T.C. SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ

Transkript

1 T.C. SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ AMANITA CAESAREA (SCOP.: FR.) PERS. NIN ANTĠOKSĠDAN, ANTĠMĠKROBĠYAL ETKĠLERĠNĠN VE YAĞ ASĠTĠ KOMPOZĠSYONUNUN BELĠRLENMESĠ Gülsün AKBAġ YÜKSEK LĠSANS TEZĠ Biyoloji Anabilim Dalı Aralık 2010 KONYA Her Hakkı Saklıdır

2

3 TEZ BĠLDĠRĠMĠ Bu tezdeki bütün bilgilerin etik davranıģ ve akademik kurallar çerçevesinde elde edildiğini ve tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalıģmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. DECLARATION PAGE I hereby declare that all information in this document has been obtained and presented in accordance with academic rules and ethical conduct. I also declare that, as required by these rules and conduct, I have fully cited and referenced all material and results that are not original to this work. Gülsün AKBAġ 07 / 12 / 2010

4 ÖZET YÜKSEK LĠSANS TEZĠ AMANITA CAESAREA (SCOP.: FR.) PERS. NIN ANTĠOKSĠDAN, ANTĠMĠKROBĠYAL ETKĠLERĠNĠN VE YAĞ ASĠTĠ KOMPOZĠSYONUNUN BELĠRLENMESĠ Gülsün AKBAġ Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı DanıĢman: Doç. Dr. H. Hüseyin DOĞAN 2010, 103 Sayfa Jüri DanıĢman: Doç. Dr. H. Hüseyin DOĞAN Yrd. Doç.Dr. Rüstem DUMAN Yrd. Doç. Dr. Yener TEKELĠ ÇalıĢmada, Amanita caesarea nın antioksidan kapasiteleri (DPPH radikallerini süpürme etkisi, β- karoten- linoleik asit sistemindeki etkisi, indirgeme gücü ve toplam fenolik içeriği), antimikrobiyal aktiviteleri ve yağ asidi kompozisyonu belirlenmiģtir. Amanita caesarea nın antioksidan aktiviteleri, BHA, BHT gibi standart antioksidanlar ile kıyaslanmıģtır. Linoleik asit sisteminde Amanita caesarea nın ve standartların artan konsantrasyonu ile orantılı olarak inhibisyon değerlerinin arttığı gözlenmiģtir. Fenolik madde konsantrasyonu A. caesarea da mg/ml GAE olarak bulunmuģtur. DPPH radikallerini süpürme etkisi 0,5 mg/ml de; % olarak bulunmuģtur. A. caesarea nın kloroform, aseton ve metanolik ekstraktlarının antimikrobiyal aktiviteleri 4 Gram pozitif (Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6633, Listeria monocytogenes tip 2 NCTC 5348, Streptococcus pyogenes ATCC 19615), 5 Gram negatif bakteri (Escherichia coli ATCC 35218, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Proteus vulgaris ATCC 7829, Salmonella enteritidis RSHMB) ye ve 1 maya (Candida albicans ATCC 1023) ya karģı mikrodilüsyon yöntemi ile belirlenmiģtir. A. caesarea nın sokslet ekstraksiyon yöntemiyle elde edilen aseton ekstraktı, bakterilere karģı en yüksek antimikrobiyal aktiviteyi göstermiģtir. Tüm ekstraktlar içerisinde en düģük antimikrobiyal aktiviteyi ise maserasyon yöntemiyle elde edilen metanol ekstraktı göstermiģtir. A. caesarea nın yağ asidi kompozisyonları gaz kromatografi metoduyla araģtırılmıģ ve toplam 37 farklı yağ asidi belirlenmiģtir. Bu yağ asitleri C 6 ile C 24 arasında değiģiklik göstermektedir. A. caesarea da en çok doymamıģ yağ asitleri tespit edilmiģ ve en fazla (C 18:1) oleik asit % olarak bulunmuģtur. Bunu sırasıyla (C 18:2) linoleik asit % 20.55, (C 16:0) palmitik asit % ve (C 18:0) stearik asit % 5.34 takip etmektedir. Anahtar Kelimeler: Amanita caesarea, antioksidan kapasite, antimikrobiyal aktivite, yağ asidi bileģimi. iv

5 ABSTRACT MS THESIS THE IDENTIFICATION OF ANTIOXIDAN CAPACITY, ANTIMICROBIAL EFFECTS AND FATTY ACIDS COMPOSITION OF AMANITA CAESAREA (SCOP.: FR.)PERS. Gülsün AKBAġ THE GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE OF SELÇUK UNIVERSITY THE DEGREE OF MASTER OF SCIENCE IN BIOLOGY Advisor: Assoc. Prof. Dr. H. Hüseyin DOĞAN 2010, 103 Pages Jury Advisor: Assoc. Prof. Dr. H. Hüseyin DOĞAN Asist. Prof. Dr. Rüstem DUMAN Asist. Prof. Dr. Yener TEKELĠ In this study, the antioxidant capacity (DPPH free radical-scavenging, β- carotene/linoleic acid systems, reducing power and total phenolic content), the antimicrobial activities and fatty acid composition of Amanita caesarea were determined. Antioxidant activities of Amanita caesarea were compared to standard antioxidants such as BHA and BHT. Inhibition values of mushrooms and the standards in the linoleic acid system were found getting to rise with increasing concentration and showed a parallelism. Total phenolics were determined as mg/ml GAE for A. caesarea. DPPH free radical-scavenging activities were found at concentrations of 0.5 mg/ml as % for A. caesarea. Chloroform-, acetone- and methanol extracts of A. caesarea were used for the antimicrobial activities against to four Gram positive bacteria (Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6633, Listeria monocytogenes tip 2 NCTC 5348, Streptococcus pyogenes ATCC 19615), five Gram-negative bacteria (Escherichia coli ATCC 35218, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Proteus vulgaris ATCC 7829, Salmonella enteritidis RSHMB) and one yeast (Candida albicans ATCC 1023) by microdillution method. The aceton extract of A. caesarea obtained by soxhlet method showed the highest antimicrobial activity against the bacteria. The methanol extract obtained by maceration method showed the minimum antimicrobial activity the all extracts. The fatty acid compositions of A. caesarea were investigated by gas chromatographic method and totally, 37 different fatty acids were determined. These fatty acids are C 6 C 24. The major fatty acids are unsaturated fatty acids in A. caesarea and (C 18:1) Oleic acid (59.87 %) was found at most. It was followed by (C 18:2) linoleik acid (20.55 %), (C 16:0) palmitic acid (11.70 %) and (C 18:0) stearic acid (5.34 %), respectively. Keywords: Amanita caesarea, antioxidant capacity, antimicrobial activity, fatty acid composition v

6 ÖNSÖZ Canlı sistemlerde, oksijen kullanımı sırasında eģlenmemiģ elektron içeren atom veya moleküller oluģur. Serbest radikaller adı verilen bu moleküller hayati öneme sahip hücre elemanlarından elektron çalarak eģlenir, böylece hücre zarı ve hücre yapısını bozar. Serbest radikaller anabolik ve katabolik süreçler sonucu oluģabileceği gibi, radyasyon, ilaçlar, zehirli kimyasallar gibi maddelerin tesiriyle ortaya çıkabilirler. Serbest radikaller bağıģıklık sistemini zayıflatarak çeģitli hastalıklara yol açarlar ve erken yaģlanmaya katkıda bulunurlar. Hücre içinde oluģabilen serbest radikaller; superoksit anyonları, hidroksil radikali ve hidrojen peroksit gibi oksijen içeren reaktif moleküllerdir ve Reaktif Oksijen Türleri (ROS) olarak adlandırılırlar. Hücre içinde diğer moleküller ile hızla reaksiyona girip onların yapısını bozacak zincirleme reaksiyonları baģlatan bu oksidan moleküller ancak antioksidan moleküller tarafından çeģitli mekanizmalarla durdurulabilirler. Son yıllarda sentetik antioksidanların ya da bulundukları ortamda oluģturdukları yan ürünlerin kanserojen olduğu veya negatif sağlık etkilerine neden olduğu pek çok araģtırmacı tarafından rapor edilmiģtir. Bunun sonucu olarak da doğal kaynaklı antioksidanlara olan eğilim gittikçe artmaktadır. Ülkemizin mantar çeģitliliği yönünden önemli bir potansiyele sahip olması ve özellikle de yenen türlerin tabi ortamlarından bol miktarda toplanıp tüketilmesi bu talebe paralellik arz etmektedir. Hastalıklarla mücadelede bugüne kadar geliģtirilen doğal ve sentetik antibiyotiklerin esas etkileri patojen mikroorganizmaların faaliyetlerinin engellenmesidir, fakat bu uygulamadan bazı yararlı mikroorganizmalar da etkilenmektedir. Ayrıca antibiyotiklerin sıkça kullanımı patojen mikroorganizmaların direnç kazanmasına ve antibiyotiklerin etkilerinin giderek azalmasına neden olmakta ve canlının sindirim sistemindeki mevcut dengeyi de bozabilmektedir. Bu gibi çeģitli yan etkenlerden dolayı bilim adamları, bitki ve mantarlar gibi doğal maddelerin antimikrobiyal etkenini araģtırmaya yönelmiģtir. Yağlar, insan beslenmesinde karbonhidrat ve proteinlerle birlikte diyetle alınması zorunlu olan besin öğelerinden biridir. Toplumlarda ortaya çıkabilen sağlık sorunları ile beslenme rejimleri arasındaki iliģki araģtırıldığında en fazla sorgulanan gıda bileģeninin yağlar olduğu ve bu nedenle yağ tüketiminde, yağ çeģidi seçiminden tüketim Ģekline kadar uzanan her aģamada daha bilinçli ve duyarlı olmak gerektiği araģtırmacılar tarafından sürekli vurgulanmaktadır. Mantarların bileģiminde birçok vitamin ve mineralin bulunuģu, protein ve karbonhidrat miktarının düģük oluģu, sağlıklı ve güvenilir bir besin kaynağı olduğunu göstermektedir. Ayrıca bünyelerinde bulundurdukları birçok temel yağ asitleri sayesinde hücre metabolizmasının düzgün çalıģmasında, büyüme ve geliģmede önemli roller oynamaktadırlar. ÇalıĢmamızda elde edilen sonuçların antioksidan, antimikrobiyal ve yağ asitleri konusunda yapılacak araģtırmalara ıģık tutacağı ve besin maddeleri açısından bir alternatif ürün olarak kullanılabileceği kanısındayım. Tez konusunu belirleyen ve her konuda yardım eden, Tez danıģmaınm Doç Dr. Hasan Hüseyin DOĞAN a, antimikrobiyal çalıģmalarında yarımcı olan Yrd.Doç.Dr. Rüstem DUMAN ve Yrd.Doç.Dr. Birol ÖZKALP e, antioksidan çalıģmalarında yardımcı olan Yrd.Doç.Dr. Yener Tekeli ye, yağ asileri çalıģmalarında yardımcı olan Prof.Dr. Abdurrahman AKTÜMSEK e ve tezin yazımında yardım eden Sema AYDIN a teģekkür ederim. Gülsün AKBAġ KONYA 2010 vi

7 ĠÇĠNDEKĠLER ÖZET... iv ABSTRACT... v ÖNSÖZ... vi ĠÇĠNDEKĠLER... vii SĠMGELER... ix 1. GĠRĠġ KAYNAK ARAġTIRMASI GENEL BĠLGĠLER Reaktif oksijen türleri Antioksidanlar Antioksidanların sınıflandırılması Doğal antioksidanlar Tokoferoller Flavonoidler Fenolik asitler Askorbik asit Karotenoidler Sentetik antioksidanlar Antioksidanların etki mekanizmaları Antimikrobiyal aktivite bakımından makrofunguslar Yağ asitleri Yağ asitlerinin sınıflandırılması DoymuĢ yağ asitleri DoymamıĢ yağ asitleri Tekli doymamıģ yağ asitleri Çoklu doymamıģ yağ asitleri Amanita caesarea (Scop.: Fr.) Pers. nın genel özellikleri MATERYAL VE METOT Mantarların antioksidan aktivitelerinin belirlenmesinde izlenen metot ve materyal Mantar ekstraktlarının hazırlanması Materyal Metot Toplam fenolik madde tayini Materyal Metot Ġndirgeme gücü Materyal vii

8 Metot DPPH (1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl) radikallerini süpürme etkisi Materyal Metot β- Karoten- linoleik asit metodu Materyal Metot Mantarların antimikrobiyal aktivitesinin belirlenmesinde izlenen materyal ve metot Materyal Metot Ekstraktların hazırlanıģı Mikrodilüsyon yöntemiyle antimikrobiyal etkinin belirlenmesi Mantarların yağ asitlerinin bileģiminin tespit edilmesinde izlenen materyal ve metot Materyal Metot Mantarların öğütülmesi Mantarlardan yağ ekstraksiyonu EsterleĢtirme iģlemi Numunelerin gaz kromatografiye enjekte edilmesi BULGULAR Antioksidan aktivite bulguları Toplam fenolik madde tayini DPPH Radikallerini süpürme etkisi Mantarların indirgeme gücü Karoten Linoleik asit metodu A. caesarea nın antimikrobiyal aktiviteleri ile ilgili bulgular A. caesarea nın yağ asidi analiz bulguları TARTIġMA VE SONUÇ A. caesarea nın antioksidan aktiviteleri Toplam fenolik madde tayini DPPH radikallerini süpürme etkisi Ġndirgeme gücü Karoten Linoleik asit sisteminde mantarların antioksidan aktivitesinin belirlenmesi Antimikrobiyal aktivite Amanita caesarea nın yağ asidi kompozisyonu KAYNAKLAR ÖZGEÇMĠġ viii

9 SĠMGELER ROS : reaktif oksijen türleri LDL : düģük yoğunluklu lipoprotein HDL : yüksek yoğunluklu lipoprotein TEAC : troloks eģdeğeri antioksidan kapasitesi GA : gallik asit GAE : gallik asit eģdeğeri BHA : butillenmiģ hidroksi anisol BHT : butillenmiģ hidroksi toluen TBHQ : tersiyer butil hidrokinon DPPH : 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil ω : omega EPA : eikosapentaenoik asit DHA : dokosahekzaenoik asit SFA : saturated fatty acid, doymuģ yağ asitleri UFA : unsaturated fatty acid, doymamıģ yağ asitleri PUFA : poli unsaturated fatty acid, çoklu doymamıģ yağ asitleri MUFA : mono unsaturated fatty acid, tekli doymamıģ yağ asitleri TFAs : Trans yağ asitleri a : aseton k : kloroform m: metanol k.a: kontrol antibiyotiği K : kloramfenikol Ns : nistatin ix

10 1 1. GĠRĠġ Antik çağlardan beri varlığı bilinen mantarlara insanların ilgisi günümüzde de devam etmektedir. Besleyici değerlerinin yanında pek çok yenilebilen mantar türünün uzun zamandan beri dünyanın birçok ülkesinde tıbbi amaçlarla da kullanıldığı belirtilmektedir. Ayrıca, pek çok yenilemeyen ve zehirli mantar türlerinin de önemli tıbbi özellikleri olduğu saptanmıģtır (Doğan, 2001). Ġngiliz arkeoloji kayıtlarına göre puf mantarı ile kav mantarının yaklaģık 2000 yıl önce kanamaları durdurmak amacı ile kullanıldığı anlaģılmaktadır. Kültür koģullarında mantar üretme olanaklarının geliģmesi ile birlikte mantarların çeģitli hastalıklara karģı kullanımının da yaygınlaģtığı gözlenmektedir. Mantarlar doğu kültüründe uzun yıllardır çay ve besleyici gıda olarak kullanılmaktadır (Manzi ve ark., 1999). Tatlı ve besleyici bir gıda olarak değerlendirilen birçok yabani mantar türü, dünya genelinde farklı milletler tarafından düzenli olarak toplanmaktadır. Sonra direkt olarak ana besin kaynağı olarak kullanılmakta ya da yemeğe katılmaktadır. Örneğin eģsiz özelliklerinden dolayı tıbbi mantar olan Çin tırtıl mantarı Çin tıbbında neredeyse altın değerindedir. Antik Romalılara göre; mantarlar tanrıların yiyecekleriydi. Mısırlılar mantarları tanrı Osiris ten bir hediye olarak nitelendirirken, Çinliler de mantarları hayatın iksiri olarak düģünmüģlerdir. Ġlk kavimler, deneme yanılma yoluyla yenilebilen ve yenilemeyen zehirli mantarlar hakkında bilgi sahibi olmuģlardır (Smith ve ark., 2002). Mantarlar esansiyel tüm amino asitleri içerir ancak metiyonin, sistin ve sülfür amino asitleri az miktarda bulundurmaktadır. Ġçeriklerine bakıldığında mantarlar büyük oranda fosfor ve potasyum, az miktarda demir ve kalsiyum dahil, var olan tüm mineralleri geliģimlerinin tüm basamaklarında bulundururlar. Mantarlar özellikle tiyamin, riboflavin, niyasin, biyotin ve askorbik asit gibi vitaminlerin kaynağıdırlar. Mantarlar potasyum, fosfor, kalsiyum, demir ve bakır yönünden de oldukça zengindir. Ayrıca bazı türler de β-karoten ve ergosterol içermektedir (bunlar ultraviyole ıģınlarına maruz kaldıklarında aktif D vitaminine dönüģürler). Mantarlardaki ham yağlar, yağ asitleri mono-, di- ve tri- gliserid ler, steroller, sterol esterleri ve fosfolipidler dahil tüm ana lipid bileģenlerini içerir. Yağ seviyeleri genelde düģük olup kuru mantarın yaklaģık % 2 8 ini oluģturur. Hiç Ģüphesiz yenen mantarların tazeyken ve iģlendikten sonraki halleri birçok insan için, özellikle de vejetaryenler için önemli bir besin kaynağıdır. Buna bağlı olarak lezzeti bakımından komplementer olan ticari mantarlar ayrıntılı olarak çalıģılmaktadır (Smith ve ark., 2002).

