ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKURVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ PEKTİNAZ ENZİMİNİN FARKLI İKİ DESTEK ÜZERİNE İMMBİLİZASYNU VE KARAKTERİZASYNU KİMYA ANABİLİM DALI ADANA, 2007

2 ÇUKURVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PEKTİNAZ ENZİMİNİN FARKLI İKİ DESTEK ÜZERİNE İMMBİLİZASYNU VE KARAKTERİZASYNU YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI Bu tez.../.../2007tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından ybirliği/yçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza... İmza İmza.... Doç..Dr.Güzide YÜCEBİLGİÇ Prof.Dr.S.Seyhan TÜKEL Prof.Dr.Nuray ŞAHAN DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Kimya Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar ve Projeler (BAP) Birimi tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FEF.2006.YL.70 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ PEKTİNAZ ENZİMİNİN FARKLI İKİ DESTEK ÜZERİNE İMMBİLİZASYNU VE KARAKTERİZASYNU ÇUKURVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİMYA ANABİLİM DALI Danışman : Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ Yıl : 2007 Sayfa: 47 Jüri : Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ Prof. Dr. S.Seyhan TÜKEL Prof. Dr. Nuray ŞAHAN Pektinaz enzimi alginat ve florisil üzerine immobilize edilmiştir. Belirlenen optimum koşullarda serbest ve alginat üzerine immobilize edilen Pektinaz için maksimum aktivite sırasıyla 69,4 ve 20,7 U/mg protein olarak ölçülmüştür. K m değerleri sırasıyla 8,04 ve 0,36 mg/ml olarak belirlenmiştir. İmmobilize Pektinaz ın tekrar kullanılabilirliği kesikli reaktör modelinde araştırılmış ve 20 kullanımdan sonra immobilize Pektinaz ın başlangıç aktivitesinin % 94 ünü koruduğu belirlenmiştir. Serbest ve immobilize Pektinaz ın farklı sıcaklıklarda belirlenen termal kararlılıkları karşılaştırılmıştır. Serbest Pektinaz ın 5 o C ve 25 o C de 5 hafta depolanma süresi sonunda kalan aktivitesi sırasıyla başlangıç aktivitesinin % 57 ve % 64 üdür. Bununla birlikte immobilize enzim 5 o C ve 25 o C de 5 hafta depolanma süresi sonunda sırasıyla başlangıç aktivitesinin % 75 ve % 76 sını korumuştur. Florisil destek üzerine yapılan immobilizasyonda, denenen koşullarda enzimin desteğe bağlandığı, bağlandıktan sonra aktivite göstermediği gözlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Pektik enzimler, exopoligalakturonaz, alginat, immobilizasyon, florisil. I

4 ABSTRACT MSc THESIS IMMBILIZATIN F PECTINASE NT TW DIFFERENT SUPPRTS AND THEIR CHARACTERIZATIN DEPARTMENT F CHEMISTRY INSTITUTE F NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY F ÇUKURVA Supervisor : Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ Year : 2007 Pages: 47 Jury :Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ Prof. Dr. S.Seyhan TÜKEL Prof. Dr. Nuray ŞAHAN Pectinase enzyme was immobilized onto alginate and florisil. Maximum activity of free pectinase and immobilized pectinase onto alginate were measured as 69,4 and 20,7 U/mg protein respectively, at predetermined optimum conditions. The K M values for free and immobilized pectinase were determined as 8,04 and 0,36 mg/ml,respectively. Reusability of the immobilized pectinase was investigated in a batch type reactor. After 20 reuses, the residual activity of immobilized pectinase was about % 94 of its initial activity. Thermal stabilities of free and immobilized pectinase determined at different temperatures were compared. The residual activity for immobilized pectinase stored at 5 o C and 25 o C for five weeks were 57 % and 64 % of its initial activity, respectively. However, the immobilized enzyme protected 75 % and 76 % of its original activity at 5 o C and 25 o C, respectively for five weeks. In the immobilization onto the florisil support, it was observed that the enzyme was bound to the support however, no activity was observed. florisil. Keywords: Pectic enzymes, exopolygalacturonase, alginate, immobilization, II

5 TEŞEKKÜR Yüksek Lisans Tezinin yönetiminde ve oluşumunda aynı zamanda tez çalışmam süresince her türlü desteğini gördüğüm, sabır ve anlayışından dolayı değerli Danışmanım Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ e, Çalışmalarımda benden yardım ve desteklerini esirgemeyen hocalarım Prof. Dr. S.Seyhan TÜKEL e ve Yrd. Doç. Dr. Ramazan BİLGİN e, Çalışmalarım süresince her türlü yardım ve manevi desteklerini gördüğüm Özlem ALPTEKİN, Dilek ALAGÖZ, Deniz YILDIRIM, Özlem YILDIRIM a ve aynı laboratuarı paylaştığım arkadaşlarıma, Şu an çalışmakta olduğum Adli Tıp Anabilim Dalında bana her türlü yardım ve desteği gösteren Nebile DAĞLIĞLU ve Dilek AKÜNAL a, Karşılaştığım her zorlukta hep yanımda olan, varlığıyla bu sürecin kolaylaşmasını sağlayan, çalışmalarımda yardımlarını esirgemeyen, hayatımı paylaşmaya karar verdiğim Ümit YALDIZ a, Benden maddi, manevi desteklerini esirgemeyen, beni büyük bir ilgi ve sevgiyle bugünlere getiren babam Abdullah YENER, annem Nursel YENER e ve hayatımı anlamlı hale getiren kardeşlerime teşekkürlerimi sunmayı bir borç bilirim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ..I ABSTRACT..II TEŞEKKÜR.III İÇİNDEKİLER IV ÇİZELGELER DİZİNİ.. VI ŞEKİLLER DİZİNİ....VII SİMGELER VE KISALTMALAR.....VIII 1.GİRİŞ Enzim İmmobilizasyon Yöntemleri Çözünmez Formda İmmobilizasyon Yöntemleri Bağlama Tutuklama Çözünür Formda İmmobilizasyon İmmobilize Edilen Enzimden Beklenilen Özellikler Pektin (Pektik bileşikler) Pektinin Endüstriyel Önemi PektolitikEnzimler Pektolitik Enzimlerin Genel Özellikleri Endüstride Pektolitik Enzimlerin Kullanılması Alginat Florisil ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 19 3.MATERYAL VE METD Materyal Metod Protein Tayini Pektinaz ın Alginat Destek Üzerine İmmobilizasyonu Pektinaz ın Florisil Destek Üzerine İmmobilizasyonu...23 IV

7 Serbest veya İmmobilize Pektinaz ın Aktivitesinin Belirlenmesi Galakturonik Asit Tayini Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Karakterizasyonu Serbest ve immobilize Enzimlerin ptimum ph larının Belirlenmesi Serbest ve İmmobilize Enzimlerin ptimum Tampon Derişimlerinin Belirlenmesi Serbest ve İmmobilize Enzimlerin ptimum Sıcaklıklarının Belirlenmesi Serbest ve İmmobilize Enzimlerin K M ve V max Değerlerinin Belirlenmesi Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Termal Kararlılıklarının Belirlenmesi Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Depolama Kararlılıklarının Belirlenmesi İmmobilize Pektinaz ın Tekrar Kullanım Kararlılığının Belirlenmesi BULGULAR VE TARTIŞMA Bulgular Serbest ve İmmobilize Pektinaz ın Karakterizasyonu Pektinaz ın Florisile İmmobilizasyonu Tartışma Pektinaz ın Alginat Destek Üzerine İmmobilizasyonu ve Karakterizasyonu Pektinaz ın Florisil Destek Üzerine İmmobilizasyonu SNUÇLAR VE ÖNERİLER Sonuçlar Öneriler...42 KAYNAKLAR...44 ÖZGEÇMİŞ...47 V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1. Çizelge 1.2. Çizelge 1.3. Çizelge 4.1. Çizelge 4.2. Meyve pektin içeriği...8 Pektik bileşikler ve özellikleri...10 Pektik enzimlerin sınıflandırılması...14 Serbest ve immobilize Pektinaz ın kinetik parametreleri...32 Pektinaz ın florisile immobilizasyonu...36 VI

