MEME KANSERİ TEDAVİSİNDE PAKLİTAKSEL YÜKLÜ POLİKATYONİK VE ANYONİK SİKLODEKSTRİN NANOKÜRE FORMÜLASYONU VE IN VİTRO DEĞERLENDİRİLMESİ

Transkript

1 MEME KANSERİ TEDAVİSİNDE PAKLİTAKSEL YÜKLÜ POLİKATYONİK VE ANYONİK SİKLODEKSTRİN NANOKÜRE FORMÜLASYONU VE IN VİTRO DEĞERLENDİRİLMESİ FORMULATION OF PACLITAXEL LOADED POLYCATIONIC AND ANIONIC CYCLODEXTRIN NANOSPHERE FOR BREAST CANCER TREATMENT AND IN VITRO EVALUATION GAMZE IŞIK Hacettepe Üniversitesi Lisansüstü Eğitim Öğretim ve Sınav Yönetmeliğinin NANOTEKNOLOJİ ve NANOTIP Anabilim Dalı İçin Öngördüğü YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak hazırlanmıştır. 2013

2

3 Annem e

4 Meme Kanseri Tedavisinde Paklitaksel Yüklü Polikatyonik ve Anyonik Siklodekstrin Nanoküre Formülasyonu ve In vitro Değerlendirilmesi Gamze Işık ÖZ Paklitaksel (PCX), meme kanserinde kullanılan, suda çözünürlüğü çok düşük ve stabilite sorunu olan bir antikanser ajandır. Bu nedenle ticari formülasyonlarında Cremophor EL kullanılmaktadır. Bu sistemin nörotoksisite ve nöropati gibi ciddi yan etkileri vardır. Amfifilik siklodekstrinler kendiliğinden nanopartikül oluşturabilme yeteneğine sahip moleküllerdir. Bu özelliklerinden dolayı nano ölçekte ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmanın amacı farklı yüzey yüküne sahip amfifilik CD türevlerinden hazırlanan nanokürelerin in vitro özelliklerinin, hücresel etkileşiminin ve ilaç taşıma potansiyellerinin yanısıra yeni sentezlenen polikatyonik βcdc6 nın nanopartikül eksipiyanı olarak etkinliğinin ve güvenilirliğinin literatürde ilk kez belirlenmesi ve PCX in bu nanokürelerde stabil olarak enkapsüle edilmesidir. Negatif yüklü 6-O-CAPRO-β-CD nanoküre, pozitif yüklü kitosan kaplı 6-O-CAPRO-β-CD nanoküre ve βcdc6 nanoküre hazırlanarak; partikül büyüklüğü dağılımı, zeta potansiyel değeri, ilaç yükleme etkinliği ve in vitro salım profilleri belirlenerek formülasyonlar birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Farklı parametrelerle polikatyonik βcdc6 nanoküreler hazırlanmıştır. Uygun partikül büyüklüğü (<200nm) ile farklı yüzey yüküne sahip nanoküreler elde edilmiştir. Boş nanokürelerin 12 ay boyunca stabil kaldıkları gözlenmiştir. Pozitif yüklü nanoküreler, daha yüksek ilaç yükleme etkinliği göstermiştir. PCX yüklü nanoküreler 30 gün boyunca fiziksel stabilitelerini korudukları gözlenmiştir. Boş nanokürelerin L-929 hücrelerinde toksik etki göstermedikleri belirtilmiştir. Bununla birlikte PCX yüklü nanoküreler MCF-7 hücrelerinde PCX solüsyonuna göre daha fazla antikanser etkinlik göstermiştir. Anahtar Kelimeler: Paklitaksel, amfifilik siklodekstrin, polikatyonik, anyonik, nanoküre, formülasyon geliştirme, stabilite, yükleme etkinliği, salım, antitümöral etkinlik, meme kanseri Danışman: Doç.Dr. Erem Bilensoy, Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı i

5 Formulation of Paclitaxel Loaded Polycationic and Anionic Cyclodextrin Nanosphere for Breast Cancer Treatment and in vitro Evaluation Gamze Işık ABSTRACT Paclitaxel (PCX) is a well-known anti-cancer agent that has poor water solubility and poor stability displaying cytotoxic activity against breast cancer. The commercial formulation contains Cremophor EL. However this vehicle causes severe side effects such as neurotoxicity and neuropathy. Amphiphilic cyclodextrins have the ability to form self-organizing nanoparticles spontaneously. Due to their properties they have been used for the development of drug delivery systems in nanoscale. The aim of this study was to determine the effect of in vitro properties of amphiphilic CD nanospheres with different surface charges on cellular interaction and drug loading capacity as novel polycationic βcdc6 nanoparticle excipient, safety and efficacy and encapsulation of PCX stable physically. Negatively charged 6-O-CAPRO-β-CD, pozitively charged chitosan coated 6-O-CAPRO-β-CD and polycationic βcdc6 nanospheres were formulated. Mean particle diameter, zeta potential, drug loading and in vitro drug release profiles were determined and compared with each other. According to different parameters polycationic β-cdc6 nanospheres were prepared and in vitro characterization was performed. With the appropriate mean particle size(<200nm) different surface charged nanospheres were observed. Blank nanoparticles maintained their stability for 12 months. Positively charged nanoparticles displayed higher drug loading capacity. PCX loaded nanospheres maintained their stability for 30 days. Blank nanospheres have no cytotoxic effect against L-929 cells. In addition, PCX loaded nanospheres have higher anticancer effect when compared with the PCX solution against MCF-7 cells. Keywords: Paclitaxel, amphiphilic cyclodextrin, polycationic, anionic, nanosphere, formulation development, stability, loading, release, antitumoral efficacy,breast cancer Advisor: Assoc. Prof. Erem Bilensoy, Hacettepe University, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmaceutical Technology ii

6 TEŞEKKÜR Bu tez çalışması boyunca tüm bilgilerini ve imkânlarını bana cömertçe sunan ve yol gösteren saygıdeğer hocam Doç. Dr. Erem Bilensoy a, Hücre kültürü çalışmalarındaki desteklerinden dolayı sayın Prof.Dr. İmran Vural ve sayın Dr. Can Sarısözen e Yol gösterici tavsiyeleri ve yardımları için Ecz.(B.U.) Nazlı Erdoğar a Her anımda yanında dostlukları ve yardımlarını hiçbir zaman esirgemedikleri için Bio. Cem Varan ve Kim.Öğr. Hale Ünal a Eczacılık Teknolojisi Bölümü ndeki değerli hocalarıma, idari personelimize ve teknisyenlerimize Nanoteknoloji ve Nanotıp Anabilim Dalı başkanı sayın Prof. Dr. Süleyman Ali Tuncel ve değerli hocam Prof. Dr. Emir Baki Denkbaş ile araştırma görevlilerine değerli katkılarından dolayı teşekkürlerimi sunarım. Son olarak hayatımın her aşamasında yanımda olan ve bana verdikleri sonsuz manevi destek ve sevgileri için çok değerli anneme, babama ve kardeşlerime teşekkürü bir borç bilirim. iii

7 İÇİNDEKİLER DİZİNİ Sayfa ÖZ... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii İÇİNDEKİLER DİZİNİ... iv ŞEKİLLER DİZİNİ... viii ÇİZELGELER DİZİNİ... x SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... xi 1. GİRİŞ ve AMAÇ GENEL BİLGİLER Meme Anatomisi ve Fizyolojisi Kanser Kanser Hücresinin Gelişimi Meme Kanseri Epidemiyolojisi Etiyolojisi Sınıflandırma Tanı Yöntemleri Görüntüleme Yöntemleri Biyopsi Yöntemleri Tedavi Yöntemleri Cerrahi Yöntem Radyoterapi Hormonoterapi Kemoterapi Paklitaksel Paklitakselin Tarihsel Gelişimi Fizikokimyasal Özellikleri Farmakokinetik Özellikleri Farmakolojik Özellikler ve Etki Mekanizması Klinik Uygulamada Karşılaşılan Problemler Alternatif Formülasyon Yaklaşımları Siklodekstrin Siklodekstrinlerin Tarihsel Gelişimi Doğal Siklodekstrinler iv

8 Siklodekstrin Türevleri Amfifilik Siklodekstrinler Noniyonik Amfifilik Siklodekstrinler Katyonik Amfifilik Siklodekstrinler Anyonik Amfifilik Siklodekstrinler Siklodekstrin: İlaç İnklüzyon Kompleksi Siklodekstrinlerin Farmasötik Uygulama Alanları Siklodekstrin İçeren Ticari Formülasyonlar Nanoteknoloji Nanoonkoloji Nanopartiküler İlaç Taşıyıcı Sistemler Nanopartiküler İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Avantajları Hedeflendirme Pasif Hedeflendirme Aktif Hedeflendirme Nanokapsül ve Nanoküre Nanopartikül Hazırlama Yöntemleri Önceden oluşturulmuş polimerin dispersiyonu Emülsiyon bazlı yöntemler Nanopresipitasyon Koaservasyon Püskürterek Kurutma/Püskürterek Dondurma Süperkritik Sıvı Teknolojisi Monomerlerin Polimerizasyonuna Dayanan Yöntemler Emülsiyon polimerizasyon yöntemi Dispersiyon Polimerizasyon GEREÇ VE YÖNTEM Araçlar ve Gereçler Kimyasal Maddeler Biyolojik Materyal Aletler Yöntemler ve Deneyler Siklodekstrin Nanopartiküllerin Sentezlenmesi Boş Siklodekstrin Nanokürelerin Hazırlanması Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu Partikül Büyüklüğü Analizi Zeta Potansiyel Ölçümü v

9 Uzun Süreli Fiziksel Stabilite Çalışmaları Taramalı Elektron Mikroskopu (SEM) Paklitakselin HPLC Yöntemi ile in vitro Miktar Tayini ve Validasyonu Analitik Yöntem Validasyonu Kalibrasyon Doğrusallık Doğruluk Kesinlik Duyarlılık Özgünlük Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Hazırlanması İlaç Yüklü Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu Partikül Büyüklüğü Analizi Zeta Potansiyel Ölçümü Kısa Süreli Fiziksel Stabilite Çalışmaları İlaç Yükleme Etkinliğinin Belirlenmesi Nanopartiküllerden Paklitakselin In Vitro Salım Profilinin Belirlenmesi Paklitakselin Dilüsyon Testi Boş Nanopartiküllerin in vitro Güvenilirlik Testi Paklitaksel Yüklü Nanopartiküllerin in vitro Etkinlik Testi BULGULAR Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Ön Formülasyon Çalışmaları Siklodektrin Nanokürelerin Karakterizasyonu Partikül Büyüklüğü Dağılımı Zeta Potansiyeli Uzun Süreli Stabilite Testi SEM Görüntüleri Paklitakselin HPLC Yöntemi ile in vitro Miktar Tayini ve Validasyonu Analitik Yöntemin Validasyonuna Ait Bulgular Kalibrasyon Denklemine Ait Bulgular Doğrusallık Doğruluk Kesinlik Duyarlılık Özgünlük Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonuna Ait Bulgular vi

10 Partikül Büyüklüğü Dağılımı Zeta Potansiyeli Kısa Süreli Stabilite Testi İlaç Yükleme Etkinliğinin Belirlenmesi Paklitaksel Dilüsyon Testi İlaç Salım Profilinin Belirlenmesi Boş Siklodekstrin Nanopartiküllerin Güvenilirlik Çalışması Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanopartiküllerin Etkinlik Çalışması TARTIŞMA Amfifilik β-siklodekstrin Türevleri Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Ön Formülasyon Çalışmaları Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu Partikül Büyüklüğü Dağılımı Zeta Potansiyel SEM Görüntüleri Uzun Süreli Stabilite Paklitaksel in Analitik Yöntem Validasyonu Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu Partikül Büyüklüğü Dağılımı Zeta Potansiyeli Kısa Dönemli Stabilite İlaç Yükleme Etkinliğinin Belirlenmesi İn-vitro Salım Çalışmaları Paklitakselin Dilüsyon Çalışması Boş Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin in vitro Güvenilirlik Çalışması Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Etkinlik Çalışması SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR DİZİNİ EKLER ÖZGEÇMİŞ..130 vii

11 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Memenin anatomik yapısı... 3 Şekil 2.2. Memenin arterleri... 4 Şekil 2.3. Memenin lenfatik sistemi... 4 Şekil 2.4. Memenin gelişimi... 4 Şekil 2.5. Kanser hücrelerinin gelişimi... 6 Şekil 2.6. Meme kanserinin kadınlarda görülme sıklığı ve mortalite oranı... 7 Şekil 2.7. Meme kanserinde ırka bağlı görülme sıklığı ve mortalite oranı... 8 Şekil 2.8. İnvaziv ve İn situ kanserleşme Şekil 2.9. Aromataz inhibitörlerinin etki mekanizması Şekil Paklitakselin kimyasal yapısı Şekil Mikrotübüllerin oluşum mekanizması Şekil Paklitaksele alternatif yaklaşımlar Şekil Doğal siklodekstrinler Şekil β- Siklodekstrin türevleri Şekil Amfifilik siklodekstrin türevleri Şekil Etek şeklinde (solda) ve Medusa benzeri (sağda) Polikatyonik Amfifilik Siklodekstrinin (pacds) şematik gösterimi Şekil Farklı ilaç: siklodekstrin inklüzyon kompleksi oranları Şekil Tümör damar yapısı ve EPR etkisi Şekil Nanotaşıyıcıların tümöre farklı ilaç taşıma stratejilerinin şematik gösterimi Şekil Nanokürelere ilaç yükleme modelleri: a) hapsetmek, b) çözmek veya dağıtmak, c) adsorbe etmek Şekil Emülsiyon bazlı yöntemler ile nanopresipitasyon yönteminin karşılaştırılması Şekil O-Capro βcd Şekil 3.2. Polikatyonik βcdc Şekil 3.3. Nanopresipitasyon yönteminin şematik gösterimi Şekil 4.1. Farklı sürfaktan konsantrasyonlarının boş amfifilik siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü üzerine etkisi Şekil 4.2. Boş nanopartiküllerin zamana bağlı partikül büyüklüğü değişimi (± SS, n=3) Şekil 4.3. Boş nanopartiküllerin zamana bağlı polidispersite indeksi değerindeki değişim (± SS, n=3) viii

12 Şekil 4.4. Boş nanopartiküllerin zamana bağlı zeta potansiyel değerindeki değişimi (± SS, n=3) Şekil O-Capro β-cd nanokürelerine ait SEM görüntüleri Şekil 4.6. CS-6-O-Capro β-cd ve β-cdc6 nanokürelerine ait SEM görüntüleri.. 72 Şekil 4.7. Paklitaksele ait HPLC kromotogramı Şekil 4.8. Paklitakselin farklı konsantrasyonlarına ait HPLC piklerin toplu gösterimi Şekil4.9. Paklitaksele ait kalibrasyon eğrisi ve denklemi Şekil Paklitaksel ve formülasyondaki diğer maddelerin HPLC kromotogramının karşılaştırılması Şekil Boş ve ilaç yüklü nanopartiküllerin zamana bağlı partikül büyüklüğü değişimi (± SS, n=3) Şekil Boş ve ilaç yüklü nanopartiküllerin zamana bağlı polidispersite indeksi değerindeki değişim (± SS, n=3) Şekil Boş ve ilaç yüksüz nanopartiküllerin zamana bağlı zeta potansiyel değerindeki değişim (± SS, n=3) Şekil Seyreltme faktörüne bağlı salınan Paklitaksel miktarı (±SS, n=3) Şekil % Kümülatif salınan Paklitaksel miktarı(±ss, n=3) Şekil Boş siklodekstrin nanokürelerin L929 hücre yaşayabilirliğine etkisi (± SS,n=3) Şekil İlaç yüklü ve boş siklodekstrin nanokürelerin MCF-7 hücre yaşayabilirliğine etkisi (± SS,n=3) ix