11 2 Sebzeler ve meyveler, fonksiyonel maddelerin iyi bir kaynağı olarak düģünülmektedir. Birçok çalıģma, bu fonksiyonellikten sorumlu bileģiklerin, mantarda yüksek miktarda bulunan antioksidanlar olduğunu göstermektedir. Antioksidanlar ya da radikal süpürme kapasitesi olan moleküller, serbest radikal hasarlarına karģı potansiyel koruyucu etkisi olduğu bilinen maddelerdir. Bu biyomoleküller, koroner damar hastalıkları ve oksidatif reaksiyonların önlenmesi ile tümör oluģumunun önlenmesini sağlamaktadır. Bu oksidatif hasar serbest radikal hareketlerinin bir sonucudur (Ramírez- Anguiano ve ark., 2007). Çin de Yakuzen ifadesi tıbbi mantarlar için kullanılmaktadır. Doğuda birkaç bin yıl önce yenen ve yenilmeyen bazı mantarların sağlığa faydalı olabilecekleri biliniyordu. Tıbbi mantarlar normalde daha çok pudra haline getirilmiģ konsantreler olarak veya sıcak su ekstraktları yapılarak tedavide kullanılmaktadır. Sıvı konsantreler veya kurutulup pudra haline getirilmiģ mantarları içeren kapsüller, ek besin olarak kullanılmaktadır. Ayrıca sağlığa potansiyel katkıları da vardır. Sıvı konsantrasyon halinde veya kuru toz haline getirilmiģ mantar ekstraktlı kapsüllerin, diyet maddesi veya sağlıklı yaģamı destekleyecek besin maddesi olarak rahatlıkla kullanılabileceği belirtilmiģtir (Smith ve ark., 2002). Nütrasötikal medikal olarak hastalıklardan korumak ya da iyileģtirmek gibi sağlığa yararlı özellikleri olan, yiyecek ya da yiyeceğin parçası olarak değerlendirilebilen bir madde olarak tanımlanmaktadır. Diyet ve besinlerden izole edilerek elde edilen nütrasötikaller; genetik mühendisliğin tasarladığı yiyecekler, bitkisel ürünler ve hububat, çorba ve içecekler gibi geliģtirilmekte olan ürünleri oluģturmaktadır. Yenilebilir nütrasötikallerin bazı örnekleri diyet lifi, çoklu doymamıģ yağ asitleri, proteinler, yağlar, amino asitler, ketoasitler, mineraller, oksidatif mineraller ve antioksidanlardır. Epidemiyolojik çalıģmalar gösteriyor ki meyve ve sebzeler ile kardiyovasküler hastalık ve kanserin tüm formları arasında ters orantılı bir iliģki vardır. Terapötik alternatiflerin araģtırılmasında farklı mantar türleriyle bilimsel olarak çalıģılmıģ ve sonuçlar onların biyoaktif özellikleri olduğunu kanıtlamıģtır. Mantarlar; antioksidan, antitümör ve antimikrobiyal özelliklerinden sorumlu olan nütrasötikallerin zengin bir kaynağıdır (Barros ve ark., 2008). Mantarların tıbbi özellikleri arasında; antimikrobiyal aktiviteleri, antioksidan kapasiteleri, hepatoprotektif etkileri (karaciğer koruyucu etkileri), antidiyabetik etkileri, bağıģıklık sistemini düzenleyici özelliği, antitümör etkileri, kolesterol düģürücü özelliği, Ģeker düģürücü özelliği vardır.

12 3 Yeni tedavi yöntemleri üzerine çalıģan bilimsel kuruluģlar, çalıģmalarında çok sayıda çeģitli mantarlar da kullanmıģ ve bu mantarlarda antikanserojenik, antiiltihap, bağıģıklık sistemini destekleyici ve antibiyotik etkileri gibi çeģitli terapik etkileri keģfetmiģlerdir. Son zamanlarda bazı ticari mantarların antitümör, antiviral ve immuno düzenleyici gibi birkaç tedavi edici tıbbi aktivitesi daha bulunmuģtur (Türkoğlu ve ark., 2006). Hatta son zamanlarda niasin den zengin olan mantar türlerinin alzheimer ve yaģa bağlı biliģsel becerilerin azalmasını önlediği ve güçlü bir antioksidan olduğu kanıtlanmıģ ve yine çinkodan zengin olan mantarların bağıģıklık sistemini güçlendirdiği, yaraları iyileģtirdiği ve sağlıklı hücre bölünmesi gibi etkilerinin olduğu vurgulanmaktadır. Son zamanlarda Grifola frondosa ve Hericium erinaceus un da içinde bulunduğu özel mantarların antitümör, immuno düzenleyici ve kronik bronģit gibi hastalıklar üzerine tedavi edici etkisi gibi tıbbi aktiviteleri bulunmuģtur (Mau ve ark., 2002). Mantarların hipertansiyon, hiperkolesterol ve kanser gibi hastalıklara karģı koruyucu bir besin olarak kullanıldıkları bildirilmiģtir. Bu karakteristik fonksiyonların temel nedeni kimyasal kompozisyonlarıdır (Manzi ve ark., 2001). S. commune den izole edilen polisakkarit bilesiklerin P. aeruginosa, S. aureus, E. coli, K. pneumoniae, S.thyphimurium ve M. luteus enfeksiyonlarına karģı koruyucu ve antimikrobiyal etki gösterdikleri belirtilmiģtir. Klinik çalıģmalarda ve xenograph larda ciddi bir antikanser etki gösteren bir polisakkarit olan schizo-phyllan ın kaynağı olan Schizophyllum commune, farmakolojik açıdan son derece önemlidir (Demirhan ve ark., 2007). UV-C radyasyon uygulaması birçok meyve ve sebzenin yüzeyindeki mikroorganizmaları inaktif hale getirerek muhafaza etmede kullanılan bir yöntemdir. Narenciye, domates, elma, Ģeftali gibi sebze ve meyvelerin depolanmasından önce UV- C kullanılması, fitolaksin birikimine neden olmakta ve bu değiģim gıdaların dokularında dayanıklılığı arttırarak antioksidan etkisi göstermektedir. Lentinula edodes de UV-C ıģığına maruz bırakılarak mantarın toplam fenolik, toplam flavonoidleri, askorbik asit ve H 2 O 2 içeriği, süperoksit anyonu(o2 ) ve katalaz (CAT), süperoksit dismutaz (SOD), askorbat peroksidaz (APX) ve glutatyon redüktaz (GR) enzim aktiviteleri ölçülmüģ ve artan konsantrasyona bağlı olarak arttığını ve oldukça yüksek aktiviteye sahip olduğunu gözlemlemiģlerdir (Jiang ve ark., 2010).

13 4 2. KAYNAK ARAġTIRMASI Mantarların tıbbi özellikleri ile ilgili çalıģmalar antik çağlara kadar uzanır. Fakat mantarların antioksidan aktivitesine ıģık tutan Breene (1990) nin çalıģmasıdır. Breene (1990), bazı mantarların (Agaricus bisporus, Lentinula edodes, Volvariella volvacea, Pleurotus sp., Flammulina velutipes, Ganoderma sp.) besin değeri ve tıbbi özelliklerini belirlemiģtir. Bu mantarların protein kaynaklı olduğunu ayrıca B vitamini, C vitamini ve mineraller içerdiğini belirlemiģtir. Lipit seviyelerini düģük, fakat doymuģ ve doymamıģ yağ asit oranlarını yüksek bulmuģtur. Klinik çalıģmalar sonucu Lentinula edodes, Flammulina velutipes, Pleurotus sp. ve özellikle Ganoderma sp. kanser tedavisinde, viral hastalıklarda (grip, çocuk felci) ve hipertansiyonda bir numara tedavi özelliği göstermiģlerdir. Mantarların antoksidan aktivitesiyle ilgili esas çalıģmalar ise Liu ve ark. (1997) ile baģlamıģ ve günümüze kadar geliģme göstermiģtir. Liu ve ark. (1997), mantarlardan elde edilen bazı polisakkarid ekstraktlarının serbest radikalleri süpürme kapasitesini belirlemiģlerdir. Süperoksit ve hidrooksil radikal süpürme aktiviteleri sırasıyla NADH-nitroblue tetrazoliom sistemi ve askorbik asit -Cu 2+ -sitokrom C sistemi kullanarak araģtırmıģlardır. Mantarların polisakkarit ekstraktlarının serbest radikalleri süpürme etkisini belirlemiģler ve bu sonucun gözlenmesinde polisakkarit ekstraktlarının protein içeriğinin doğrudan etkisi olduğunu belirtmiģlerdir. Wasser ve Weis (1999), tıbbi özellikleri yönünden güçlü olan Basidiomycetes ler (Lentinus edodes, Ganoderma lucidum, Schizophyllum commune, Trametes versicolor, Inonotus obliquus ve Flammulina velutipes) hakkında bir derleme yayınlamıģ ve türlerin antikanserojen ve antioksidan özelliklerinin oldukça etkili olduğunu belirlemiģlerdir. Huang (2000), Antrodia camphorata ve Agaricus blazei nin antioksidan özelliklerini ve polisakkarid bileģikleri içeriğini belirlemiģtir. A. camphorata nın, A. blazei den daha fazla indirgeme kapasitesine sahip olduğunu gözlemiģtir. Smith ve ark. (2002), mantarların antikanserojenik özellikleri baģta olmak üzere birçok tıbbi özellikleri hakkında Ġngiltere Kanser AraĢtırma Kurumu adına bir derleme hazırlamıģlardır. Yang ve ark. (2002), bazı ticari mantarların antioksidan kapasitelerini tespit etmiģlerdir. DPPH analizinde Shimada ve ark. (1992) metodunun kullanıldığı çalıģmada ticari mantarların (Flammulina velutipes, Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus,

14 5 Pleurotus cystidious) metanolik ekstraktlarının DPPH süpürme gücü artan konsantrasyona bağlı olarak artmıģtır. Oyaizu (1986) metoduna göre yapılan bir diğer çalıģmada ticari mantarların metanolik ekstraktlarının indirgeme gücü mükemmel sonuçlar vermiģ ve artan konsantrasyona bağlı olarak artmıģtır. En yüksek indirgeme kapasitesine sahip olan mantarlar ise P. ostreatus ve P. cystidiosus tur. Nukata ve ark. (2002), Albatrellus ovinus un neogrifolin türevlerine sahip antioksidan aktivitesini belirlemiģlerdir. Japon mantarı olan Albatrellus ovinus un grifolin ve neogrifolin ile beraber üç neogrifolin türevleri (3 hydroxyneogrifolin, 1 formylneogrifolin ve 1 formyl 3 hydroxyneogrifolin) izole etmiģlerdir. 3 hydroxyneogrifolin ve 1 formyl 3 hydroxy neogrifolin in spektroskopik analizleri sentetik antioksidanlardan (α tokoferol ve BHA) daha güçlü etki göstermiģtir. Mau ve ark. (2002), birkaç özel mantarın (Dictyophora indusiata, Grifola frondosa, Hericium erinaceus ve Tricholoma giganteum) antioksidan aktivitelerini belirlemiģlerdir. DPPH analizi için Shimada ve ark. (1992) metodunun kullanıldığı çalıģmada mantarların metanolik ekstraktlarının DPPH süpürme gücü artan konsantrasyona bağlı olarak artmıģtır. D. indusiata nın metanolik ekstraktının süpürme gücü, diğer mantarların DPPH radikalini süpürme etkisine göre yüksek bir etki göstermiģtir. Ġndirgeme gücü Oyaizu (1986) metodunda ise D. indusiata nın metanolik ekstraktı çok iyi bir indirgeme gücü göstermiģtir. Ajith ve Janardhanan (2002), Phellinus rimosus un antioksidan ve antihepatotoksik faaliyetlerini araģtırmıģlardır. Etil asetat ekstraksiyonuyla süperoksit anyon süpürme etkisi, Fe² askorbat içeren lipid peroksidasyon inhibisyonu, hidroksil radikal süpürme etkisi ve nitrik oksit süpürme aktivitesi belirlenmiģtir. İnvitro ortamdaki P. rimosus, önemli antioksidan aktivite göstermiģtir. Ayrıca etil asetat ekstraksiyonu Ģiddetli toksisiteyle uyarılmıģ fare karaciğerinde karbotetraklorüre karģı güçlü antihepatotoksik aktivite göstermiģtir. Cheung ve ark. (2003), bazı yenebilen mantarların antioksidan kapasitelerini ve toplam fenolik bileģik içeriklerini tespit etmiģlerdir. Lentinus edodes ve Volvariella volvacea nin metanol ve saf su ekstraktları ile yapılan antioksidan aktiviteleri (βkaroten, linoleik asit DPPH radikal süpürme etkisi yöntemiyle) ve peroksil radikaller tarafından indüklenen sıçan eritrositlerinin hemoliz inhibisyonunu incelemiģlerdir. DPPH radikal süpürme etkisini en fazla Lentinus edodes in su ekstraktlarında gözlemiģlerdir.

15 6 Badalyan (2003), yenebilen ve tıbbi Basidiomycetes mantarlarının doğal birer antioksidan kaynağı olduğunu belirlemiģtir. Basidiomycetes sınıfından antioksidan aktivite bakımından yüksek olan 14 mantar kültürünü (Coprinus comatus, C. disseminatus, C. micaceus, Hypholoma fasciculare, Lentinus edodes, Lepista personata, Marasmius oreades, Pholiota alnicola, Pleurotus ostreatus, Stropharia coronilla, Suillus luteus, Schizophyllum commune, Trametes versicolor, Volvariella bombycina) incelemiģtir. Serbest radikal süpürme etkisi en fazla Pholiota alnicola, Lepista personata, Trametes versicolor, Volvariella bombycina, Schizophyllum commune, Suillus luteus ve Lentinus edodes te gözlemiģtir. Mau ve ark. (2004), Grifola frondosa, Morchella esculenta ve Termitomyces albuminosus misellerinin antioksidan kapasitelerini belirlemiģlerdir. Yapılan çalıģmada, Morchella esculenta nın DPPH radikalini süpürme etkisi diğer mantarlara göre yüksek bir etki göstermiģtir. Oyaziu (1986) metoduna göre Morchella esculenta misellerinin metanolik ekstraktlarının indirgeme gücü, artan konsantrasyona bağlı olarak artarken diğer mantarların miselleri, kayda değer bir etki göstermemiģtir. Cui ve ark. (2005), Inonotus obliquus un antioksidan etkilerini araģtırmıģlardır. DPPH analizi, Mc Cune ve Jhons (2002) metoduna göre yapılan çalıģmada Inonotus obliquus un polifenol etanolik ekstraktı DPPH radikalleri üzerine yüksek bir süpürme etkisi göstermiģtir. Zhan ve ark. (2006), Cordyceps militaris in antioksidan kapasitesini araģtırmıģlardır. Cordyceps militaris in DPPH radikalini süpürme etkisi Blois (1958) metoduna göre tespit edilmiģ, süpürme etkisi artan konsantrasyona bağlı olarak artmıģ ve aynı konsantrasyonda askorbik asitten yüksek bulunmuģtur. Cordyceps militaris in indirgeme gücü Yen ve Chen (1995) metoduna göre tespit edilmiģ ve mantarın metanolik ekstraktının artan konsantrasyonuna bağlı olarak arttığı gözlenmiģtir. ElmastaĢ ve ark. (2007), doğadan toplanıp tüketilen bazı mantarların (Agaricus bisporus, Polyporus squamosus, Pleurotus ostreatus, Lepista nuda, Russula delica, Boletus badius ve Verpa conica ) antioksidan özelliklerini ve içerdikleri antioksidan bileģiklerini belirlemiģlerdir. Bu mantarların antioksidan aktiviteleri standart antioksidanlar olan BHA, BHT ve α tokoferol ile karģılaģtırılmıģtır. Oyaizu (1986) metoduna göre yapılan çalıģmada Russula delica ve Verpa conica nın çok güçlü indirgeme gücüne sahip oldukları tespit edilmiģtir. DPPH radikallerini süpürme etkisi Blois (2002) metoduna göre belirlenmiģ ve mantarların tümünün DPPH radikallerini süpürme etkisi yüksek bulunmuģtur.

