark. (1977), Salmonella typhimurium un histidin bağımlı iki farklı suşunu (TA 1535 ve TA 100) kullanarak Metoksiflurane in mutajenik etkisini araştırmışlardır. Sonuçlar Metoksiflurane in mutajenik olmadığını ortaya koymuştur. Waskell (1978), salmonella-sıçan karaciğer mikrozomal testini kullanarak Metoksiflurane in genotoksik etkilerini araştırmıştır. Bu çalışmada araştırıcı Metoksiflurane in mutajenik olmadığını saptamıştır. White ve ark.(1979), Metoksiflurane nin genotoksik etkiye sahip olup olmadığını KKD ve ames testi ile araştırmışlardır. Bu çalışmada araştırıcılar test maddesinin bakterilerde mutasyona neden olmadığını saptamışlardır ve ayrıca araştırıcılar bu maddenin Chinese hamster yumurtalık hücrelerinde de KKD yi uyarmadığını belirlemişlerdir Sevoflurane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Baden ve ark. (1982), bir solunum yolu anesteziği olan Sevoflurane nin mutajenitesini belirlemek amacıyla, Salmonella typhimurium un TA1535 ve TA100 19

33 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN mutantlarını kullanmışlar, araştırıcılar yaptıkları bu çalışmada söz konusu anestezik ajanın mutajenik olmadığını saptamışlardır. Eger ve ark. (1997), sevoflurane nin bir ayrışım ürünü olan bileşik A nın, Chinese hamster yumurtalık hücrelerinde kardeş kromatid değişimi üzerine etkisini araştırmışlardır. Araştırıcılar sevofluranın minimum alveoler konsantrasyonda ( 1 atm.basınç altındaki alveoler anestezik parsiyel basıncın yüzdesi) kullanıldığında kardeş kromatid değişimini arttırdığını saptamışlardır. Karabıyık ve ark.(2001), sevoflurane nın insan lenfositlerinde genotoksik etkilerini in vivo comet testi ile araştırmışlardır. Sevoflurane a maruz kalan hastaların periferal lenfositleri anestezi öncesi, devamı ve sonrası süreçlerinde incelenmiş ve bu gaza hiç maruz kalmayan kontrol grubunun sonuçları ile karşılaştırılmışlardır. Bu çalışmada sevoflurane nın DNA zararlarına yol açtığı saptanmıştır. Fakat bu zararların ameliyattan sonraki 50 gün içinde hücreler tarafından tamir edilebildiğini de vurgulamışlardır. Alleva ve ark. (2003), ortopedi cerrahisi altındaki 20 hastanın lenfositlerinin DNA ları üzerinde solunum yolu anesteziği olan Sevoflurane nin genotoksisitesini araştırmışlardır. Sevoflurane nin genotoksisitesi DNA zararlarının analiz edilmesi, apopitoz ve DNA tamir enzim aktivitesi kullanılarak çalışılmıştır. Sonuç olarak Sevoflurane dan kaynaklı riskin çok az olduğunu saptamışlardır. Fakat elde ettikleri bulgular, DNA zararlarının tamir mekanizmasının anlaşılması yönünden katkı sağlamıştır. Krause ve ark.(2003), sevoflurane anestezisinin çocukların periferal kan lenfositlerinde kardeş kromatid değişiminin üzerine etkisini araştırmışlar ve kısa süreli sevoflurane anestezisi uygulanmasında, bu ajanın çocukların T lenfositlerinde kardeş kromatid değişimine neden olmadığını saptamışlardır. Szyfter ve ark.(2004), anestezik solunum yolu ajanı olan Sevoflurane nin genotoksisitesini in vivo ve in vitro koşullarda araştırmışlardır. Araştırıcılar bu çalışmada genotoksik aktiviteleri daha önce bilinen Halothane ve Isoflurane anestezik ajanlarının genotoksik aktiviteleri ile Sevoflurane nin genotoksik aktivitesi commet testi ile karşılaştırılmıştır. Netice olarak araştırıcılar hem in vivo hem de in 20