9 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Enzim immobilizasyon yöntemleri... 3 Şekil 1.2. Enzimin polimerler arasında tutuklanması Şekil 1.3. Düşük ve yüksek esterleşme dereceli pektin... 9 Şekil 1.4. Pektin molekülünde düz ve saçaklı bölgeleri gösteren model Şekil 1.5. Pektin molekülü Şekil 1.6. Poligalakturonaz enziminin etki mekanizması Şekil 1.7. Pektat-liyaz enziminin etki mekanizması Şekil 1.8. Pektin-liyaz enziminin etki mekanizması Şekil 1.9. Pektinesteraz enzimin etki mekanizması Şekil 4.1. Serbest ve immobilize Pektinaz aktivitesinin ph ya bağlı olarak değişimi Şekil 4.2. Serbest ve immobilize Pektinaz aktivitesinin tampon derişimine bağlı olarak değişimi.. 29 Şekil 4.3. Serbest ve immobilize Pektinaz aktivitesinin sıcaklığa bağlı olarak değişimi Şekil 4.4. Serbest Pektinaz ın Arrhenius grafiği 30 Şekil 4.5. İmmobilize Pektinaz ın Arrhenius grafiği 31 Şekil 4.6. Serbest Pektinaz için Lineweaver-burk grafiği Şekil 4.7. İmmobilize Pektinaz için Lineweaver-burk grafiği 32 Şekil 4.8. Serbest Pektinaz enziminin termal kararlılık grafiği.. 33 Şekil 4.9. İmmobilize Pektinaz enziminin termal kararlılık grafiği Şekil Serbest Pektinaz enziminin depolama kararlılığı 34 Şekil İmmobilize Pektinaz enziminin depolama kararlılığı. 35 Şekil İmmobilize Pektinaz ın tekrar kullanım kararlılığı VII

10 SİMGELER ve KISALTMALAR K M : Michaelis-Menten hız sabiti (mg/ml) Vmax : Maksimum hız (µmol.dk -1.mg protein -1 ) Ea : Aktivasyon enerjisi (J mol -1 ) V max / K M : Katalitik etkinlik U : Ünite V : Tepkime hız sabiti (µmol.dk -1.mg protein -1 ) [S] DNSA : Subsrat derişimi : Dinitrosalisilik asit VIII

11 1.GİRİŞ 1.GİRİŞ Enzimler, canlı hücrelerde oluşan ve organizmadaki tüm reaksiyonların çok yumuşak koşullarda gerçekleşmesini sağlayan ve bunları regüle eden biyolojik katalizatörlerdir. Enzimlerle katalizlenen reaksiyonlar katalizlenmemiş karşıtlarına göre kez daha hızlı gerçekleşirler. Enzimler son derece özgün olup birbirinin aşağı yukarı aynısı olan enantiomerleri bile ayırt edebilirler. Enzimlerin kimyasal katalizörlere göre üstünlüklerini incelediğimizde; enzimler ileri derecede substrat spesifikliğine sahip olmaları nedeniyle, istenmeyen yan ürünlerin oluşumunu engeller. Enzimlerin katalizlediği reaksiyonlarda verim % 100 dür. Stereospesifik reaksiyonları enzimler katalizleyebilirler. Enzimler ılımlı koşullarda ( ph 7.0, oda sıcaklığı) çalıştığı için reaksiyon maliyetini düşürürler ve çevresel sorunlar yaratmazlar. Yeterli koşulların sağlanması koşuluyla etkilerini doğal ortamlarının dışında da gösterebiliyor olmaları, enzimlerden pek çok alanda yararlanabilme imkanı vermektedir. Enzimlerden başlıca endüstriyel, tıbbi, bilimsel ve analitik amaçlı olmak üzere üç farklı alanda yararlanılmaktadır. Her bir alanda kullanılan enzimlerin fiyatları beklenen özelliklerine göre birkaç dolardan birkaç bin dolara kadar değişebilmektedir. Enzimler canlılar tarafından üretildiklerinden endüstriyel veya analitik amaçlı kullanımları için doku, kan, mikroorganizma gibi canlı veya canlı kökenli kaynaklardan saflaştırılırlar. Enzim üretiminde hammadde olarak canlıların kullanımı ekonomik açıdan sınırlayıcı bir durum olsa da bu sorun mikrobiyal kaynaklar sayesinde büyük ölçüde çözülmüş görünmektedir. Bununla birlikte enzimlerin mikrobiyal kaynaklardan saflaştırılması oldukça masraflı bir iştir. Endüstriyel uygulamalarda serbest enzimin aktivitesini kaybetmeden geri kazanılması çok zordur. Serbest enzim, reaksiyon ortamından istenilen anda uzaklaştırılamadığından reaksiyonun kontrolü çok güçtür. Reaksiyonun istenilen anda durdurulması için inhibitör katılması düşünülebilir. Ancak serbest enzim tarafından kirletilmiş olan reaksiyon ürünlerine böylece yeni bir kirlilik unsuru eklenmiş olacaktır. Ürün veya ürünlerin bu kirlilik unsurlarından arıtılması maliyeti çok arttırmaktadır. Katalizör olarak kullanılan serbest enzimi reaksiyon ortamından aktivitesini yitirmeden 1

12 1.GİRİŞ çıkarabilmek olanaksız olduğundan enzimin yeniden kullanılması da söz konusu değildir. Bu ise enzimlerin spesifik ama o ölçüde pahalı katalizör olmaları nedeniyle maliyeti yükselten önemli bir etmendir. Ayrıca serbest enzimler sürekli üretim sistemlerine de uygulanamazlar. Bu nedenle saflaştırılan enzimlerden olabildiğince faydalanmak için immobilizasyon teknikleri geliştirilmiştir. Enzimler, suda çözünmeyen bir taşıtıcıya fiziksel veya kimyasal olarak bağlanarak, suda çözünmeyen ürün veren bir kopolimerizasyona enzim molekülünün monomer olarak katılmasıyla ve suda çözünmeyen mikrokapsüllerde tutuklamakla immobilize edilirler (Telefoncu, 1997). İmmobilize enzimin serbest enzime göre üstünlükleri; Reaksiyon sonunda ortamdan kolayca uzaklaştırılabilir (süzme, santrifüjleme v.b.) ve ürünlerin enzim tarafından kirletilmesi gibi bir problem yaratmaz. Çevre koşullarına ( ph, sıcaklık v.s.) karşı daha dayanıklıdır. Birçok kez ve uzun süre kullanılabilir. Sürekli işlemlere uygulanabilir. Doğal enzime kıyasla daha kararlıdır. Ürün oluşumu kontrol altında tutulabilir. Birbirini izleyen çok adımlı reaksiyonlar için uygundur. Bazı durumlarda serbest enzimden daha yüksek bir aktivite gösterebilir. Enzimin kendi kendini parçalama olasılığı azalır. 2

13 1.GİRİŞ 1.1.Enzim İmmobilizasyon Yöntemleri İmmobilizasyon yöntemleri çeşitli şekillerde sınıflandırılmakla beraber Şekil 1.1 de verildiği gibi sınıflandırmak mümkündür (Telefoncu, 1997). Şekil 1.1. Enzim İmmobilizasyon Yöntemleri (Telefoncu, 1997) Çözünmez Formda İmmobilizasyon Yöntemleri Çözünmez formda immobilizasyon yöntemleri bağlama ve tutuklama olarak ikiye ayrılmaktadır. 3