16 7 Ferreira ve ark. (2007), Portekiz in kuzeydoğusunda tüketilen iki yabani mantarın (Lactarius deliciosus ve Tricholoma portentosum) antioksidan kapasitelerini belirlemiģlerdir. Fenolik madde içeriği en yüksek L.deliciosus ta gözlenmiģtir. Barros ve ark. (2007), Portekiz de doğadan toplanıp tüketilen 3 mantarın (Leucopaxillus giganteus, Sarcodon imbricatus ve Agaricus arvensis) antioksidan kapasitelerini ve içerdikleri antioksidan bileģiklerini belirlemiģlerdir. Fenolik madde içeriği en yüksek Leucopaxillus giganteus ta gözlenmiģtir. Tsai ve ark. (2007), Agaricus blazei, Agrocybe cylindracea ve Boletus edulis in antioksidan aktivitelerini belirlemiģlerdir. Bu mantarların etanolik ekstraktlarının indirgeme gücünün Oyaziu (1986) metoduna göre belirlendiği çalıģmada en yüksek indirgeme kapasitesine sahip olan mantar Boletus edulis tir. Ramírez-Anguiano ve ark. (2007), Avrupa da yaygın olarak tüketilen mantarların antioksidan aktivitesini araģtırmıģlardır. Yapılan çalıģmada Pleurotus sp., A. bisporus, M. esculenta, B. edulis in metanol ekstreleri % 90 a yakın yüksek DPPH süpürme aktivitesi göstermiģtir. Su ekstreleri de yüksek antioksidan aktivite göstermiģtir. A. bisporus, L. edodes, V. valvacea, Pleurotus sp., F. velutipes, Auricularia sp., Tremella sp. mantarları; A. aegerita ve Asya ülkelerinde yaygın olarak tüketilen diğer yenilebilir mantarlar (Dictyophora indusiata, Grifola frondosa, Hericium erinaceus, Tricholoma giganteum, Ganoderma lucidum) ın metanol ve su ekstraktları önemli antioksidan ve antitümöral aktivite ve diğer yararlı biyoaktif özellikler göstermiģlerdir. Ajith ve Janardhanan (2007), Güney Hindistan da yetiģen tıbbi mantarların (Ganoderma lucidum, Phellinus rimosus, Pleurotus florida ve Pleurotus pulmonaris) antioksidan ve antitümör aktivitelerini araģtırmıģlardır. Lee ve ark. (2008), Hypsizigus marmoreus un çeģitli ekstraktlarının antioksidan aktivitelerini tespit etmiģlerdir. DPPH radikali süpürme etkisi yüksek bulunmuģtur. Tekeli ve ark. (2008), Cantharellus cibarius un antioksidan aktivitesini belirlemiģlerdir. Toplam fenolik madde konsantrasyonu Folin-Ciocaltaeu yöntemiyle standart madde (Gallik asit) ye göre hesaplamıģlar ve yüksek fenol içeriğine sahip olduğunu gözlemlemiģlerdir. DPPH radikal süpürme etkisi de BHA ve BHT ile kıyaslanmıģ ve oldukça yüksek bir süpürme etkisi olduğunu belirlemiģlerdir. Bao ve ark. (2009), Antioksidanlar aynı zamanda doğal renk koruyucu maddeler olarak ta kullanılabildiğini tespit etmiģlerdir. Flammulina velutipes in 340 mg/l (=48 mg/kg sulu ortam) ergotiyonin ESH bulunduran kültür ortamından sıvı ekstaktı

17 8 hazırlanmıģ ve ESH in % 50 ekstrakt bileģiminin DPHH radikal süpürme etkisi 0.3 μg olarak bulunmuģtur. Sıvı ekstraktı, dondurulmuģ Seriola quinqueradiata kasına 4 gün boyunca verildikten sonra, kaslarda bozulmanın engellendiği ve balığın renginin değiģmediği tespit edilmiģtir. 0 2 C de % 1 ve % 10 luk diyet olarak kullanılan ekstraktlar, sarı kanatın siyah kaslarının kahverengiye dönüģmesini engellemiģtir. Bu çalıģmayla doğal antioksidanlardan elde edilen sıvı konsantrasyonlar düģük sıcaklıklarda balıkların depolanması ve transferi esnasında oluģabilecek renk ve kalite kaybını engelleyebildiği ortaya çıkarılmıģtır. Youguo ve ark. (2009), Ganoderma lucidum dan izole edilen polisakkaritleri, serum antioksidan aktiviteleri fare ovaryum hücreleri üzerinde polisakkaritlerin anti kanser etkilerinin ortaya çıkarılması ve mekanizmasının anlaģılması için kullanmıģlardır. G. lucidum dan elde edilen polisakkaritler önemli derecede MDA üretimini azaltmıģ ve serum antioksidan enzim aktivitesini artırmıģtır. Sonuç olarak da, G. lucidum dan elde edilen polisakkaritler ovaryum kanseri tedavisinde kullanılabileceğini tespit etmiģlerdir. Soares ve ark. (2009), Agaricus brasiliensis in genç ve olgun örnekleri ayrı ayrı metanol ekstraktlarına tabi tutarak antioksidan kapasitesini ve toplam fenolik madde tayinini incelemiģlerdir. Demir iyonları için indirgeme gücü, radikal süpürme etkisi, lipid peroksidasyon inhibisyonu ve Ģelatlama yeteneği olmak üzere dört tamamlayıcı testten geçirilmiģtir. Toplam fenolik madde tayininde küçük farklılıklar gözlense de ekstraktlar benzer antioksidan aktivitesi göstermiģtir. Ancak demir iyonları için Ģelatlama yeteneği genç safhaya göre olgun safhada daha yüksek tespit edilmiģtir. Tsai ve ark. (2009), Clitocybe maxima, Pleurotus ferulae ve Pleurotus ostreatus un tad bileģenlerini ve antioksidan aktivitelerini incelemiģlerdir. Yapılan çalıģmaya göre mantarların oldukça lezzetli bir tada sahip olduğu ayrıca sıcak su ve etanol ekstraktlarından DPPH radikali süpürme etkisinin sıcak su ektraktlarında daha etkili olduğunu gözlemlemiģlerdir. Ju ve ark. (2010), Mantar ekstraktlarının klasik yöntem yerine buhar uygulamasından sonra organik çözücülerle çözülmesiyle kullanılan ekstraktın antioksidan etkisinin arttığını belirlemiģlerdir. Yapılan çalıģmada, Inonotus obliquus un serbest fenolik asitleri üzerinde buhar uygulamasının etkisi araģtırılmıģtır. Buhar uygulanmayan ve uygulanan Inonotus obliquus un örnekleri organik solventlerle ekstrakt edilmiģ ve serbest fenolik asit taģıyan fraksiyonları izole edilmiģtir. Serbest fenolik asitler LC/PDA, ESI LC/MS ve GC/MS kullanılarak belirlenmiģtir. Buhar

18 9 uygulamasıyla vanillic acid, protocatechuic acid, syringic acid ve 2,5- dihydroxyterephthalic miktarları önemli derecede artmıģtır. DüĢük moleküler ağırlıktaki serbest radikallerin hareket kabiliyetleri buhar uygulamasıyla artmıģtır. Sonuç olarak radikal süpürme etkisini, buhar uygulamasıyla önemli derecede arttığını gözlemiģlerdir. Kalyoncu ve ark. (2010), 21 mantar miselinin (Agaricus bresadolanus, Auricularia auricula-judae, Chroogomphus rutilus, Fomes fomentarius, Ganoderma lucidum, Gloeophyllum trabeum, Gymnopus dryophilus, Infundibulicybe geotropa, Inocybe flocculosa var. crocifolia, Inocybe catalaunica, Lentinula edodes, Lentinus sajor-caju, Lycoperdon excipuliforme, Macrolepiota excoriata, Morchella esculenta var. rigida, Morchella intermedia, Omphalotus olearius, Pleurotus djamor, Postia stiptica, Rhizopogon roseolus ve Stropharia inuncta) antioksidan özelliklerini incelemiģlerdir. Antioksidan özellikleri etanol, kloroform ve su ekstraktları ile DPPH radikal süpürme etkisi ve 2,2 -azinobis radikal katyon (ABTS.+) olmak üzere 2 farklı metodla çalıģmıģlardır. Bu 21 mantar ekstraktı içerisinde en güçlü antioksidan aktiviteyi Omphalotus olearius ta gözlemiģlerdir. Fu ve ark. (2010), Polisakkaritler için Inonotus obliquus dan bir ultrasonik teknik geliģtirmiģler, geliģme üzerinde I. obliquus un DPPH radikal süpürme aktivitesini ve ultrosonik koģullarının etkisini değerlendirmiģlerdir. Deferansiyel kalorimetre taraması ile fizikokimyasal özelliklerini analiz etmiģlerdir. Sonuçta DPPH radikal süpürme aktivitesi üzerinde ultrasonik koģullarının etkisi bariz bir Ģekilde gözlenmiģtir. Singla ve ark., (2010), A. bisporus un toplam fenolik ve serbest radikal süpürme etkisini, ozmotik dehidrasyon ve iģlenmemiģ çiğ baharatlı aperatif yiyeceği olarak çalıģmıģlardır. Agaricus bisporus un % 5 tuz çözeltisi ve baharatın uygun bir kombinasyonun karıģımının vakumlanmasıyla elde edilen mantar aparatiflerini ozmotik dehidrasyonla laboratuarda hazırlamıģlardır. Çiğ ve kuru aperatif mantarların DPPH süpürme etkilerini sırasıyla % 76 ve % 72 bulmuģlardır. Sonuçta kuru ve çiğ mantarların antioksidan etkileri arasında önemli derecede bir değiģiklik olmadığı gözlenmiģ ancak ozmotik dehidrasyonla hazırlanan kuru materyalde toplam flavonoid seviyesinin belirgin bir Ģekilde yükseldiği tespit edilmiģtir. Mantarların antimikrobiyal aktiviteleriyle ilgili dikkat çeken ilk çalıģma Rougieux (1963) ün yaptığı araģtırmadır. Rougieux (1963), Terfezia boudieri den hazırlanan çeģitli ekstrelerin gözde kornea ve göz içi enfeksiyonlarından sorumlu Staphylococcus aureus un geliģimi üzerinde engelleyici etkisi olduğunu belirlemiģtir.

19 10 Komatsu (1973), Schizophyllum commune den izole edilen schizophyllan polisakkaridinin Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae ya karģı antibakteriyal etki gösterdiğini tespit etmiģtir. Maga (1981), mantarların lezzetini sağlayan faktörler üzerine bir derleme yayınlamıģtır. Takazawa ve Kashino (1991), Basidiomycetes lerin farklı türlerinin fermantasyon sıvılarından hazırladıkları metanolik ekstraktların çeģitli bakteri türleri üzerinde antibakteriyel etkiye sahip olduğunu gözlemlemiģlerdir. Dülger ve ark. (1997), Russula delica nın antimikrobiyal aktivitesini araģtırmıģlardır. Russula delica dan etil asetat, aseton, kloroform ve etanol ekstreleri hazırlanarak disk difüzyon metoduna göre bazı bakteriler üzerinde antimikrobiyal etkileri denenmiģtir. Bulgulara göre Russula delica özellikle Corynebacterium xerosis ve Listeria monocytogenes baģta olmak üzere bazı gram (+) ve gram (-) bakterilere ve bazı mayalara (özellikle Kluyveromyces fragilis e) karģı antimikrobiyal aktivite içerdiği saptanmıģtır. Dülger ve Arslan (1998), Coriolus versicolor ın antimikrobiyal aktivitesini tespit etmiģlerdir. Coriolus versicolor dan elde edilen aseton, etilasetat, kloroform ve etanol ekstrelerinin antimikrobiyal aktiviteleri disk difüzyon metoduna göre bazı gram (+), gram (-) bakterilere ve mayalara karģı denenmiģtir. C.versicolor un çalıģmada kullanılan bazı gram (+) ve gram (-) bakterilere karģı çeģitli dereclerde antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu, buna karģılık maya kütürlerine karģı hiç bir antagonistik aktiviteye sahip olmadığı saptanmıģtır. Hirasawa ve ark. (1999), antimikrobiyal aktivite için Lentinus edodes ten üç çözgen (kloroform, etilasetat ve su ekstraktları) yardımıyla ekstraksiyon yapmıģlardır. Lentinus edodes ten ekstraksiyonla elde edilen ekstrakların ağız orijinli Streptococcus, Actinomyces, Lactobacillus, Prevotella ve Porphyromonas cinslerine karģı etkili olduklarını tespit etmiģlerdir. Dülger ve ark. (1999), Tricholoma terreum un antimikrobiyal etkisini araģtırmıģlardır. Tricholoma terreum dan hazırlanan tüm ekstraktların Pseudomonas putida, Aeromonas hydrophila, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium lerosis, Bordatella brochiseptica, Pseudomonas extorquens ve Kanthomonas campestris bakteri kültürlerine karģı, aseton ve kloroform ekstraktı; Serratia marcescens e karģı kloroform ve etanol ekstraktı; Bacillus brevis e karģı kloroform, etil asetat ve etanol ekstraktı ve

20 11 Bacillus sphaericus a karģı aseton ve etanol ekstraktının yüksek antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğunu belirlemiģlerdir. Mothana ve ark. (2000), Ganoderma pfeifferi den iki yeni antimikrobiyal madde olan Ganomisin A ve B elde etmiģler ve yapılarını spektrofotometrik metodla ortaya çıkarmıģlardır. Her iki karboksilik asitin de bazı gram (+) ve gram (-) bakterilere karģı etkili olduklarını tesbit etmiģlerdir. Hatvani (2001), Lentinus edodes in misel ekstraktlarının bazı gram (+) ve gram (-) bakterilere ve maya (Candida albicans) ya karģı antimikrobiyal aktivitesini araģtırmıģtır. Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus ve Bacillus megaterium a karģı antibakteriyel etkisi olduğunu gözlemlemiģtir. Die z ve Alvarez (2001), Ġspanya da tüketilen iki yabani mantarın (Tricholoma portentosum ve Tricholoma terreum) bileģimlerini ve besin değerlerini tespit etmiģlerdir. Her iki mantarın diyet lif içeriği kuru ağırlığının yaklaģık % 45 ini, protein içeriklerinin ise kuru ağırlığının yaklaģık % 16 sını oluģturduğunu belirlemiģlerdir. Mantarların temel amino asitleri, toplam amino asitlerin Tricholoma portentosum da % 61,8, Tricholoma terreum da % 63,3 ünü oluģturduğunu tespit etmiģlerdir. Yağ asiti sentezinde her ikisinde de en fazla linoleik ve oleik asitler olduğunu saptamıģlardır. Dülger ve ark. (2002), Lactarius türlerinden Lactarius deterrimus, Lactarius sanguifluus, Lactarius semisanguifluus, Lactarius piperatus, Lactarius deliciosus ve Lactarius salmonicolor un disk difüzyon metoduna göre antimikrobiyal aktivitelerini araģtırmıģlardır. Lactarius türleri en çok Escherichia coli, Proteus vulgaris ve Mycobacterium smegmatis e karģı antimikrobiyal aktivite göstermiģlerdir. Lactarius deliciosus test mikroorganizmalarına karģı en etkili mantar olmuģtur. Duman ve ark. (2003), Morchella conica ve Suillus luteus un antimikrobiyal aktivitelerini araģtırmıģlardır. Morchella conica ve Suillus luteus un etanolik ekstraktları test mikroorganizmalarına karģı önemli bir antimikrobiyal aktivite göstermemiģtir. Sheena ve ark. (2003), Phellinus rimosus, Ganoderma lucidum ve Navesporus floccosa nın metanol ekstreleri çukur difüzyon ve mikrodilüsyon metodu ile Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium ve Bacillus subtilis e karģı antibakteriyel aktivitelerini araģtırmıģlardır. G. lucidum, E. coli, S. typhimurium ve B. subtilis e karģı iyi bir antibakteriyel aktivite göstermiģtir. Jonathan ve Fasidi (2003), Lycoperdon pusilum ve Lycoperdon giganteum un antimikrobiyal aktivitesini agar disk difüzyon metodu ve çukur difüzyon metodu ile