13 ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Memedeki fizyolojik ve yapısal değişikliğe neden olan hormonlar... 5 Çizelge 2.2. Paklitakselin tarihsel gelişimi Çizelge 2.3. Paklitakselin organik çözücülerdeki çözünürlük değerleri Çizelge 2.4. Paklitakselin neden olduğu toksisite Çizelge 2.5. Doğal siklodekstrinlerin fizikokimyasal özellikleri Çizelge 2.6. Siklodekstrinlerin oral uygulamasına örnekler...35 Çizelge 2.7. Siklodekstrinlerin rektal uygulamasına örnekler Çizelge 2.8. Siklodekstrin içeren ticari preparatlara örnekler Çizelge 2.9. Nanoteknolojik ilaç taşıyıcı sistemlerin ticari preparat örnekleri Çizelge Nanopresipitasyon yönteminde parametrelerin partikül üzerindeki etkisi Çizelge 4.1. Ön formülasyon çalışmaları Çizelge 4.2. Nanoküre formülasyonlarının ortalama partikül büyüklüğü dağılımı (nm) ve polidispersite indeksleri (± SS, n=3) Çizelge 4.3. Nanoküre formülasyonlarının Zeta potansiyel değerleri (mv) (± SS, n=3) Çizelge 4.4. Paklitakselin geri kazanım yüzdeleri ve varyasyon katsayıları (n=6) 75 Çizelge 4.5. Paklitaksele ait tekrar edilebilirlik değerleri ve varyasyon katsayıları (n=6) Çizelge 4.6. Paklitaksele ait tekrar elde edilebilirlik değerleri ve varyasyon katsayıları (n=6) Çizelge 4.7. Paklitaksele ait günler arası farklılık değerleri ve varyasyon katsayıları (n=3) Çizelge 4.8. Paklitaksel yüklü nanoküre formülasyonlarının ortalama partikül büyüklüğü (nm) ve polidispersite indeksleri (± SS, n=3) Çizelge 4.9. İlaç yüklü nanoküre formülasyonlarının zeta potansiyel değerleri (mv) (± SS, n=3) Çizelge Yükleme etkinliği ve yükleme kapasitesi değerleri (±SS, n=3) x

14 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ CD CS DAD DCM DMEM DMSO EPR FBS HPLC LOD LOQ PCX PEG RES SS SEM VK WST-1 Siklodekstrin Kitosan Çoklu dalga boyu Diklorometan Dulbecco s Modified Eagle Medium Dimetil sülfoksit Artmış geçirgenlik ve tutulma etkisi Fetal sığır serumu Yüksek basınçlı sıvı kromotografisi Gözlenebilirlik sınırı Alt tayin limiti Paklitaksel Polietilen glikol Retiküloendotelyal sistem Standart sapma Taramalı elektron mikroskobu Varyasyon katsayısı Suda çözünür tetrazolyum tuzu xi

15 1. GİRİŞ ve AMAÇ Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanser türüdür. Meme kanseri, genetik, endokrin, diyet gibi faktörlerin hastalığın başlama, gelişme ve yayılmasında kritik rol oynadığı çok basamaklı bir hastalıktır. Günümüzde bu hastalığın tedavisinde uygulanan başlıca yöntem diğer kanser türlerinde de olduğu gibi kemoterapidir. Kemoterapi, kanser hücrelerini öldüren veya çoğalmalarını kontrol altında tutan kemoterapötik ajanların kullanılması ile gerçekleştirilen bir tedavi yöntemidir. Sıklıkla kullanılan bir tedavi yöntemi olmasına rağmen kemoterapide etkinlik ve güvenilirlik anlamında istenilen başarı elde edilememektedir. Bunun başlıca nedeni kemoterapide kullanılan antikanser ilaçların selektif olmayan toksisitesidir. Bunun dışında bir başka sorun antikanser ajanların çoğunun suda çözünürlüklerinin çok düşük olmasıdır. Çözünürlük sorununu ortadan kaldırmak için formülasyonlarda yardımcı çözücüler kullanılmaktadır. Ancak bu yardımcı çözücülerin aşırı duyarlılık reaksiyonları, nörotoksisite gibi ciddi yan etkileri bulunmaktadır. Bu yan etkileri ortadan kaldırmak amacıyla suda çözünürlüğü düşük olan antikanser ilaçların farklı taşıyıcı sistemlerle alternatif formülasyonları geliştirilmektedir. Amfifilik β-siklodekstrinler, doğal β- siklodekstrinlerin primer veya sekonder yüzeyinin uzun alifatik zincirler eklenmesiyle oluşturulan kimyasal türevleridir. Amfifilik siklodekstrinlerin yapısında bulunan uzun alifatik zincirler sayesinde hidrofobik ilaçlarla etkileşimleri artmaktadır. Amfifilik β-siklodekstrinlerin önemli bir başka özelliği ara yüzeylerde kendiliğinden bir araya gelerek nanokapsül ve nanoküre oluşturabilmeleridir. Bu özellikleri sayesinde özellikle son yıllarda nano boyutta ilaç taşıyıcı sistemler olarak kullanılmaktadır. Nanopartiküler sistemler, küçük boyutları, geniş yüzey alanları sayesinde ilaç taşıyıcı sistem olarak birçok avantaj sunmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında belirtilen özelliklerinden dolayı Amfifilik β- siklodekstrin nanoküreler taşıyıcı sistem olarak seçilmiştir. Bu amaçla çalışmalar kapsamında 6-O-Capro βcd, kitosan kaplı 6-O-Capro βcd ve polikatyonik βcdc6 siklodekstrin türevleri kullanılmıştır. 1

16 Bu çalışmada: Farklı yüzey yüküne sahip amfifilik siklodekstrin nanokürelerin hazırlanması ve in vitro karakterizasyonunun yapılması Yüzey yükünün amfifilik siklodekstrin nanokürelerin hücresel etkileşimleri ile ilaç taşıma potansiyelleri üzerine etkisinin belirlenmesi Yeni bir amfifilik siklodekstrin türevi olan polikatyonik βcdc6 nın nanoküre eksipiyanı olarak etkinliğinin ve güvenilirliğinin belirlenmesi Bunların sonucu olarak da daha güvenilir ve daha etkili kemoterapi sağlanması amaçlanmaktadır. Bu amaçla çalışma kapsamında hazırlanan farklı yüzey yüklerine sahip amfifilik β siklodekstrin nanokürelerin in vitro karakterizasyonu yapılacaktır. Boş ve Paklitaksel yüklü amfifilik siklodekstrin nanoküreler stabilite açısından değerlendirilmiştir. Yüzey yükünün ilaç yükleme etkinliği ve in vitro salım profili üzerine etkisi araştırılmış, formülasyonların güvenilirlikleri ve etkinlikleri hücre kültürü çalışmaları ile değerlendirilmiştir. Bulgular ışığında Paklitaksel için en güvenilir ve etkin formülasyon belirlenmiştir. 2

17 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Meme Anatomisi ve Fizyolojisi Meme, kadınlarda süt üretimi için düzenlenmiş farklılaşmış bir ter bezi, tubuloalveolar bir bezdir. Memeler toraksın üzerinde ve sternumun iki yanında 2. ile 7. kaburgalar arasına yerleşmiştir. Meme lobüller (süt bezleri) ve duktuslar (süt kanalları) olmak üzere iki kısımdan oluşur. Lobüller, lob adı verilen gruplarda toplanırlar ve her memede adet lob vardır [1]. Meme yapısında kas bulunmaz ancak göğüs duvarının en büyük kasları olan pektoral kas üzerine tutunmuşlardır [2,3] (Şekil2.1.). Şekil 2.1. Memenin anatomik yapısı [3] Meme yapısında çok geniş bir kan ve lenf damar ağı mevcuttur. Memenin kanlanması lateral torasik arter, arteria mammoria interna ve arteria interkostalislerden olmaktadır (Şekil 2.2). Memenin lenf damarları çok önemlidir. Meme kanseri hücreleri, lenf damarlarına girerek lenf nodlarına ulaşır ve burada büyümeye başlayabilirler. (Şekil 2.3) [2]. 3

18 Şekil 2.2. Memenin arterleri [2] Şekil 2.3. Memenin lenfatik sistemi [2] Memeler yaşam boyunca insan vücudunda en fazla değişime uğrayan yapılardır. (Şekil 2.4.) [4]. Doğumdan sonra, meme lobülleri terminal duktus lobüler üniteler olarak bilinen Tip 1 yapısındadır. Doğum sonrası ise Tip 4 yapısındadırlar ve aktif şekilde süt üretimini sağlarlar [5]. Şekil 2.4. Memenin gelişimi [5] Doğumdan menopoza kadar olan süreçte, hormonların kandaki düzeyine bağlı olarak meme yapısında değişiklikler görülür. Bu hormonlar arasında en çok rol oynayan östrojen hormonudur. Asıl olarak yumurtalıklardan salgılanır. Meme hücrelerinin bölünmesini arttırır. Damarlanmayı, çevre bağ dokusunun yapımını ve yağ dokusu birikimini sağlar [4,6,7]. Meme yapısında değişikliğe neden olan diğer hormonlar Çizelge 2.1. de açıklanmaktadır. 4

19 Çizelge 2.1. Memedeki fizyolojik ve yapısal değişikliğe neden olan hormonlar [7] Hormon Büyüme Hormonu Prolaktin Folikül Uyarıcı Hormon Lüteinize Edici Hormon Oksitosin Progesteron Etki Hücrelerinde boyutlarında ve bölünme oranında artışa yol açar, aminoasitlerin membranlardan geçişini arttırır Doğumdan sonra süt üretimini devamlılığını sağlar, süt bezlerini döşeyen hücre tabakasını aktif süt salgılayan salgı hücrelerine çevirir Yumurtalıklarda yumurta içeren foliküllerin gelişiminden sorumludur, östrojen salgılayan hücreleri uyarır Cinsiyet hormonlarının salgılanmasından sorumludur, kadınlarda her siklusta bir yumurta bırakılmasını sağlar Süt bezlerinin kasılmasını sağlar Gebelikte üretimi artar, süt ve salgı üreten yapıların farklılaşmasını sağlar 2.2. Kanser Kanser, genetik değişkenlik ve birden çok moleküler değişikliğin birleşmesi sonucu oluşan kompleks bir hastalıktır. Kontrolsüz hücre bölünmesi ve bu anormal hücrelerin yayılması ile karakterize edilir [8] Kanser Hücresinin Gelişimi Hücresel düzeyde kanserin gelişimi mutasyonları içeren çok aşamalı bir süreç sonunda çoğalma, canlı kalma, invazyon ve metastaz yetenekleri artan hücrelerin seçilmesi şeklinde ortaya çıkar. Kanser hücresinin gelişimi temelde üç aşamada açıklanmaktadır (Şekil 2.5.). Tümör başlangıcı: Kanserojen etkiye sahip kimyasal, fiziksel veya kalıtsal etkenlerin etkisi ile hücrenin yapısında geri dönüşümsüz değişiklikler meydana gelir. Tümörün tetiklenmesi: Kanser oluşumu için hücrede sekonder değişiklikler oluşur. Tümör ilerlemesi: Tümörün büyüme hızı artar, tümör gelişir ve yayılır [8]. 5

20 Şekil 2.5. Kanser hücrelerinin gelişimi Kanser hücresinin temel özelliklerinden birisi klonalite olması yani tek bir hücreden çoğalmasıdır. Tümörler sınırsız çoğalma yeteneği kazanan bir hücrenin anormal çoğalması ile meydana gelir. Ancak başlangıçtaki bu ilk hücre sonuçtaki kanserli hücrenin tüm özelliklerini taşımaz, çünkü her bölünme sırasında kanser hücresinde yeni değişiklikler meydana gelmektedir. Sağlıklı hücreler ile çevrili tek bir kanser hücresi kendini daha fazla oranda replike ederek ilk olarak küçük tümör kütlesi halini alır. Sağlıklı hücreler, bu tümör kütlesi ile besin için yarışamaz hale gelir. Tümör hücresi besin yetersizliğini dikkate almadan büyümeye devam eder ancak yetersiz besin varlığında birçok hücre kaybı olur. Tümörlerde difüzyon sınırlı maksimum büyüme yaklaşık 2mm 3 dür. Hücre toplulukları bu büyüklüğe kadar difüzyonla beslenirken, bu büyüklüğün üzerinde büyüyebilmesi için tümörün besini sağlayacak yeni kan damarlarını toplamasına ihtiyacı vardır. Bu nedenle anjiyogenez yani yeni damar oluşumu tümörler için çok önemlidir [9] Meme Kanseri Meme kanseri kısaca süt bezleri ve kanalları döşeyen hücrelerin kontrol dışı olarak çoğalmaları ve vücudun çeşitli yerlerine giderek çoğalmaya devam etmeleri olarak tanımlanabilir [10]. 6

21 Epidemiyolojisi Meme kanseri dünyada kadınlar arasında en sık görülen malign tümör olup kadınlarda görülen tüm kanserlerin yaklaşık % 30 unu oluşturmaktadır (Şekil 2.6) yılından bu yana meme kanseri görülme sıklığı yıllık %1.5 oranında genel bir artış göstermiştir [11]. Şekil 2.6. Meme kanserinin kadınlarda görülme sıklığı ve mortalite oranı Amerika Kanser Topluluğu nun verilerine göre Amerika Birleşik Devletleri nde 2011 yılında 230,480 yeni invasiv; 57,650 yeni In situ meme kanseri olgusu saptanmıştır yılında yaklaşık olarak yeni meme kanseri kaynaklı ölüm vakası beklenmektedir [11,13]. Ülkemizdeki duruma bakıldığında, Sağlık Bakanlığı Kanserle Savaş Daire Başkanlığı nın 2005 istatistik verilerine göre meme kanseri % 35,47 oranı ile Türkiye de de kadınlarda en sık görülen kanser türüdür [12] Etiyolojisi Meme kanserinin nedeni tam olarak anlaşılmamasına rağmen bazı faktörler ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Meme kanserine neden olan faktörler, belirli başlıklar altında toplanabilirler. 7

22 Cinsiyet: Meme kanseri nedenlerinin en başında cinsiyet gelmektedir. Tüm meme kanserlerinin %99 u kadınlarda, %1 i erkeklerde görülmektedir. Yaş: Yaş meme kanserinde en önemli risk faktörlerindendir. Yaş ilerledikçe meme kanseri insidansı artmaktadır. 40 yasın altında meme kanseri görülme sıklığı 1/235 oranında iken, yaş arası 1/25 oranında, yaş arasında 1/15 oranındadır [13]. Irk: Beyaz kadınlarda meme kanseri gelişme riski daha yüksek olmasına rağmen Afrika kökenli Amerikalı kadınların bu hastalıktan ölme riski daha yüksektir.(şekil 2.7.) [14]. Şekil 2.7.Meme kanserinde ırka bağlı görülme sıklığı ve mortalite oranı [15] Genetik Etkenler: Meme kanserinde ailesel yatkınlık, ilk olarak 1866 da Paul Broca tarafından ileri sürülmüştür. Kendi eşinin ailesinde dört nesil boyunca 24 kadının 10 unda meme kanserinin ortaya çıkması bu düşüncenin gelişmesine sebep olmuştur [15]. Dünya Sağlık Örgütü nün yaptığı açıklamaya göre aile öyküsü meme kanseri riskini 2-3 kat arttırmaktadır. Meme kanser olgularının, %20-30 unda aile öyküsü olmasına karşılık sadece %5-10 meme kanseri vakasında genetik yatkınlık saptanmıştır. Bu yatkınlığa neden olan en önemli genetik mutasyonlar başta BRCA1 ve BRCA 2 olmak üzere PTEN, TP53, MLH1, MLH2 vestk11 gen mutasyonlarını içerir. Bunlardan mutasyona uğramış BRCA1 genini taşıyan bir kadında 70 yıllık yaşam süresi boyunca meme kanserine yakalanma riskinin % 85 olduğu belirtilmiştir. BRCA1 mutasyonuna sahip kadınlarda puberteden sonra meme tümörlerinin gelişme riski %5-10 kat artar [16-20]. 8