34 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN vitro koşullarda Sevoflurane nin herhangi bir genotoksik etkisi olmadığı kanısına varmışlardır. Lüleci ve ark. (2005), Sevoflurane nin hücre bölünmesi ve kardeş kromatid değişiminin düzeyine etkisini inceledikleri çalışmalarında, sevoflurane nın anestezide uygulandığında insanlarda hücre bölünmesini etkiliyebileceği ve ayrıca bu ajanın DNA üzerinde mutajenik etkiye sahip olabileceğini saptamışlardır. Bu çalışmada sigara içmeyen 42 hastaya anestezide % 8 sevoflurane % 100 oksijen verilirken, nöromusküler blok ve endotrakeal entübasyon (yapay solunum yapılabilmesi için hava yoluna tüp takılması) için de 0.1 mg/kg vecuronium verilmiştir. Kan örnekleri, kontrol olarak kullanılmak üzere anesteziden önce, anesteziden 60 dakika sonra, 24 saat sonra ve son olarak da anesteziden 5 gün sonra olmak üzere 4 defa alınmıştır. Anestezinin sürdüğü 60 dakika boyunca KKD nin arttığını, anesteziden 24 saat sonra alınan kan örneklerinde yapılan incelemelerde ise KKD nin bir önceki incelemeye kıyasla düştüğünü saptamışlardır. Anesteziden 5 gün sonraki kan örneği incelemelerinde de KKD nin normal seviyesine döndüğünü belirlemişlerdir Synthane İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Baden ve ark. (1982), solunum yolu anesteziği olan Synthane nin mutajenitelerini belirlemek amacıyla, Salmonella typhimurium un TA1535 ve TA100 mutantlarını kullanmışlar, araştırıcılar yaptıkları bu çalışmada söz konusu anestezik ajanın mutajenik olmadığını saptamışlardır Trikloretilen İle Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Waskell (1978), salmonella-sıçan karaciğer mikrozomal testini kullanarak daha çok solunum yolu anestezikleri ve birkaç metabolitlerinin mutajenitesi ile ilgili bir çalışma yapmıştır. Çalışmasında, hem bir sedatif hem de Trikloretilen in metaboliti olan Kloral hidrat ın zayıf bir mutajen olduğunu saptamıştır. Land ve ark.(1981), solunum yolu anestezik ajanı olan Trikloretilen in fare spermlerindeki morfolojik değişimler üzerine olan etkisini araştırmışlar, 21

35 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN Trikloretilen in kontrole kıyasla anormal spermatozoidlerin oranını istatistiksel anlamda önemli derecede arttırmış olduğunu saptamışlardır. Robbiano ve ark. (1998), Trikloretilen in genotoksisitesini farelerde MN testini kullanarak araştırmışlar ve Trikloretilen ile muamele edilen fare hücreleri arasında binükleer olanların frekansında bir düşme olduğunu ve bunun nedeninin de hücre bölünmesi üzerindeki toksik etkilerinden kaynaklandığını ortaya koymuşlardır. Bu nedenlerden dolayı, bu ajanın fareler için potansiyel genotoksik aktiviteye sahip olduğu kanısına varmışlardır Atık anestezik gazlarla Yapılmış Genotoksisite Çalışmaları Husum ve ark. (1983), atık anestezik gazlara düşük konsantrasyonlarda uzun süreli maruz kalmalardan sonra, insanlarda muhtemel kromozomal zararları araştırmışlardır. Ameliyathane personellerinin periferal lenfositlerinde kardeş kromatid değişimi ve kromozom aberasyonlarını incelemişlerdir. KKD için her bir kişide 30 hücre, KA için de 100 hücre incelenmiştir. Toplam 45 kişinin kan örnekleri incelenmiştir. Netice olarak bu atık anestezik gazların (halothane ve azot oksid) eser konsantrasyonlarına uzun süre maruz kalan ameliyathane personellerinin lenfositlerinde herhangi bir mutajenik etkiye rastlanmamıştır. Lamberti ve ark. (1989), ameliyathanede çalışan ve anestezik gazlara maruz kalan personellerin genotoksik risk taşıyıp taşımadıklarını KKD ve kromozom aberasyonu testi ile araştırmışlardır. Çalışmada 45 ameliyathane çalışanından kan örnekleri alınmış, bunlardan 15 i anestezik gazlara maruz bırakılırken diğer 15 i de anestezik gazlara ve iyonize radyasyona maruz bırakılmıştır. Son 15 kişi de kontrol grubunu oluşturmuştur. Sonuç olarak KKD nin kontrole kıyasla düşük bir oranda arttığını, fakat kromozom aberasyonunun kontrole kıyasla anlamlı bir artış gösterdiğini saptamışlardır. Araştırıcılar her iki artışın da istatistiksel olarak çok önemli olmadığını da vurgulamışlardır. Sardas ve ark. (1992), ameliyathanede çalışan 67 personelin periferal lenfositlerinde KKD testi ile anestezik gaz atıklarından (halothane, isoflurane, azot oksid) kaynaklı bir mutajenik etkinin olup olmadığını araştırmışlardır. Sağlıklı 50 kişilik bir grup da kontrol grubu olarak kullanılmıştır. Neticede KKD nin kontrole 22