21 12 belirlemiģlerdir. Lycoperdon pusilum ve Lycoperdon giganteum un metanolik, etanolik ve sulu ekstraktları, bazı gram (+) ve gram (-) bakteriler ile mayalara karģı denendiği çalıģmada, etanolün bu mantarların antimikrobiyal aktivitelerinin belirlenmesinde daha iyi sonuçlar verdiği ortaya çıkmıģtır. En geniģ inhibisyon zonu disk difüzyon metodunda görülmüģ ve bu zonu L. pusilum un etanolik ekstraktı E. coli bakterisine karģı verirken, aynı mantarın metanolik ve etanolik ekstraktları daha düģük sonuçlar vermiģtir. En iyi antifungal aktiviteyi L. giganteum un etanolik ekstraktı M. boulardii ye karģı vermiģtir. Mothana ve ark. (2003), Ganoderma pfeifferi ve diğer Ganoderma türlerinden izole edilen triterpenlerin antiviral aktivitelerini belirlemiģlerdir. Bu bileģikler influenza tip A ve HSV tip1 e karģı antiviral aktivite göstermiģtir. Hur ve ark. (2004), Phellinus linteus un methisillin antibiyotiğine dirençli Staphylococcus aureus bakterisi üzerine etkisini araģtırmıģlardır. Phellinus linteus un bütanol fraksiyonu Staphylococcus aureus un methisillin dirençli tüm suģlarına karģı iyi bir antimikrobiyal aktivite göstermiģtir. Dülger ve ark. (2004), Cantharellus cibarius un disk difüzyon yöntemi ile etil asetat, aseton, kloroform ve etanol ekstraktları bazı gram pozitif ve gram negatif bakterilere ve mayaya karģı antmikrobiyal aktivitesini araģtırmıģlardır. Cantharellus cibarius bazı gram (+) ve gram (-) bakterilere karģı antimikrobiyal etki göstermiģtir. Gao ve ark. (2005), tıbbi bir mantar olan Ganoderma sp. türlerinin antimikrobiyal etkileri üzerine bir derleme hazırlamıģlardır. Ganoderma applanatum dan izole edilen birkaç triterponoid Bacillus cereus, Corynebacterium diphtheriae, Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus ve Streptococcus pyogenes gibi bazı gram (+) ve gram (-) bakterilere karģı inhibitör etki göstermiģtir. Yamaç ve Bilgili (2006), bazı mantarlardan elde edilen izolatların antimikrobiyal aktivitesini araģtırmıģlardır. Hygrophorus agathosmus un disk difüzyon metoduna göre yapılan çalıģmada kloroform ekstraktı Enterobacter aerogenes, Salmonella typhimurium, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae ve Suillus collinitus un; diklorometan ekstraktı Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae nin de aralarında bulunduğu mikroorganizmalara karģı oldukça iyi antimikrobiyal aktivite göstermiģlerdir.

22 13 Solak ve ark. (2006), Clitocybe alexandri ve Rhizopogon roseolus un antimikrobiyal aktivitesini araģtırmıģlardır. Clitocybe alexandri ve Rhizopogon roseolus un çeģitli çözgenlerle hazırlanan ekstraktlarının agar disk difüzyon metodu ile bazı mikroorganizmalar üzerine denendiği çalıģmada her iki mantarın da metanolik ekstraktları E. coli, Bacillus subtilis ve Enterobacter aerogenes e karģı antimikrobiyal aktivite göstermiģtir. Ayrıca C. alexandri nin etilasetat ekstraktı Candida albicans ve Saccharomyces cerevisiae ye karģı etkili olduğunu gözlemlemiģlerdir. Gezer ve ark. (2006), doğadan toplanıp tüketilen bazı mantarların serbest radikalleri süpürme kapasitesini ve antimikrobiyal etkisini araģtırmıģlardır. Yapılan çalıģmada Ramaria flava nın etanolik ekstraktının IC 50 değeri yaygın olarak kullanılan sentetik antioksidanlarla karģılaģtırıldığında (BHA, α-tokoferol) oldukça önemli bir aktivite göstermiģtir. R. flava nın toplam fenolik bileģik miktarı Slinkard ve Singleton (1977) metoduna göre yapılmıģtır. R. flava nın etanolik ekstraktının toplam fenolik bileģik miktarı pirokateģol eģdeğeri çok yüksek bir değer olarak bulunmuģtur. R. flava nın antimikrobiyal etkisi agar disk difüzyon yöntemi ile belirlenmiģtir. Antimikrobiyal aktivite yedi gram (+) ve gram (-) bakteri ve bir maya üzerine denenmiģtir. Mantarın antimikrobiyal etkisinin olmadığı belirlenmiģtir. Türkoğlu ve ark. (2006), Laetiporus sulphureus un antioksidan ve antimikrobiyal aktivitelerini belirlemiģlerdir. L. sulphureus un etanolik ekstraktının toplam fenolik bileģik miktarı pirokateģol eģdeğeri çok yüksek bir değer olarak bulunmuģtur. L. sulphureus un antimikrobiyal etkisi agar disk difüzyon yöntemi ile belirlemiģlerdir. Antimikrobiyal aktivitesi yedi gram (+) ve gram (-) bakteri ve bir maya üzerine denenmiģtir. L. sulphureus gram (-) bakterilere karģı pek etkili olamazken; aralarında Bacillus subtilis, B. cereus, Micrococcus luteus ve M. flavus unda içinde bulunduğu gram (+) bakterilere karģı güçlü bir inhibisyon etki göstermiģtir. Ayrıca Candida albicans a karģı da iyi bir antimikrobiyal etki göstermiģtir. Türkoğlu ve ark. (2006), Morchella conica nın antioksidan ve antimikrobiyal aktivitelerini belirlemiģlerdir. Elde edilen verilere göre Morchella conica nın etanolik ekstraktının IC 50 değeri yaygın olarak kullanılan sentetik antioksidanlarla kıyaslandığında (BHA, α-tokoferol) oldukça önemli bir aktivite göstermiģtir. M. conica nın toplam fenolik bileģik miktarı Slinkard ve Singleton (1977) metoduna göre yapılmıģ ve M. conica nın etanolik ekstraktının toplam fenolik bileģik miktarı, pirokateģol eģdeğeri çok yüksek bir değer olarak bulunmuģtur. Antimikrobiyal etki agar disk difüzyon yöntemi ile belirlenmiģtir. Antimikrobiyal aktivite yedi gram (+) ve altı

23 14 gram (-) bakteri ve bir maya üzerine denenmiģtir. M. conica nın etanolik ekstraktına karģı en duyarlı bakteri Micrococcus flavus olmuģtur. Demirhan ve ark. (2007), Pleurotus ostreatus, Pleurotus florida, Schizophyllum commune, Helvella leucomelaena ve Amanita virosa nın etil asetat, kloroform, aseton ve etilalkol ekstrelerini disk difüzyon yöntemi ile E. coli, S. aureus ve P. aureginosa ya karģı antimikrobiyal aktivitelerini araģtırmıģlardır. En yüksek antibakteriyel aktivite; E. coli de P. florida nın kloroform çözgeninde, S. aureus da S.commune nin etil asetat çözgeninde ve P. aeruginosa da H. leucomelaena nın kloroform çözgeninde saptamıģlardır. Kitzberger ve ark. (2007), Lentinula edodes in antioksidan ve antimikrobiyal etkilerini tespit etmiģlerdir. Lentinula edodes in Mensor ve ark. (2001) metoduna göre belirlenen çalıģmada DPPH radikali süpürme etkisi oldukça iyi sonuç vermiģtir. Lentinula edodes in toplam fenolik bileģikleri Folin Denis metoduna göre belirlenmiģ ve oldukça yüksek değerler bulunmuģtur. Türkoğlu ve ark. (2007), Russula delica nın antioksidan ve antimikrobiyal etkilerini belirlemiģlerdir. R. delica nın toplam fenolik bileģik miktarı Slinkard ve Singleton (1977) metoduna göre yapılırken toplam flavonoid bileģik miktarı kuarsetin standardı esas alınarak Park ve ark. (1997) yöntemine göre yapılmıģtır. Russula delica nın etanolik ekstraktının toplam fenolik bileģik miktarı, pirokateģol eģdeğeri çok yüksek bulunmuģtur. Russula delica nın antimikrobiyal etkisi agar disk difüzyon yöntemi ile belirlenmiģtir. Antimikrobiyal aktivite yedi gram (+) ve altı gram (-) bakteri ve bir maya üzerine denenmiģtir. Russula delica gram (-) bakterilere karģı pek etkili olamazken; Micrococcus luteus ve M. flavus un da içinde bulunduğu gram (+) bakterilere karģı güçlü bir inhibisyon etkisi göstermiģtir. Iwalokun ve ark. (2007), Pleurotus ostreatus un antioksidan ve antimikrobiyal özelliklerinin karģılaģtırılmalı fitokimyasal değerlendirmesini yapmıģlardır. Petrol eter ve aseton ekstreleri agar difüzyon metodu ile Bacillus subtilis, Escherichia coli ve Saccharomyces cerevisae e karģı antimikrobiyal aktivite göstermiģtir. Ancak petrol eter ekstraktının etkinliği aseton esktraktından daha iyi sonuç vermiģtir. Petrol eteri ile karģılaģtırıldığında aseton ekstraktı, toplam fenolik içeriği ve invitro antioksidan kapasitesi daha yüksek gözlenmiģtir. Sonuçta bu mantarın antioksidan ve antimikrobiyal potansiyelinin olduğunu saptamıģlardır. Wong ve ark. (2009), Malezya da yetiģtirilen Hericium erinaceus un, antimikrobiyal ve antioksidan aktivitelerini araģtırmıģlardır. Taze mantar ile fırınlanarak

24 15 veya dondurularak kurutulan mantar misellerini karģılaģtırmıģlardır. Taze mantarın metanol ekstraksiyonun patojenik bakterilerin büyümesini inhibe ettiği ancak kurutulan mantar misellerinin etki etmediğini gözlemiģlerdir. Yine taze mantar ile kurutulmuģ mantar misellerinin antioksidan etkisi karģılaģtırılmıģ ve taze mantarın DPPH radikal süpürme etkisi oldukça yüksek gözlenmiģtir. Ancak indirgeme gücü ve β-karoten etkisi kurutulan mantar misellerinde daha yüksek tespit edilmiģtir. Buradan da anlaģılacağı üzere mantarın yetiģtirilme Ģekilleri ile biyoaktif özellikleri farklılık gösterebilir. Mantarların yağ bileģenleriyle ilgili ilk çalıģma Jacobs (1951) in yaptığı çalıģmadır. Jacobs (1951), Agaricus bisporus un lipid miktarını g / 100 g olarak bulmuģtur. Longvah ve Deosthale (1998), Kuzeydoğu Hindistan ın tüketilen yabani mantarların bileģimlerini ve besin değerlerini araģtırmıģlardır. Yapılan çalıģmada protein miktarları Lentinus edodes te % 23 ve Schizophyllum commune de % 16 gibi yüksek, yağ oranlarını ise her iki türde de % 2 olarak tespit etmiģlerdir. Aktümsek ve ark. (1998), Agaricus bisporus (Lange) Sing. un yağ asiti bileģenlerini belirlemiģlerdir. Agaricus bisporus un etli kısmı, sapı, lameli ve toplamının yağ asiti bileģimlerini ayrı ayrı gaz kromatografisinde analiz etmiģler ve tüm yağ asiti bileģenlerinde en yüksek etkiyi linoleik asitte gözlemlemiģlerdir. Yağ asiti bileģenlerinde linoleik asitten baģka en yüksek yüzdeye sahip yağ asitlerinin palmitik, oleik ve stearik asitler olduğunu belirlemiģlerdir. Yılmaz ve ark. (2006) Orta Karadeniz Bölgesi nde yetiģen bazı yenebilen yabani mantarların yağ asitleri bileģenlerini tespit etmiģler ve tüm örneklerde linoleik asitin (18:2) baskın olduğunu ve % arasında bulunduğunu bildirmiģlerdir. Barros ve ark. (2007), Portekizin kuzeydoğusunda tüketilen beģ yabani mantarın (Agaricus arvensis, Lactarius deliciosus, Leucopaxillus giganteus, Sarcodon imbricatus, Tricholoma portentosum) yağ asiti içerikleri, Ģeker bileģenleri ve besin değerlerini araģtırmıģlardır. Çoklu doymamıģ yağ asitleri (PUFA) Agaricus arvensis ve Leucopaxillus giganteus un ana bileģenlerini oluģtururken; Lactarius deliciosus, Leucopaxillus giganteus, Sarcodon imbricatus ve Tricholoma portentosum un ana bileģenlerini tekli doymamıģ yağ asitleri oluģturmuģtur. Uslu (2007), master tezinde Tricholoma anatolicum ve Cantharellus cibarius un antioksidan kapasitesini, antimikrobiyal etkilerini ve yağ asiti kompozisyonunu belirlemiģtir. DPPH radikallerini süpürme etkisi 250 µg/ml de C. cibarius da % 91 ve

25 16 T. anatolicum da % 90 olarak bulmuģtur. C. cibarius un indirgeme gücü 0,4 mg/ml de 0,5 ten daha yüksek bir absorbans vererek mükemmel bir antioksidan aktivite gösterdiğini gözlemlemiģtir. C. cibarius ve T. anatolicum un hekzan, aseton, kloroform ve metanolik ekstraktları altı gram (+) ve dört gram (-) bakteri ve mayaya karģı antimikrobiyal aktivitesini araģtırmıģtır. Mantarların yeterli antimikrobiyal etkisinin olmadığını tespit etmiģtir. Cantharellus cibarius ve Tricholoma anatolicum un yağ asiti kompozisyonlarını gaz kromatografi metoduyla incelemiģ ve T. anatolicum un yağında en fazla linoleik asit, C. cibarius un yağında ise en fazla oleik asit olduğunu tespit etmiģtir. Kavishree ve ark. (2008), Hindistan daki mantarların (23 tür) yağ ve yağ asiti bileģenlerini tespit etmiģlerdir. Bu mantarların toplam yağ seviyeleri düģük olmakla birlikte doymamıģ yağ asitlerini doymuģ yağ asitlerinden daha yüksek gözlemlemiģlerdir. Çoklu doymamıģ yağ asitlerinden linoleik asitin en fazla Hydnum repandum ve Macrolepiota procera da olduğunu belirlemiģlerdir. Pedneault ve ark. (2008), Kanada da doğal ortamda yetiģen Agaricaceae, Amanitaceae, Boletaceae, Coprinaceae, Ganodermataceae ve Lycoperdaceae familyalarına ait 10 mantar türünün nötr ve polar yağ içeriğini analiz etmiģlerdir. Her iki yağ içeriğinde de doymamıģ yağ asitleri yüksek oranlarda gözlenmiģ ve linoleik, oleik ve palmitik asit her iki içerikte de tesbit edilmiģtir. Cis-11-heptadesenoik asit (17:1 Δ 11 c) Basidiomycetes lerde, elaidik asit (18:1 Δ 9 t) ise mantarlarda ilk defa rapor edilmiģtir. Aydın (2009), master tezinde T. boudieri ile L. vellereus un antioksidan kapasiteleri, antimikrobiyal aktiviteleri ve yağ asidi kompozisyonunu belirlemiģtir. Fenolik madde miktarı T. boudieri de 0,21 ± 0.10 mg ml -1 ve L.vellereus da 0,17 mg ml -1 (Gallik asit eģdeğeri) olarak bulmuģtur. DPPH radikallerini süpürme etkisi 5,00 mg/ml de T. boudieri de % 89 ve L. vellereus da % 88 olarak bulmuģtur. T. boudieri ile L. vellereus un kloroform, aseton ve metanolik ekstraktları 4 Gram pozitif, 5 Gram negatif bakteriye ve 1 mayaya karģı antimikrobiyal aktiviteleri mikrodilüsyon yöntemi ile belirlemiģtir. L. vellereus un maserasyondan elde edilen metanol ekstraktı bakterilere karģı en yüksek antimikrobiyal aktiviteyi göstermiģ, tüm ekstraktlar içerisinde en düģük antimikrobiyal aktiviteyi ise T. boudieri nin soksletten elde edilen kloroform ekstraktı göstermiģtir. T. boudieri ve L. vellereus un yağ asidi kompozisyonları gaz kromatografi metoduyla incelemiģ, her iki mantar türünde de en fazla linoleik asit olduğunu tespit etmiģtir.