14 1.GİRİŞ Bağlama Bağlama yöntemi; çapraz bağlama, enzim kopolimerizasyonu ve taşıyıcıya bağlama olmak üzere üç gruba ayrılmaktadır. Çapraz bağlama; Küçük moleküllü iki veya çoklu fonksiyonel grupları olan reaktifler enzim molekülleri arasında çapraz bağlar yapmaktadırlar. En çok kullanılan çapraz bağlama reaktifleri; glutaraldehit, klorformat ve karbonilimidazol, heterosiklik halojenürler, bioksiranlar, divinilsülfonlar, p-benzokinon, geçiş metal iyonları ve epiklorohidrinlerdir. Enzim kopolimerizasyonu; Enzimler bir kopolimerizasyon reaksiyonunda monomerlerden biri gibi davranarak matrikse bağlanmaktadır. Yöntem polimer matrikse tutuklanmaya benzemekle birlikte enzim kaçışının önlenmesi gibi üstünlüğü vardır. Taşıyıcıya bağlama; Adsorpsiyon, iyonik bağlama, şelat bağlama, kovalent bağlama ve biyospesifik bağlama olarak beş gruba ayrılmaktadır. Bir protein olan enzim molekülünün yapısından yararlanılır. Molekül yüzeyindeki fonksiyonel gruplar, iyonik gruplar ve hidrofobik bölgeler bu bağlamada rol alırlar. Enzim immobilizasyonunda doğal veya sentetik birçok organik ve inorganik materyal kullanılmaktadır. Taşıyıcı membran, suda çözünmeyen katı veya polimer olabilir. Enzim immobilizasyonunda kullanılacak taşıyıcıda aranan nitelikler şunlardır: Hidrofilik karakter, Suda çözünmeme, Gözenekli yapı, Mekanik stabilite uygun partikül formu, Kimyasal ve termal stabilite, Kovalent bağlamada kullanılacak taşıyıcıların yumuşak koşullarda reaksiyon verebilen fonksiyonel grupları taşıması, 4

15 1.GİRİŞ Mikroorganizmalara karşı dirençlilik, Ucuzluk, Zehirsizlik, Rejenere olabilme. Enzim immobilizasyonunda kullanılacak taşıyıcılar reaktif değillerse yardımcı bir reaktif ile aktifleştirilmesi gerekir. İmmobilizasyon çok yumuşak koşullarda (oda sıcaklığı, nötral ph vb.) gerçekleştirilmelidir. Taşıyıcı suda çözünmemeli ancak büyük ölçüde hidrofobik karakterli de olmamalı, suda ıslanabilmeli, ayrıca mekanik kararlı olmalıdır. Bu tür taşıyıcıların seçiminde enzim-taşıyıcı bağının aktivite için zorunlu gruplar üzerinden olmaması yanında taşıyıcının enzim tarafından parçalanmaması, mikroorganizma üremesine olanak vermemesi, ph ve çözücülere karşı dayanıklı olması gibi özellikler taşımasına dikkat edilmelidir Tutuklama Yöntemleri Tutuklama yönteminde, enzim molekülü belirli bir mekanda durmaya zorlanmaktadır. Enzim bulunduğu çevreden dışarıya çıkamaz. Bu işlem polimer matriks içindeki kafeslerde gerçekleştirilebileceği gibi yarı geçirgen membranlar içinde mikrokapsülleme ve miseller ile de gerçekleştirilebilir. Bu yöntemi, kovalent bağlama ve çapraz bağlama ile immobilizasyondan ayıran en önemli özellik enzim molekülünün fiziksel veya kimyasal olarak herhangi bir taşıyıcıya bağlanmamış olmasıdır. Tutuklama yöntemi; polimer matrikste tutuklama, mikrokapsülleme, lipozom tekniği olmak üzere üçe ayrılır. Polimer matrikste tutuklama yöntemi, yüksek derecede çapraz bağlı bir polimerin enzim çözeltisi içinde oluşturulması temeline dayanır (Şekil 1.2). Polimerleşme sonucu enzim molekülleri çapraz bağ ağları arasında tutuklanmakta ve böylece ana çözeltiye geçmeleri engellenmektedir. Bu amaçla en çok kullanılan polimer N,N -metilenbisakrilamid ile çapraz bağlanmış poliakrilamiddir. 5

16 1.GİRİŞ Şekil 1.2. Enzimin polimerler arasında tutuklanması Mikrokapsülleme yöntemi, enzim moleküllerinin yarı geçirgen bir membran içinde tutuklanması esasına dayanır. Mikrokapsüllerin büyüklüğü µ arasında değişmektedir. Yarıgeçirgen membranın gözenek çapları; substrat moleküllerinin kapsül içine girişine ve ürün moleküllerinin dışarı çıkışına olanak verecek bir büyüklükte olmalıdır. Substrat molekülleri ne kadar küçükse bu yöntem ile immobilize edilmiş enzimin verimliliği o ölçüde yüksek olacaktır. Lipozom tekniği, sıvı-yüzey yapıcı membran temeline dayanır. Yöntemin en önemli üstünlüğü; süreksiz, dönüşümlü ve tamamen fiziksel oluşudur. Aynı anda bir adımda birçok enzimin immobilizasyonuna olanak sağlar ve oldukça büyük bir kontakt yüzeyine sahiptir. Önemli sakıncaları ise; substrat ve ürünün membranda geçişinin çözünürlüğe bağımlı olması, işlem sırasında enzimin inaktive olması ve sıvı olan membrandan enzimin kaçma olasılığıdır. 6

17 1.GİRİŞ Çözünür Formda İmmobilizasyon Çözünür formda immobilizasyon yöntemi enzimin herhangi bir taşıyıcıyla fiziksel veya kimyasal etkileşiminden çok yarı geçirgen bir zarla çevrelendiği ve enzime geniş bir hareket alanının sağlandığı bir yöntemdir. Enzim taşıyıcıya herhangi bir bölgesinden bağlanmadığı için moleküler geometrisi, esnekliği ve dolayısıyla katalitik etkinliği değişmemektedir. Fakat substratın membrandan geçip enzime ulaşmasında kısıtlamalara rastlanmaktadır. Bu nedenle küçük moleküllü substrata sahip olan enzimlerin bu yöntemle immobilize edilmesi tercih edilebilir İmmobilize Edilen Enzimden Beklenilen Özellikler Kullanılan immobilizasyon tekniği ne olursa olsun immobilize edilen enzimden beklenilen özellikler şunlardır: Yüksek kararlılık Tekrar kullanılabilirlik Sürekli üretime olanak vermesi Reaksiyon kontrolüne olanak vermesi Yüksek saflık Yüksek ürün yüzdesi Ekonomik olması 7

18 1.GİRİŞ 1.2.Pektin (Pektik Bileşikler) Meyve ve sebzelerin teknolojik açıdan en önemli polisakkaritleri pektindir.bu ürünlerde pektin miktarı % 0.5-% 1.0 düzeyindedir. Metilasyon derecesi, moleküler ağırlık ve pektin içeriği meyve çeşidine göre farklılık gösterir (Çizelge 1.1). Çizelge 1.1. Meyve pektin içeriği (Aehle, W., 2004) Meyve Pektin, % Metilasyon, % Elma Kuşüzümü Üzüm Portakal kabuğu Armut Ananas Çilek Pektin, gerçekte özellikleri birbirine benzeyen ve pektik maddeler adı verilen bir madde grubu içinde yer alır. Ancak çoğu zaman bu maddelerin tümü için de pektin sözcüğü kullanılabilmektedir. Pektik maddeler grubunda yer alan bileşikler Çizelge 1.2 de verilmektedir. Bir heteropolisakkarit olan pektin, α-d-galakturonik asit moleküllerinin α- 1,4-glikozidik bağlarla birbirlerine göre bağlanmasıyla oluşan poligalakturonik asit zinciridir. Galakturonik asit ünitelerinden bir kısmı metanol ile esterleşmiş haldedir. Pektin molekülünde bulunan metanol ile esterleşmiş galakturonik asit miktarının % 50 nin altında ve üstünde olmasına göre düşük ve yüksek esterleşme dereceli pektin şeklinde değerlendirme yapılmaktadır (Acar ve Gökmen, 2004). 8