36 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ümit ZAN kıyasla anlamlı bir artış gösterdiğini ve bu artışın sigara içmeyen ameliyathane çalışanlarında gözlendiğini ortaya koymuşlardır. Bozkurt ve ark. (2002), periferal lenfositlerde atık anestezik gazların genotoksisitesiyle ilgili bir çalışmayı KKD testini kullanarak yapmışlardır. Çalışmanın amacı, maruz kalınan atık anestezik gazların genotoksik riski oluşturup oluşturmadığını araştırmaktır. Bu çalışmanın sonucunda, bu gazların bir takım kromozomal lezyonlara neden olabildiğini, fakat bu zararların çok hızlı bir şekilde tamir edilebildiğini saptamışlardır. 23

37 3. MATERYAL VE METOD Ümit ZAN 3. MATERYAL VE METOD Bu çalışmada materyal olarak sağlıklı ve sigara içmeyen aynı yaşlarda iki bayan (19 ve 20 yaşlarında) ve iki erkekten (18 ve 20 yaşlarında) alınan periferik kan ve test maddesi olarak esmeron kullanılmıştır Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları Kullanılan Kimyasal Maddeler Esmeron Hastalara genel anestezi uygulamasında kullanılan ilaç gruplarından bir tanesi de kas gevşeticilerdir. Esmeron kas gevşetici bir ilaç olup klinikte hala ameliyatlarda kullanılmaktadır. Bu ilaç damar yolundan hastaya enjekte edilir ve etkisini hemen gösterir. Organon ilaç firması bu ürünü 1994 de ABD de Zemuron olarak kullanıma sunmuştur. O zamandan bu yana dünyada 79 ülkede Esmeron adı altında ruhsat almıştır ve çeşitli enjeksiyon dozları bulunmaktadır. Türkiye de Esmeron 50mg/12 şişe formu mevcuttur. Esmeron kas üzerinde hızlı bir şekilde etkisini gösterir. Verilmesinden yaklaşık 1 dakika sonra kas gevşemesi sağlanır. Bu, hasta açısından riskleri en aza indirmektedir. Metabolizması ve eliminasyonu karaciğer ve böbrekler yolu ile olmaktadır. Esmeron un kimyasal özellikleri ve esmeron hakkındaki diğer bilgiler aşağıda verilmiştir. Ticari adı : Esmeron, Zemuron Kimyasal adı : Rocuronium bromür, 1-(17β-Acetoxy-3α-hydroxy-2βmorfolino- 5α-androstan-16β-yl)-1- allylpyrrolidiniumbromid Kapalı formülü : C 30 H 49 BrN 2 O 4 Molekül ağırlığı : CAS No : Açık formülü : 24

38 3. MATERYAL VE METOD Ümit ZAN Kromozom Medyumu Bu çalışmada Biochrom firmasının ürettiği Chromosome Medium B (cat. no. F5023), hücre kültürü için kullanılmıştır. Chromosome Medium B nin her litresinde aşağıdaki bileşikler verilen miktarlarda bulunmaktadır: MEM JOKLIK with Non essential Amino Acids ml Fetal Calf Serum ml Heparin E Penicillin G, Sodium Salt E Streptomycin Sulphate...50 mg Phytohemagglutinin M mg Bu medyum her tüpe 2.5 ml olacak şekilde paylaştırılmış ve bu miktarlarda kullanılmıştır. Kültür tüpleri steril olarak temin edilmiştir Mitomycin C (MMC) Pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. MMC steril saf suda 0.25μg/ml olacak şekilde hazırlanmış ve buzdolabında saklanmıştır Kolşisin (Kolkisin) Kromozom preparatlarının hazırlanmasında mitotik zehir olarak Colchicine (kolkisin) (Sigma cat. No. C9754) kullanılmıştır. Kolşisin eriyiği steril saf su içerisinde hazırlanmış ve kromozom medyumunun her ml sinde 0.06 µg olacak şekilde (0.06 µg/ml) 2.5 ml lik kromozom medyumuna ilave edilmiştir. 25