26 17 Ribeiro ve ark. (2009), oniki yenilebilir yabani mantar türleri (Suillus bellini, Suillus luteus, Suillus granulatus, Hygrophorus agathosmus, Amanita rubescens, Russula cyanoxantha, Boletus edulis, Tricholoma equestre, Fistulina hepatica, Cantharellus cibarius, Amanita caesarea ve Hydnum rufescens) nin yağ asiti kompozisyonunu belirlemiģlerdir. Bu mantar türlerinde toplam 30 farklı yağ asiti belirlenmiģ ve genel olarak linoleik, palmitik, oleik ve stearik asitleri en yüksek olarak bulunmuģtur. A. caesarea ve H. rufescens in yağ asit profillerini ise ilk kez açıklamıģlardır.

27 18 3. GENEL BĠLGĠLER 3.1. Reaktif oksijen türleri Oksijen, insan vücudu metabolizmasında süperoksit, singlet oksijen, hidroksil vb. reaktif oksijen türleri (ROS) oluģturmaktadır (Wagner ve ark., 1992). ROS, oksijen metabolizması sırasında az miktarda oluģan süperoksit radikali (O 2 - ), hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ve hidroksil radikali (OH ) dir. ROS un biyolojik sistemlerde yararlı ve zararlı etkileri olmak üzere iki rolü bulunmaktadır (Valko ve ark., 2004). Yararlı etkileri arasında hücresel cevaplar gibi fizyolojik rolleri vardır. Çoğunlukla ROS, düģük konsantrasyonlarda mitojenik özelliğin uyarılması gibi yararlı etkiler gösterirken yüksek düzeylerde nükleik asit, protein ve lipidleri içeren hücresel yapıların bozulmasında önemli aracıları oluģturur (Poli ve ark., 2004). Reaktif oksijen birikimi organizmada bulunan veya gıdalarla alınan antioksidanlarla dengelenmediği durumlarda oluģan oksidatif stres nedeniyle kanser, koroner kalp rahatsızlığı, hücresel yıpranma ve yaģlanma, mutajenizm, bağıģıklık sistemi hastalıkları ve lipoprotein (LDL) oksidasyonu ile son bulan, DNA ve hücre membranları gibi duyarlı biyolojik yapıların oksidatif zararını meydana getiren radikalik zincir reaksiyonları oluģmaktadır (Halliwell ve Aruoma, 1991). Reaktif oksijen türleri: 1 - Radikaller: Süperoksit radikal (O 2 - ) Alkoksil radikal (LO - ) Peroksil radikal (LOO - ) 2 - Radikal olmayanlar: Hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) Lipid hidroperoksit (LOOH) Hipoklorik asit (HOCI) 3 - Singlet oksijen Ģeklinde sınıflandırılır (Çavdar ve ark., 1997). McCord (1993), hidrojen peroksit membranlardan kolaylıkla geçip hücreler üzerinde bazı fizyolojik rollere sahip olabilmektedir, fakat çiftlenmemiģ elektrona sahip olmadığından radikal olarak adlandırılamaz. Bu nedenle "reaktif oksijen türleri", süperoksit gibi radikaller, ayrıca hidrojen peroksit gibi radikal olmayanlar için ortak olarak kullanılan bir terimdir (Çavdar ve ark.,1997). Oksijen molekülü, orbitalinde çiftlenmemiģ elektron taģıyorsa süperoksit radikali olarak adlandırılır (Halliwell, 1991). Diğer ROS grubunda ise normal oksijenden çok daha hızlı bir biyolojik molekül olan "singlet oksijen" bulunmaktadır. Singlet oksijen molekülü yapısında iki çiftlenmemiģ elektron taģır. Singlet oksijen, hücre membranındaki poliansatüre (çoklu doymamıģ) yağ asitleriyle doğrudan reaksiyona girerek lipid peroksitlerin oluģumuna yol açar.

28 19 I - Normal biyolojik iģlemler 1 - Oksijenli solunum 2 - Katabolik ve anabolik iģlemler II - Oksidatif stres yapıcı durumlar 1 - Ġskemi - hemoraji - travma - radyoaktivite - intoksikasyon 2 - Ksenobiotik maddelerin etkisi a-) Ġnhale edilenler b-) AlıĢkanlık yapan maddeler c-) Ġlaçlar 3 - Oksidan enzimler a-) Ksantin oksidaz b-) Ġndolamin dioksigenaz c-) Triptofan dioksigenaz d-) Galaktoz oksidaz e-) Siklooksigenaz f-) Lipooksigenaz g-) Monoamino oksidaz 4 - Stres ile artan katekolaminlerin oksidasyonu 5 - Fagositik inflamasyon hücrelerinden salgılanma (nötrofil, monosit, makrofaj, eosinofıl, endotelyal hücreler) 6 - Uzun süreli metabolik hastalıklar 7 - Diğer nedenler: Sıcak Ģoku, güneģ ıģını, sigara III - YaĢlanma süreci (Çavdar ve ark., 1997). Kimyasal bileģikler iki veya daha çok elementin aralarında kimyasal bağ oluģturması ile meydana gelir. Bu bağlar negatif yüklü elektronlarla sarılır ve bu elektronların düzeni bileģiğe kararlılık sağlar. Kararlı bileģiklerin elektronları çiftlenmiģ halde bulunur. Eğer elektron çiftlenmemiģ ise molekül daha reaktif ve kararsız duruma geçer. Bir ya da daha fazla sayıda çiftlenmemiģ elektrona sahip element veya bileģiklere serbest radikaller denir. Serbest radikallerdeki çiftlenmemiģ elektronlar kararlı duruma geçmek ister ve kararlı halde bulunan bir bileģikten elektron alarak, bu bileģiği yeni bir serbest radikal haline dönüģtürür. Serbest radikallerin baģlattığı bu zincirleme reaksiyonlar dizisi, antioksidanlar tarafından durduruluncaya kadar devam eder (Gökpınar ve ark., 2006). Oksidasyon yaģayan çoğu organizmanın biyolojik sürecinde enerji üretimi için Ģarttır. Bununla birlikte kontrolsüz oksijen türevli radikallerin üretimi, kanser, eklem romatizması, siroz, damar tıkanıklığının yanı sıra yaģlanma süreciyle ilgili bozulmaları da içeren birçok hastalığın baģlangıcını tetikler. Ġnsan vücudunda dıģ kaynaklı kimyasallar ve iç kaynaklı metabolizmik süreç ya da yiyecekler belki de serbest radikalleri özellikle biyomolekülleri okside etme yeteneğine sahip olan ve sonuçta hücreleri öldüren ve böylece dokulara zarar veren ROS ları yüksek miktarda üretmektedir (ElmastaĢ ve ark., 2007). Serbest radikallerin birikimiyle DNA da

29 20 meydana gelen oksidatif bozulmanın ve proteinler ile diğer makromoleküllerin zamanla birikimi, yaģlanmaya neden olan önemli iç faktörler olarak varsayılmaktadır (Harman, 1981). Lipid epoksidaz, hidroksiperoksidaz, alkoksil ve peroksil radikalleri ve lipid peroksidasyonu gibi etmenler mutajenikliği arttırmalarının yanı sıra yiyeceklerin renginin, tadının, yapısının ve besin değerinin bozulmasında da büyük rol oynamaktadırlar (Gezer ve ark., 2006). YaĢlanmayla beraber antioksidan koruma mekanizmasında dengesizlikler meydan geldiği zaman, belki de fizyolojik fonksiyonlarda bozulmalar meydana gelerek sonuçta hastalıkları ve hızlı yaģlanmayı tetiklemektedir (ElmastaĢ ve ark., 2007). Bununla birlikte, antioksidan ilaveleri ya da antioksidan içeren besinler belki de insan vücudundaki oksidatif zararı azaltmaya yardımcı olmaktadır (Yang ve ark., 2002). Ayrıca ROS un neden olduğu hastalıklardan korunmada önemli roller oynarlar (Willcox ve ark., 2004). ROS oluģumu enflamasyon, radyasyon, yaģlanma, normalden yüksek parsiyel oksijen basıncı (po 2 ), ozon (O 3 ) ve azot dioksit (NO 2 ), kimyasal maddeler ve ilaçlar gibi bazı uyarıların etkisiyle artar. ROS un oluģumunu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için birçok savunma mekanizmaları vardır. Bu mekanizmalar antioksidan savunma sistemleri veya kısaca antioksidanlar olarak bilinirler Antioksidanlar Antioksidanlar, gıdalarda oksidatif bozulmayı önleyen veya geciktiren bileģikler olarak tanımlanmaktadır. Bu bileģikler oksidatif ve otooksidatif iģlemlerin baģlangıcında etki göstererek oksidasyonu ve buna bağlı olarak oluģan istenmeyen reaksiyon ürünlerinin (kötü koku ve lezzet) oluģumunu engelleyebilmektedirler. Pek çok gıda maddesinin bozulmasının önemli bir kaynağının oksijen olduğu bilinmektedir. Ġstenmeyen lezzet ve koku oluģumlarına neden olan oksidatif acılaģma reaksiyonu nem, ısı, ıģık, metaller, metal içeren bileģikler ve enzimler ile katalizlenebilmektedir. Gıdalarda uygulanan hazırlama, paketleme ve soğutma iģlemleri acılaģmayı geciktirmekte ancak bunu engelleyememektedir. Antioksidanlar, gıdalarda oksidasyonun baģlangıcında ilave edildiklerinde reaksiyonu önleyebilmekte veya azaltabilmektedir. Antioksidanlar serbest radikallerin zararlı etkilerini önemli ölçüde azaltabilen bileģiklerdir (Halliwell ve Aruoma, 1991). Düzgün çalıģan bir metabolizmada mitokondriyel sitokrom sistemi, sitozoldaki organelleri oksidanların zararlı etkilerinden korur. Bu sistemin yetersiz kaldığı

30 21 durumlarda doğal enzimler devreye girer. Enzimlerce etkisiz hale getirilemeyen oksidanlar ilk olarak hücre membranındaki lipidleri etkileyerek lipid peroksidasyonu nu baģlatır. Lipid peroksidasyonunda, membranlarda bulunan çoklu doymamıģ yağ asitleri (PUFA), serbest oksijen radikalleri tarafından peroksitlenir ki bu olay; PUFA nın alkoller, aldehitler gibi çeģitli ürünlere yıkılması reaksiyonudur ve sonuçta ortaya çıkan biyo-aktif aldehitler hücre hasarına neden olur (Benzer ve Ozan 2003). Lipid peroksidasyonu sırasında yeterli düzeyde E vitamini (tokoferol) ve C vitamini (askorbik asit) gibi antioksidan vitaminlerin bulunması halinde bu tip hücresel hasarların önüne geçilebilir (Gökpınar ve ark., 2006) Antioksidanların sınıflandırılması Antioksidanlar, doğal ve yapay antioksidanlar olmak üzere iki sınıfa ayrılırlar Doğal antioksidanlar Doğal antioksidanların baģında tokoferoller, flavonoidler, fenolik asitler, askorbik asit ve karotenoidler gelir Tokoferoller En iyi bilinen ve en geniģ kapsamlı kullanılan antioksidanlardır. Tokoferoller ve tokotrienoller olmak üzere iki gruba ayrılırlar ve her iki grup için dört izomer (α-, β-, γ- ve δ-) vardır. Böylelikle toplam sekiz tokoferol izomeri bulunmaktadır. Hemen hemen tüm gıdalarda (eser miktarda dahi olsa) bulunurlar. Bu gruptaki en önemli antioksidan E vitamininin en aktif formu olan α-tokoferoldür. Tokoferoller, hidroksil grubunun hidrojenini lipid peroksil radikaline vererek antioksidatif aktivite göstermektedirler. α- tokoferolün (ġekil 3.1.) aynı zamanda hidroperoksitlerin dekompozisyonunu yavaģlattıkları da bilinmektedir. Tokoferoller ısıya karģı oldukça dayanıklıdırlar. α- tokoferolün oksidatif stabiliteyi artırmada ve sıcaklık arttıkça oksidasyon hızını azaltmada etkili olduğu bildirilmiģtir (Can ve ark., 2005). Bir molekül -tokoferol 100 molekül PUFA nın peroksidasyonunu engelleyebilmektedir (AkkuĢ 1995). ġekil tokoferolün kimyasal formülü.

31 Flavonoidler Flavonoidler (ġekil 3.2.), genellikle bitkilerde bulunan ve günlük diyetle sıklıkla tüketilen difenilpropanlardır. En önemli flavanoid kaynakları sebzeler, meyveler ve bunlara ait içeceklerdir. Flavonoidler, C6 C3 C6 karbon iskeleti ile karakterize edilmektedirler. Iki aromatik halka, üç karbonlu bir alifatik zincir ile birbirine bağlanmaktadır. Flavon, flavonol, izoflavon, flavonon ve çalkonları içeren flavonoidler tüm bitki dokularında bulunmaktadırlar. Flavonoidler, antioksidatif aktivitelerini ksantin oksidaz, lipoksijenaz ve siklooksijenaz gibi oksidatif enzimleri inhibe ederek, metal iyonları ile Ģelat oluģturarak, diğer antioksidanlar ile etkileģime girerek ve süperoksit anyonları, lipid peroksil radikalleri, hidroksil radikalleri gibi serbest radikalleri yakalayarak göstermektedirler (Can ve ark., 2005). ġekil 3.2. Flavonoidlerin genel kimyasal formülü Fenolik asitler p-hidroksibenzoik, 3,4-dihidroksibenzoik, vanillik, syringic, p-kumarik, kafeik, ferulik, sinapik, klorojenik ve rosmarinik asit bitkilerde sıklıkla rastlanılan fenolik asitlerdendir (ġekil 3.3.). Organik asit esterleri veya glikozitler Ģeklinde bulunmaktadırlar. Pozisyon ve hidroksilasyon dereceleri, antioksidatif aktiviteyi belirlemede öncelik taģımaktadır (Awad ve Jager, 2003). ġekil 3.3. Genel bir fenolün kimyasal formülü.