23 Endokrin Faktörler: Menarş, menopoz, doğum ve laktasyon gibi doğurganlıkla ilişkili özelliklerle meme kanseri arasında ilişki vardır [21]. Erken menarşın meme kanseri gelişiminde bir risk faktörü olduğu gösterilmiştir [22]. Genel olarak menarşın her bir yıl gecikmesi ile meme kanseri riskinin % 20 azaldığı kabul edilmektedir [23]. Meme kanseri riski ile menopoz yaşı arasında da bir ilişki mevcuttur. Menopoza 45 yaşından önce giren kadınlarda meme kanseri riskinin azaldığı bilinmektedir [24-25]. Meme kanserinde östrojenin önemli rolü olduğunu bilinmektedir. Yapılan çalışmalarda dışarıdan verilen östrojenin meme kanseri oluşumunu arttırdığı, overlerin çıkartılmasının veya dışarıdan antiöstrojenlerin verilmesinin ise kanser oluşumunu azalttığı bildirilmiştir [7,26] Sınıflandırma Dünya Sağlık Örgütü meme kanserini histopatolojik açıdan aşağıdaki gibi sınıflandırmıştır [27-29]. İnvaziv Olmayan(In situ) Kanser Duktal Karsinoma In situ Lobüler Karsinoma In situ İnvaziv Kanser İnvaziv Duktal Karsinoma İnvaziv Lobüler Karsinoma Müsinöz Karsinom Medüller Karsinom Papiller Karsinom Tübüler Karsinom Adenoid Kistik Karsinom Sekretuvar (jüvenil) Karsinom Apokrin Karsinom Metaplastik Karsinom İnflamatuvar Karsinom 9

24 Kanser hücreleri, çevresindeki bazal hücreleri aştığında invaziv, aşmadığında ise In situ olarak adlandırılırlar. (Şekil 2.8) Şekil 2.8. İnvaziv ve In situ kanserleşme Tanı Yöntemleri Görüntüleme Yöntemleri Mamografi: Mamografi, meme dokusunun 2 plaka arasında sıkıştırılarak iki pozisyonda filmleri alınması temeline dayanır. Mamografi, dünyada en yaygın kullanılan meme kanseri erken tanı yöntemidir [30-32]. Ultrason: Mamografi ile birlikte en sık kullanılan yöntem ultrasondur. Mamografi veya klinik muayene sırasında saptanmış şüpheli kitleleri değerlendirme de kullanılır. Duktografi: Duktografi (galaktografi) meme kanallarını görüntüleme için kullanılan özel bir yöntemdir. İnce bir kanül yardımıyla meme kanalının iyotlu kontrast madde ile doldurulmasının takiben özel mamografik görüntüler alınır [33] Biyopsi Yöntemleri Biyopsi temelde şüpheli kitleden örnek alınması sonucu histopatolojik incelenmesi temeline dayanan bir yöntemdir. İnce iğne aspirasyon biyopsi ile cilt ince bir iğne yardımıyla geçilerek şüpheli kitleye ulaşıldıktan sonra iğnenin içine dokudan kopan hücrelerin alınması sonucu patolojik olarak incelenir [34]. Stereotaktik biyopside, kitlenin koordinatları mamografi veya mamografi benzeri cihazlarla belirlenerek, bu bölgeden doku örneği alınarak patolojik incelemeye gönderilmektedir [35]. 10

25 Tedavi Yöntemleri Cerrahi Yöntem Cerrahi yöntem, mastektomi sonrası meme şeklinin geri kazanılmasında, koltuk altı lenf nodlarına sıçrama olup olmadığını anlamak için veya ileri kanser vakalarında belirtileri hafifletmek için uygulanabilir [36]. Mastektomi: Meme dokusunun tamamının, bazı durumlarda ise yakın diğer dokularla uzaklaştırıldığı cerrahi yöntemdir. Bazı durumlarda ise meme dokusunun tutunduğu Majör pektoralis kasının rezeksiyonu yapıldığı radikal mastektomi uygulanır [37]. Meme Koruyucu Cerrahi: Lumpektomi olarak da adlandırılan bu cerrahi yöntemde memenin bir kısmı uzaklaştırılır Radyoterapi Radyoterapi, kanser hücrelerinin yüksek enerji ışınları ile öldürülmesidir. Cerrahi sonrası yeniden tümör oluşumunu engellemek için veya meme kanserinin metastazı durumunda kullanılan bir tedavi yöntemidir [30, 32, 37] Hormonoterapi Meme kanseri hücrelerinin %80 i östrojen pozitif ve östrojen pozitif meme kanserlerinin %65 i progesteron pozitiftir [37]. Hormon tedavisinde amaç, hormon reseptörü içeren kanser tiplerinde, hormonun etkisinin ortadan kaldırarak kanserin gelişmesinin önlenmesidir. Bu amaçla kullanılan 4 farklı tedavi yöntemi vardır [40]. 1)Aromataz inhibitörleri: En sık kullanılan hormonal tedavi yöntemidir. Aromataz enzimi, sitokrom p450 enzim kompleksine ait 19 karbonlu androjenlerin 18 karbonlu östrojenlere dönüşümü sırasında birbirini izleyen üç hidroksilasyon basamağını katalizleyen bir enzimdir. Tedavi sırasında vücuda verilen aromataz inhibitiöleri, aromatazı inhibe ederek östrojen sentezini bloke ederler.(şekil 2.9) 11

26 Şekil 2.9. Aromataz inhibitörlerinin etki mekanizması [39] 2)Seçici östrojen reseptör modülatörleri: Bu tedavide kullanılan ilaçlar, meme ve bazı diğer dokulardaki östrojen reseptörlerine yerleşerek östrojenin reseptörler ile buluşmasına engel olurlar. Bu amaçla klinikte en sıklıkla kullanılan ilaç Tamoksifen (Nolvadex )dir [40]. 3)Östrojen reseptör kısıcıları: Östrojen reseptör kısıcıları (ERD), östrojen reseptörlerine zarar verirler. Hücrede reseptör olmadığında, östrojen hücre içine giremez [40]. 4)Yumurtalık işlevinin durdurulması: Pre-menopozal kadınlarda yumurtalıkların östrojen üretimini durdurmasına dayanan tedavi yöntemidir. Yumurtalıkların östrojen üretimi, enjeksiyon şeklinde ilaç verilerek, yumurtalıklar alınarak (ooforektomi) veya düşük dozda radyasyon uygulanarak durdurabilir [40] Kemoterapi Kemoterapi, kanser hücrelerini öldüren veya çoğalmalarını kontrol eden kemoterapötik ajanların kullanılması ile gerçekleştirilen tedavi yöntemidir. Kemoterapinin etkinliği kullanılan ilaçlar, hastanın durumu, dozaj formu ve dozlama rejimi gibi birçok faktöre bağlıdır. Tümörü tamamen yok etmek ve hastayı iyileştirmek için, tümörün yayılmasını engellemek veya gerilemesini sağlamak için, tümörün sebep olduğu belirtileri yok etmek için kemoterapi uygulanır [40]. 12

27 Kemoterapi tek başına, ya da başka tedavilerin yanı sıra verilebilir. Diğer tedavilerin daha faydalı olmasına yardımcı olabilir. Uygulama amacına göre çeşitli kemoterapi türleri vardır [41]. Adjuvan tedavi: Ameliyat veya radyoterapi sonrası kanser hücrelerinin yeniden çoğalmasını engellemek için uygulanan kemoterapidir. Neoadjuvan tedavi: Tümör dokusunun büyüklüğünü azaltmak için operasyon öncesi uygulanan kemoterapidir. Metastatik tedavi: Yayılmış kanser hücrelerini öldürmek için uygulanan kemoterapidir Paklitaksel Paklitakselin Tarihsel Gelişimi Paklitaksel, Taxus brevifolia nın kabuklarından izole edilen doğal diterpendir [42]. Paklitaksel klinikte uygulanan ilk taksan türevidir. İlk olarak kemoterapiye dirençli meme ve ovaryum kanserli hastalarda palyatif (hafifletici) olarak kullanılmıştır. Ama günümüzde paklitaksel başlangıç tedavisi olarak kullanılmaktadır [43]. Paklitaksel, Ulusal Kanser Enstitüsü nün binlerce farklı bitkinin antikanser etkisini araştırdığı bir programda keşfedilmiştir. İlk olarak 1963 yılında Pasifik in kuzeybatısında, uzun yıllarda yetişen her zaman yeşil olan Taxus brevifolia isimli Pasifik porsuk ağacının işlenmemiş özütü elde edilmiştir ve klinik öncesi çalışmalarda çeşitli tümörlere karşı antitümöral etkisi olduğu gösterilmiştir yılında bu özütteki aktif bileşen olan paklitaksel tanımlanmıştır [43]. Paklitakselin gelişimi, yeni bir kimyasal yapı olması ve klinik öncesi çalışmalarda o dönemlerde araştırılan diğer etkin maddelere oranlara daha fazla antitümöral etkinlik göstermemesi ve sudaki düşük çözünürlüğü nedeniyle formülasyon probleminin olması nedeniyle uzun sürmüştür. Ancak yapılan tümör taraması sırasında ortaya çıkan paklitakselin benzersiz etki mekanizması, onun yeniden canlandırılmasını sağladı [43]. Paklitakselin tarihsel gelişimi Çizelge 2.2 de açıklanmıştır. 13

28 Çizelge 2.2. Paklitakselin tarihsel gelişimi [44,45] Tarih Gelişim Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) nün doğal ürünlerden antikanser ajanlar taraması 1967 Antitümör Aktivitesinin keşfedilmesi 1969 Saf Paklitakselin izolasyonu 1971 Kimyasal yapısının aydınlatılması 1979 Kendine özgü etki mekanizmasının açıklanması 1983 Faz I çalışmalarının başlatılması 1986 Aşırı duyarlılık reaksiyonlarının gözlenmesi 1988 NCI tarafından premedikasyonunun önerilmesi 1989 Ovaryum kanserinde etkinliğinin saptanması 1991 Meme kanserinde etkinliğin saptanması 1992 Küçük hücreli akciğer kanserinde etkinliğinin saptanması 1992 Ovaryum kanserinde kullanılmak üzere FDA tarafından onaylanması 1994 Meme kanserinde kullanılmak üzere FDA tarafından onaylanması 1997 AIDS ile ilişkili Kaposi s sarkoma tedavisinde kullanılmak üzere FDA tarafından onaylanması 1998 Sisplatin ile kombine olarak ilerlemiş yumurtalık kanserinde kullanılmak üzere FDA tarafından onaylanması 1999 Sisplatin ile kombine olarak küçük hücreli olmayan akciğer kanserinin ilk basamak tedavisi için FDA tarafından onaylanması 14

29 Fizikokimyasal Özellikleri Paklitaksel, beyaz renkte kristal toz yapıdadır. Oldukça lipofilik yapıdadır. Erime sıcaklığı C dir. Şekil da kimyasal yapısı gösterilmektedir. Kimyasal açık adı 5β, 20-epoksi-1,2α, 4, 7β, 10β, 13α-hekzahidroksitaks-11-en-9 on 4, 10- diasetat 2-benzoat-13 ester (2R,3S)-N-benzoil-3-fenilizoserin dir. Molekül formülü C 47 H 51 NO 14, moleküler ağırlığı 853,9 dalton dur [44]. Şekil Paklitakselin kimyasal yapısı [43] Paklitakselin sudaki çözünürlüğü 0,3 µg/ml dir. Ancak çeşitli organik çözücülerde nispeten daha fazla çözünürlük göstermektedir. Çizelge 2.3. te Paklitakselin çeşitli organik çözücülerdeki çözünürlük değerleri verilmiştir [46]. Çizelge 2.3. Paklitakselin organik çözücülerdeki çözünürlük değerleri [46] Organik Çözücü Çözünürlük (µg/ml) 2-propanol 14 Asetonitril 20 Diklorometan 20 Etanol 46 Metanol 12 İzopropanol 12 Triasetin 75 Metilen klorür 19 15

30 Farmakokinetik Özellikleri Paklitaksel yüksek oranda plazma proteinlerine bağlanmaktadır.(%88-98). Ortalama dağılım yarı-ömrü 0,34 saat; eliminasyon yarı-ömrü 5,8 saattir [47]. Plazmadan eliminasyonu bifazik olmaktadır. Başlangıçtaki hızlı düşüş merkezi kompartmanlara dağılmasına, sonra gözlenen faz ise periferik kompartmanlara sızıntı yapmasına bağlı olarak gerçekleşmektedir [43]. Paklitaksel oral yoldan absorbe olmamaktadır. Yapılan çalışmalarla Paklitakselin in nonlineer farmakokinetik özellik gösterdiği belirlenmiştir [48]. Paklitaksel büyük oranda P-450 aracılı hepatik metabolizmaya uğrar ve %10 undan daha azı değişmeden idrarla atılır [43]. Paklitaksel in metabolizasyon sonucu C6 ve C3 pozisyonları hidroksilasyona uğrar ve 6α-hidroksi-paklitaksel, 3'-p-hidroksi-paklitaksel ve 6α,3'- p-hidroksi-paklitaksel olmak üzere üç majör metabolit oluşur [48]. Yapılan bir çalışmada, sıçanlarda 6 saatlik infüzyonu takiben en yüksek Paklitaksel konsantrasyonu akciğer, karaciğer ve dalakta eser miktarda da beyin ve testislerde biriktiği gösterilmiştir [43] Farmakolojik Özellikler ve Etki Mekanizması 1979 yılında, Dr. Susan Band Horwitz yaptığı çalışmalarla Paklitakselin benzersiz etki mekanizmasını keşfetti. Paklitakselin tubulinlere bağlanması, onun klinik uygulamalar için öneminin artmasına neden olmuştur [43,47]. Paklitaksel antitümör etkisini hücrede mikrotübüllerin toplanmasını arttırmak ve depolimerizasyonunu önleyerek stabil mikrotübül toplulukları oluşturmak suretiyle göstermektedir [42]. Mikrotübüller, tüm ökaryot hücre sitoplazmasında bulunan içleri boş, silindirik yapılardır. Mikrotübüller hücre iskeletini oluşturan temel üç lif tipinin en kalın olanıdır. Çapları yaklaşık 25 nm, uzunlukları ise 25 µm ile 200 µm arasındadır. İçi boş olan tübül duvarı, tubulin adı verilen globüler proteinlerin oluşturduğu protofilamentlerden meydana gelmektedir. Her tubulin molekülü dimer yapıda olup, bu dimerdeki polipeptid alt birimleri birbirinden çok az farklı olan α-tubulin ve β- tubulindir [49]. Mikrotübüller, her iki uca tubulin alt birimlerinin eklenmesiyle uzarlar (polimerizasyon) veya tersi olarak uçlardan tubulin ayrılmasıyla kısalırlar (depolimerizasyon) ve hızlı büyüyen uca (+) son, yavaş büyüyen veya kısalmanın olduğu uca (-) son denir. Hareket, besin alımı, hücre şeklinin kontrolü, hücreler arası madde alışverişi ve hücresel sinyaller gibi çeşitli hücresel fonksiyondan 16

31 sorumludurlar [44,47]. Ancak temel görevleri hücre bölünmesi sırasında kromozomların ayrılması sağlamalarıdır. Şekil Mikrotübüllerin oluşum mekanizması [50] Mikrotübülleri birleşmesi ve ayrılması hücrede dinamik bir denge halindedir (Şekil 2.11). Mikrotübüllerde polimerizasyon GTP (Guanozin trifosfat )ye bağlıdır. Guanin RNA sentezi sırasında rol oynayan pürin nükleotitlerindendir. GTP, hücrede protein sentez, sırasında enerji kaynağı olarak kullanılır. GTP bağlı tübülün monomerleri mikrotübülünün artı ucuna eklenirken GTP nin hidroliz edilmesi ise tubulin moleküllerinin komşu moleküllere olan bağlanma eğilimini zayıflatır ve daha sonra GDP bağlı tubulin ayrışarak hızlı depolarizasyona ve mikrotübülün kısalmasına yol açar [50]. Paklitaksel hücreler üzerindeki etkisini iki yolla yapmaktadır. 1)Hücre Döngüsünü Bloke Etmek: Paklitaksel, kanser tedavisinde kullanılan, etkisini mikrotübüller üzerinde gösteren Vinca alkoloidleri olarak bilinen vinkristin ve vinblastin den farklı olarak tubulin proteinlerine bağlanarak mikrotübül yapılanmasını engellemek yerine stabilize ederek hücre bölünmesini 17