39 3. MATERYAL VE METOD Ümit ZAN Hipotonik Eriyik Hipotonik eriyik olarak %0,4 lük KCl (Merck) kullanılmıştır. Eriyik bidestile su içinde stok halinde hazırlanıp ağzı kapalı bir cam kapta buzdolabında (+4 ºC) saklanmıştır. Her preparasyondan yaklaşık 2 saat önce yeteri kadar miktar alınıp 37ºC deki inkübatörde ısıtılıp kullanılmıştır Fiksatif KKD ve KA için kullanılan fiksatif, 1 hacim glasial asetik asit in 3 hacim metanol ile karıştırılması sonucu hazırlanmıştır. MN için ise iki farklı fiksatif kullanılmıştır. İlk fiksatif 1 hacim glasial asetik asit in 5 hacim metanol ile karıştırıldıktan sonra 1/1 oranında %0.9 NaCl ile seyreltilmesiyle hazırlanmıştır. Diğer fiksatifler ise NaCl ilave edilmeden kullanılmıştır. Fiksatif kullanılmadan iki saat önce hazırlanmış ve buzdolabında saklanmıştır. Her seferinde preparat yapım işleminden iki saat önce taze olarak hazırlanıp kullanılmıştır Bromo-2 -deoxyuridine (BrdUrd) BrdUrd Sigma firmasından (Cat. No. B 5002) temin edilmiştir. BrdUrd eriyiği bidistile su içerisinde hazırlanmış, daha sonra 0.2 µm çapındaki membran filtre (Sartorius marka) ile steril edilmiştir. Bu eriyikten kültür tüpleri içerisindeki kromozom medyumuna 10 µg/ml olacak şekilde ilave edilmiştir Sorensen Tamponu (Sorensen Buffer) KKD ni incelemek amacıyla preparat yapımı sırasında preparatlar Sorensen tamponu içerisinde UV lambası ile ışınlandırılmıştır. Ayrıca bu tampon %5 lik Giemsa boyası hazırlanmasında da kullanılmıştır. Bu tampon eriyik tampon A ve tampon B olmak üzere iki stok çözelti halinde hazırlanmış olup bu çözeltiler çalışmanın amacına uygun olarak birbirleriyle değişik miktarlarda karıştırılarak kullanılmıştır. 26

40 3. MATERYAL VE METOD Ümit ZAN Hazırlanışı: Tampon A : gr KH 2 PO ml saf su içinde eritilmiştir (ph=4.8). Tampon B : gr Na 2 HPO 4.12H 2 O 250 ml saf su içinde eritilmiştir (ph=9.3) Standart Saline Citrate (SSC) Eriyiği Bu eriyik ışınlamadan sonra kardeş kromatidler arasındaki kontrast farkını artırmak amacıyla kullanılmıştır. SSC eriyiğini hazırlamak için gr trisodyum sitrat (C 6 H 5 Na 3 O 7.2H 2 O) ve 21.9 gr NaCl kullanılmıştır. Bu iki madde ayrı ayrı kaplarda bir miktar saf su içerisinde çözülmüş, daha sonra aynı kaba aktarılarak birbirleriyle karıştırılmış ve üzerlerine 500 ml oluncaya kadar saf su ilave edilmiştir. Hazırladığımız bu stok eriyik 5xSSC dir ve bu eriyik buzdolabında saklanmıştır. Deneyimizde, bu stoktan 20 ml alıp üzeri 100 ml oluncaya kadar saf su ile tamamlanarak elde edilen 1x SSC kullanılmıştır Giemsa Giemsa boyası Merck firmasından (cat. no. 9204) temin edilmiş olup deneylerimizde Sorensen tamponu içinde hazırlanmış olan %5 lik boya eriyiği preparatların boyanmasında kullanılmıştır Entellan Preparat kapatma solüsyonudur (Merck, cat. no. 7961). Preparatlar daimi hale getirilirken lam ve lamelin birbirlerine yapıştırılmasında kullanılmıştır Nitrik Asit (HNO 3 ) Lamları temizlemek amacıyla 1 N HNO 3 çözeltisi olarak hazırlanmıştır. Bu çözelti plastik şişede saklanarak her defasında tekrar tekrar kullanılmıştır. 27