19 1.GİRİŞ Yüksek esterleşme dereceli pektin (%75) H CCH 3 H H H H H H H H H H CCH 3 H H H H CH H H H H H H H H H H H H CCH 3 Düşük esterleşme dereceli pektin (%25) CH H H H H H H H H H H CH H H H H CCH 3 H H H H H H H H CH Şekil 1.3. Düşük ve yüksek esterleşme dereceli pektin (Acar ve Gökmen, 2004) H H H Pektinin esterleşme oranı kaynağına göre değişim göstermektedir. Örneğin elma pektininde esterleşmiş karboksil gruplarının oranı % 95.3 iken vişne pektininde % 55.4 dür. 9

20 1.GİRİŞ Çizelge 1.2. Pektik bileşikler ve özellikleri (Ekşi, 1988) Bileşik adı Özelliği Pektik asit Esteleşmemiş galakturonik asit birimlerinden oluşan (poligalakturonik asit) zincir. Asit formda suda çözünmez, kısmen nötralizasyondan sonra suda çözünür ve Ca ile jel oluşturur. Pektat Pektik asitin nötral veya asidik tuzudur.çok az sayıda metoksil grubu içerir. (Na-pektat suda çözünmekte,ancak Ca-pektat suda çözünmemektedir.) Pektin Kısmen ve tümüyle metil alkolde esterleşmiş (metilize olmuş) poligalakturonik asittir. Metoksil grubu sayısı (esterleşme derecesi) ve polimerizasyon derecesine bağlı olarak özellikleri değişmektedir. Pektinat Düşük ve yüksek esterleşme oranı içeren pektinin tuzudur.molekülde metoksil gruplarıda bulunur. Protopektin Pektin zincirleri, esterleşmemiş CH grupları üzerinden birbirine metal iyonu (Mg, Ca) ile bağlanmıştır.kısıtlı sayıda fosforik asit üzerinden ester köprüsü de içeren doğal pektin olup, suda çözünmez. Pektin türevleri Ana valenslerine asetil vb. gibi özel grupların bağlandığı pektindir. Pektin molekülünde doğrusal poligalakturonik asit ana zincirinde α-1,2- glikozidik bağlarla bağlanmış ramnoz molekülleri yer almaktadır. Ramnoz moleküllerinin pektin molekülü içinde dağılımı muntazam değildir. Bu nedenle bu konuda yapılan çalışmalarda, pektin molekülünde düz (smooth) ve saçaklı (hairy) bölgelerin varlığından söz edilmektedir (Şekil 1.4).Bazı araştırmacılara göre pektin bitkide bulunduğu yere bağlı olarak orta lamel pektini veya primer hücre duvarı pektini olarak da sınıflandırılmaktadır (Acar ve Gökmen, 2004; Bonnin ve ark., 2002). 10

21 1.GİRİŞ Şekil 1.4. Pektin molekülünde düz (smooth) ve saçaklı (hairy) bölgeleri gösteren model (Acar ve Gökmen, 2004). Pektin molekülünde yer alan ramnoz moleküllerine galaktan gibi nötral şekerler ya uzun yan zincirler halinde ya da monomerler halinde bağlanmışlardır (Şekil 1.5). 11

22 1.GİRİŞ Galaktan GUA GUA RAM GUA Galaktan RAM GUA GUA GUA GUA GUA RAM RAM Şekil 1.5. Pektin molekülü (Acar, 2004) RAM GUA GUA Pektik maddeler, bitki duvarlarında oluşan yapısal polisakkaritlerdir.bu maddeler büyük oranda anhidrogalakturonik asit birimlerinden oluşan karmaşık, kolloidal karbonhidrat türevlerinden meydana gelen yüksek su tutma kapasiteli polisakkaritlerdir. Bu durumda pektik maddeleri oluşturan birim, poligalakturonik asit olup, düz bir zincir yapmak üzere birbirleriyle α -1,4 bağı yapmışlardır Da moleküler ağırlıklı heteropolisakkaritlerdir. Pektik maddeler pektinik asit, pektin, pektik asit ve bunların tuzlarını içeren bir grup maddeye verilen genel addır (Willatns ve ark., 2001). Pektin selüloz ve hemiselüloz gibi yüksek bitkilerin hücre duvarında bulunan bir polisakkarittir. Pektinin yapısında poligalakturonik asit, rhamnogalakturonik asit, galaktanlar ve arabinogalaktanlar vardır (Celestino ve ark., 2006). Pektinler pektik maddeler, protopektinler ve pektik asitler olarak sınıflandırılırlar. Pektik maddeler, tamamen veya bir kısmı esterleşmiş poligalakturonik asitleri içerirler. Tamamen esterleşmiş poligalakturonik asitler teorik olarak % 16.3 metoksil grubu içerirler. Protopektinler selüloz, xylan ve glukomannan gibi düğer hücre duvarı maddelerine kimyasal ve fiziksel olarak bağlı suda çözünmez pektinlerdir. Pektik asitler, çok az esterleşmiş veya hiç esterleşmemiş poligalakturonik asitlerdir. Bunlar şekerlerle, 12

23 1.GİRİŞ asitlerle veya divalent iyonlarla katı jel formuna getirilebilirler. Meyve ve sebzelerin yapıları pektik maddelerin özellikleri ve içerikleriyle düzenlenir Pektinin Endüstriyel Önemi Pektin gıda endüstrisinde reçel ve marmelat üretiminde jelleşmeyi sağlamak amacıyla kullanılmaktadır. Pektin ( E 440) bir gıda katkı maddesidir, Meyve ve sebze teknolojisinde berrak meyve suyu üretiminde önemli bir yere sahiptir. Meyve suyu üretiminde mayşe enzimasyonu uygulansa bile pres suyu, kolloidal olarak çözünen pektin içerir. Pektin koruyucu özelliğinden dolayı, diğer bileşikleri de meyve ham suyu içinde askıda tutmaktadır. Bu nedenle berrak meyve suyu üretimi için öncelikle pektik bileşiklerin enzimatik yolla degredasyonu gereklidir (Ekşi, 1988). Pektin endüstriyel olarak elma ve turunçgil meyveleri posasından elde edilir. Ham maddedeki protopektin asit ekstraksiyonu ile çözünür hale getirilir ve daha sonra izopropil alkol ile çözünür pektin sulu çözeltiden ayrılır. Pektin ticarette sıvı veya kurutulmuş toz halde bulunur (Acar ve Gökmen, 2004) Pektolitik Enzimler Pektolitik Enzimlerin Genel Özellikleri Pektolitik enzimler galakturonik asidin doğal polimeri olan pektinleri parçalarlar. Bu enzimlerin üretimi daha çok yüzey kültür tekniği ile katı besiyerlerde gerçekleştirilir. Üretimde A. niger, A. oryzae, A. wentii, A. flavus, Rhizopus liquefaciens ve Penicillum türleri kullanılır. Pektolitik enzimlerin biyosentezi indüksiyon veya katabolik represyon mekanizması ile kontrol edilir (Telefoncu, 1997). Pektik enzimler, genelde polisakkaritleri parçalayan zincir kırıcı enzimler olarak bilinmektedirler. Bitki hücrelerinin orta lamelinin ve primer hücre duvarının yapısını oluşturan pektik asit ve pektini parçalayan bu enzimler bakteri, mantar, 13

24 1.GİRİŞ böcek, nematod ve protozoada bulunmaktadırlar. Bitkisel kaynaklı pektik enzimler oldukça yüksek molekül ağırlıklı pektik asitleri tercih ederler ve pektatların indirgeyici olmayan uçlarına atak yaparak monogalakturonat oluştururlar. ligo ve digalakturonatları da parçalarlar. Substratlarını tek zincir etki mekanizmasına göre ürüne çevirirler. Kalsiyum (Ca ++ ) iyonu varlığında sitimüle olurlar. Pektatların tamamen hidrolize olmamasının nedeni, substratların yapılarındaki düzensizlik nedeniyle olduğu şeklinde yorumlanmaktadır. Pektik maddelere etki eden ve kısaca pektik enzimler denilen grupta da çok sayıda enzim yer almaktadır (Sunnotel ve Nigam, 2002). Pektik enzimleri, pektin molekülünün galakturonan omurgasına olan etkilerine göre pektinesterazlar (ester bağını hidrolize edici enzimler) ve depolimerazlar (zincir kırıcı enzimler) olarak iki sınıfa ayırarak incelemek olasıdır (Aksöz ve ark., 1985). Depolimerazlar, pektik maddeler üzerinde iki farklı mekanizmayla çalışırlar. Birincisi, glikozidik bağları hidroliz eden hidrolitik reaksiyon. İkincisi, glikozidik bağları su katılması olmaksızın kıran trans-eliminasyon reaksiyonu. Depolimerazların bu sınıfı liyazlar olarak adlandırılır. Bu farklı kırılma reaksiyonları pektinazların sınıflandırılmasında kullanılır (Soares ve ark., 1999). Çizelge 1.3. Pektik enzimlerin sınıflandırılması EC numarası Kırma noktası Hidrolazlar Endopoligalakturonaz Zinciri arasından rastgele Exopoligalakturonaz Zincirin sonundan Liyazlar Pektat-liyaz Zinciri arasından rastgele Pektin-liyaz Zinciri arasından rastgele Esteraz Pektin-esteraz Deesterifikasyon 14