32 durdurmaktadır. Paklitaksel β tubulinde N-terminal 31 amino asite bağlanarak (rao- 2) hücrelerin G 2 /M evresinde kalmasına neden olmaktadır. Hücre siklus sırasında Mitotik faza geçemeyen hücreler bölünememekte ve G 1 kontrol noktası tarafından apoptozise yönlendirilmektedir. 2) Apoptozis: Paklitakselin apoptozis etki mekanizması ilk olarak 1993 yılında insan lenfoit lösemi hücrelerinde gösterilmiştir. Ardından bu konuda farklı hücre hatlarında ve çeşitli in vivo hayvan modelinde çok sayıda araştırma yapılmıştır. Apoptozis programlanmış hücre ölümü olarak tanımlanır. Hücre ve dokuların mekanik bir etki ve hasar olmaksızın belirli moleküler işlemler ve sinyaller sonrası hücrelerin kendiliğinden ölmesidir. Paklitakselin hücrelerin mitotik evreye geçmelerini engellemesi sonucu hücreler bölünememektedir. Mitotik evrede kalan hücre sayısındaki artış o hücreleri apoptozise yönlendirici sinyaller oluşmasına neden olmaktadır. Aynı zamanda yapılan çeşitli çalışmalarla Paklitakselin blc-2 adı verilen ve apoptozisi bloke eden proteine bağlanarak onu inhibe ettiğini göstermektedir. Böylece apoptozisin devam etmesine izin vermektedir [51-55] Klinik Uygulamada Karşılaşılan Problemler Paklitaksel, günümüzde klinikte sıklıkla Taxol ticari preparatı olarak kullanılmaktadır. Paklitaksel ticari preparatlarında, Cremophor EL: etanol (1:1) karışımından oluşan taşıyıcı kullanılarak formüle edilmektedir. Paklitakselin çözünme probleminin önüne geçmek için kullanılan Cremophor EL (polietoksillenmiş hint yağı) non-iyonik amfifilik bir sürfaktandır [56]. Paklitaksel terapötik indeksi dar bir ilaçtır. Genellikle mg/m 2 kadar doz 3 veya 24 saatlik infüzyon şeklinde verilir. Maksimum tolere edilebilir doz 3 saatlik infüzyon sonucu hastalarda mg/m 2 bulunmuştur [44]. Artan ilaç konsantrasyonu ile birlikte plazma konsantrasyonunun artması ancak klirensin ve dağılımın azalması paklitakselin lineer olmayan farmakokinetik özelliğe sahip olduğunu göstermektedir. Paklitakselin klinik uygulamadaki en büyük sorunu suda çözünürlüğünün düşük olmasından kaynaklanmaktadır. Ticari preparatlarda vehikül olarak kullanılan Cremophor EL un ciddi sitotoksik etkilerinin olduğu bilinmektedir (Çizelge 2.4) [57]. Cremophor EL aşırı duyarlılık reaksiyonları, nefrotoksisite ve nörotoksisiteye 18

33 neden olmaktadır. Bununla birlikte letarji, nefes almada güçlük ve vazodilatasyona bağlı hipotansiyona neden olmaktadır. Preklinik ve klinik testler sonucunda öldürücü aşırı duyarlılık reaksiyonlarına neden olduğu gösterilmiştir. Cremophor ve yardımcı çözücü etanolün neden olduğu bir başka sorun ise infüzyon setleri ile geçimsizlik göstermeleridir. Hem etanol, hem de Cremophor un, polivinil klorür infüzyon torbalarından dietilheksilftalatı (DEHP) açığa çıkardıkları belirtilmiştir [58-60]. Bunu engellemek için cam, polipropilen veya poliolefin kaplarda saklama önerilmektedir. Ancak; bu çeşit saklama kaplarının teminatı sınırlıdır. Karşılaşılan en önemli problemlerden birisi de Cremophor EL ve etanolün hastaya uygulama sırasında aynı kataterden Paklitaksel ile birlikte uygulanan diğer ilaçlar ve eksipiyanları ile etkileşime girmeleri stabilitelerinde bozulmaya neden olmalarıdır [44,61-64]. Çizelge 2.4. Paklitakselin neden olduğu toksisite [44] a) Doz sınırlayıcı toksik etkiler Nötropeni, mukoza iltihabı, nörotoksisite, aşırı duyarlılık b) Farklı sistemlere toksik etkiler Kardiyovasküler Asemptomatik bradikardi, atriyoventriküler blok, atriyal aritmi, ventriküler taşikardi, iskemi Hematolojik Nötropeni, trombositopeni Aşırı duyarlılık Nörotoksisite Gastrointestinal sistem Hepatotoksisite Diğerleri Dispne, hipotansiyon, ürtiker Periferal nöropati, miyalji, Mukoza iltihabı, mide bulantısı, kusma, diyare Karaciğer fonksiyonlarında artış Alopesi(saç dökülmesi), miyopati, pulmoner yağ embolisi 19

34 Alternatif Formülasyon Yaklaşımları Paklitakselin alternatif formülasyon yaklaşımlarındaki temel amaç, çözünürlüğünü arttırarak günümüzde kullanılan Cremophor EL nin neden olduğu sistemik toksisitenin önüne geçmektir. Bununla birlikte Paklitakselin çözünürlüğüne bağlı olarak etkinliğinde artış, uzun süreli stabilitesi ve büyük ölçekli üretim imkanı da hedeflenmektedir [43]. Son yıllarda literatürde çok sayıda farklı formülasyon geliştirme çalışmaları vardır (Şekil 2.12). Şekil Paklitaksele alternatif yaklaşımlar [43] Yardımcı çözücü: Paklitaksel gibi non-polar ilaç molekülleri genellikle suda düşük çözünürlüğe sahip moleküllerdir. Bu moleküllerin çözünürlükleri, ilacın çözünebildiği ve su ile karışabilen iyi bir çözücü yardımıyla arttırılabilir [65]. Bu nedenle suda çözünmeyen ilaçların intravenöz formülasyonlarında yardımcı çözücü kullanılır. Bu yöntemle etkin madde yardımcı çözücü içerisinde çözünerek, ortamdaki suyun etkin madde üzerindeki hidroliz yapıcı etkisi en aza indirilmektedir. Ancak bu yöntemde en sık karşılaşılan problem formülasyonların intravenöz sıvı veya kanla karşılaşması sonucu çökelti oluşmasıdır [43]. Bununla birlikte Cremophor EL da olduğu gibi yardımcı çözücülerin de istenmeyen yan etkileri ile karşılaşmak mümkün olmaktadır. Paklitakselin yardımcı çözücü ile formülasyonunda başka bir yaklaşım ise etanol, Polisorbat 80 ve Pluronic L64 (3:1:6) nın kullanıldığı çalışmadır [66]. Bu yaklaşım sonucu Paklitakselin çözünürlüğü 5 mg/ml olarak bulunmuş ve yapısında herhangi bir değişiklik olmadan üç ay stabil kaldığı gözlemlenmiştir. Ancak su ile dilüsyonu sonrası 20

35 sadece üç gün stabil kaldığı gösterilmiştir. Hidrofilik yapısından dolayı Paklitaksel formülasyonlarında sıklıkla kullanılan bir diğer madde ise polietilen glikoldür. Literatürde %75 PEG 400 içeren sulu çözeltide Paklitaksel çözünürlüğünün 16 mg/ml olduğu gösterilmiş ancak infüzyon için dilue edildiğinde çökelti oluşmuştur [67]. Bununla birlikte PEG 400: Paklitaksel formülasyonunun, implante edilmiş B16 melanoma hücrelerinde intraperitonal uygulama sonrası etkinliğinin Paklitakselin sulu süspansiyonu ve Cremophor EL içeren formülasyonundan daha az olduğu belirtilmiştir. Emülsiyon: Birbiri içinde çözünmeyen iki veya daha fazla sıvının sıvının emülgatör varlığında oluşturduğu heterojen karışımlar emülsiyon olarak adlandırılmaktadır. Yağ/ su emülsiyonları bazı antineoplastk ilaçların çözünürlüğünü ve stabilitesini arttırmak için kullanılan uygun yaklaşımlardır. Ancak bazı emülsifiye edici ajanların hemolitik reaksiyonlar gibi ciddi toksik etkileri bulunmaktadır. Tarr ve Yalkowsky [66], yaptıkları bir çalışmada iç faz olarak triasetin kullandıkları yağ/su emülsiyonunda Paklitakselin çözünürlüğü 10 mg/ml bulmuşlardır. Ancak, terapötik doz için gerekli olan triasetinin tek başına farelere intravenöz uygulandığında toksik etki yaptığı gözlenmiştir. Bu nedenle bu formülasyonda antitümör etkinlik gözlenememiştir. Yapılan bir başka çalışmada, PLGA (polilaktid- ko- glikolid) içeren emülsiyon formülasyonlarında çözünürlüğünün arttığı ve kontrollü salımın sağlandığı gösterilmiştir [45]. Ön İlaç: Paklitakselin çözünürlüğü arttırmak ve sentezini kolaylaştırmak için üzerinde çok çalışılan alternatif formülasyon yaklaşımlarından biri de ön ilaçtır. Ön ilaç, ana etken maddenin aktif olmayan türevidir. Aktif olmayan ön ilaç vücuda girdiği zaman hidroliz veya enzimatik degradasyon nedeniyle aktif forma dönüşerek etki göstermektedir [42]. Ancak ön ilaç hazırlanması zor ve pahalı bir işlemdir. Aynı zamanda etkin maddenin yapısında meydana gelen değişiklikler istenmeyen farmakokinetik ve farmakodinamik özelliklere yol açabilir. Paklitakselin, suda düşük çözünürlüğü olması nedeniyle sulu formülasyonu ve yapısında fonksiyonel grup olmaması nedeniyle tuz formu bulunmamaktadır. Paklitakselin ön ilaç formülasyonları ile ilgili en temel çalışma Mellado ve arkadaşları tarafından C-2 hidroksil grubunun fonksiyonelleştirilebilmesi ile yapılmıştır [68]. Bu pozisyondaki türevler hidrolizle, enzimatik veya kimyasal 21

36 reaksiyonlarla kolayca oluşturulabilmektedir. Bazı Paklitaksel C-2 esterleri ile ön ilaç çalışmalarında sıklıkla araştırmalar yapılmaktadır. Süksinat ve glutarat türevleri, sülfonik asit türevleri, amino asit türevleri bunlar arasında en çok çalışılanlarıdır. Bütün bu türevler Paklitaksel için yeterli olan suda çözünürlüğü sağlamakta ve in vivo çalışmalarda başarılı sonuçlar vermektedir [69]. Ancak sulu çözeltilerinde kimyasal stabil olmadıklarından ön ilaç formülasyonları için uygun olmadıkları gözlenmiştir. Araştırılan esterler içerisinde en uygun olanının, 2 -[3- (N,N-dietilamino)propionil] Paklitaksel olduğu bulunmuştur. Stabil yapısından dolayı ön ilaç formülasyonu için uygun bir esterdir. Çalışmalar sonucu yarılanma ömrünün 5 dakikadan fazla olmadığı, uzun süre stabil kaldığı ve B16 melanoma hücre hattı üzerinde yapılan in vivo araştırmalarda Paklitaksel ile aynı antitümöral etkinliğe sahip olduğu gösterilmiştir [70]. Lipozom: Lipozomlar, bir veya daha fazla lipid membrandan oluşan aralarında sulu faz bulunan veziküllerdir. Bu veziküller, yağda çözünen ilaçları lipid membranları arasında enkapsüle ederek intravenöz taşınımını sağlarlar [43,45]. Lipozom formülasyonlarında karşılaşılan en büyük problem stabil olmamalarıdır. Lipozomlar, enkapsüle ettikleri ilaçların farmakokinetik ve farmakodinamik özelliklerini değiştirerek toksisitelerini azaltıp, etkinliklerini arttırmaktadırlar [71]. Straubinger ve arkadaşlarının [72] çalışmasında 300 ün üzerinde lipozom formülasyonu geliştirilmiş, formülasyonlar etkinlik ve stabilite açısından incelenmiştir. Taxol dirençli mürin tümörü Colon 26 tümörü ile yapılan in vivo çalışmada Paklitaksel içeren lipozom formülasyonlarının tümörün gelişimini durdurdukları görülmüştür [73]. Yapılan çalışmalar lipozom bazlı paklitaksel taşıyıcı sistemlerin klinikte kullanım açısından umut vaad ettiğini göstermektedir. Miseller: Misel yapılar, hidrofilik ortamda hidrofobik ilaçların çözünmesini sağlayan, ilacı içerisine fiziksel olarak hapseden polimerik ilaç taşıyıcı sistemlerdir. Misel yapılar partikül büyüklüklerinin küçük olması ( nm) nedeniyle retiküloendoteliyal sisteme yakalanmadıkları ve dayanıklı yapıları sayesinde pasif hedeflendirmede kullanılmaya uygundur [75]. Miseller biyolojik olarak parçalanabilen, toksik olmayan polimerlerden yapılabilirler. 22

37 Mikro/Nanopartikül: Paklitaksel için formülasyon geliştirme çalışmalarında en sık kullanılan taşıyıcılar mikro/nanopartiküler sistemlerdir. Antikanser ilaçların biyoparçalanabilir polimerler kullanılarak hazırlanan mikropartikül veya nanopartiküllerle taşınması, ilacın kontrollü salımını sağladığı için hem etkinliği arttırmakta hem de sistemik toksisitenin önüne geçmektedir [43]. Nanopartiküllerin boyutları nedeniyle mikropartiküllere göre ilaç taşıyıcı sistem olarak çeşitli üstünlükleri bulunmaktadır. Nanopartiküller olası iritasyonların önüne geçebilmek için intravenöz uygulamanın yanı sıra intramüsküler ve subkütan enjeksiyonla da uygulanabilirler. Uzun süre stabil kalmaları nanopartikülleri lipozomlardan ayıran en önemli özellikleridir. Bununla birlikte lipozomlara göre daha dayanıklı yapıda olmaları ve daha fazla etkin madde hapsedebilmeleri en büyük avantajlarındandır. Değişik hazırlama yöntemi ve farklı polimerler kullanılarak çok geniş aralıkta partikül büyüklüğü ve farklı yüzey yüküne sahip partiküller elde edilebilir. Bu özellik, nanopartiküllerin pasif hedeflendirmede kullanılmalarında ve yüzey yüküne bağlı olarak tümörlü bölgede toplanmalarında önemli rol oynar. Nanopartiküler ilaç taşıyıcı sistemlere alternatif bir diğer yöntem ise ilaç etkin maddesinin uygun bir makromoleküle konjuge edilerek taşınmasıdır. Bu alanda albümin, globülin gibi doğal veya sentetik polimerler kullanılmaktadır. Albumin bağlı nanopartikül (nab) teknolojisi kullanılarak 2005 yılında meme kanserinde kullanılmak için FDA tarafından onay alan Abraxane, Paklitakselin insan serum albümine konjuge edilmiş, 130 nm partikül büyüklüğüne sahip formülasyonudur [76]. Albümin, insan ve diğer memeli hayvanların kan plazmasında bulunan en yaygın proteindir. Kanda bulunan proteinlerin %60'ını oluşturur. Ayrıca, doku sıvılarında, özellikle kas ve deride de bulunur. Yağ asitleri ve çeşitli başka maddelerin kanda taşımasının yanı sıra en önemli işlevi, kan ile doku sıvıları arasında suyun dengelenmesini sağlamaktır. Toksik olmaması, doğal bir polimer olması, antijenik özellik taşımaması nedeniyle ilaç taşıyıcı sistemlerde tercih sebebidir. Albümin 1972 yılında FDA tarafından ilaç taşınımında kullanılması onaylanmıştır. Albüminin en önemli özelliği yapısında, suda çözünmeyen ilaçların bağlanabileceği hidrofobik bölgelerin bulunmasıdır. Her bir ilacın albümine bağlanma sayısı ilacın moleküler yapısına bağlıdır. Paklitakselin tek albümine yedi farklı bölgeden bağlandığı bilinmektedir. Abraxane ın, Taxol e göre çok sayıda avantajı bulunmaktadır. Bunlardan en önemlisi Abraxane ın yapısında hiçbir 23