41 3. MATERYAL VE METOD Ümit ZAN Kullanılan Deney Ekipmanları Hassas Terazi Hava akımlarına karşı özel cam paravanlarla korunan ve 0,0001 gr hassasiyetindeki GEC AVERY marka terazi kimyasalların tartılmasında kullanılmıştır Santrifüj Rotor çapı 21 cm olan ve 4000 rpm e kadar yükselebilen devir hızı, 99dk. lık zaman ayarlayıcı ve 28 tüp kapasiteli HETTICH UNIVERSAL marka santrifüj çalışmalarda kullanılmıştır Mikroskop Koordinat cetveli ve immersiyon objektifi olan PRIOR marka binoküler ışık mikroskobu preparat incelemeleri sırasında kullanılmıştır. Fotoğraflar ise Olympos marka dijital fotoğraf makinalı mikroskopta çekilmiştir İnkübatör Hücrelerin 37ºC de inkübe edilmesi için Dedeoğlu marka inkübatör kullanılmıştır ph Metre Kimyasalların ph değerlerini saptamak için WTW 315i (Germany) marka ph metre kullanılmıştır Lamların Temizlenmesi Kültür süresinin bitiminden iki gün önce etiketlenmiş olan lamlar şaleye dizilerek üzerlerini iyice örtecek şekilde 1 N nitrik asit konmuştur. Şalenin ağzı kapatılarak bu şekilde 24 saat bekletilmiştir. Süre bitiminde lamlar yarım saat akan 28

42 3. MATERYAL VE METOD Ümit ZAN çeşme suyunda iyice yıkanmıştır. Lamlar 3-4 defa saf sudan geçirildikten sonra şale saf su ile doldurularak lamlar buzdolabında saklanmıştır Kardeş Kromatid Değişimini (KKD) (Sister Chromatid Exchange=SCE) ve Kromozom Anormalliklerini (KA) (Chromosomal Aberration=CA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İncelemeler Kardeş Kromatid Değişimini (KKD) ve Kromozom Anormalliklerini (KA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi ve Preparatların Hazırlanması Sağlıklı ve sigara içmeyen yaşları birbirine yakın iki erkek ve iki bayandan alınan 1/10 oranında heparinize edilmiş kan örnekleri kromozom medyumlarına steril şartlarda 6 damla (0.2 ml) (Rencüzoğulları ve Topaktaş, 1991) ekilmiştir. Yine steril şartlarda ve daha önce hazırladığımız BrdUrd eriyiğinden her tüpe son konsantrasyonu 10 µg/ml olacak şekilde ilave edilerek iyice karıştırılmış ve hücre kültürü inkübatörde 37±1 C de 72 saat için inkübe edilmiştir. Esmeron un etkisini incelemek için kültür süresinin bitimine 24 ve 48 saat kala esmeronun daha önce belirlenmiş konsantrasyonları olan 60, 80 ve 100 µg/ml lik miktarları kültür tüplerine ilave edilmiştir. Esmeron 5 ml lik flakonlar halinde sıvı olarak hazırlanmış bir ilaçtır. Ayrıca 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde pozitif kontrol olarak MMC kullanılmıştır. MMC tüplere 0.25 µg/ml olacak şekilde verilmiştir. Kültür süresinin bitiminden 2 saat önce (yani kültürün 70. saatinde) her tüpe hazırlanan kolşisin eriyiğinden ilave edilmiş (0.06 µg/ml) ve tüpler hafifçe sallanarak iyice karıştırılmıştır. Hücreler 2 saat süresince (37 C de) kolşisin ile ön muameleye tabi tutulmuştur. Kültür süresi olan 72. saatin bitiminde kültür tüpleri 1200 rpm de 15 dk. santrifüj edilmiş, süpernatant atılmıştır. Dipte kalan ve hücreleri ihtiva eden ml lik sıvı iyice karıştırıldıktan sonra tüplere, etüvde 37 C de tutulan hipotonik 29