25 1.GİRİŞ Endopoligalakturonazlar (Endo-PG; ), mantar, bakteri, maya gibi birçok mikroorganizmada ve bitkilerde bulunur. Poligalakturonaz için en iyi subsrat pektik asitlerdir. Pektik asitler endopoligalakturonaz tarafından hidrolizle depolimerize olurlar. Pektik asitlerdeki serbest karboksil ucuna yakın glikozidik bağı kırarlar. Pektat çözeltisinin viskozitesindeki hızlı azalma PG aktivitesinin bir göstergesidir. Birkaç bağın kırılması bile viskozitede % 50 azalmaya neden olur. Subsratın esterifikasyon derecesinin düşmesiyle PG aktivitesi düşer. Exopoligalakturonazlar (Exo-PG, EC ), yüksek bitkilerde, mantarlarda, bakterilerde ve bazı böceklerin bağırsak sistemlerinde bulunurlar. Yüksek moleküllü pektik asit zincirini sonundan kırarlar. Hidroliz ile depolimerizasyon sonunda monomerler açığa çıkarırlar. CH H H CH H H + H 2 CH H H H CH H H H Poligalakturonaz Şekil 1.6. Poligalakturonaz enziminin etki mekanizması H H Pektat-liyazlar (PATE; EC ), bazı bakteri ve patojenik mantarlar tarafından üretilirler. Serbest karboksil ucuna yakın glikozidik bağını eliminasyon tepkimesiyle kırarlar. Pektat-liyazlar için en iyi subsratlar düşük metoksilli pektinler veya tamamen deesterifiye olmuş pektik asitlerdir. Enzimin aktif olması için Ca+2 iyonuna ihtiyacı vardır. CH H H H CH H H Pektat-liyaz CH H H H CH H H Şekil 1.7. Pektat-liyaz enziminin etki mekanizması 15

26 1.GİRİŞ Pektin liyazlar (PTE; EC ), yüksek bitkilerde bulunmazlar ama bazı mantarlarda bulunurlar. Depolimerazların bu türleri, ticari enzimlerin önemli elemanlarıdır. Özellikle pratik uygulamalarda önemlidir. Yüksek dereceli esterleşmiş poligalakturonik asitleri depolimerize ederler. Pektin liyazlar glikozidik bağını kırdıklarında metilenmiş galakturonik asit artıkları açığa çıkar. En iyi subsratları fazla esterleşmiş pektinlerdir ve Ca +2 iyonu tarafından aktif hale getirilirler. CCH 3 H H H CCH 3 H H Pektin-liyaz CCH 3 H H H CCH 3 H H Şekil 1.8. Pektin-liyaz enzimininin etki mekanizması Pektin-esterazlar (PE; EC ), yüksek bitkilerde, çeşitli mantarlarda, bazı maya ve bakterilerde bulunurlar. Pektinleri enzimatik bir şekilde deesterifike ederler. Deesterifikasyon sonunda metanolün ayrılmasıyla düşük esterli pektinlere ve pektik asitlere dönüşürler.pektin zincirinde tercih ettiği kırma noktası, serbest karboksil ucuna yakın esterli galakturonik asit artıklarıdır. CCH 3 H H CCH 3 H + H 2 0 CH H CH H HCH 3 H H Pektin-esteraz Şekil 1.9. Pektin-esteraz enzimininin etki mekanizması H H Endüstride Pektolitik Enzimlerin Kullanılması Pektinazlar 60 yıldan daha fazla süredir gıda ve meyve suyu üretiminde kullanılmaktadır. Ticari pektinaz üretiminde kullanılan asıl mikroorganizma A.niger dir. Pektinazlar elma, armut, üzüm, turunçgiller, kuru erik gibi meyve sularının domates suyu gibi sebze sularının hazırlanmasında kullanılmaktadır. 16

27 1.GİRİŞ Yüksek poligalakturonaz aktivitesine sahip pektik enzimlerin kullanımı ile meyve sularındaki bulanıklığın kararlı hale gelmesi başarılmıştır. Pektin parçalayan enzimler gıda endüstrisinde özellikle meyve sularının berraklaştırılmasında, meyve suyu üretiminde filtrasyonu kolaylaştırıp verimin artırılmasında, C vitamini sentezi için çıkış maddesi olan galakturonik asit eldesinde, şarap endüstrisinde, yağların ekstraksiyonunda, pigmentlerin ve selüloz fiberlerin hazırlanmasında, kahve ve çay fermantasyonunda fonksiyonel gıda maddeleri olarak oligosakkaritlerin üretiminde yeni uygulamalar için kullanılmaktadırlar (Telefoncu, 1997; Phutela ve ark., 2005; Patil ve ark., 2006; Botella ve ark., 2007). 1.4.Alginat Alginat deniz yosunlarında bulunan bir polisakkarit olup, aralarında β (1-4) glikozidik bağları olan D-manuronik (M) asit ve α (1-4) glikozidik bağları olan L- guluronik asit (G)'ten meydana gelen organik bir bileşiktir (Sardar ve Gupta, 1998). Endüstriyel olarak üretildiği mikroorganizmalar şunlardır: Laminaria hyperborea Macrocystis pyrifera Ascophyllum nodosum L.digitata, vb. Alginat molekülünün bileşimi elde edildiği organizmaya ve dokuya göre farklılıklar gösterir. Alginat iki ve üç değerlikli katyonlar ile reaksiyona girerek jel oluşturur. Katyonlar (Ca +2, Sr +2, Ba +2, Al +3, Fe +3 gibi) moleküldeki guluronik asitleri birbirlerine bağlayarak jel olşumuna sebep olurlar. 2 Na (Alginate) + Ca ++ Ca (Alginate) Na + İyonik bağlı jel o C arasındaki sıcaklıklarda kararlıdır. Bu nedenle ısıtmak jeli sıvılaştırmaz. Yüksek sodyum veya potasyum içeren bir çözeltiyle muamele edilirse kolaylıkla çözünür. 17

28 1.GİRİŞ Jel oluşturma özellikleri alginat molekülünün kompozisyon ve sırasına bağlıdır. G bloklarının uzunluğu jel formasyonunun başlıca yapısal durumunu belirler. Eğer molekülde G miktarı fazla ise sert ve kırılgan bir jel oluşur, eğer M miktarı fazla ise daha yumuşak ve elastik jel oluşumu gözlenir.genellikle hücrelerin immobilizasyonunda kullanılan bu metod enzimler için kullanıldığında, bazı özel tekniklerin kullanılması gereklidir. Alginat ile bead, kapsül ve fiber oluşturularak enzim veya hücre immobilize edilebilir. Hiçbir toksik etkisi olmadığından alginat, gıda, ilaç, tekstil, kağıt endüstrisinde geniş kullanım alanına sahiptir (Smidsrod ve ark., 1990). 1.5.Florisil Florisil (magnezyum silikat) yüksek mekanik dayanıklılığa sahip, organik çözücülere dayanıklı, mikrobiyal saldırılara karşı dirençli inorganik desteklerdir. Pektinaz enziminin alginat ve florisil destek üzerine immobilizasyonu, immobilize enzimlerin karakterizasyonu (optimum ph, optimum sıcaklık, termal kararlılık, depolama kararlılığı, tekrar kullanılabilirliği); immobilize enzimlerin kinetik parametrelerinin (aktivasyon enerjisi, Km, Vmax, katalitik etkinliği) belirlenmesi ve bu parametrelerin serbest Pektinaz ile kıyaslanması bu çalışmanın temelini oluşturmaktadır. 18