32 Askorbik asit C vitamininin meyvelerde bulunan en baskın formu askorbik asittir (ġekil 3.4.). Primer oksidasyon ürünü olan L-Dehidroksiaskorbik asit de biyolojik aktiviteye sahip olduğu için önemlidir. Meyvelerdeki ortalama L-Dehidroksiaskorbik asit miktarı, toplam C vitamini içeriğinin % 10 undan azdır. Okside olmuģ olan form, dekompozisyona daha dayanıksız olduğu ve biyolojik aktivite kaybına yol açtığı için, askorbik asit formlarındaki değiģiklikler hem teknolojik hem de besinsel açıdan önemlidir (Cordenunsi ve ark., 2004). ġekil 3.4. Askorbik asitin kimyasal formülü Karotenoidler Bitkilerde ve hayvansal dokularda bulunan kırmızı-sarı pigmentlerdir. Gıdalarda bulunan karotenoidler, sekiz tane beģ karbonlu izoprenoid biriminin biraraya gelmesiyle oluģan 40 C lu polienlerdir. Doğada 670 ten fazla karotenoid bulunmakta ve bunların çoğu antioksidatif aktivite göstermektedir. Gıdalarda bulunan en önemli karotenoidler β-karoten, α-karoten, likopen, lutein ve β- kriptoksantindir. β-karoten (ġekil 3.5.), vücutta A vitaminine dönüģtürülmektedir. Sarı-turuncu renkli meyve ve sebzeler, koyu yeģil renkli sebzeler karotenoid kaynağı gıdalar olarak gösterilmektedir (Can ve ark., 2005). ġekil karotenin kimyasal formülü. Organizmaların hemen hemen tamamı serbest radikallerin zararlarına karģı süperoksid dismutaz (SOD) ve katalaz (CAT) gibi oksidatif enzimlerle ya da α- tokoferol, askorbik asit, karotenoidler, polifenoller ve glutatyon ile iyi korunmaktadırlar

33 24 (Mau ve ark., 2002). Hemen hemen tüm organizmalar antioksidan kökenli savunma ve tamir sistemine sahip olmasına rağmen bunların oksidatif zarara karģı koruyuculukları yaģlanmayla etkisini yitirerek zarara karģı koruyuculuğu etkisiz hale gelmektedir (Türkoğlu ve ark., 2006). Sonuçta kanser, kalp-damar hastalıkları, bağıģıklık sistemi zayıflıkları, beyin fonksiyonları bozuklukları ve katarakt gibi vücudu dejenere eden hastalıklar baģ gösterir (Ames ve ark., 1993). Sebze ve meyvelerin C, E vitamini ve β-karoten gibi antioksidanlar bakımından zengin kaynaklar olduğu antiepidemilojikal çalıģmalarda antiatherojenik olduğu ileri sürülmüģtür (Gezer ve ark., 2006). Son zamanlarda besin materyallerindeki fitokimyasallar ve onların insan sağlığına olan etkileri özellikle aktif oksijeni baskılayan çaylar, baharatlar ve bitkiler gibi doğal antioksidanlar kapsamlı olarak çalıģılmaktadır. Mantarlar da fenolik bileģikleri, polikedleri, terpenleri ve steroidleri içeren çeģitli sekonder metabolizma ürünlerini biriktirirler. Fenolik bileģiklerin LDL oksidasyonunun inhibisyonunda antioksidan aktivite gösterdikleri bulunmuģtur (Teissdre ve Landrault, 2000). Mantarlar genellikle serbest radikalleri süpürme etkisine sahip, polisakkaridler ve polifenoller gibi çok çeģitli moleküller barındırırlar (Cui ve ark., 2005) Sentetik antioksidanlar Sentetik antioksidanlar yiyeceklerin bozulmadan uzun süre saklanabilmesinde kullanılmaktadırlar. En yaygın olarak kullanılan sentetik antioksidanlar butillenmiģ hidroksi anisol (BHA), butillenmiģ hidroksi toluen (BHT) ve üçüncü dereceden butillenmiģ hidroksikinon (TBHQ) dur (Türkoğlu ve ark., 2006). Son birkaç yıldır doğal ürünlerin içine artan miktarlarda ilave edilen bazı sentetik bileģiklerin toksik özelliğinden Ģüphelenilmektedir (Stone ve ark., 2003). Toptan gıda üreticileri, kozmetikçiler ve eczacılar gibi bazı endüstri kuruluģları, ekstraksiyon ve saflaģtırma ile doğal ürünlerden biyoaktif bileģikler hazırlama çabası içerisindedirler. Antioksidan bileģikleri, üretimi ve muhafazası sürecinde gıda ürünlerinin bozulmasının temel sebeplerinden biri olan lipid peroksidasyonu sürecini geciktirmekte ve serbest radikalleri süpürebilmektedirler (Barros ve ark., 2007). Buna göre bilhassa son yıllarda artan, bitkisel orijinli doğal antioksidanlar için araģtırma yapılması ve doğal güvenilir kaynaklardan alternatif gıda antioksidanları keģfedilmesi gerekmektedir (Skerget ve ark., 2005) Antioksidanların etki mekanizmaları Antioksidanlar baģlıca dört yolla oksidanları etkisiz hale getirirler;

34 25 1. Süpürme etkisi (Scavenging): Oksidanları daha zayıf yeni bir moleküle dönüģtürerek etkisizleģtirir. Antioksidan enzimler ve mikromoleküller bu yolla etki eder. 2. Söndürme etkisi (Quenching): Oksidanlara bir hidrojen aktararak inaktive etmesine denir. Vitaminler, flavanoidler, timetazidin ve mannitol bu Ģekide etki eder. 3. Zincir reaksiyonlarını kırma etkisi (Chain Breaking): Hemoglobin, serüloplazmin ve ağır mineraller oksidanları kendilerine bağlar ve inaktive eder. 4. Onarma etkisi (Repair): Oksidatif hasar görmüģ biyomolekülü onarırlar (Gökpınar ve ark., 2006) Antimikrobiyal aktivite bakımından makrofunguslar Dünya nüfusunun giderek artması, beslenme ve sağlıkla ilgili sorunları da artırmıģtır. Günümüzde bilim ve teknolojideki büyük ilerlemelere rağmen, doğal kaynakların bilinçsizce tüketimi ve karģılaģılan ekonomik güçlükler, doğal kaynakların çok amaçlı kullanılmalarını zorunlu kılmıģtır. Diğer taraftan enfeksiyöz hastalıklarla mücadelede bugüne kadar geliģtirilen doğal ve sentetik antibiyotiklerin esas etkileri patojen mikroorganizmaların faaliyetlerinin engellenmesi üzerine olsa da bu uygulamadan bazı yararlı mikroorganizmalar da etkilenmektedir. Ayrıca antibiyotiklerin sıkça kullanımı patojen mikroorganizmaların direnç kazanmasına ve antibiyotiklerin etkilerinin giderek azalmasına neden olmaktadır. Kontrolsüz kullanılan ilaç ve antibiyotikler canlının sindirim sisteminde mevcut mikrofloradaki dengeyi bozmaktadır (Demirhan ve ark., 2007). Bu gibi çeģitli yan etkilerinin bulunması, tıp ilmini yeni ve değiģik antimikrobiyal maddeler keģfetmek için doğaya yöneltmiģtir. Doğal kaynaklar bakımından oldukça zengin olan ülkemizde sahip olduğumuz en önemli değerlerden birisi de halkımızın tükettiği doğal bir besin durumunda olan makrofunguslardır (Duman ve ark., 2003). Penicillium notatum un kültürlerinden ekstraktlar (penisilin) elde edilmiģtir (Moyer ve Coghill, 1946). Son yıllarda bulaģıcı hastalıkların tedavisinde kullanılan birbirinden farksız ticari antimikrobiyal ilaçlara ve çok yönlü droglara dirençli insan patojeni mikroorganizmalar geliģmektedir. Bilim insanları alıģılmamıģ olan çeģitli antimikrobiyal kemoterapik ajanların kaynaklarından yeni antimikrobiyal maddeler bulmak için çaba sarfetmektedirler (Karaman ve ark., 2003). Makrofunguslarda antimikrobiyal aktiviteden sorumlu bileģiklerin en iyi belirlenen grubu poliasetilenlerdir. Bu antimikrobiyal maddelerden 50 den fazlasının Aleurodiscus, Clitocybe, Daedalea, Marasmius, Merulius, Pleurotus, Polyporus, Poria, Psathyrella ve Tricholoma cinslerinde bulunduğu belirlenmiģtir. Makrofungusların

35 26 antimikrobiyal etkileri fungal yapıda sentezlenen ve çoğunlukla organizmaya özgü bazı fenolik bileģikler, pürinler, primidinler, kinonlar, terpenoidler ve fenil proponoid türevi gibi antagonistik maddelerden kaynaklanmaktadır. Antitümoral etki gösteren en önemli maddeler ise; kalvasin, volvotoksin, flammutoksin, lentinan ve porisin denilen ve yalnızca makrofunguslardan izole edilen maddelerdir. Makrofungusların, infeksiyon etmeni bakteri türlerine karģı antibakteriyal etkilerinin bulunduğu bilinmektedir. Bu etkiler özellikle; Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus, Lactobacillus, Prevotella, Porphyromonas, Pseudomonas aeroginosa, Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae gibi bakteriler ve Absidia glauca, Alternaria porri, Ascochyta pisi, Aspergillus ochraceus, Fusarium oxysporum, Mucor miehei, Paecilomyces varioti, Penicillium islandicum ve Zygorrhynchus moelleri gibi mantarlar üzerinde yapılan değiģik çalıģmalarla gözlemlenmiģtir. S. commune Fr. den izole edilen polisakkart bileģiklerin P. aeruginosa, S. aureus, E. coli, K. pneumoniae, S. thyphimurium ve M. luteus enfeksiyonlarına karģı koruyucu ve antimikrobiyal etki gösterdikleri belirtilmiģtir (Komatsu, 1973). Macrolepiota procera (Scop.: Fr.) Singer makrofungusundan elde edilen çeģitli ekstrelerin gram (+) ve gram (-) bakterilere ve bazı mayalara karģı antagonistik etki gösterdiğini belirlemiģlerdir. Özellikle E. aerogenes, C. utilis ve Hansenula sp. üzerine oldukça etkili olduğunu tespit etmiģlerdir (Dülger ve ark., 1999). C. versicolor (Fr.) Quél. dan hazırlanan ekstrelerin bazı gram (+) ve gram (-) bakterilere karģı antimikrobiyal aktivite gösterdiğini tespit etmiģlerdir (Dülger ve ark., 1998). Avrupada Ganoderma pfeifferi den üretilen Ganomisin olarak adlandırılan terpenoid methisillin, antibiyotiğe dirençli Staphylococcus aureus ve diğer bakterilerin geliģmelerini inhibe etmiģtir (Mothana ve ark., 2000). Tıbbi bitkilerden elde edilen doğal bileģiklerin çoğunun antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğunu belirlemiģlerdir. Bu bitkilerdeki antimikrobiyal kimyasallar; terpenler, steroidler, flavonlar, saponinler, komarinler ve alkoloidler gibi farklı sınıfları içermektedir (Harris ve ark., 2001). Kaneda ve Tokuda ile alınan besinin % 5 i Lentinus edodes ile desteklendiğinde plazmadaki kolesterolü önemli ölçüde düģürdüğü tespit edilmiģtir (Tokita ve ark., 1972).

36 27 Polisakkaridler ve peptidoglikanlar, kimyasal yapısı ve izolasyonu en çok araģtırılan farmakolojik olarak aktif iki mantar bileģiğidir. Lentinus edodes (Berk.) Sing. in lentinanının, Schizophyllum commune Fr. nin Ģizofilanının, Grifola frondosa nın grifolanının ve Sclerotinia sclerotiorum un β-1,3-glukanının önemli ölçüde antitümör aktiviteleri olduğu bulunmuģtur (Fan ve ark., 2006). G. pfeifferi ve diğer Ganoderma türlerinden izole edilen ganodermadiol, lusidadiol ve applanoksidik asit G.influenza virüs tip A ya karģı antiviral aktivite göstermiģlerdir. Ayrıca, ganodermadiol uçuk ve diğer semptonlara neden olan herpes simpleks virüs tip 1 e karģı antiviral aktivite göstermiģtir (Mothana ve ark., 2003). Trametes versicolor dan izole edilen, protein bağlı polisakkaridlerden PSK ve PSP nin hücrede HIV e ve sitωlovirüse karģı antiviral etki göstermiģtir (Ichimura ve ark., 1998) Yağ asitleri Yağlar, insan beslenmesinde karbonhidrat ve proteinlerle birlikte diyetle alınması zorunlu olan besin öğelerinden biridir. Toplumlarda ortaya çıkabilen sağlık sorunları ile beslenme rejimleri arasındaki iliģki araģtırıldığında en fazla sorgulanan gıda bileģeni yağlar olduğu ve bu nedenle yağ tüketiminde, yağ çeģidi seçiminden tüketim Ģekline kadar uzanan her aģamada daha bilinçli ve duyarlı olunması gerektiğine değinilmiģtir (TaĢan ve Geçgel, 2007). Yağlar, gliserol ve yağ asitlerinden oluģan trigliseritlerdir. Yağı meydana getiren öğelerden gliserolün, bütün yağ bitkilerinde aynı, buna karģılık yağı oluģturan diğer unsur olan yağ asitlerinin her bir yağ bitkisinde farklı bir kompozisyonda bulunmaktadırlar. Yağların fiziksel ve kimyasal özelliklerini, içerdikleri yağ asitlerinin kompoziyonu belirlemektedir. Bu özelliklerine göre yağlar, yemeklik sıvı yağ, sabun, parfümeri ve diğer endüstri kollarında kullanılırlar. Yağ asiti (ġekil 3.6.), yapısında karboksil grubu (-COOH) taģıyan düz bir hidrokarbon zinciri olup, yağın en önemli öğesidir. Yağlarda hakim yağ asitleri, çift karbon atomu sayılı ve bir karboksil grubu içeren yağ asitleridir. Yağ asitleri; hidrokarbon zincirinde karbon sayısı, karbon atomları arasında çift bağ bulunup bulunmaması, çift bağ varsa yeri ve sayısı gibi özelliklerine göre birbirlerinden ayrılırlar (Karaca ve Aytaç, 2007).

37 28 O CH 3 (CH 2 ) x C OH { Alifatik Zincir }{ Karboksil Grubu } ġekil 3.6. Bir yağ asitinin genel formülü Yağ asitlerinin sınıflandırılması Doğal yağlarda bulunan yağ asitleri genelde düz zincir türevleri olup doymuģ (SFA) ve doymamıģ (UFA) yağ asitleri olmak üzere 2 Ģekilde sınıflandırılır DoymuĢ yağ asitleri Karbon-karbon atomları arasında tek bir kovalent bağdan (-C-C-) oluģan ve oda sıcaklığında genelde katı olan yağ asitleri doymuģ yağ asitleri (ġekil 3.7.) olarak adlandırılır. Bu yağ asitlerince zengin olan yağlara da doymuģ yağlar denir. ġekil 3.7. DoymuĢ yağ asiti zincirinde C atomları. Laurik asit (C 12:0), Miristik asit (C 14:0), Palmitik asit (C 16:0), Stearik asit (C 18:0), AraĢidik asit, (C 20:0) ve Behenik asit (C 22:0) bitkisel yağlarda bulunan en önemli doymuģ yağ asitleridir. Özellikle palmitik ve stearik asit bitkisel yağlarda bulunan en yaygın doymuģ yağ asitleridir. DoymuĢ yağ asitleri insan vücudunda da sentezlenirler; hiç yağ yenilmese dahi bu tip yağ asitleri karbonhidrat metabolizması ile oluģan moleküllerden sentez edilebilmektedir (Karaca ve Aytaç, 2007) DoymamıĢ yağ asitleri Karbon zinciri üzerinde çeģitli konumlarda, korbon- karbon arasında bir veya daha fazla çift kovalent bağ içeren yağ asitlerine doymamıģ yağ asitleri denir (ġekil 3.8.). Bu yağ asitlerince zengin olan yağlara da doymamıģ yağlar denir (Nas ve ark., 2001).

38 29 ġekil 3.8. DoymamıĢ yağ asiti zincirinde C atomları. Yapılarındaki çift bağlar nedeniyle, doymamıģ yağ asitleri doymuģ yağ asitlerine göre daha reaktiftir. Bu reaktivite yağ asiti zincirindeki çift bağ sayısına göre artmaktadır. DoymamıĢ yağlar vücudun gereksinim duyduğu zorunlu yağ asitlerindendir. Oda sıcaklığında sıvı haldedirler ve büyük çoğunluğu bitkisel kaynaklıdır (Karaca ve Aytaç, 2007) Tekli doymamıģ yağ asitleri Yapılarında bir çift bağ içeren yağ asitleri tekli doymamıģ yağ asitleri veya monoenoik yağ asitleri olarak adlandırılır. Bu grubun en önemli iki üyesi, palmitoleik asit (C 16:1) ile oleik asittir (C 18:1). Bunlardan palmitoleik asit daha çok deniz hayvanlarının yağları için karakteristik bir bileģen olduğu halde, oleik asit bugüne dek bilinen bütün doğal yağların yapısında yer almaktadır. Zeytin ve kolza yağları, kabuklu yemiģler (fındık, fıstık, ceviz), kabuklu yemiģ yağları (yerfıstığı ve badem yağları), avokado; tekli doymamıģ yağ asitlerini yüksek oranda içermektedirler (Karaca ve Aytaç, 2007) Çoklu doymamıģ yağ asitleri Birden fazla çift bağ içeren yağ asitleri ise çoklu doymamıģ (poliansatüre, PUFA) yağ asitleri veya polienoik yağ asitleri olarak adlandırılmaktadır. Linoleik (C18:2), linolenik (C18:3), araģidonik (C20:4), eikosapentaenoik (C22:5) ve dokosahexaenoik (C22:6) asitler çoklu doymamıģ yağ asitlerinin en önemlileridir. Çoklu doymamıģ yağ asitleri beslenmede önemli esansiyel yağ asitleridir. Bunların yağlar ve çeģitli yağ ürünlerinde belli düzeylerde bulunmaları gerekir (Nas ve ark., 2001) Amanita caesarea (Scop.: Fr.) Pers. nın genel özellikleri ÇalıĢmalarımızda kullandığımız mantar, yüksek yapılı Ģapkalı mantarlardan olup yöre halkı tarafından sevilerek tüketilen ve yurt dıģında da çok rağbet gören bir türdür.