43 3. MATERYAL VE METOD Ümit ZAN eriyik ilave edilmiştir. Bu eriyiğin ilavesi damla damla ve karıştırılarak yapılmıştır. Aksi halde hücrelerde kümeleşme olmakta ve amaca uygun olmayan preparatlar hazırlanmaktadır. Her tüpe 5 ml hipotonik eriyik ilave edildikten sonra tüpler, ağzı kapatılarak inkübatöre konulmuştur. Hücreler 12 dk. hipotonik eriyikte 37 C de muamele edilmiştir. Sürenin sonunda tüpler 15 dk rpm de santrifüj edilmiş, süpernatant atılmıştır. Bu sefer hipotonik eriyik ilavesi gibi yavaş yavaş ve karıştırarak her tüpe 5 ml olacak şekilde soğuk fiksatif ilave edilmiştir. Oda sıcaklığında 20 dk. fiksatif ile muamele edilen hücreler 1200 rpm de 15 dk. santrifüj edilmiş ve süpernatant atıldıktan sonra tüplere tekrar fiksatif ilave edilmiştir. Bu işlem 3 kere tekrarlanmıştır. 3. fiksatif muamelesinin sonunda tüpte kalan sıvının tamamen berraklaştığı görülmüştür. Eğer sıvı berraklaşmamışsa tekrar fiksatif muamelesine devam etmek gerekir. Her fiksatif ilavesinden sonra tüpler santrifüj edilerek üstteki sıvı atılmıştır. Son santrifüjden sonra dipte ml sıvı kalacak şekilde süpernatant atıldıktan sonra preparat yapma işlemine geçilmiştir. Tüpün dibinde toplanan hücreler pasteur pipeti ile karıştırılarak homojen hale getirilmiştir. Pasteur pipetine 4-5 damla olacak şekilde bu hücre süspansiyonundan çekilmiştir. Özel olarak hazırlanmış düzeneğe tutturulan pasteur pipetinden daha önce temizlenmiş ve saf su içerisinde buzdolabında saklanmış lamların üzerine 75 cm yükseklikten farklı alanlara 1 er damla olmak üzere hücre süspansiyonu damlatılarak (her lama 3-4 damla) hücrelerin ve dolayısıyla kromozomların lam üzerinde yayılması sağlanmıştır. Hücre süspansiyonunun lamlara damlatılması esnasında damlaların üst üste düşmemesine dikkat edilmiştir. Bu şekilde hazırlanan preparatlar kurumak üzere 24 saat oda sıcaklığında bekletilmiştir Preparatların Boyanması Bir kromozoma ait kardeş kromatidlerin farklı boyanmasını (Sister chromatid differentiation=scd) sağlamak amacıyla Speit (1984), Speit ve Haupter (1985) in geliştirdikleri metod modifiye edilerek kullanılmıştır. Bu amaçla bir günlük preparatlar ışınlama kabına konarak üzeri bir film gibi örtülecek şeklide Sorensen 30