38 sürfaktan ve çözücü içermemesidir. Bu sayede Taxol formülasyonunda bulunan Cremophor EL nin neden olduğu toksisite ortadan kalkmaktadır. Bununla birlikte ilacı plazmaya uzun sürede ve sürekli salarak depo etkisi sağlar ve bunun sonucunda da infüzyon süresini kısaltır. Toksik etkisinin bulunmaması nedeniyle haftalık tolere edilebilen maksimum doz miktarı Taxol e göre % daha fazladır [76-79]. Siklodekstrin: Siklodekstrinler, suda çözünürlüğü düşük olan ilaçların çözünürlüklerini, biyoyararlanımlarını ve dissolüsyon oranlarını arttırmak için kullanılan siklik oligosakkaritlerdir. Kararsız ilaçların stabilitelerini arttırarak intravenöz uygulamada etkinliklerini güçlendirirler. Hidrofilik dış yapı ve lipofilik iç kaviteden oluşurlar. Hidrofobik etkin maddeleri lipofilik iç kavitelerine hapsederek çözünürlüklerini arttırırlar. Doğal siklodekstrinlerin yapılarından kaynaklanan toksisitenin önüne geçebilmek için genellikle kimyasal olarak modifiye edilirler. Bu modifikasyon aynı zamanda siklodekstrinler, enkapsüle ettikleri ilaçların çözünürlük, stabilite, biyoyararlanımı gibi fizikokimyasal özelliklerini değiştirmelerine olanak sağlar [42,44]. Yapılan bir çalışmada, Paklitakselin çözünürlüğünü arttırmak için hidroksipropil β- CD (HPβCD) ile inklüzyon kompleksi oluşturulmuştur. Çalışmanın sonucunda HPβCD ile kompleks oluşturan ilacın, serbest ilaca göre daha hidrofilik olduğu gösterilmiştir [44]. Yapılan başka bir çalışmada ise Paklitakselin α-cd ile kompleksi oluşturulmuş ancak Paklitakselin geniş halkasal yapısı hesaba katıldığında, paklitaksel için formülasyonlarda daha geniş kaviteye sahip β-cd ve γ-cd lerin daha uygun olduğu düşünülmektedir [80]. Araştırmalar β-cd in Paklitakselin çözünürlüğünü 950 kat arttırdığını ve klinikte kullanılan uygun konsantrasyonun kolayca elde edilebildiğini göstermektedir [43] Siklodekstrin Siklodekstrinler (CD), nişastanın glukanotransferaz (CGTase) enzimi tarafından parçalanması sonucu endüstriyel olarak üretilebilen doğal polimerlerdir [81]. Siklodekstrinler, α-1,4-d(+)-glukozidik bağlı glukopiranoz ünitelerinden oluşmaktadırlar [82]. Siklodekstrinler, makrosiklik oligosakkarit bileşiklerdir [83]. Siklodekstrinler, halkasal moleküllerdir ancak glukopiranoz üniteleri arasındaki bağlarda serbest rotasyon olmadığında toroidal veya huni şeklindedirler. Primer 24

39 hidroksil gruplar dar yüzeyde, sekonder hidroksil gruplar ise geniş yüzeylerde yer alır. Halka yapısı tepesi kesilmiş koniğe benzemektedir. C6 karbon atomunun C2 ve C3 hidroksil gruplarına göre rotasyon yapabilmesinden dolayı siklodekstrin boşluğu sona doğru daralmaktadır. Siklodekstrin moleküllerinin yapısında bulunan iç kavite sekonder C-H bağları nedeniyle hidrofobik özellik gösterir. Dış yüzey ise hidrofilik yapıdadır [84] Siklodekstrinlerin Tarihsel Gelişimi Siklodekstrinler ilk olarak 1891 yılında Fransız bilim adamı Villiers tarafından keşfedilmiştir. Villers 1000 gram nişastadan yaklaşık olarak 3 gram kristal ürün izole etmiştir ve ürünün kompozisyonunu (C 6 H 10 O 5 ).3H 2 O olarak belirlemiştir. Elde ettiği bu ürüne selüloz gibi asit hidrolizine dirençli olduğu için selülozin adını vermiştir yılında Avusturyalı mikrobiyolog Franz Schardinger, yiyeceklerde bozulmaya neden olan bakteriler üzerinde yaptığı bir çalışma sırasında, patates nişastasının bakteriler tarafından parçalanması sonucu oluşan iki kristal bileşik tanımlanmıştır. Bunları A ve B olarak isimlendirdi ve B bileşiğini A bileşiğine göre çok daha fazla miktarda izole edebildi yılında Schardinger tarafından yayınlanan makalede bileşiğin ismi kristalin dekstrin olarak değiştirilerek A ve B bileşikleri α-dekstrin ve β- dekstrin olarak adlandırıldı. Ardından 8 yıl boyunca yaptığı çalışmalarla patates, mısır ve buğday gibi farklı kaynaklardan, farklı bakteri enzimleri ile bu bileşikleri izole edebilmeyi başardı yılında yayınladığı bir makalede siklodekstrinlerin kimyasal yapılarını açıklamıştır. O yıllarda bu konuda fazla bilgi olmamasına rağmen bu çalışma siklodekstrin kimyasının temeli kabul edilmektedir yılında Freudenberg, γ siklodekstrini keşfetti ve 1938 yılında siklodekstrinlerin α(1-4) bağlı glukoz ünitelerinden oluşan halkasal yapısını gösterdi. Ardından Cramer yaptığı çalışmalarla, α,β ve γ-siklodekstrinlerin yapılarını ve çözünürlükleri, kompleks oluşturabilme kabiliyetleri, iç kavite büyüklükleri gibi fizikokimyasal özelliklerini tanımladı [85-89] Doğal Siklodekstrinler Doğal siklodekstrinler, yapılarında bulunan glukopiranoz ünitesinin sayısına göre adlandırılırlar. Bunlar arasında farmasötik açıdan önem taşıyanlar α siklodekstrin (6 ünite), β-siklodekstrin (7 ünite) ve γ-siklodekstrin (8 ünite)dir. 25

40 Yapılarında bulunan glukopiranoz ünite sayılarına bağlı olarak hidrofobik kavite hacmi ve çapları değişmektedir (Şekil 2.13). Şekil Doğal siklodekstrinler [88] Yapısal faktörler ve gerilme nedeniyle 6 glukopiranoz ünitesinden daha az sayıda ünite içeren siklodekstrin bulunmamaktadır ancak 9-13 arasında ünite içerenler vardır ve bunlar ortak olarak δ-cd olarak adlandırılır. Çünkü bunlardan yapısı en iyi aydınlatılmış olanı 9 üniteli olan δ-cd dir [82]. Doğal siklodekstrinler kristal yapıda, homojen, higroskopik olmayan makrosiklik yapılardır. Siklodekstrinler, 4 C 1 sandalye konformasyonuna sahiptir. Hidrofobik kavitedeki H atomları ile glikozidik O köprülerinin eşleşmemiş elektron çiftleri kavitenin içine doğru yöneldikleri için kavitede yüksek elektron yoğunluğu gösterirler. Glukopiranoz ünitesindeki C-2 hidroksil grup komşu glukopiranoz ünitesindeki C-3 hidroksil grup ile H bağı oluşturur. β-siklodekstrinin ikinci kemeri bu hidrojen bağlarından oluşmaktadır. Bu nedenle β-siklodekstrin diğer doğal siklodkstrinlere göre daha katı yapıdadır ve çözünürlüğü en azdır. α-siklodekstrinin yapısındaki glukopiranoz ünitelerinden birisi bükük yapıda olduğu için hidrojen kemerleri tam değildir. 6 hidrojen bağından sadece 4 tanesi biçimlenmiştir. γ-siklodekstrinler ise doğal siklodekstrinler içerisinden yapısı en esnek ve suda çözünürlüğü en fazla olandır [82,98]. Doğal siklodesktrinlerin en önemli fiziksel ve kimyasal özellikleri Çizelge 2.5. te gösterilmiştir. 26

41 Çizelge 2.5. Doğal siklodekstrinlerin fizikokimyasal özellikleri [88-90] Özellik α-cd β-cd γ-cd Glukopiranoz ünite sayısı Moleküler ağırlık (g/mol) Suda çözünürlük(25 o C,g/L) Dış çap (Å) 14,6 15,4 17,5 Kavite çapı (Å) 4,7-5,3 6,0-6,5 7,5-8,3 Yükseklik (Å) 7,9 7,9 7,9 Kavite hacmi (Å 3 ) pk a değeri 12,3 12,2 12,1 Erime noktası ( o C) Yarılanma ömrü (1M HCL, 60 o C,saat) 6,2 5,4 3,0 Doğal siklodekstrinlerin, oral uygulama sonrası ince bağırsakta hidroliz olmadıkları ancak hidrolizin sadece kolonda meydana geldiği bilinmektedir. Siklodekstrinler, sadece serbest son grupları degrede eden β-amilaza karşı dirençli oldukları için nişastadan daha yavaş metabolize olurlar. Siklodekstrinler içinde α-cd en yavaş, γ-cd ise en hızlı parçalanır. Oral uygulamalarında herhangi akut toksisiteye neden olmazlar. Uzun süreli uygulama sonucunda organlarda ve biyolojik değerlerde belirgin bir değişikliğe neden olmamaktadır [91]. Doğal siklodekstrinlerin parenteral uygulamaları belirgin farklılıklar göstermektedir. β-siklodekstrinlerin intramüsküler (kas içi) uygulaması ülser oluşumuna; intravenöz (damar içi) uygulaması ise nefrotoksisiteye ve hemolize neden olmaktadır. γ-siklodekstrinde ise yüksek suda çözünürlüğü nedeniyle α-cd ve β-cd den daha az nefrotoksisite ve hemolize neden olduğu bilinmektedir [89,91] Siklodekstrin Türevleri Doğal siklodekstrinlerin suda çözünürlükleri, yapılarındaki hidroksil grupları arasında bulunan hidrojen bağları nedeniyle lineer dekstrinlere göre oldukça 27

42 düşüktür [83,85]. Aynı zamanda α- ve β-cd in nefrotoksisiteye neden olduğu bilinmektedir. Parenteral uygulama sonrası siklodektrinlerin, böbrek tübül hücreleri tarafından alındığı ve bunun sonucunda hücre içi fonksiyonlarda bozulma olmaktadır. Doğal siklodekstrinlerin kırmızı kan hücrelerinde hemolize neden olmaları ve kolesterol ve fosfolipid gibi membran bileşenlerinde bozulmaya neden olmaları diğer dezavantajlarıdır [90]. Doğal siklodekstrinlerin neden olduğu bu durumların önüne geçebilmek için kimyasal yöntemlerle siklodestrinler modifiye edilerek yeni türevleri elde edilmektedir. Doğal siklodekstrinlerin modifikasyon nedenleri aşağıdaki gibi özetlenebilir: Doğal siklodekstrinlerin (özellikle β-cd) suda çözünürlüğünü arttırmak Doğal siklodekstrinlerin en önemli yan etkisi olan nefrotoksisiteyi ortadan kaldırmak Siklodekstrinlerin biyolojik membranlardan geçişini arttırmak Siklodekstrinlerin inklüzyon kompleksi kapasitelerini arttırmak Hemolizi önlemek Siklodekstrinlere kendiliğinden organizasyon özelliği kazandırarak kolloidal ilaç taşıyıcı sistem oluşturmak Modifiye edilen doğal siklodekstrinler içerisinde farmasötik alanda en çok üç grup kullanılmaktadır (Şekil 2.14): metillenmiş siklodekstrin, hidroksipropillenmiş siklodekstrin sülfobütillenmiş siklodekstrin 28

43 Şekil β- Siklodekstrin türevleri [99] Metillenmiş siklodekstrin türevleri, her bir glukopiranöz ünitesine iki veya üç tane hidroksil grubunun metilasyonu ile elde edilir. İki hidroksil grubunun metillenmesi durumunda dimetil siklodekstrin (DM-CDs) oluşur ve metillenme bütün C6 primer hidroksil ve bütün C2 sekonder hidroksil gruplarında seçici olarak gerçekleştirilir. Üç hidroksil grubu metillendiği zaman ise trimetil siklodektrin (TM-CDs) oluşur ve bu durumda DM-CDs sentezine ek olarak bütün C3 sekonder hidroksil grupları da metillenir [83]. Metillenmiş siklodestrin türevlerinin, esas alınan siklodekstrinlere göre çözünürlükleri daha fazladır. Örneğin; β-siklodekstrinin 25 o C deki çözünürlüğü 1,85 g/100 ml dir. Bu değer DM-CDs de 57 g/100 ml; TM-CDs de 31g/100 ml dir [91]. Hidroksipropillenmiş siklodekstrin türevlerinde, metillenmiş siklodekstrindeki gibi seçici sübstitüsyon gerçekleşmez. Siklodekstrin içindeki hidroksillerin sayısı sabit olmasına rağmen reaksiyon ilerledikçe hidroksil reaktivitesi değişir. Bu durum farklı derecelerde sübstitüsyon içeren ürünler oluşmasına yol açar. Hidroksipropil siklodekstrinler, amorf yapıları nedeniyle suda çok yüksek oranda çözünürler. Çözünmeleri endotermiktir ve artan sıcaklığa bağlı olarak çözünürlüğünde azalma gerçekleşmez. 25 o C de 50g/100ml den fazla çözünürlüğe sahiptirler. Metillenmiş siklodekstrinlerin aksine, gastro-intestinal amilaz ile hidrolize olmazlar. Parenteral uygulamalarında, temel alınan siklodekstrine göre daha az hemolitik aktivite gösterirler [91]. 29

44 Sülfobütileter siklodekstrinler, anyonik ve suda çözünen siklodekstrin türevidir [92]. Diğer siklodekstrin türevlerinden üstün olmasını sağlayan özelliği sübstitüsyon derecesi artışına bağlı olarak ilaca bağlanmada artış olmasıdır. İlaç stabilitesini arttırır. Polianyonik yapıya bağlı olarak daha az hemolize neden olur [90] Amfifilik Siklodekstrinler Doğal siklodekstrinlerin çözünürlüğünü arttırmak için sentezlenen siklodestrin türevlerinde meydana gelen en büyük sorun iç yüzeyinin olduğu kadar dış yüzeyinin de hidrofilik özellikte olmasıdır. Çünkü bu durum biyolojik membranlarla siklodekstrinlerin temasının azalmasına neden olmaktadır. İstenmeyen bu sonucun önüne geçebilmek için son yıllarda farklı amfifilik siklodekstrin türevleri sentezlenmektedir [93]. Amfifilik siklodekstrinlerin sentezlenmesinin diğer nedenleri ise siklodekstrinlerin yapısına uzun alifatik zincirler eklenerek hidrofobik ilaçlarla etkileşimini arttırmak ve fizyolojik ph da ve sulu ortamda kendiliğinden biraraya gelerek nanoküre ve nanokapsül oluşumuna imkan sağlamak olarak sıralanabilir [90]. İlk amfifilik siklodextrin 1986 yılında Kawabata tarafından sentezlenmiştir. β-cd in primer yüzeyini çeşitli uzunluktaki alkilsülfinil gruplarıyla hidrofobik yapmıştır [94]. Şekil Amfifilik siklodekstrin türevleri [90] 30

45 Noniyonik Amfifilik Siklodekstrinler Noniyonik amfifilik siklodekstrinler, siklodekstrinlerin glukopiranoz ünitelerinin primer veya sekonder yüzeyine farklı uzunlukta alifatik zincirler eklenmesi sonucu elde edilirler. Yapılarına göre farklı türevleri vardır (Şekil 2.15). Lolipop siklodekstrinler 6-amino-β-siklodekstrinlerin yapısına sadece bir alifatik zincir eklenmesiyle elde edilen amfifilik siklodekstrin türevleridir. Bu siklodestrin türevinde, alifatik zincir siklodekstrinin kavitesine girerek molekülle inklüzyon kompleks oluşumunu engelleyebilir. Bu durumu engellemek için alifatik zincirlerin ucuna çok sayıda terbütil grubu eklenebilir. Bu şekilde elde edilen siklodekstrin türevi kap ve top siklodekstrindir. Medusa benzeri siklodekstrin sentezi sırasında β- siklodekstrinlerin primer hidroksil gruplara karbon içeren uzun zincirler eklenir. Etek şeklinde siklodekstrinlerde, α ve γ- siklodektrinlerin sekonder yüzeylerine 2-14 karbon içeren alifatik esterler eklenir. Buket şeklinde siklodekstrinler, 3-monometil-β-siklidekstrinlerin toplamda 14 olmak üzere her iki yüzeyine de polimetilen zincirlerin eklenmesiyle sentezlenir Katyonik Amfifilik Siklodekstrinler Katyonik amfifilik siklodekstrinler son yıllarda üzerinde yoğunlaşılan siklodekstrin türeleridir. Katyonik amfifilik siklodekstrin türevlerinin hazırlanmasında iyonik grup olarak amino grupları kullanılmaktadır. Katyonik amfifilik siklodekstrinlerin oluşumunun, yapısındaki hidrofobik kuyruk (tiyoalkil zincirleri) ile hidrofilik bileşenleri (etilen glikol oligomerleri) arasındaki dengeye bağlı olduğu düşünülmektredir. Etilen glikol zincirlerinin varlığının, katyonik siklodekstrinler tarafından meydana getirilen çok moleküllü agregatların kolloidal stabilitesini artırdığına inanılmaktadır [90]. İlaç ve özellikle gen taşınımında son yıllarda poliamino (polikatyonik) siklodekstrinler kullanılmaktadır (Şekil 2.16.). Katyonik polimerler, nükleik asitlere ve nükleotitlere yüzey yüklerinden dolayı kolayca bağlanabilmektedir. 31