39 30 Regnum: Fungi Divisio: Basidiomycota Classis: Basidiomycetes Ordo: Agaricales Familya: Amanitaceae Species: Amanita caesarea (Scop.:Fr.) Pers. Makroskobik ve mikroskobik özellikleri: Mantar gençken beyaz renkte velum universal örtüyle tamamen kaplı ve yumurta Ģeklindedir. GeliĢme ilerledikçe velum universal örtü parçalanarak açılarak Ģapka ve sap görünür hale gelir (ġekil 3.9.). ġapka: 7-15 cm, önce yarı küre Ģekline sonra konveks, en sonunda tamamen açılarak düzleģir ve Ģemsiye Ģeklini alır. Gençken portakal sarısı renkte, geliģme ilerleyince renk koyulaģır ve Ģapka üzerinde beyaz renkli, velum universal artıkları kalır. Bu artıklar yağıģlı durumlarda kaybolabilir. Tamamen kuruyan Ģapkalar ipeksi bir parlaklık kazanır. Lameller: Sık ve sarı renklidir. ġapkaya göre daha açık renklidir Sap: x 5-10 cm boyutlarında, silindirik, sarı renkli, belirgin halkası ve volvası vardır Etli kısım: Bol sulu, beyaz veya sarımsıdır. Tadı ve kokusu oldukça hoģa giden özelliktedir Sporlar: x 6-10 μm, elips Ģeklindedir. Spor tozları beyazdır. YetiĢme Yeri Özellikleri: A. caesarea, meģe ile karıģık ormanlarda tek tek ya da gruplar halinde yetiģir (Breitenbach ve Kränzlin, 1995) ve meģe ormanlarının silisli topraklarında yaygındır. Pinus brutia ormanı altlarında tespit edilmiģtir. Toplama yeri Antalya-GazipaĢa, Karatepe, , HD2234. Diğer Özellikleri: Amanita caesarea dünyada Ġmparator mantarı olarak bilinir. Roma imparatorluğu döneminde, impartorların favori mantarı olduğu için caesarea yani Sezar mantarı olarak da isimlendirilmiģtir. GörünüĢünün çok ayırdedici olması sayesinde Amanita türleri arasında nispeten en güvenli olarak yenebilecek olanıdır. Ülkemizde doğal olarak Karadeniz, Akdeniz, Marmara ve Ege bölgesinde çam ve karıģık ormanlarda, sonbahar aylarında bol miktarda yetiģen bir mantardır. Halk

40 31 tarafından sarı gödelek, kırmızı mantar olarak da bilinir. Halk tarafından severek tüketilen bir mantardır. ġekil 3.9. Amanita caesarea (Scop.:Fr.) Pers. in makroskobik görünümü.

41 32 4. MATERYAL VE METOT 4.1. Mantarların antioksidan aktivitelerinin belirlenmesinde izlenen metot ve materyal Mantar ekstraktlarının hazırlanması Materyal Petrol Eteri, Metanol (MeOH), sokslet apareyi, evaperatör, liyofilizatör, mantarlar Metot Mantar öncelikle kurutulup, değirmende toz haline getirildikten sonra yaklaģık 30 g alınarak sokslet apareyinde metanol ekstraksiyonu yapılmıģtır. Bunun için numune soxhlette, % 70 lik metanolde 40 o C de, ilk etapta 1 saat süreyle ekstraksiyona tabi tutulmuģtur. Bu iģlem her defasında süzmek suretiyle en az 3 kez tekrarlanmıģtır. Süzüntüler birleģtirilerek evaporatörde vakum altında 40 o C de uzaklaģtırılmıģtır. Evaperasyondan sonra kalan hafif metanollü kısım liyofilize ĢiĢelerine alınarak liyofilizasyona tabi tutulmuģtur. Böylece kalan metanol de düģük atmosfer basıncında ve düģük sıcaklıkta tamamen uzaklaģtırılmıģtır. Liyofilize edilerek tamamen kurutulan drog analiz edilene kadar +4 o C de saklanmıģtır Toplam fenolik madde tayini Materyal Folin reaktifi, Na 2 CO 3, Metanol, Gallik asit (GA), Shimadzu U.V spektrofotometre Metot Toplam fenolik madde tayini Folin-Ciocaltaeu (1927), metoduna göre yapılmıģtır. Standart olarak kullanılan gallik asit ve mantar, % 70 lik metanol içerisinde hazırlanmıģtır. 0,4 mg/ml konsantrasyonunda 0,5 ml mantarın metanol ekstraktı, % 10 luk folin reaktifinden 2,5 ml ve % 10 luk Na 2 CO 3 dan 7,5 ml bir deney tüpünde karıģtırılmıģ ve oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat bekletilmiģtir. Bu süre sonunda 750 nm de çözeltilerin absorbansları okunmuģtur. Aynı yöntem kullanılarak 0,4 mg/ml konsantrasyonundan baģlayarak giderek azalan konsantrasyonlarda hazırlanan gallik asit için kalibrasyon eğrisi çizilmiģtir. Çözeltilerin absorbansları çizilen kalibrasyon eğrisinden alınarak eģ değer gallik asit (GAE) miktarı mg/ml olarak hesaplanmıģtır.

42 Ġndirgeme gücü Materyal Metanol, FeCl 3 ; Fosfat tamponu [(ph: 7)- K 2 FeCN], Potasyum ferrosiyanit, Trikloroasetik asit (TCA), Shimadzu U.V spektrofotometre, santrifüj, benmari Metot Mantarın indirgeme gücü Oyaizu (1986), metodu ile belirlenmiģtir. Mantarın metanolik ekstraktarından 5 farklı konsantrasyonda çözeltiler hazırlanmıģtır (0,4 0,04 mg/ml). Hazırlanan her bir çözeltiden deney tüplerine 2,5 ml numune alınmıģtır. Her birinin üzerine 200 mm 2,5 ml fosfat tamponu, % 1 lik potasyum ferrosiyonit çözeltisinden ilave edilmiģtir. Tüpler 50 C de 20 dk. boyunca benmaride inkübe edilmiģtir. Daha sonra 2,5 ml % 10 luk trikloroasetik asit (TCA) ilave edilip, 10 dk. boyunca 600 rpm de santrifüj edilmiģ ve tüplerdeki karıģımların üst kısmından 5 er ml alınarak baģka tüplere aktarılmıģtır. Yeni tüplere aktarılan numunelerin her birinin üzerine 5 ml deiyonize su eklenmiģtir. % 0,1 lik FeCl 3 den 1 ml ilave edildikten sonra oluģan yeģil renkli çözeltilerin absorbansları Shimadzu U.V spektrofotometrede 700 nm de ölçülmüģtür DPPH (1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl) radikallerini süpürme etkisi Materyal DPPH, BHT, BHA, metanol, Shimadzu U.V spektrofotometre Metot Qian ve Nihorimbere (2004) e göre Sanchez Moreno metodu esas alınarak yapılmıģtır. Liyofilize ile elde edilmiģ droglardan 5 farklı konsantrasyonda çözeltiler metanolde hazırlanmıģtır. DPPH ın kalibrasyon eğrisi çıkarılmıģtır. Hazırlanan çözeltilerden 0,5 ml alınarak üzerine 3 ml DPPH çözeltisi ilave edilmiģtir. Kuvvetlice karıģtırılıp ağzı kapatıldıktan sonra 30 dk. süre ile karanlıkta bekletilmiģtir. Bu sürenin sonunda her bir karıģımın absorbansları spektrofotometrede 515 nm de okunmuģtur. Her bir mantarın ayrı ayrı % inhibisyon değerleri hesaplanmıģtır; I (%) = (A 0 - A numune / A 0 ) x 100 Bu değerlerden ve DPPH in kalibrasyon eğrisinden faydalanarak her bir mantar için DPPH serbest radikalinin yarısının süpürüldüğü andaki mantar konsantrasyon (IC 50 ) değerleri hesaplanmıģtır. Değerler sentetik antioksidan olan BHT ve BHA ile kıyaslanmıģtır.

43 β- Karoten- linoleik asit metodu Materyal Kloroform (CHCI 3 ), β karoten, Linoleik asit, Tween 40, deiyonize su, evaperatör, Shimadzu 1700 UV spektrofotometre Metot Bu metot Amin ve Tan, 2002 ye göre yapılmıģtır. β karoten linoleik asit emülsiyon karıģımının hazırlanması; 0,2 mg β karoten, 1 ml kloroformda çözülmüģtür. Üzerine % 60 lık 0,02 ml linoleik asit çözeltisi ve 200 mg Tween 40 ilave edilmiģtir. Vakum altında 40 0 C de evaporatörde kloroform, tamamen uzaklaģtırıldıktan sonra 100 ml oksijenle doyurulmuģ veya deiyonize suda çözülmüģtür. ġiddetli Ģekilde karıģtırılmıģtır. Kontrol çözeltisi için aynı iģlemler β karoten ilave edilmeden tekrarlanmıģtır. Numunelerin konsantrasyonu 1 mg/ml olacak Ģekilde % 70 lik metanolde hazırlanmıģtır. Deney tüplerine, hazırlanan bu çözeltilerden 0,2 ml alınarak üzerine 5 ml, hazırlanan emülsiyon çözeltisi ilave edildikten sonra 40 o C de su banyosunda inkübasyona bırakılmıģtır. Deney tüplerindeki numunelerin ve kontrol çözeltisinin absorbansı 470 nm de okunmuģtur (t 0 ). Bu andan itibaren inkübasyondaki çözeltilerin absorbansı her 15 dakikada bir 2 saat süresince okunmuģtur. Bu absorbanslara dayanarak, yapılan hesaplamalarda absorbans değiģim oranı (AO) ve buna bağlı olarak da % oksidasyonu engelleme katsayıları hesaplanmıģtır: Absorbans değiģimin oranı (AO) = A 0 = t 0 anındaki absorbansı A t = t anındaki absorbansı (t= 120 dk) ln ( A / A ) 0 t t AO(kontrol) AO (numune) % Oksidasyonu engelleme = x 100 AO (kontrol) 4.2. Mantarların antimikrobiyal aktivitesinin belirlenmesinde izlenen materyal ve metot Materyal Kloroform, aseton, metanol, 96 gözlü mikrotitrasyon pleytleri (Falcon Microtest III 96-well trays, Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, New Jersey), Müeller Hinton Broth (MHB), Brain Heart Infusion Broth, bitki değirmeni, Sokslet apareyi, deney tüpleri, petriler, evaperatör, etüv, dimethyl sulfoxide (DMSO), phosphate buffered saline

44 35 (PBS), liyofilizatör, ampisilin, EL x 800 ELISA Mikropleyt Okuyucu, 0.5 McFarland bulanıklık standardı. Mantardan elde edilen ekstraktların antimikrobiyal aktivitelerinin belirlenmesinde 4 gram pozitif bakteri (Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6633, Listeria monocytogenes tip 2 NCTC 5348, Streptococcus pyogenes ATCC 19615), 5 gram negatif bakteri (Escherichia coli ATCC 35218, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeroginosa ATCC 15442, Proteus vulgaris ATCC 7829, Salmonella enteritidis RSHMB) ye ve bir maya (Candida albicans ATCC 1023) ya karģı antimikrobiyal etkisi mikrodilüsyon metodu ile belirlenmiģtir. ÇalıĢmada kullanılan bakteri türlerinin ve mantarın neden oldukları infeksiyonlar kısaca aģağıdaki gibidir; Bacillus subtilis, sporları doğada çok yaygın olup toz, toprak, gübre, bitki ve hayvanlar ile süt ve sularda bulunur. Bakteri aslında saprofit olmakla birlikte doğrudan doğruya dokuya ve özellikle göz içine girmesi sonucunda göz yangıları meydana getirebilir. Ekmeğin yumuģayarak bozulmasına neden olur. Ġnsan ve hayvanlarda besin zehirlenmelerine yol açan fırsatçı patojenlerdir. Listeria monocytogenes, dondurma, kurutma ve ısıtma iģlemlerinin yok edici etkilerine karģı oldukça dayanıklı ve dirençli bir bakteridir. Listeriyoz, L. monocytogenes' in sebep olduğu genel hastalık grubuna verilen isimdir. Listeriyozun belirtileri, septisemi, menenjit, ensefalit ve intrauterin veya gebelerde çocuk düģmesi (2. veya 3. ay) ya da ölü doğumla sonuçlanan servikal infeksiyonları içerir. Bu tür hastalıkların baģlangıcında sürekli ateģli grip benzeri semptomlar gözlenir. Mide bulantısı, kusma, ishal gibi mide bağırsak belirtileri, listeriyozun daha ciddi durumlarında gözlenir. Ağır listeriyoz durumlarına dair baģlangıç zamanı bilinmemektedir. Fakat bu, birkaç gün ile 3 hafta arasında değiģebilir. Mide bağırsak semptomlarına dair baģlangıç zamanı da yine bilinmemektedir. Fakat 12 saatten fazla olduğu tahmin edilmektedir. Staphylococcus aureus, stafilokok türleri içinde en virulenti olan, önemli bir insan patojeni olarak bilinir. Fronkül ve çıbanlara, çeģitli abselere, kornea göz içi infeksiyonlarına, toksik Ģok sendromuna, solunum sistemi infeksiyonlarına ve besin zehirlenmelerine yol açarlar. Streptococcus pyogenes, normalde insan florasında (boğaz ve burunlarda) bulunur. Ancak sayısı arttığında bu bakteri farenjite yol açar ve deri infeksiyonlarına da neden olur.

45 36 Escherichia coli, doğumdan birkaç saat veya birkaç gün sonra sıcakkanlı hayvanların gastrointestinal yoluna yerleģir. Bağırsakların normal flora üyesidir ve bağırsakları patojen mikroorganizmalardan korur. Aynı zamanda insan için önemli bir fırsatçı patojendir ve çoğu bakteriyel infeksiyonun sorumlusudur. Bazı suģları kalın bağırsağa yerleģerek dizanteriye neden olurlar. Ayrıca kırmızı kan hücrelerinde, böbreklerde hasara yol açarlar. Yine üriner yol infeksiyonları, solunum yolu infeksiyonları, menenjit, karaciğer absesi gibi infeksiyonlara neden olmaktadır. Klebsiella pneumoniae, insanların % 5 inde bağırsaklarda kolonize halde bulunur. Tipik olarak lober pnömoni oluģturur. Genellikle alkoliklerde, diyabetiklerde, kronik tıkayıcı akciğer hastalığı gibi ağır hastalığı olanlarda gözlenmekte ve üst solunum yollarında kolonize olup bakterilerin aspirasyonu sonucu oluģmaktadır. Pnömoniden baģka üriner yol enfeksiyonlarına, yara enfeksiyonlarına ve bakteriyemiye yol açar. Pseudomonas aeruginosa, doğada çok yaygın olan bu bakteriler insanlar için özellikle de savunma sistemi zayıf olan bireyler için fırsatçı bir patojendir. Kimyasal dezenfektanlara (diğer vejetatif bakterilere oranla) oldukça dirençlidir. Biraz nemin olduğu yerlerde yaģamlarını rahatlıkla sürdürebilirler. Ġlaç bağımlılarında kalp kapağına yerleģerek intektif endokardite neden olur. Hastane ortamında özellikle de yoğun bakımda bulunulması ve solunum cihazlarının kullanılması bu bakterinin çoğalmasına neden olabilmektedir. Ayrıca menenjit ya da beyin absesine, göz infeksiyonuna (özellikle de kontakt lens kullananlarda), göz radyasyonu almıģ olanlarda bu bakteri hastalık etkenidir. Proteus vulgaris, idrar yolu infeksiyonlarına ve böbrek taģına neden olan bakterilerdir. Bu bakteriler ayrıca; yara infeksiyonları, menenjit, organ apseleri, özellikle yeni doğanlarda göbek kordonu infeksiyonları ve bu infeksiyonlardan kaynaklanan epidemiler halinde görülebilen sepsis ve menenjitlere neden olabilmektedirler. Salmonella enteritidis, insanlarda ishalli hastalığa neden olan bir bakteridir. Genellikle hayvan dıģkısı bulaģmıģ olan yiyecekler yoluyla yayılır. Gıdadan kaynaklanan hastalıklara neden olan en yaygın bakterilerden biridir. Çiğ ya da az piģmiģ et, tavuk, yumurta ya da pastörize olmayan sütte (pastörize olmayan sütten üretilen ürünler) gözlenmektedir. YıkanmamıĢ mutfak malzemelerinden ya da bazı ev hayvanlarının dıģkılarıyla temastan sonra ellerin yıkanmaması sonucu da enfekte olabilir.