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Roy ve ark., 2003 Aspergillus niger den saflaştırılan Pektinaz enzimini kovalent olmayan bir şekilde alginat üzerine immobilize etmişlerdir. Substrat olarak kitini kullanmışlar, immobilize enzimin serbest enzime göre % 56 aktivite gösterdiğini bildirmişlerdir. İmmobilize enzim serbest enzimle karşılaştırıldığında optimum sıcaklığın değişmeden kaldığını optimum ph nın ise geniş bir aralık gösterdiğini rapor etmişlerdir. Alginat üzerine immobilize edilen Pektinaz ın termal kararlılığını 55 ve 65 o C olarak bulmuşlardır. Serbest ve immobilize enzimin kinetik parametrelerini çalışmışlar, V max değerinin değişmediğini K M değerinin immobilizasyonla yükseldiğini göstermişlerdir. İmmobilize enzimin K M ve V max değerlerini sırasıyla 6 mg ml -1 ve 3.4 nmol min -1 olarak bulmuşlardır. İmmobilize enzimin ilk kullanımdan sonra aktivitesinin % 55 azaldığını göstermişler ve bu azalmanın sebeplerini incelemişlerdir. rtega ve ark., 2004 Üç farklı ticari Pektinaz enzim kompleksindeki (Rapidase C80, Pectinase CCM and Pectinex 3XL) poligalakturonaz aktivitesinin termal inaktivasyonunu ve kinetik özelliklerini incelemişlerdir. Bütün örneklerde PG aktivitesinin Michaelis-Menten kinetikleri ve onların katalitik etkinlikleri incelemişlerdir. Pectinex 3XL için optimum ph yı 4.7, diğer ikisi için optimum ph yı 4.0 olarak hesaplamışlardır. Rapidase C80, Pectinase CCM, Pectinex 3 XL için aktivasyon enerjilerini sırasıyla 26.5, 45.6, 4.2 kj mol -1 hesaplamışlar ve termal inaktivasyon eğrilerinin o C arasında doğrusal olmadığını rapor etmişlerdir. Ayrıca enzim komplekslerinin serbest enerji ( G # ), entalpi ( H # ) ve entropi ( S # ) gibi termodinamik aktivasyon parametrelerini hesaplamışlardır. En yüksek katalitik etkinliği (V max /K M ) 44.4 değeri ile Rapidase C80 gösterdiği için üç enzim kompleksi arasındaki en etkin enzimin Rapidase C80 olduğunu belirlemişlerdir. Sardar ve Gupta, 2005 Domatesten saflaştırdıkları Pektinaz ı Concanavalin A bağlı agaroza immobilize etmişlerdir. İmmobilize ve serbest enzimin katalitik etkinliğini(v max /K M ) sırasıyla 0.4 ve 0.3 olarak bulmuşlar ve immobilize enzimin katalitik etkinliğinin daha yüksek olduğunu rapor etmişlerdir. İmmobilize enzimin 19

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR termal kararlılığının 50 o C ve depolama kararlılığının 4 o C de yüksek olduğunu rapor etmişlerdir. İmmobilize enzimi aktivitesi kaybolmadan 3 kez kullanabilmişlerdir. Busto ve ark., 2006 Meyve suyu üretiminde kullanılan ticari pektinazlardan pektinliyazı alginat boncuklar üzerine immobilize etmişler ve optimum koşulları 0,17 g alginat ml -1, % 1,2 enzim konsantrasyonu ve ph 3,6 asetik- HCl/glisin HCl veya ph 6,4 tris HCl / imidazol tamponu olarak belirlemişlerdir. İmmobilizasyonun maksimum % sini (%10,6) Rapidase C 80 ile belirlemişlerdir. Serbest ve immobilize enzimin optimum ph ve sıcaklık değerlerini 7,2 ve 55 o C olarak bulmuşlardır. İmmobilizasyonla termal kararlılığın özellikle 40 o C de önemli şekilde değişmediğini göstermişlerdir. Yüksek esterli pektinin viskozitesindeki azalmayı serbest enzim için 1,09 dan 0,70 mm 2 sn -1 ve immobilize enzim için 1,09 dan 0,72 mm 2 sn -1 olarak bulmuşlardır. Ayrıca enzimin 4 kez kullanılabileceğini ve viskozite azalmasındaki verim kaybını sadece % 9,2 olarak belirlemişlerdir. Aslan ve Tanrıseven, 2007 Aspergillus aculeatus dan elde edilen ticari enzim kompleksi Pectinex Ultra SP-L yi Eupergit C üzerine immobilize etmişler ve galaktooligosakkaritleri elde etmek için kullanmışlardır. İmmobilizasyonu % 100 bağlanma yüzdesi ve serbest enzimden % 24 daha yüksek GS (galaktooligosakkarit) verimi ile sonuçlandırmışlardır. ptimum koşulların immobilizasyondan çok etkilenmediğini göstermişler, optimum ph ve optimum sıcaklığı her iki enzim için sırasıyla ve o C olarak hesaplamışlardır. Serbest ve immobilize enzimi kullanarak % 30 luk laktoz çözeltisinden üretilen GS miktarını reaksiyon karışımındaki toplam şekerin sırasıyla % 12.8 ve % 15.8 i olarak belirlemişlerdir. İmmobilize enzim 20 gün boyunca azalma olmaksızın aktivite gösterdiği ve immobilizasyon yüzdesi yüksek olduğu için immobilize Pectinex Ultra SP-L nin galaktooligosakkaritlerin üretimi için kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Li ve ark., 2007 Pektinaz enzimini gluteraldehit kullanılarak sodyum alginat destek üzerine kovalent bir şekilde immobilize etmişler ve aktivitesinin % 66 nı koruduğunu bildirmişlerdir. İmmobilizasyondan sonra aktivite için en uygun ph değerinin 3 den 3.5 a değiştiğini fakat optimum sıcaklığın değişmeden 40 o C de kaldığını göstermişlerdir. İmmobilize enzimin serbest enzime göre daha yüksek termal kararlılığa ve tekrar kullanılabilirliğe sahip olduğunu, 11 kullanımdan sonra 20

31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ilk aktivitesinin % 80 nini koruduğunu rapor etmişlerdir. Farklı substrat değişimlerinde V max ve K M değerlerini çalışmışlar, V max değerini serbest enzim için 0,5 µmol/mg dk, immobilize enzim için 0,4µmol/mg dk bulmuşlardır. K M değerini ise serbest enzim için 0,7 mg ml-1, immobilize enzim için 0,6 mg ml-1 olarak bulmuşlardır. Lei ve Bi., 2007b Pektinaz enzimini ATRP (atom transfer radikal polimerizasyonu) kullanılarak sentezlenen gözenek boyutu belirli PS-b-PAA (polisitiren-b-poliakrilik asit) kopolimeri üzerine immobilize etmişlerdir. Polimer üzerindeki karboksil gruplarının enzim immobilizasyonu için çok basit, hafif ve zaman tasarruflu bir süreç sunduğunu göstermişlerdir. İmmobilize pektinazın bazı özelliklerini ( ph, termal kararlılık, sıcaklık, depolama kararlılığı) çalışmışlar, bunlardan optimum ph yı 6,0 optimum sıcaklığı 65 o C olarak bulmuşlardır. Serbest ve immobilize enzimin aktivitelerini farklı substrat derişimlerinde ölçmüşler ve K M ve V max değerlerinin değişmediğini görmüşlerdir. Bunun sonucunda immobilize enzimin serbest enzimle benzer hızda çalıştığını göstermişlerdir. Fakat immobilize enzimin K M değerinin, serbest enziminkine göre daha yüksek olduğunu ortaya çıkarmışlardır. Lei ve ark., 2007a Pektinazı Si 2 üzerine daha önceden adsorbe edilmiş kitozan yüzeyine immobilize etmeye çalışmışlardır. Kitozanın enzim immobilizasyonu için uygun bir destek olduğunu ve gluteraldehit gibi reaktiflerle kolay bir şekilde karşı bağ yaparak jel haline gelebildiğini bunun içinde iyi bir destek olduğunu belirtmişlerdir. Glutaraldehitle aktifleştirilmiş silika kaplı kitozan destek olarak kullanıldığında immobilize enzimin termal ve ph denaturasyonuna karşı daha dirençli olduğunu belirtmişlerdir. Bu immobilize enzimin aktivitesini kaybetmeden geniş bir ph aralığında (3-4.5) uygulanabileceğini göstermişlerdir. Bu partiküller üzerine adsorbe edilen immobilize enzimin aktivitesini Michaelis-Menten parametreleriyle analiz etmişlerdir. K M değerlerini serbest ve immobilize enzim için sırasıyla 8.28 g pektin ml-1 ve g pektin ml-1 olarak bulmuşlardır. değerindeki ufak değişimin sebebini destek ve polimer zincirlerinin üç boyutlu yapısıyla oluşan difüzyon etkileri olarak açıklamışlardır. K M 21