44 3. MATERYAL VE METOD Ümit ZAN tamponu ile kapatılmıştır. Işınlama eriyiği, 5 ml tampon A, 5 ml tampon B den alınıp bu karışımın destile su ile 100 ml ye tamamlanmasıyla hazırlanmıştır (ph=6.8). Işınlama eriyiğinin fazla veya az olması kardeş kromatidler arasındaki kontrast farkını önemli derecede etkilediği görülmüştür. Bu şekilde ince bir tabaka halinde ışınlama eriyiği ile örtülen preparatlar, karanlıkta 15 cm yükseklikten 30W lık 254 nm dalga boyunda ışık yayabilen tek ultraviyole lambası ile 30 dk. ışınlanmıştır. Işınlama bittikten sonra preparatlar 1xSSC eriyiği içerisinde C arasındaki sıcaklıklarda 60 dk. inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi bitmeden 15 dk. önce %5 lik Giemsa boya eriyiği hazırlanmıştır. %5 lik Giemsa nın Hazırlanması: 5 ml tampon A, 5 ml tampon B ve 5 ml Giemsa karıştırılarak üzerleri 100 ml oluncaya kadar saf su ile tamamlanmıştır (ph=6.8). Sonra bu boya dik bir şale içine filtre kâğıtları ile süzülmüştür. İnkübasyon süresinin sonunda preparatlar 1xSSC eriyiğinden alınarak direkt olarak boya içerisine konmuş ve yaklaşık olarak 20 dk. boya içerisinde bekletilmiştir (kardeş kromatidler arasındaki en iyi kontrast farkı bu sürede sağlanmıştır). Bu sürenin sonunda preparatlar boyadan çıkarılmış, üç ayrı kaptaki saf su içinden geçirilerek preparatlar üzerindeki fazla boyanın akması sağlanmıştır. Bundan sonra preparatlar dik vaziyette konularak kurumaya bırakılmıştır. Kuruyan preparatlar entellan ile kapatılarak daimi hale getirilmiştir. Entellan kuruduktan sonra bu daimi preparatlarda mikroskobik incelemeler yapılmıştır Mikroskobik İnceleme Hazırlanmış olan daimi preparatlar Prior marka binoküler ışık mikroskobunda immersiyon objektifi ile incelenmiştir (10x100=1000 büyütmede). 31

45 3. MATERYAL VE METOD Ümit ZAN KKD ve Proliferasyon İndeksinin (PI) (Replikasyon İndeksi=RI) Saptanması (1). KKD Sayısının Saptanması KKD sayısı, her kişinin kan kültürüne ait preparatlardan iyi dağılmış ve ikinci mitozu geçiren 25 hücrede (4 kişiden toplam 100 hücrede) saptanmıştır. KKD sayısı bir kromozomun açık boyanmış kromatidindeki koyu boyanmış parçaların veya koyu boyanmış kromatidindeki açık boyanmış parçaların sayılmasıyla belirlenmiştir (Topaktaş ve Speit, 1990). Ortadan bir parça değişimi olmuş ise bu iki KKD olarak değerlendirilmiş (Şekil 3.1.a), uçtan parça değişimi olmuş ise bu da bir KKD olarak sayılmıştır (Şekil 3.1.b). Ancak bu incelemeler esnasında kromatidlerin primer boğum bölgelerinden dönüm yapıp yapmadıklarına dikkat etmek gerekir. Bu durumdaki kromozomlarda KKD yoktur (Şekil 3.1.c). Şekil 3.1. Kardeş Kromatid Değişiminin Olduğu ve Olmadığı Durumun Şematik Olarak Gösterilmesi (Topaktaş ve Speit, 1990) (2). Proliferasyon İndeksinin (PI) (Replikasyon İndeksi=RI) Saptanması Esmeron un DNA replikasyonu üzerindeki etkilerini saptamak amacı ile PI bulunmuştur. Bunun için her bireyden tesadüfi seçilmiş 100 hücre incelenmiştir. Bu incelemeler sırasında gözlenen birinci, ikinci ve üçüncü metafaz devresindeki hücreler sayılmıştır. Bu verilerden yola çıkarak PI şu şekilde hesaplanmıştır: PI= 1xM 1 +2xM 2 +3xM 3 /100 M 1 : 1. Mitozdaki hücre sayısı 32