46 37 Candida albicans, sistemik infeksiyonlara neden olabilen bir mayadır. GeniĢ etkili antibiyotikler birçok mikropları öldürdüğü halde bu mayaya zarar veremedikleri gibi aksine çoğalmalarına bile neden olabilmektedir. Ġnsanlarda ağızdaki tükürükte ve vajinada görülebilmektedir. Deri ve mukozada pek tehlikeli olmadıkları halde; kalpte, beyinde, kemikte bulunması durumunda tehlikeli olabilmektedir Metot Ekstraktların hazırlanıģı Makrofungus örnekleri uygun koģullarda kurutulup, aseptik Ģartlara uyularak bir bitki değirmeni yardımı ile toz haline getirildikten sonra, ekstraksiyon iģlemleri basit bir maserasyon ve sokslet ekstraksiyon yöntemleriyle gerçekleģtirilmiģtir. Maserasyon yönteminde, toz halindeki mantarlardan 30 g tartılarak 250 ml kloroform içerisinde (sürekli karıģtırarak) 24 saat tutulmasını takiben, elde edilen süpernatant Whatman No 1 filtre kağıdı kullanarak filtre edilmiģtir. Bu iģlem aynı numuneyle diğer çözgenler olan aseton ve metanol için de tekrarlanmıģtır. Sokslet ekstraksiyon yönteminde ise, yine toz halindeki mantarlardan 30 g tartılarak, 250 ml kloroform içerisinde sokslet cihazına yerleģtirilmiģtir. 8 saat ekstraksiyon iģlemine tabi tutulduktan sonra ekstraksiyon fazı ayrılmıģ ve bu iģlem aynı numune ile sırasıyla diğer çözgenler olan aseton ve metanol için de tekrarlanmıģtır. Maserasyon metodu ve sokslet cihazında elde edilen ekstraktlar, rotary evaporatör kullanılarak 40 C nin altındaki bir sıcaklıkta, düģük basınç altında 10 ml kalıncaya kadar uçurulmuģ ve ardından liyofilizasyon iģlemine tabi tutularak toz haline getirilmiģtir. Daha sonra, ekstraktlar 100 mg/ml konsantrasyonda DMSO: PBS (1:1) içinde çözülmüģtür µm lik milipor filtrelerden geçirilerek, üzerinde ekstrakt numarası yazılı tüplerde 20ºC de saklanmıģtır Mikrodilüsyon yöntemiyle antimikrobiyal etkinin belirlenmesi Denemede kullanılacak olan bakteri kültürlerini aktifleģtirmek için Brain Heart Infusion Broth (BHIB, Oxoid) kullanılmıģtır. Stok kültürlerden alınan bakteri suģları 4-5 ml BHIB besiyerinde süspanse edilerek, 2-5 saat etüvde inkübasyona bırakılmıģtır. Bu süre sonunda bakteri süspansiyonları 0.5 McFarland standart tüpüne göre steril PBS ile ayar edilmiģtir (yaklaģık 10 8 bakteri/ml). Hazırlanan Mueller Hinton Broth (MHB) besiyerinden steril 96 kuyucuklu (U tabanlı) pleytlerin her bir kuyucuğuna 100 µl dağıtılmıģtır (ġekil 4.11.). Ekstraktların PBS: DMSO (1:1) ile 20 mg/ml konsantrasyonda sulandırımları hazırlanmıģtır. Bu sulandırımlardan 96 kuyucuklu pleytlerin ilk kuyucuklarına (A1, A2, A3, ) 100 er µl konulduktan sonra on iki kanallı

47 38 pipet ile ilk kuyucuklardaki besiyeri ve ekstrakt pipete edilerek iyice karıģtırılıp, bunlardan alınan 100 µl lik hacimler bir sonraki kuyucuklara aktarılmıģtır. Bu Ģekilde pipetlemeyi takiben bir sonraki kuyucuklara 100 µl aktarılarak ekstraktların ½ seri sulandırımları yapılmıģtır (10 mg/ml-4µg/ml). Mcfarland 0,5 bulanıklığındaki bakteri süspansiyonundan MHB ile 10-2 sulandırım yapılarak ml sinde 10 6 bakteri olan süspansiyon hazırlanmıģ ve bu süspansiyonlardan her kuyucuğa 100 er µl aktarılarak ekstraktların 5 mg/ml ile 2 mg/ml konsantırasyonları arası sulandırımları elde edilmiģtir. ġekil Ekstrenin seyreltilmesi. Kontrol olarak da; 1. Ampisilin: Standart suģun kalitesini ve deneyin doğruluğunu test etmek için bir serinin ilk kuyucuğuna 100 µl ampisilin solüsyonu (ilk kuyucukta 100 µg/ml olacak Ģekilde) konulmuģtur. 2. PBS: DMSO (1:1): Çözücünün iki misli seyreltilmiģ çözeltileri hazırlanarak, inhibitör etkinin çözücü ile iliģkisi araģtırılmıģtır. 3. Bakteri Kontrol: Bir sıra kuyucukta bulunan besiyerinin üzerine 100 µl bakteri süspansiyonu (10 6 bakteri/ml) eklenerek, bakterinin üreme kabiliyeti değerlendirilmiģtir. 4. Besiyeri Kontrol: Bir sıraya sadece besiyeri eklenerek (200 er µl) kontaminasyon sebebiyle oluģabilecek inhibitör etki araģtırma dıģı bırakılmıģtır. Her bir kuyucuğun absorbansı, 620 nm ye ayarlanmıģ otomatik bir ELISA mikropleyt okuyucusu (EL x 800) kullanarak belirlenmiģtir. Bu iģlemlerden sonra pleytlerin kapakları kapatılarak 37 C de 18 saat süreyle inkübe edilerek çalkalanmıģ ve absorbans, aynı dalga boyunda okuyucuda tekrar okunmuģtur. Bu absorbans değerleri, inkübasyondan önce elde edilen değerlerden çıkarılmıģtır (düģüldü). Ekstraktların konsantrasyonlarına karģı 620 nm deki düzeltilmiģ absorbans değerleri grafiğe dönüģtürülüp bu grafikten yararlanarak absorbans değerinde ani bir düģüģün olduğu konsantrasyon, ekstraktın MĠK değeri olarak belirlenmiģtir. Tüm test mikroorganizmalarına karģı yapılan antimikrobiyal aktivite deneyleri üç kez tekrarlanmıģtır. Standart hataları ± 0,9 4 aralığındadır (Bazı modifikasyonlarla birlikte,

48 39 Abbasoğlu ve ark., 1995; Devienne ve Raddi, 2002) Mantarların yağ asitlerinin bileģiminin tespit edilmesinde izlenen materyal ve metot Materyal Sodyum hidroksit ( Merck ) ve Metanol ( Merck ), % 2 lik Metanolik NaOH (2 gr NaOH, metanol ile 100 ml ye tamamlanmıģtır), % 14 lük BF3 Metanol Kompleksi, n-heptan (Merck), doymuģ NaCl (bir litrelik ĢiĢeye NaCl distile su ile doyurulmuģtur), geri soğutucu, 45 cm, düz; yağ balonu, 250 ml, dibi düz ve 29*32 Ģilifli; ayırma hunisi, (100 ml. lik) olmalıdır. Ayrıca, ekstraktör, milivial ve insert kullanılmıģtır. Kullanılan cihazlar ise bitki değirmeni, gaz kromatografi, sokslet apareyi, derin dondurucu, vorteks Metot Mantarın toplanıp yağ asidi değerlerinin tespitine kadar takip edilen yöntemler aģağıda sırasıyla verilmiģtir Mantarların öğütülmesi Temin edilen mantarlar, Selçuk Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü nde bulunan bitki öğütme değirmeninde 1 mm lik elekte öğütülmüģtür Mantarlardan yağ ekstraksiyonu Mantarlardan ham yağ eldesi A.O.A.C., (1990) metoduna göre, sokslet apareyinde petrol eteri ile 8 saat süreyle ekstrakte edilmiģtir EsterleĢtirme iģlemi Yağ örneğinden 0,16 0,20 gr alınarak yağ balonlarına konulmuģtur. Üzerine 4 ml 0,5 N lik metanolik NaOH çözeltisi ilave edildikten sonra; su banyosu üzerinde sabunlaģma oluncaya kadar 10 dakika kaynatılmıģtır. SabunlaĢma sonunda, yağ balonu içine 5 ml % 14 lük BF 3 metanol kompleksi eklenmiģ ve 5 dakika daha kaynamaya bırakılmıģtır. Kaynama sonrasında balon sürekli ve yavaģ bir Ģekilde çalkalanmıģ, sonra üzerine 2 ml n heptan ilave edilmiģtir. Tüm bunlar bir dakika daha kaynatıldıktan sonra, üzerine 4 ml doymuģ NaCl çözeltisinden eklenmiģtir. KarıĢım iyice karıģtırıldıktan sonra ayırma hunisine alınarak 5 10 dakika kadar fazların ayrılması beklenmiģtir. En sonunda alttaki sulu faz atılmıģtır. Üstteki açık sarı renkli faz, viallere konularak analizin yapılacağı zamana kadar derin dondurucuda saklanmıģtır (Paquot, 1979).

49 Numunelerin gaz kromatografiye enjekte edilmesi Gaz kromatografik analizler HP (Hewlett Packard) Agilent marka, 6890 N model, FID (Flame Ionization Dedector, alev iyonlaģtırma dedektörü) dedektörlü ve otomatik injektörlü gaz kromatograf ile gerçekleģtirilmiģtir. Analizlerde 100 metrelik HP-88 kapiller kolon kullanılmıģtır. Gaz kromatografta injektör bloğu sıcaklığı 240 C, dedektör bloğu sıcaklığı 250 C olarak ayarlanmıģtır. Kolona sıcaklık programı uygulanmıģtır. Kolonun baģlangıç sıcaklığı 160 C olarak ayarlanmıģ, bu sıcaklıkta 2 dakika bekletilmiģ daha sonra dakikada 4 C artarak 185 C ye ulaģılmıģtır. Bu sıcaklığı takiben dakikada 1 C artarak 200 C ye ulaģılmıģ ve bu sıcaklıkta 46,75 dakika bekletilmiģtir. Sonuçta analizler 70 dakikada tamamlanmıģtır (ġekil 4.12.). TaĢıyıcı gaz olarak kullanılan helyum:1 ml/dak. olarak ayarlanmıģtır. Yağ asitlerinin belirlenmesinde Alltech ve Accu standartlarından faydalanılmıģtır. Sonuçlar yüzde alan Ģeklinde verilmiģ olup üç kez tekrarlanmıģtır. Standart hataları ± 1 3 aralığındadır ve üç GC analiz sonucunun ortalaması Ģeklinde verilmiģtir. ġekil EsterleĢme reaksiyonu (Alcantara 2000).

50 Absorbans 760 nm BULGULAR 5.1. Antioksidan aktivite bulguları Toplam fenolik madde tayini Çözeltilerin absorbansları (Çizelge 5.1.), çizilen gallik asit kalibrasyon eğrisinden (ġekil 5.13.) okunarak toplam fenolik madde konsantrasyonunu eģdeğer gallik asit olarak hesaplanmıģtır (mg/ml GAE). Buna göre Amanita caesarea nın fenolik madde konsantrasyonu 0, mg/ml GAE olarak bulunmuģtur (Çizelge 5.2.). Çizelge 5.1. Gallik asit kalibrasyon değerleri. Konsantrasyon mg/ml Absorbans (760 nm) 0,025 0,112 ± 0,003 0,050 0,236 ± 0,001 0,100 0,549 ± 0,002 0,200 0,862 ± 0,002 0,400 1,958 ± 0,001 Çizelge 5.2. Fenolik madde konsantrasyonu (gallik aside eģdeğer). Tür Absorbans değeri Fenolik Madde Konsantrasyonu mg/ml GAE Amanita caesarea 0,027 ± 0,002 0, ,5 2 y = 4,8276x - 0,0049 R 2 = 0,9928 1,5 1 0, ,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 Konsantrasyon (mg/ml) ġekil Gallik asit kalibrasyon eğrisi.

51 Absorbans (517 nm) DPPH Radikallerini süpürme etkisi Amanita caesarea nın DPPH radikallerini süpürme etkisi (ġekil 5.14.) artan konsantrasyona bağlı olarak artmakla beraber (Çizelge 5.3. ve ġekil 5.15.), DPPH serbest radikalinin yarısının süpürüldüğü andaki mantar ekstresi konsantrasyon (IC 50 ) değerleri BHA da 0,35519 mg/ml, BHT de 0,4119 mg/ml ve A. caesarea da ise 0,7615 mg/ml olarak bulunmuģtur (ġekil 5.16.). Daha düģük bir IC 50 daha yüksek bir antioksidan aktiviteye iģaret etmektedir. Çizelge 5.3. DPPH radikallerini süpürme etkisi için konsantrasyona bağlı olarak elde edilen absorbans değerleri. Konsantrasyon (mg/ml) BHA Absorbans (nm) BHT A. caesarea 0, ,056 0,045 0,049 0,0625 0,05 0,043 0,047 0,125 0,044 0,040 0,045 0,25 0,037 0,037 0,042 0,5 0,026 0,031 0,042 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 y = 0,095 x + 0,019 R 2 = 0, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Konsantrasyon (mg/ml) ġekil DPPH kalibrasyon eğrisi.

52 43 ġekil A. caesarea nın, BHA ve BHT nin DPPH radikallerini süpürme etkisi. ġekil A. caesarea nın, BHA ve BHT nin IC 50 değerleri. Mantarların ve standartların DPPH radikallerini inhibe etme yüzdeleri (% I ) Ģu Ģekilde hesaplanmıģtır: I (% ) = (A kontrol - A numune / A kontrol ) x 100 Bu hesaplama sonrasında 0,5 mg/ml deki inhibisyon yüzdeleri; A. caesarea % , BHA % ve BHT % 53 olarak bulunmuģtur (Çizelge 5.4. ve ġekil 5.17.).

53 44 Çizelge 5.4. A. caesarea nın ve standartların DPPH radikallerinin inhibisyon yüzdeleri. Konsantrasyon (mg/ml) 0, ,0625 0,125 0,25 0,5 A.caesarea % 25,7580 % 28,7880 % 31,8200 % 36,3640 % 40,9100 BHA % 15,1520 % 24,2424 % 33,3333 % 43,9400 % 60,6000 BHT % 31,8200 % 34,8500 % 39,3940 % 43,9400 % 53,0000 ġekil A. caesarea nın ve standartların DPPH radikallerinin inhibisyon yüzdeleri Mantarların indirgeme gücü A. caesarea'nın indirgeme gücü artan konsantrasyona paralel olarak artmıģtır (Çizelge 5.5.). Daha yüksek bir absorbans daha yüksek bir indirgeme gücünü gösterir (ġekil 5.18.). Çizelge 5. Ġndirgeme gücü için konsantrasyona bağlı olarak elde edilen absorbans değerleri. Konsantrasyon (mg/ml) Absorbans (700 nm) BHA BHT A. caesarea 0,075 1,466 1,388 0,258 0,15 1,611 1,466 0,274 0,3 1,779 1,602 0,288 0,6 1,9 1,775 0,334 1,2 2,021 1,869 0,451