32 3.MATERYAL VE METD 3.MATERYAL VE METD 3.1.Materyal Araştırmada kullanılan tüm reaktifler analitik saflıkta olup Merck veya Sigma, St. Louis, M. Firmasından sağlanmıştır.araştırmada kullanılan kimyasallar, araç ve gereçler şunlardır: Kimyasallar: Pektinaz (Novenzymes), alginat, galakturonik asit, sodyum hidroksit, sodyum karbonat, sodyum potasyum tartarat, 3,5-dinitrosalisilik asit, fenol, sodyum sülfit, florosil ( mesh), glutaraldehit, 3-aminopropil trietoksisilan, nitrik asit, aseton, bakır (II) sülfat, folin-ciocalteu çözeltisi, sodyum klorür, fosforik asit, asetik asit, sitrik asit, sığır serum albumin (BSA). Araç ve gereçler: UV- Vis spektrofotometre (ATI UNICAM), ph metre (HANNA 8417), magnetik karıştırıcı, inkübatör (ES 500), santrifüj, analitik terazi, otomatik pipet, girdap karıştırıcı, termostatlı çalkalayıcı su banyosu, kriyostat. 3.2.Metod Protein Tayini Protein tayini Lowry (1951) yöntemiyle yapılmıştır. Bunun için içerikleri bildirilen A, B ve C çözeltileri hazırlanmıştır. 1) Çözelti A: 20 g Na 2 C 3 ve 4 g NaH saf suda birlikte çözülüp son hacim 1 L ye tamamlanarak hazırlanmıştır. 2) Çözelti B: 0,5 g CuS 4.5H 2, % 1 lik sodyum sitrat çözeltisinde çözülüp son hacim aynı çözelti ile 100 ml ye tamamlanarak hazırlanmıştır. 3) Çözelti C: 50 ml A çözeltisi ile 1 ml B çözeltisi karıştırılarak hazırlanmıştır. (Kullanılacağı zaman hazırlanmasına dikkat edilmiştir). 4) Folin-Ciocalteu çözeltisi: Folin-Ciocalteu saf su ile 1:2 oranında seyreltilerek hazırlanmıştır. 22

33 3.MATERYAL VE METD 5) Standart protein çözeltisi:100 ml de 14 mg sığır albümini olacak şekilde 0,9 luk NaCl çözeltisi ile hazırlanmıştır. 6) Standart protein eğrisinin çizimi: 8 adet deney tüpü alınarak tüplere sırasıyla 0, 50, 100, 125, 250, 500, 750 ve 1000 µl olacak şekilde standart protein çözeltisinden konulmuştur. Her tüp içeriğinin hacmi su ile 1 ml ye tamamlanmış, her tüpe 5 ml C çözeltisi ilave edilmiştir. 10 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra her tüpe 1:2 oranında seyreltilmiş Folin- Ciocalteu çözeltisinden 0,5 ml eklenmiştir. 30 dakika oda sıcaklığında bekletilip tüp içeriklerinin absorbansları köre karşı 750 nm de okunmuştur, bu değerler derişime karşı grafiğe geçirilmiştir. Örneklerin protein içerikleri aynı yöntemle standart protein eğrisi kullanılarak değerlendirilmiştir Pektinaz ın Alginat Destek Üzerine İmmobilizasyonu Enzimlerin immobilizasyonunda Mondal ve ark.(2003), tarafından önerilen yöntem kullanılmıştır.30 µl enzim çözeltisi (3,75 mg/ml) ph 5,0 sodyum asetat tamponu ile 1 ml ye tamamlanmıştır.sonra % 2 lik 2 ml alginat çözeltisi eklenmiş ve son hacim asetat tamponu ile 4 ml ye tamamlanmıştır. Reaksiyon karışımı 3M asetik asitle ph 3,8 e getirilmiştir.25 o C de bir saat bekletildikten sonra 2M CaCl 2 çözeltisinden 400 µl eklenmiş ve 20 dakika sonunda santrifüj edilmiştir. İmmobilizasyon işleminden sonra immobilize enzim saf su ile süzüntüde protein kalmayıncaya kadar asetat tamponu ile yıkanmıştır.toplam süzüntüde protein tayini yapılarak g destek başına tutuklanan mg enzim miktarı hesaplanmıştır.protein tayini Lowry metoduna göre yapılmıştır Pektinaz ın Florisil Destek Üzerine İmmobilizasyonu Pektinaz ın immobilizasyonunda önce florisil destek yüzeyinin aktifleştirilmesi gerekmektedir (Tükel ve Alptekin, 2004). Bu nedenle 3- aminopropiltrietoksisilan kullanılarak desteğin alkilamin türevi oluşturulmuştur. Alkilamin türevinin hazırlanmasında (silanlama) Weetall, H.H. (1976) tarafından literatürde bildirilen yöntem kullanılmıştır. Destek materyali %5 (v/v) lik nitrik asit ile ºC de 60 23

34 3.MATERYAL VE METD dakika yıkanmış ve takiben su ile yıkanıp 120 ºC de kurutulmuştur. Kurutulmuş desteğin 1 gramı hacimce % 4 lük 3- aminopropiltrietoksisilanın aseton içerisindeki çözeltisine eklenerek 45 o C de 24 saat bekletilmiştir. Saf su ile yıkanarak 115 o C de etüvde 1 gece kurutulmuştur.1 g silanlanmış desteğe 25 ml % 2,5 (v/v)`luk glutaraldehitin 50 mm ph 7,0 fosfat tamponundaki çözeltisi eklenmiş 120 dakika beklendikten sonra, reaksiyona girmemiş glutaraldehit saf su ile yıkanarak uzaklaştırılmış ve 60 o C de 1 sa kurutulmuştur.bu basamaktan sonra enzim destek üzerine doğruda immobilize edilmeye çalışılmıştır ( Costa ve ark., 2001) Serbest veya İmmobilize Pektinaz ın Aktivitesinin Belirlenmesi Pektinaz ın aktivite tayini için Debing ve ark.(2006), önerdiği yöntem kullanılmıştır. Pektinaz enzim kompleksinde exopoligalakturonaz aktivitesi ölçülmüştür. Serbest enzim için 50 o C de 10 dakika bekletilen reaksiyon karışımında pektinin hidrolizi sonucu oluşan galakturonik asit miktarı Dinitrosalisilik asit (DNSA) yöntemi ile belirlenmiştir. DNSA yöntemi ilk kez Sumner ve ark. (1921) tarafından geliştirilmiştir. Yöntem bir indirgen şekerin 3,5-Dinitrosalisilik asit ile yükseltgenmesi esasına dayanmaktadır. Bu çalışmada kullanılan DNSA reaktifinin bileşimi (w/v) olarak aşağıda verilmiştir (Wang ve ark., 1997). % 1 DNSA % 0,2 Fenol % 0,05 Sodyum Sülfit % 1 Sodyum Hidroksit % 30 Sodyum-Potasyum Tartarat DNSA yöntemi ile galakturonik asit tayini yapmak için 300 µl galakturonik asit çözeltisi ile 300 µl DNSA reaktifi bir tüpte karıştırılır, kaynar su banyosunda 15 dakika tutulur.tüm tüpler aynı anda kaynar su banyosundan alındıktan sonra buz 24