46 3. MATERYAL VE METOD Ümit ZAN M 2 : 2. Mitozdaki hücre sayısı M 3 : 3. Mitozdaki hücre sayısı Birinci, ikinci ve üçüncü metafazlar şu şekilde ayırt edilmiştir (Topaktaş ve Speit, 1990): BrdUrd, deoxytimidin (dt) ve deoxyuridin (du) birbirlerinin analoğu olan bileşiklerdir (Şekil 3.2). BrdUrd, dt ve du arasındaki tek fark taşıdıkları benzen halkasındaki 5.C atomuna dt de CH 3, BrdUrd de Br ve du da H atomunun bağlı olmasından kaynaklanmaktadır. O O O CH3 Br H HN HN HN O N O N O N HO CH 2 O HO CH 2 O HO CH 2 O OH OH OH Deoxytimidin (dt) Bromodeoxyuridin (BrdUrd) Deoxyuridin (du) Şekil 3.2. Deoxytimidin (dt), Bromodeoxyuridin (BrdUrd) ve Deoxyuridin (du) in Kimyasal Yapıları. BrdUrd, DNA nın yapısında bulunan timin bazlarının analoğu olduğundan dolayı kültür ortamına BrdUrd koyduğumuzda hücre DNA sını replike ettiği sırada (1.S fazında) yeni sentezlenen polinükleotid ipliği içine timinin yerine ortamda bulunan BrdUrd ni alacaktır. Böyle hücrelerinin kromozomları boyandığında bir kromozomun her iki kromatidi de (dt/brdurd:dt/brdurd) homojen koyu renkte boyanacaktır. Bu hücreler 1. mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir (Şekil 3.3.A ve Şekil 3.4). Birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerden meydana gelen yavru hücreler tekrar S fazına girdiğinde (BrdUrd'li ortamda 2.S fazı) timin ihtiva eden polinükleotid ipliğine komplementer olarak sentezlenen yeni DNA ipliğinde BrdUrd yer alacaktır. Bu iki polinükleotid ipliği bir kromozomun koyu boyanan kromatidini (dt/brdurd) oluşturacaktır. BrdUrd'li ipliğe komplementer olarak sentezlenen yeni ipliğe de BrdUrd girecektir ve bir kromatidi oluşturan iki polinükleotid ipliği de 33

47 3. MATERYAL VE METOD Ümit ZAN BrdUrd ihtiva ettiklerinden (BrdUrd/BrdUrd) bu kromatid aynı kromozomun açık boyanan kromatidini oluşturacaktır. İşte bu hücrenin metafaz devresinde preparat yapıldığında hücrenin tüm kromozomlarının (dt/brdurd:brdurd/brdurd) kromatidlerinden biri koyu diğeri ise açık renkte boyanacaktır. Bunlar da ikinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir (Şekil 3.3.B ve Şekil 3.5). Bu hücreler tekrar S fazına girdiğinde (BrdUrd'li ortamda 3.S fazı) ikinci mitozda açık boyanan kromatidden tüm polinükleotid ipliklerine BrdUrd girmiş olan bir kromozom meydana gelecektir ve bu kromozomun her iki kromatidi de açık renkte boyanacaktır (BrdUrd/BrdUrd:BrdUrd/BrdUrd). İkinci mitozda koyu boyanan kromatidden ise, bir kromatidin her iki ipliği BrdUrd'li ve diğer kromatidin bir ipliği BrdUrd'li diğer ipliği timinli olan bir kromozom oluşacaktır. Bu kromozom da boyandığında bir kromatidi koyu renkte, bir kromatidi de açık renkte boyanacaktır (dt/brdurd:brdurd/brdurd). İşte böyle hücrelerin metafaz devresinde preparat yapıldığında bazı kromozomların her iki kromatidi açık renkte, bazı kromozomların bir kromatidi açık, diğer kromatidi de koyu renkte boyanacaktır. Bu hücreler de 3. mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir (Şekil 3.3.C ve Şekil 3.6). İşte bu şekilde 1., 2. ve 3. mitoz bölünmeyi geçiren hücreler ayırt edilmiş, bu hücrelerin 100 hücre içindeki sayısı saptanmış, bundan da yukarıda belirtilen formüle göre proliferasyon indeksi (PI) hesaplanmıştır. 34

48 3. MATERYAL VE METOD Ümit ZAN Şekil 3.3. BrdUrd in DNA Yapısına Girmesi ile 1., 2. ve 3. Mitoz Bölünmeyi Geçiren Hücrelerin Ayırt Edilmesinin Şematik Olarak Açıklanması (During 1985 e göre Topaktaş ve Speit 1990 den). 10 µm Şekil 3.4. Birinci Mitoz Bölünmeyi Geçiren Hücreye Ait Kromozomlar. 35

49 3. MATERYAL VE METOD Ümit ZAN 10 µm Şekil 3.5. İkinci Mitoz Bölünmeyi Geçiren Hücreye Ait Kromozomlar. 10 µm Şekil 3.6. Üçüncü Mitoz Bölünmeyi Geçiren Hücreye Ait Kromozomlar. 36