46 Şekil Etek şeklinde (solda) ve Medusa benzeri (sağda) Polikatyonik Amfifilik Siklodekstrinin (pacds) şematik gösterimi [96] Katyonik/Polikatyonik siklodekstrinlerin, en önemli avantajı gen taşınımında in vitro ve in vivo çalışmalarda poli(amidin) gibi polimerlere karşı daha düşük sitotoksisite göstermesidir [95-97]. Katyonik siklodekstrinler de nükleotidleri bağlama/ nükleotidlere büyük bir bağlanma eğilimi gösterirler ve viral vektörler ile taşınımını artırırlar. Polikatyonik CD lerin ve bunlardan hazırlanan nanopartiküllerinin en büyük avantajı, bu polimerlerin kendi organize olabilme özellikleri ile beraber nükleik asitlerle etkileşime girebilme yeteneklerinin artmasıdır. Böylece gen tedavisinde kullanılmaya yönelik polipleksler olarak öne çıkmaktadırlar [90] Anyonik Amfifilik Siklodekstrinler Anyonik amfifilik siklodekstrin türevlerinin hazırlanmasında anyonik özellikteki sülfat grupları kullanılmaktadır. Açil-sülfatlanmış-β-CD lerin eldesi için, siklodekstrinin primer yüzüne sülfat gruplarının, sekonder yüzüne ise yağ asidi esterlerinin bağlandığı, etkin ve spesifik bir sentetik yol açıklanmıştır [98]. Bu türevleri sulu ortamlarda agregat oluşturabilirler. Yapılan çalışmada, Sul-β-siklodekstrinin ve SBE7-β-siklodekstrinin in vivo ve in vitro insülin glarjinin çözünürlüğünü ve etkinliğini arttırdığı gösterilmiştir [100]. Florin içeren anyonik β-siklodekstrinler, ilk olarak Granger ve arkadaşları tarafından 6 pozisyonuna triflorometilthio gruplarının bağlanması ile elde edilmiştir. Hava-su ara yüzünde amfifilik bir davranış elde etmişler ve bunu yeni sınıf amfifilik taşıyıcılar için iyi bir aday olarak düşünmüşlerdir [90]. 32

47 Siklodekstrin: İlaç İnklüzyon Kompleksi Siklodekstrin molekülünün merkezi kavitesi apolardır. İnklüzyon kompleksi oluşturmak için sulu çözeltilerde uygun büyüklükteki molekülün tamamı veya bir kısmı bu lipofilik kaviteye tersinir olarak hapsedilir [84]. Genellikle ilaç molekülü ile siklodekstrin arasında 1:1 stokiometrik oran beklenmektedir ancak bazı bileşiklerde 1:2 veya 2:1 oranında kompleks oluşumu da gözlenebilir (Şekil 2.17). 1:1 1:2 2:1 Şekil Farklı ilaç: siklodekstrin inklüzyon kompleksi oranları İnklüzyon kompleksinin avantajları aşağıdaki şekilde sıralanabilir [101]. Çözünürlüğün Arttırılması: Siklodekstrinlerin inklüzyon kompleksleri, suda çözünürlüğü düşük olan ilaçların, yapılarında bulunan apolar molekül veya fonksiyonel grupları yardımıyla çözünürlüğünü arttırmaktadır. Siklodekstrinlerin dış yüzeyleri hidrofilik olduğu için, çevre ile temas halindedir ve ilacı hidrofobik kavitesinde saklayarak sulu çevreden korur. Biyoyararlanımın Arttırılması: Antikanser ilaçların genellikle sudaki çözünürlükleri düşük oldukları için biyoyararlanımları da düşük olmaktadır. Bu etkin maddelerin siklodekstrinlerle formülasyonu biyoyararlanımda artış sağlamaktadır. Oral uygulamada absorbsiyonun ilk koşulu etkin maddenin formülasyondan çözünmüş halde salınmasıdır. İlaçlar vücuda siklodekstrin içinde verildiğinde çözünme oranı ve buna bağlı olarak biyoyararlanımı artmaktadır. Aynı zamanda siklodekstrinlerin, ilacın hidrofobik özelliğini azaltması rektal ve perkütan absorbsiyonunu da arttırmaktadır. 33

48 Stabiliteyi arttırmak: Siklodekstrinler ilaçların kimyasal, fiziksel ve termal stabilitelerini arttırmaktadır. Kavitesinde taşıdığı aktif molekülü; oksijen degredasyonundan, kimyasal enzimlerden, su, radyasyon ve ısıdan koruduğu için stabil kalmasını sağlar. İrritasyonu Azaltmak: İlaçların, inklüzyon kompleksi oluşturularak uygulanması serbest ilacın biyolojik membranlarda lokal konsantrasyonunu azaltacağı için meydana gelecek irritasyonun da önüne geçilir. Tat ve Koku Maskelemesi: İlaç molekülü siklodekstrinlerin fonksiyonel grupları tarafından iç hidrofobik kavitede saklanacağı için uygulama sonrası sensör reseptörlerinde uyarı oluşturmazlar. İstenmeyen tat ve koku maskelenmiş olur Siklodekstrinlerin Farmasötik Uygulama Alanları İlaç etkin maddesinin, hücre membranına ulaşabilmesi için sudaki çözünürlüğünün yeterli olması gerekmektedir. Ancak hücreye ulaştıktan sonra da hücre membranından geçebilmesi için yeterince hidrofobik özellikte olması gerekmektedir [89]. Siklodekstrinlerin en önemli özellikleri biyolojik membranlar boyunca, ilaç taşınımını arttırmasıdır. Siklodekstrinler moleküler ağırlıkları dalton arasında olan, hidrofilik dış yapıya sahip büyük moleküllerdir ve bu şartlarda biyolojik membranlardan güçlükle geçerler [102]. Bu nedenle lipofilik membranlar, hidrofilik siklodekstrin molekülüne düşük afinite gösterirler. Alkol ve yağ asidi gibi konvansiyonal penetrasyon arttırıcılar, biyolojik bariyerlerin lipid tabaka yapısını bozarlar. Ancak siklodekstriler, ilacın yapısında değişikliklere neden olarak biyolojik membranlarla temasını arttırır. Farmasötik aktif ajanların büyük çoğunluğu hidrofobik yapıdadır. Bu sorunun önüne geçebilmek için konvansiyonel formülasyon sistemlerinde birden fazla organik çözücünün kombinasyonu, sürfaktan veya aşırı ph değişiklikleri kullanılmaktadır ve bunlar iritasyonla birlikte istenmeyen yan etkilere sebep olmaktadırlar. Buna karşılık siklodekstrinler iritan etki göstermezler ve ilacın stabilitesini arttırmak, kötü tat ve koku maskelemek gibi aktif ajan üzerinde çeşitli avantajları vardır. 34

49 Siklodekstrinlerin ilaç etkin maddesinin çözünürlüğünü arttırması, ilacın biyoyararlanımını arttırarak uygulanacak terapötik dozun ve doza bağlı istenmeyen yan etkilerin azalmasını sağlayabilir [89]. Oral İlaç Taşınması: Oral uygulama bütün uygulama yolları arasında en popüler olandır. Oral uygulama sırasında ilacın salımı, çözünürlük, difüzyon, osmotik, yoğunluk ve ph gibi parametreler tarafından kontrol edilir. Siklodekstrinler oral uygulamada özellikle ilaçın absorbe edileceği lipofilik gastrointestinal sistem boyunca geçişini kolaylaştırmada eksipiyan olarak kullanılırlar [101]. α- siklodekstrin ve β-siklodekstrinlerin tükürük ile hidroliz olmamaları ilaç: siklodekstrin inklüzyon komplekslerinin oral uygulama için kullanılabilmesinin mümkün olduğunu göstermektedir (Çizelge 2.6). Oral uygulama için siklodekstrinlerin sahip olduğu en önemli avantajlardan birisi de kötü tat ve koku maskelenmesidir. Doğal siklodekstrinler ve bunların türevleri (sülfatlanmış α- siklodekstrin, sülfatlanmış β-siklodekstrin, karboksimetil β-siklodekstrin) ağız içinde kötü kokuya neden olan organik asit, amin ve amino asit gibi bileşiklerin maskelenmesinde kullanılmaktadır [103]. Kötü tat maskelemede iki yöntem vardır: Siklodekstrinlerin kötü tat oluşumuna neden olan molekül ile inklüzyon kompleksi oluşturması sonucu molekül ile tat tomurcukları arasındaki temasın azalması Siklodekstrinlerin tat alma tomurcuklarında lokalize olmuş bekçi olarak adlandırılan proteinlerle etkileşimi sonucu proteinleri paralize etmesi Çizelge 2.6. Siklodekstrinlerin oral uygulamasına örnekler Siklodekstrin türevleri Aktif Molekül Referans CM-β-CD Laktik asit ve süksinik asit [103] β-cd Flurbiprofen [104] β-cd; γ-cd; HP- β-cd; DM- β-cd Cilostazol [105] β-cd; HP- β-cd Efavirenz [106] HP- β-cd; Paklitaksel [107] β-cd; HP- β-cd;nh- β-cd Paklitaksel [108] HP- β-cd Rifampisin [109] 35

50 Çizelge 2.6. devam ediyor β-cd; HP- β-cd Gefitinib [110] Sülfobütileter- β-cd Dosetaksel [111] Me-β-CD Dosetaksel [112] Me-β-CD Karmofur [113] Me-β-CD Sakuinavir [114] Nazal İlaç Taşınması: Gastrointestinal bozulma ve yüksek hepatik ilk geçiş etkisi nedeniyle düşük biyoyararlanım gösteren yüksek potensli ilaçların, sistemik salımı için yeni bir uygulama alanı nazal yoldur [101]. Siklodekstrinler, biyolojik bariyerlerin yapısını bozmadan ilaçların etkinliklerini arttırırlar. Bu özellikleri siklodekstrinlerin nazal ilaç salım sistemi olarak uygulanmasında kullanılmasının en önemli nedenleridir. Nazal preparatlar bakteri, toz gibi alerjenler üzerinde solunum sisteminde koruyucu görev yapan mukosiliyallerin fonksiyonlarında olası etkileri açısından ciddi anlamda değerlendirilmelidir. Bu açıdan serbest steroidlerin aksine, siklodekstrin komplekslerinin kaviteleri, içerdikleri moleküllerin kendine özgü toksisitesini gizledikleri için epitel membranlar üzerinde herhangi bir etki göstermemişlerdir [115]. Oküler İlaç Taşınması: Oftalmik ilaç taşınmasında en büyük problem gözün drenaj ve gözyaşı nedeniyle hızla ilaç kaybıdır [83]. İlaç göz içinden konjuktiva, kornea ve sklera membranları (lipofilik) boyunca penetre olmak durumundadır. Bu membranlar gözyaşı sıvısı ve müsin tabakası ile çevrilidir. Bu nedenle oftalmik ilaçlar gözün dış kısmından (gözyaşı sıvısı ve müsin tabakası) içeri girebilmek için hidrofilik olmak zorundadır, ancak aynı zamanda oküler bariyerlerden gözün iç kısmına penetre olabilmek için yeterli oranda lipofilik özellik de göstermek zorundadırlar [116]. Bu bağlamda siklodekstrinler ilaçların çözünürlüğünü ve korneal permeabilitelerini artırmak açısından alternatif bir yaklaşım sunabilirler. Yapılan çalışmalarla oftalmik ilaçların siklodekstrinlerler ile inklüzyon komplekslerinin, ilaçların kimyasal 36

51 yapılarını ve aktivitelerini değiştirmeden suda çözünürlüklerini artırdığı bulunmuştur [ ]. Dermal İlaç Taşınması: Transdermal ilaç taşınması ve ilacın salımı, bu yolla uygulanan birçok bileşik için bir bariyer görevi gören stratum korneum tabakası yüzünden sınırlanmaktadır. Bu nedenle, ilacın absorbsiyonunu artırmak için birçok metot test edilmektedir. Deri üzerinden ilaç taşınmasını artırmak için 4 farklı yaklaşım öne sürülmektedir [83]: Transdermal preparatlardan ilacın salımını artırmak İlacın deride tutulmasını veya deri boyunca akışını geliştirmek Dokuya hedeflendirilebilmesini artırmak (lokalize ilaç taşınması) İlk dört maddenin kombinasyonunu sağlamak Bu kriterleri sağlamak için çeşitli sürfaktanlar, lipozomlar, geçirgenlik artırıcılar, iyon çiftleri kullanılmıştır. Son yıllarda ise kimyasal olarak modifiye edilmiş CD lerin çeşitli türevleri, hem sistemik hem lokal olarak ilaçların dermal yoldan taşınmasında hazırlanmıştır [120]. Siklodekstrinlerin, dermal ilaç taşınımında kullanılabilmesi için terapötik açıdan inert olmaları, derinin ısıdan, radyasyondan koruma gibi doğal fonksiyonlarına engel olmamaları, deri ph ını değiştirmemeleri, iritasyona neden olmamaları ve derinin bileşenleri ile etkileşime girmemeleri gerekir [100]. Rektal İlaç Taşınması: Rektal mukoza ilk geçiş etkisi yüksek olan, gastrointestinal ph dan etkilenen, kötü tat ve kokulu ilaç moleküllerinin taşınması için alternatif bi yoldur. Çocuklar, bebekler, mide bulantısı görülen hastalar ve yaşlılar için rektal yol çok önemli bir ilaç taşınım sistemidir. Ancak, ilaçların rektal yolla uygulanmasında şu zorluklarla karşı karşıya gelinmektedir: İlaçların çoğu rektal mukozadan güçlükle absorbe olur Rektal mukozada absorbiyon yüzey alanı sınırlıdır 37

52 Rektumdaki az miktardaki sıvı varlığından dolayı etkin olmayan çözünme gerçekleşir. Bu dezavantajların üstesinden gelebilmek için absorbsiyon artırıcılar, misel karışımları ve polimerler, sürfaktanların yanısıra siklodekstrinler kullanılarak çok sayıda çalışmalar yapılmıştır (Çizelge 2.7). Çizelge 2.7. Siklodekstrinlerin rektal uygulamasına örnekler Özellik Etken madde Referans İlaç salımının arttırılması İnsülin [121] Rektal absorbsiyonun arttırılması Morfin [122] Rektal iritasyonun azaltılması Prednizolon [123] Biyoyararlanımın arttırılması Morfin [124] Siklodekstrin İçeren Ticari Formülasyonlar Siklodekstrin veya siklodekstrin türevleri ile çeşitli ilaç gruplarının oluşturduğu inklüzyon kompleksleri, Türkiye de ve Dünya da ticari formülasyonlarda kullanılmaktadır. Siklodekstrinlerin çözünürleştirici madde olarak kullanıldığı oral ve injektabl ticari formülasyonlardan bazıları Çizelge 2.8 de gösterilmiştir. Çizelge 2.8. Siklodekstrin içeren ticari preparatlara örnekler [84,85,125] İlaç/ Siklodekstrin Ticari İsim / Firma Formülasyon Endikasyon α- Siklodekstrin içeren ürünler OP-1206 Opalmon Tablet Buerger hastalığı Sefotiam heksetil (HCl) Pansporin T Tablet Antibiyotik β-siklodekstrin içeren ürünler Beneksat HCl Ulgut Kapsül Antiülser Sefalosporin (ME 1207) Meiact Tablet Antibiyotik Deksametazon Glymesason Merhem Analjezik, Antienflamatuar Difenhidramin HCl Stada-Travel Çiğneme Tableti Antihistaminik Nikotin Nicorette Dil altı tableti Sigara bağımlılığı Nimesulid Nimedex Tablet Analjezik, Antipiretik Nitrogliserin Nitropen Dil altı tableti Koroner dilatör Omeprazol Omebeta Tablet Protein pompası inhibitörü 38