35 3.MATERYAL VE METD banyosunda 2-3 dakika soğutulur. Çözelti üzerine 4,4 ml damıtık su eklenerek seyreltilir ve girdap karıştırıcı ile karıştırıldıktan sonra spektrofotometrede 530 nm de okunur. Exopoligalakturonaz aktivitesini belirlemek için 0,2 mg/ml derişimindeki serbest Pektinaz ın 50 µl si 250 µl % 1 lik pektin çözeltisi ile 50 o C de 10 dk etkileştirilmiştir.reaksiyonu durdurmak için ortama 300 µl DNSA reaktifi eklenmiştir.açığa çıkan galakturonik asit miktarı belirli galakturonik asit derişimlerine karşı 530 nm de absorbans değerlerinin grafiğe geçirilmesiyle elde edilen standart galakturonik asit eğrisinden yararlanılarak bulunmuştur.enzimin aktivitesi µmol galakturonik asit dk -1 mg -1 protein olarak hesaplanmıştır. İmmobilize Pektinaz aktivitesinin ölçümünde, immobilize Pektinaz içeren 0,2 g destek % 1 lik pektin çözeltisinin 250 µl si ile 45 o C de 10 dk etkileştirilmiş ve reaksiyon DNSA reaktifi ile durdurulmuştur.açığa çıkan galakturonik asit miktarı standart eğriden yararlanılarak bulunmuştur.enzimin aktivitesi µmol galakturonik asit dk -1 g -1 destek olarak hesaplanmıştır Galakturonik Asit Tayini Standart galakturonik asit eğrisinin çizimi: 6 adet deney tüpüne sırasıyla 0,5, 1, 2, 3, 4 v 5 mm derişimlerde olacak şekilde 300 µl galakturonik asit çözeltisi ve kör için ise 300 µl saf su konulmuştur. Her bir tüpe DNSA reaktifinden 300µl eklendikten sonra 15 dakika kaynar su banyosunda bekletilmiştir.bu sürenin sonunda 2-3 dakika buz içerisinde bekletilen tüplere 4,4 ml saf su eklenerek seyreltilmiş ve tüplerin absorbansları 530 nm de okunmuştur.bu değerler derişime karşı grafiğe geçirilmiştir.örneklerin galakturonik asit içerikleri aynı yöntemle standart galakturonik asit grafiği kullanılarak değerlendirilmiştir (Debing, J., 2006). 25

36 3.MATERYAL VE METD Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Karakterizasyonu Serbest ve İmmobilize Enzimlerin ptimum ph'larının Belirlenmesi Serbest ve immobilize Pektinaz ın aktivitesi farklı ph'larda (3.5, 4, 4.5, 5.0 asetat, 6.0 sitrat) sırasıyla 50 mm ve 25 mm tampon içinde hazırlanmış % 1 lik pektin çözeltisi kullanılarak belirlenmiştir. 10 dakika sonunda oluşan galakturonik asit miktarı ölçülerek aktiviteler hesaplanmış ve sonuçlar % maksimum aktivite olarak ph'ya karşı grafiğe geçirilmiştir Serbest ve İmmobilize Enzimlerin ptimum Tampon Derişimlerinin Belirlenmesi Serbest ve immobilize Pektinaz ın aktiviteleri daha önce belirlenmiş olan optimum ph'larda ve farklı tampon derişimlerinde (5, 10, 25, 50, 75, 100 mm) hazırlanmış substrat çözeltileri kullanılarak ölçülmüştür Serbest ve İmmobilize Enzimlerin ptimum Sıcaklıklarının Belirlenmesi Serbest ve immobilize Pektinaz ın aktiviteleri daha önce belirlenmiş olan optimum ph ve tampon derişimleri için farklı sıcaklıklarda (35, 40, 45, 50, 60, 70 C) belirlenmiştir. Her enzim örneği için aktivitenin sıcaklıkla arttığı ve azaldığı bölgeler için Arrhenius grafiği çizilmiş ve elde edilen iki doğrunun ortak çözümü ile enzimin denatüre olmaya başladığı sıcaklık belirlenmiştir. Aktivitenin sıcaklıkla arttığı bölge için elde edilen grafiğin eğimi yardımıyla enzimin aktivasyon enerjisi hesaplanmıştır. 26

37 3.MATERYAL VE METD Serbest ve İmmobilize Enzimlerin K M ve V max Değerlerinin Belirlenmesi Serbest ve immobilize Pektinaz ın aktiviteleri optimum şartlarda farklı substrat derişimlerinde ölçülmüş ve Lineweaver-Burk grafiği yardımıyla K M ve V max değerleri belirlenmiştir. Ayrıca serbest ve immobilize Pektinaz enzimi için katalitik etkinlik parametresi olarak belirlenen V max /K m değerleri hesaplanmıştır Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Termal Kararlılıklarının Belirlenmesi Serbest ve immobilize Pektinaz 4 farklı sıcaklıkta (serbest enzim için; 5, 25, 50, 60 C ve immobilize enzim için; 5, 25, 45, 60 o C) 18 saat süreyle inkübe edilmiş ve belirli aralıklarla (başlangıç, 1, 3, 7 ve 18 saat) kalan aktiviteleri belirlenmiştir Serbest ve İmmobilize Pektinaz ın Depolama Kararlılıklarının Belirlenmesi Serbest ve immobilize Pektinaz ın başlangıç aktiviteleri belirlendikten sonra 4 o C ve oda sıcaklığında (25 o C) ağzı kapalı şişelerde bekletilmiş ve bu enzimlerin kalan aktiviteleri 5 hafta boyunca belirli zaman ararlıklarla ölçülmüştür İmmobilize Pektinaz ın Tekrar Kullanım Kararlılığının Belirlenmesi İmmobilize enzimin tekrar kullanım kararlılığı belirlenirken kesikli ve karıştırmalı kolon reaktör kullanılmıştır. 1 g immobilize enzim bulunan kolona 1 ml % 1 lik pektin çözeltisi eklenmiş ve 10 dakika sonunda alttaki musluğun açılması ile kolan boşaltılmıştır. Enzim aktivitesi oluşan galakturonik asit miktarı ölçülerek hesaplanmıştır. Kolon boşaltıldıktan sonra tekrar 1 ml subsrat çözeltisi eklenerek aynı şekilde aktivite belirlenmiş ve bu işlem 24 kez tekrarlanmıştır. Kalan aktivite ilk kullanımdaki aktivitenin % si olarak hesaplanmıştır. 27

38 4.BULGULAR VE TARTIŞMA 4.BULGULAR ve TARTIŞMA 4.1.Bulgular Serbest ve İmmobilize Pektinaz ın Karakterizasyonu Serbest ve immobilize Pektinaz ın farklı ph daki aktiviteleri % maksimum aktivite olarak Şekil 4.1 de verilmektedir. 120 % Maksimum Aktivite ph Şekil 4.1.Serbest ve İmmobilize Pektinaz aktivitesinin ph ya bağlı olarak değişimi ( ):İmmobilize Pektinaz, (ο):serbest Pektinaz Şekil 4.1 de görüldüğü gibi serbest ve immobilize Pektinaz ın her ikisi de en yüksek aktiviteyi ph 5.0 da göstermektedir. Serbest ve immobilize Pektinaz ın ph 5.0 da hazırlanmış olan farklı derişimlerdeki tampon çözeltileri kullanılarak aktiviteleri belirlenmiş ve sonuçlar % maksimum aktivite olarak Şekil 4.2 de gösterilmektedir. 28