53 Çizelge 2.8.devam ediyor Piroksikam Brexin Tablet, Supotizuvar Analjezik, antifilojistik 2-Hidroksipropil-β-siklodekstrin içeren ürünler Itrakonazol Sporanox Oral ve i.v. solüsyon Antifungal Mitomisin Mitozytrex i.v. infüzyon Antineoplastik Indometazin Indocid Göz damlası Antienflamatuar Hidrokortizon Dexocort Dilaltı Hormon Metillenmiş β-siklodekstrin içeren ürünler Kloramfenikol Clorocil Göz damlası Antimikrobiyal 17β-Estradiol Aerodiol Burun spreyi Menapoz semptonları Sülfobütileter β-siklodekstrin içeren ürünler Vorikonazol Vfend i.v. solüsyon Antifungal Aripiprazol Abilify i.m. solüsyon Şizofreni Maropitant Cerenia Parenteral solüsyon Antiemetik Ziprasidon mesilat Geodon IM solüsyon Antipsikotik 2-Hidroksipropil-γ-siklodekstrin içeren ürünler Diklofenak sodyum Voltaren Göz damlası Antienflamatuar 2.5. Nanoteknoloji Nanoteknoloji, kısaca maddeyi moleküler ve atomik seviyede kontrol edebilen bir bilimdir. Yunanca cüce anlamına karşılık gelen nano kelimesinden türetilmiştir. Nanoteknoloji kelimesi ilk olarak 1974 yılında Norio Taniguchi tarafından yayınlanan bir makalede kullanılmıştır. Taniguchi, nanoteknolojiyi genel olarak malzemelerinnin atom ya da molekül işlenmesi, ayrılması, birleştirilmesi ve bozulması olarak tanımlamıştır [126]. Günümüzde nanoteknolojinin NNI ( National Nanotechnology Initiative) tarafından yapılan ve US EPA (United States Environmental Protection Agency) tarafından da kabul edilen temelde aşağıdaki 3 unsuru içeren tanımı kullanılmaktadır: En az 1 boyutu nm arasında olan, atomik, moleküler ve makromoleküler seviyede araştırmalar ve teknolojik gelişmelerin yapılması Üretilen ve kullanılan bu cihaz, sistem ve yapıların küçük boyutları sayesinde yeni özellik ve fonksiyonlara sahip olmaları Yapılan bu sistemlerin atomik boyutta kontrol edilebilmesi [126,127] 39

54 Nanoonkoloji Nanoonkoloji, kanser tanı, teşhisinde ve tedavisinde nano ölçekte yapılan tüm uygulamalardır. Nanoonkoloji çalışmaları tanıya yönelik çalışmalar (diagnostik) ve tedaviye yönelik çalışmalar (terapötik) olmak üzere temelde ikiye ayrılır. Bununla birlikte nanoteknolojideki gelişmeler sayesinde tanı ve tedavinin birlikte yapıldığı sistemlerin de oluşturulması planlanmakta ve bu konuda çeşitli çalışmalar yapılmaktadır [128,129]. Günümüzde farklı nanotaşıyıcı sistemler kullanılarak formüle edilmiş ticari preparatlar mevcuttur (Çizelge 2.9.). Çizelge Nanoteknolojik ilaç taşıyıcı sistemlerin ticari preparat örnekleri [130] Etken Madde Ticari İsim Nanotaşıyıcı Endikasyon Neokarzinestotin Zinostatin Polimer-protein konjugatı Hepatoselüler karsinoma PEG-L-asparajinaz Oncaspar Polimer-protein konjugat Akut lenfoblastik lösemi PEG-granülosit koloni stimüle edici faktör Neulasta Polimer- protein konjugat Kemoterapi nedenli nötropeniyi önlemek IL2 difteri toksini Ontak Kemo-immüno konjugat KütanözT-hücresi lenfoma Anti CD33 antikorkalikamisin Mylotarg Radyo-immüno konjugat Akut miyelgenöz lösemi Anti-CD20- İodine-131 Bexxar Radyo-immüno konjugat Non-Hodgin lenfoma Daunarubisin DaonuXome Lipozom Kaposi sarkomu Doksorubisin Mycoset Lipozom Meme kanseri, ovaryum kanseri, Kaposi sarkomu Doksorubisin Doxil PEG-lipozom Meme kanseri, ovaryum kanseri Vinkristin Onco TCS Lipozom Non-Hodgin lenfoma Paklitaksel Abraxane Albümin Metastatik meme kanser 40

55 Kemoterapi ilaçları hastalara genellikle intravenöz veya oral yolla uygulanmaktadır. Her iki yolla da vücuda verilen ilacın kanser ücresi üzerinde terapötik etki gösterebilmesi için çeşitli biyolojik bariyerlerden geçmesi gerekmektedir [131]. İlacın vücuda girdikten sonra karşılaştığı bariyerler aşağıda belirtildiği gibi sınıflandırılabilir [31]: Fiziksel bariyerler (örn: gastrointestinal kanaldan ve deriden absorbsiyon) Fizyolojik bariyerler (örn: retiküloendotelyal sistem, p-glikoprotein pompası gibi hücresel ilaç atım mekanizmaları) Biyofiziksel bariyerler (örn: tümörün damar yapısı, interstisyel basınç, tümör yüzeyindeki reseptörlerin çeşidi ve yoğunluğu) Farklı yollarla vücuda verilen ilacın terapötik etki gösterebilmesi için bu bariyerlerden yapısında bir değişiklik olmadan geçtikten sonra istenilen konsantrasyonda tümörlü bölgede toplanması gerekmektedir. Kanser hücrelerinin sahip olduğu çeşitli özellikler nedeniyle ilacın tümörlü bölgede toplanması her zaman kolay olmamaktadır. Nanoonkoloji alanında yapılan çalışmaların temel amacı, ilacı çeşitli partiküler taşıyıcı sistemler ile vücuda verilip bu mekanizmaları atlatarak tümörlü bölgeye ulaştırılmasını sağlamaktır [31]. Antineoplastik ajanların vücut içinde karşılaştığı bazı engelleyici mekanizmalar aşağıdaki gibidir: Terapötiklerin dolaşımdan uzaklaştırılması: Damar içi yolla uygulanan terapötik moleküllerin hedefleme bölgesine ulaşabilmek ve terapötik etkilerini göstermek için sistemde yeterince uzun süre dolaşmaları gerekmektedir. Ancak retiküloendotelyal sistem (RES) olarak adlandırılan karaciğer, dalak, kemik iliği kan ve lenf sistemi elemanlarından oluşan çoklu savunma sistemi, dolaşımda bulunan yabancı maddeleri çok kısa sürede dolaşımdan uzaklaştırmaktır. Tek bir ilacın dolaşım yarılanma ömrü ortalama 5 dakika ile sınırlıyken, aynı ya da daha fazla dozda ilaç içeren partiküler formülasyonlar sistemik dolaşıma uygulandığında bu süre birkaç saate kadar çıkmaktadır [31]. Bu amaçla kullanılan polietilen glikol (PEG), nanopartikül sistemlerinin yüzeylerini zırh gibi örterek RES tarafından tanınmasını engeller ve dolaşımda daha uzun süre kalmalarını sağlar. İlaç yeterli süre dolaşımda kaldıktan sonra kılcal damarlarla etki göstereceği dokuya ulaşmalıdır. 41

56 Kılcal damarların ortalama çapı 5-10 µm dir. Bu sebeple 5 μm den büyük çaplı partiküller vasküler embolizasyona neden olabilirler [132]. Ancak nm den küçük partiküller ise dokuya ulaşmadan, sistemik dolaşımda bulunan fenestra adı verilen boşluklardan damar dışına çıkma eğilimi gösterirler. Bütün bu engelleri aşabilmek için, taşıyıcı partiküller hedef dokuya ulaşıncaya kadar dolaşımda kalabilmeli ve boyutları kapilerlerden geçebilecek kadar küçük ancak fenestradan geçemeyecek kadar da büyük olmalıdırlar [31]. Terapötik ajanın hücresel alımı: Biyoaktif bileşiklerin ve terapötik ajanların çoğu, ya tümör yüzeyindeki reseptörle ve sitoplazma ile ya da çekirdeğe ait bileşenlerle etkileşime girer. Terapötik etkilerini hücre yüzeyi veya ekstraselüler bileşenler arasından gösteren bileşiklerin aksine, birçok kemoterapötik ajan (doksorubisin, paklitaksel, etoposid ), etkilerini göstermek için hücre içine girmek zorundadırlar. Ancak, hücre zarı düzenleyici olarak görev yapar ve hücre devamlılığını sağlayan maddelerin hücreye giriş ve çıkışını düzenleyerek hücreyi dışardan korur. Bununla birlikte membranlar ilaç taşıyıcı sistemler için de bariyer görevi görebilirler. Hücrenin endositik yolaklarına bağlı olarak nanopartiküller farklı giriş yolları izleyerek etkin maddeyi hücre içine taşıyabilirler [31]. Tümör heterojenitesi: Meme kanseri tedavisinde en büyük problemlerden birisi de onkogenlerin ve tümör baskılayıcı genlerin umulanın dışında oluşumunu ve mutasyonunu kapsayan tümör heterojenitesidir. Bunların dışında apaptoz, hücre döngüsü kontrolü, onarım mekanizması, ilaç direnci ve metastaz gibi çok sayıda hücre mekanizmalarında da değişime neden olur [133]. Tümör heterojenitesi sorununu ortadan kaldırmak amacıyla kişiye özel çoklu kemoterapi için nanoteknoloji bazlı ilaç taşıcıyı sistemler kullanılması öngörülmektedir [134]. Tümör iç/interstisyel basıncı: İnterstisyel sıvı basıncı meme, melanoma, kolon kanseri gibi çoğu katı tümörlerde artış göstermektedir [135]. Artan interstisyel sıvı basıncı (IFP), tümörlerde transkapiler taşınımında ve ilaç tutulma süresinde azalmaya neden olur. Yüksek IFP, sadece terapötik ajanın tümörden içeriye alınmasını engellemekle kalmaz alınan molekülün tümörden dolaşıma geri atılmasına neden olur [31]. Birçok normal dokuda IFP yaklaşık 0 mmhg iken, farklı türden karsinomalarda basınç 14 den 30 mmhg a değişiklik göstermektedir. İnvaziv duktal karsinoma hastalarında IFP değeri 29±3 mm Hg iken, normal 42

57 meme parenkimasında 0.3±0.1 mm Hg, iyi huylu tümörlerde 3.6±0.8 mm Hg, non invaziv karsinomalarda 0.3±0.2 mm Hg dır. Yapılan bazı çalışmalar paklitaksel uygulanmasının ortalama IFP değerini %36 düşürdüğünü göstermektedir [135] Nanopartiküler İlaç Taşıyıcı Sistemler Nanopartiküler İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Avantajları Nanopartiküller boyutları nm olan kolloidal, submikronik yapılardır. İlaçlar nanopartiküllerin içine çeşitli metotlarla yüklenebilirler; enkapsüle edilebilirler, yüzeye adsorbe olabilirler veya tutunabilirler [136]. Nanopartiküller küçük boyutlarından dolayı ince kapilerlerden membranları aşarak hücrelere ulaşıp hedef bölgede birikme yapabilirler. Bu sebeple, istenmeyen yan etki ve terapötik maddenin toksisitesi azaltılmış ve terapötik etki de artırılmış olur [137]. Bununla birlikte terapötik ajanlar için konvansiyonel yöntemlerin sunamadığı ilaç stabilitesi ve yüksek biyoyararlanım gibi yeni terapötik fırsatlar sunmaktadırlar [138]. Nanopartiküllerin avantajlarından bir tanesi büyüklüklerinin ayarlanabilir olmasıdır [139]. İlaç taşıyıcı sistemlerin partikül büyüklükleri dolaşım süresini ve biyoyararlanımı etkiler. İlaç taşıyıcı sistemlerdeki nanopartiküllerin büyüklükleri kan damarlarından sızmayacak kadar küçük, ancak retiküloendotelyal sistem tarafından makrofaja uğramayacak kadar da büyük olmalıdır. Tümörlü bölgedeki damarların kavşak aralıkların büyüklüğü 100 ile 600 nm arasında değişmektedir. Bu nedenle nanopartiküllerin çift damarlı yapıyı aşarak tümörlü bölgeye ulaşabilmesi için büyüklüğü ortalama 200 nm kadar olmalıdır [140]. Nanopartiküller ideal olarak makrofaj alımından kaçmak için hidrofilik bir yüzeye sahip olmalıdırlar. Bu iki yolla başarılır; nanopartikülün yüzeyini PEG gibi bir polimerle plazma proteinleri tarafından opsonizasyonunu engellemek için kaplamak veya alternatif olarak nanopartikülleri hidrofilik ve hidrofobik kısımları olan blok kopolimerlerden hazırlamak olarak açıklanabilir [141, 142] Hedeflendirme Antikanser ilaçların çoğu normal ve kanserli hücreler arasında bir seçicilik gösteremediği için sistemik toksisite ve yan etkilere neden olmaktadır. Nanoteknoloji, bu alanda ilaçları hedeflendirilmiş tedavi ile uygulama imkânı 43

58 sunmaktadır. Kanser nanoteknolojisinde, nanopartiküler sistemlerin ilaçların taşınması ve hedeflendirilmesinde kullanılması klinikte en heyecan verici yeni yaklaşım haline gelmiştir [143] Pasif Hedeflendirme Hızlı büyüyen kanserli dokularda hızlı damarlanma, sızdırgan, kusurlu yapıya ve bozulan lenfatik drenaja neden olmaktadır. Bu yapı, artan geçirgenlik ve tutulma etkisi (EPR) olarak adlandırılmaktadır [143, 144]. EPR etkisi, nanopartiküllerin tümör bölgesinde akümüle olmasına neden olmaktadır (Şekil 2.18) [145]. Bu şekildeki bir pasif hedeflendirme mekanizmasının işleyişi için, ilaç taşıyıcı nanopartiküler sistemlerin büyüklük ve yüzey özellikleri, RES organları tarafından alınmasına engel olmak için, kontrol edilmelidir. Şekil Tümör damar yapısı ve EPR etkisi [145] Aktif Hedeflendirme Aktif hedeflendirme, nanopartiküle hedefleyici bir bileşenin (tercihen tümöre sahip organa, tümörün kendisine, özel kanser hücrelerine veya kanser hücreleri içindeki intraselüler organellere birikecek şekilde) konjuge edilmesiyle sağlanır [143]. Bu yaklaşım spesifik etkileşimlere dayanmaktadır, örneğin lektin-karbonhidrat, ligandreseptör ve antijen-antikor gibi. (Şekil 2.19) [130]. Birçok insan kanser türlerinde 44

59 antijen ya da reseptörün fazla miktarda bulunması, reseptör aracılı endositoz ile etkili bir ilaç alımını sağlar. Şekil Nanotaşıyıcıların tümöre farklı ilaç taşıma stratejilerinin şematik gösterimi [130] Nanokapsül ve Nanoküre Nanopartiküller boyutları nm arasında değişen submikronik kolloidal sistemlerdir. Hazırlanma yöntemlerine göre nanoküre ya da nanokapsül oluştururlar. Nanokapsüller etken maddenin sıvı iç çekirdeğe hapsedildiği polimerik bir duvarla çevrili veziküler sistemlerdir [146]. Nanokapsüller yağlı çekirdekleri nedeniyle hidrofobik yapıda ilaçlar için polimerzomlar ise sulu çekirdekleri nedeniyle hidrofilik ilaçların taşınması için uygun sistemlerdir [147]. Nanoküreler, matriks tipi katı kolloidal partiküllerdir. Nanokapsüllerin aksine yapılarında yağlı veya sulu çekirdek bulundurmazlar. İlaç ve taşıyıcının fizikokimyasal özelliklerine ve hazırlama yöntemine bağlı olarak, ilaç taşıyıcı içerisine alınır ve/veya yüzeye adsorpsiyon ile hapsedilir. İlacın ve taşıyıcının elektriksel yükleri de yükleme kapasitesini etkileyebilmektedir. Gözenekli olmayan 45

60 nanokürelere ilacın hapsedilebilmesi ilacın adsorpsiyonu yolu ile gerçekleşmektedir (Şekil 2.20) [148]. Şekil Nanokürelere ilaç yükleme modelleri: a) hapsetmek, b) çözmek veya dağıtmak, c) adsorbe etmek [148] İlacın kolloidal taşıyıcılardan salımı, taşıyıcının cinsine ve yükleme mekanizmasına bağlı olarak gerçekleşmektedir. Bu sistemlerin spesifik yüzey alanları çok geniş olduğu için, mikroküre ve mikrokapsül gibi sistemlere oranla ilaç salımı çok daha hızlı olmaktadır [45] Nanopartikül Hazırlama Yöntemleri Nanopartiküllerin hazırlanmasında çok farklı yöntemler kullanılabilir. Kullanılacak yöntemin şeçimi ilaçın, polimerin ve formülasyonda bulunan diğer kimyasalların yapısal özelliklerine göre yapılır Önceden oluşturulmuş polimerin dispersiyonu Emülsiyon bazlı yöntemler Emülsiyon bazlı yöntemlerle partiküller, emülsiyonun oluşturulması ve çözücünün uzaklaştırılması olmak üzere iki basamakta oluşur. Partiküller tekli, çift veya çoklu emülsiyon şeklinde oluşturulabilirler. Bütün emülsiyon bazlı yöntemlerde oluşturulan emülsiyon, hazırlanacak partikülün nihai özelliklerini belirler. Örneğin; organik ve sulu fazın fizikokimyasal özellikleri, emülsiyonun damlacık büyüklüğü ve karıştırma hızı gibi değişiklikler oluşacak nanopartikülün özellikleri etkilemektedir [82, 149]. 46

61 Çözücü buharlaştırma/ ekstraksiyon yöntemi Çözücü buharlaştırma/ ekstraksiyon yöntemi tekli emülsiyon ve çoklu emülsiyon olmak üzere iki kategoriye ayrılır. Tekli emülsiyon yönteminde polimer ve ilaç, suyla çok az karışabilen, uçucu bir organik çözücü içinde çözündürüldükten sonra hacimce daha fazla olan ve emülgatör içeren sulu faz içine emülsifiye edilir. Emülsiyon damlacıklarının sertleşmesi için formülasyonda bulunan organik çözücü uçurulur. Sertleşen partiküller filtrasyon veya santrifüjleme ile toplandıktan sonra su ile birkaç kez yıkanır. Çift emülsiyon yöntemi tekli emülsiyon yönteminin değiştirilmiş halidir. Hidrofilik ilaçlar için uygun bir hazırlama yöntemidir. ilaç ve emülgatörün bulunduğu sulu faz daha fazla hacimdeki organik faza eklenir. Oluşan su/yağ emülsiyonu daha fazla hacimdeki sulu faza eklenir. Ardından saflaştırma işlemi uygulanır. Spontan emülsifikasyon çözücü difüzyon Bu yöntem çözücü buharlaştırma yönteminin değiştirilmiş halidir. Bu yöntemde yağ fazı suda çözünen (aseton, metanol, etanol ) ve suda çözünmeyen (diklorometan, kloroform ) iki farklı organik çözücüden oluşmaktadır. İlaç ve polimer bu organik faz içinde çözüldükten sonra hacimce daha fazla ve emülgatör içeren sulu fazla eklenir. Suda çözünen organik çözücünün su içinde difüzyonu iki faz arasında yüzeylerarası türbülans oluşturur ve partiküller oluşur [82]. Tuzla Çöktürme Tuzla çöktürme yöntemi normal şartlarda su ile karışabilen bir organik çözücünün uygun tuz konsantrasyonu varlığında suda çözünmemesi temeline dayanır. Organik faz elektrolit ve kolloidal stabilizan içeren sulu faza emülsifiye edilir. Sulu faz içinde bulunan tuz iki fazın birbirine karışmasını engellemektedir. Bu yöntemin en büyük avantajı formülasyon hazırlama sırasında sıcaklık uygulanmadığı için ısıya duyarlı ilaç ve polimerler için uygun olmasıdır. Ancak, formülasyonda kullanılan elektrolitlerin uzaklaştırılması çok zordur. 47

62 Emülsifikasyon çapraz bağlama ve bağlantılı teknikler Bu yöntem ile partiküller oluşturulurken ilk önce ilaç, polimer ve emülgatör içeren emülsiyon oluşturulur. Ardından emülsiyona çapraz ağlayıcı ajan eklenerek partiküllerin oluşumu sağlanır. En sık kullanılan çapraz bağlayıcı ajan glutaraldehit, kitosan ve jelatindir Nanopresipitasyon Nanopresipitasyon yönteminde partiküllerin oluşması yüzeyler arası birikme (çökelti oluşma) prensibine dayanır. Emülsiyon bazlı yöntemlerin aksine nanopresipitasyonda emülsiyon oluşturmaya gerek yoktur (Şekil 2.21). Şekil Emülsiyon bazlı yöntemler ile nanopresipitasyon yönteminin karşılaştırılması [150] Nanopresipitasyon yöntemi ilk olarak Fessi ve arkadaşları tarafından tanımlanmıştır. Nanopresipitasyon yöntemiyle partikül hazırlanırken, polimer ve ilaç suyla karışabilen organik çözücüde çözülür. Ardından organik faz sulu faza eklenir. Organik çözücünün sulu faz içinde difüzyonu difüze olması sonucu nanopartiküller oluşur. Nanopresipitasyon yönteminde polimer sulu faz içerisinde 48

63 çökelti oluşturduğu için nanopartiküller spontane olarak oluşur. Bu olay Marangoni etkisi olarak bilinir. Nanopresipitasyon yöntemi kolay ve ekonomik bir yöntemdir, özel koşul gerektirmez. Ancak hidrofilik ilaçlarda, polimerin presipitasyonu sırasında ilacın sulu faza difüze olması nedeniyle düşük enkapsülasyon etkinliği gösterir. Bu yöntemde en sık kulanılan organik çözücüler aseton, asetonitril, diklorometan ve kloroformdur. Sürfaktan olarak ise poloksamerler, Pluronic, polisorbat ve Span kullanılır [82]. Nanopresipitasyon yönteminde formülasyon bileşenleri oluşacak partiküllerin karakterizasyonunda etkilidir (Çizelge 2.10). Çizelge Nanopresipitasyon yönteminde parametrelerin partikül üzerindeki etkisi [82] Değişken Polimer Organik Çözücü Sulu Faz Sürfaktan Etki Polimer konsantrasyonu arttıkça partikül büyüklüğü artar Polimerin molekül ağırlığı arttıkça partikül büyüklüğü azalır Organik fazın suda difüzyonu arttıkça partikül büyüklüğü küçülür Organik fazın vizkositesi artarsa partikül büyüklüğü artar Sulu fazın hacminin artması partikül büyüklüğünü değiştirmez Sulu fazın hacminin artması enkapsülasyon etkinliğini düşürür Sürfaktan miktarı arttıkça partikül büyüklüğü azalır Koaservasyon Koaservasyon yöntemi, polimerin partikül hazırlama sırasında çözünürlüğünün azalması temeline dayanır. Basit ve kompleks koaservasyon olmak üzere iki farklı türü vardır. Basit koaservasyonda formülasyona çözücü olmayan bir sıvının eklenmesi veya sıcaklık, ph parametrelerinden birisinin değiştirilmesi sonucu polimerin çözünürlüğü azaltılır. Kompleks koaservasyonda ise zıt yüklere sahip makromoleküller kullanılır. Koaservasyon yöntemi hem hidrofilik hem de lipofilik ilaçlar için uygun bir yöntemdir Püskürterek Kurutma/Püskürterek Dondurma Püskürterek kurutma yöntemi sıcak kuru ortamda sıvı halden katı partiküler hale geçmesi temeline dayanır. Partiküller damlacıklar halinde oluşur. Püskürterek 49

64 dondurma da ise, ilk olarak ilaç ve polimer erime derecesinin üzerinde atomize edilir. Ardından damlacıklar soğuk hava ile sertleştirilir Süperkritik Sıvı Teknolojisi İki farklı yöntem verdır. Süperkritik çözeltinin hızla genleşmesi yönteminde, ilaç ve polimer istenilen basınca ve sıcaklığa getirilen süperkritik çözücüde (genellikle CO2) çözündürülür. Süperkritik antisolvan yönteminde ise ilaç ve polimer organik çözücü içinde dağıtıldıktan sonra oluşan bu organik faz, süperkritik sıvı ile temasta bırakılır. Organik çözücünün süperkritik sıvı içinde hızla çözünmesinin ardından oluşan partiküller filtrasyon ile toplanır [151] Monomerlerin Polimerizasyonuna Dayanan Yöntemler Emülsiyon polimerizasyon yöntemi Bu yöntemde partikül oluşumu sırasında disperse edilmiş monomerler polimerize olurlar. Polimerizasyon iki karışmayan fazın arafazında gerçekleşir. Polimerizasyon sırasında emülsiyon devamlı karıştırılmaldır. Yüksek sıcaklık, gama ve UV ışınları polimerizasyonu başlatmak için kullanılabilir Dispersiyon Polimerizasyon Bu yöntemde monomer, stabilize edici ve başlatıcı çözücü içinde çözündürülür. Monomerlerin polimerizasyonu çözücü içinde çözünmeyen partiküllerin oluşumuna neden olur. 50

65 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Araçlar ve Gereçler Kimyasal Maddeler Etken Madde Paklitaksel Sigma & Aldrich, ABD Nanoküre Materyali Anyonik Amfifilik Siklodekstrin 6-O-Capro βcd Polikatyonik Amfifilik Siklodektrin βcdc6 Sevilla Üniversitesi, İspanya Sevilla Üniversitesi, İspanya Aseton Extra pure Sigma & Aldrich, ABD Asetonitril HPLC Grade Sigma & Aldrich, ABD Dikloromethan HPLC Grade Sigma & Aldrich, ABD Etanol Analysis Grade Sigma & Aldrich, ABD Kitosan (Protasan ) Mw< 200 kda, DD. %75 90 Novamatrix, Norveç Metanol HPLC Grade Sigma & Aldrich, ABD Pluronik F-68 Sigma & Aldrich, ABD 51

66 HPLC Analizinde Kullanılan Kimyasallar Asetonitril Ultrasaf su Sigma & Aldrich, ABD Milipore,ABD Hücre Kültüründe Kullanılan Kimyasallar 75 cm² lik flask Greiner, Almanya 96 kuyucuklu hücre kültür kabı Greiner, Almanya Dulbecco nun minimum esansiyal ortamı Tripsin-EDTA (%0.25/%0.02 a/h) Fetal sığır serumu (FBS) Heparin (5000 U/mL) Kollajen A (1 mg/ml) L-Glutamin (200 mm) Biochrom, Almanya Biochrom, Almanya Biochrom, Almanya Biochrom, Almanya Biochrom, Almanya Biochrom, Almanya Penisilin-Streptomisin ( U/10.000μg/mL) Biochrom, Almanya WST-1 Cell Counting Kit Biochrom, Almanya Sigma & Aldrich, ABD Biyolojik Materyal L929 fare akciğer fibroblast hücre hattı MCF-7 insan meme kanseri hücre hattı HÜKÜK,ŞapEnstitüsü, ATTC 52

67 Aletler Çalkalamalı Su Banyosu Filtre Memmert WNE22, Almanya Scheicher&Schvell, Almanya Hassas Terazi Mettler Toledo XS 105 Dualrange, ABD Isıtıcılı Manyetik Karıştırıcı IKA RCT Basic, Almanya Liyofilizatör Heto PowerDry PL 3000, Danimarka Çok Noktalı Manyetik Karıştırıcı Mikropipet Partikül Boyutu Cihazı Zeta Potansiyel Ölçüm Cihazı Variomag Multipoint HP, Almanya Eppendorf, Almanya Malvern Zetasizer Nano ZS,İngiltere Malvern Zetasizer Nano ZS,İngiltere ph metre Rotavapor Rotavapor Santrifüj Aleti Şırınga Sartorius PP-20, Almanya IKA RV06-ML, Almanya IKA RV10 Basic, Almanya Hettich EBA21, Almanya Gilson DITRITIPS, Fransa 53

68 Taramalı elektron mikroskobu (SEM) Ultra Saf Su Sistemi Ultrasonik banyo HPLC HPLC Kolonu FEI Nova NanoSEM 430, ABD Simplicity 185-Milipore, ABD Advantage-Lab ALO4-12, İsviçre Agilent 1100 Series, Almanya Hichrom 5 C18 (250X4,6 mm), U.K 3.2. Yöntemler ve Deneyler Siklodekstrin Nanopartiküllerin Sentezlenmesi Bu tez kapsamında yapılan çalışmalarda kullanılan amfifilik siklodekstrin türevleri (6-O-Capro β-cd ve polikatyonik β-cdc6) İspanya Sevilla Üniversitesi nde bilimsel işbirliği içinde olunan Dr. Juan M. Benito tarafından sentezlenmiş ve saflandırılmıştır. Anyonik siklodekstrinlerin sentez ve saflaştırılması daha önce Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı nda gerçekleştirilen sentez temel alınarak yapılmıştır [152]. Heptakis (6-O-heksanoil) siklomaltoheptoz β-cd (6-O-CAPRO-β-CD), makrosiklik halkasının 6. pozisyonuna ester bağı ile bağlanmış 6C lu yağ asiti zinciri içeren, primer yüz modifiye amfifilik CD türevidir. 6-O-CAPRO-β-CD sentezi 3 basamakta gerçekleştirilmiştir. Birinci basamak olarak Sezyum Hekzanoat sentezlenmiştir. Ardından ikinci basamakta 6-I-β-CD üzerinden Heksanoil zincirlerinin eklenmesi ile açilleme yapılmış ve son basamakta da yıkama ve saflaştırma işlemleri gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla ilk basamakta Sezyum karbonat ve hekzanoik asit başlangıç maddelerinden hareketle sezyum hekzanoat sentezi gerçekleştirilmiştir. Sentezin temelini oluşturan kimyasal reaksiyon şu şekildedir; 54

69 Cs 2 CO 3 + 2R-COOH 2R-COOC s + H 2 O + CO 2 R=C 5 H 11 Hekzanoik anhidrit üzerine distile su ilave edilerek, 1 saat karıştırma sonucunda hekzanoik asit elde edilmiştir. Hekzanoik asit içerisine sezyum karbonat ve metanol eklenerek manyetik karıştırıcıda 1 saat karıştırma sonucunda oluşan beyaz berrak çözeltideki çözücü rotavaporda uçurulmuştur. Metanolün hepsi uçtuktan sonra benzen ilavesi ile beyaz kristalize halde çöken sezyum hekzanoat, süzgeç kâğıdından süzülerek ayrılmış, oda sıcaklığında kurumaya bırakılmıştır. İkinci basamaktaki açilleme için 6-I-β-CD üzerinden nükleofilik sübstitüsyon gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, sezyum hekzanoat ve 6-I-β-CD üzerine dimetil formamid eklenmesi ile elde edilen koyu kahve çözelti, 50⁰C de geri çeviren soğutuculu yağ banyosuna konularak, manyetik karıştırıcıda karışmak üzere bekletilmiştir. Bu sürenin sonunda, rotavaporda Dimetil formamid in tamamı uçurulmadan, çözelti buzlu suyun içerisine boşaltılarak sentezlenen maddenin beyaz kristaller halinde çökmesi sağlanmıştır. Süzgeç kâğıdından süzme işlemi sonrası çökelti, süzgeç kâğıdı üzerinde oda sıcaklığında kurumaya bırakılmıştır. Son basamak olan yıkama ve saflaştırma da ise tam olarak kurumuş olan toz halindeki çökelti kloroformda çözündürüldükten sonra sırasıyla; distile su, %5 NaHCO3 ve tekrar distile su ile yıkanmıştır. Son olarak, rotavaporda uçurma işlemi uygulanmıştır. Katı halde elde edilen maddenin saflaştırılma işlemi, kolon kromatografisi ile gerçekleştirilmiştir [45,152]. Anyonik 6-O-Capro βcd in yapısı Şekil 3.1 de gösterilmiştir. Şekil O-Capro βcd 55

70 Katyonik amfifilik siklodekstrin türevi olan β-cdc6 nın sentezi temel olarak 4 basamaktan oluşmaktadır. İlk basamakta βcd, tert-bütoksikarbonil ile tepkimeye girerek siklodekstrinin yapısında bulunan 7 tane primer hidroksil grubunun her biri Boc-sisteamin grubuyla yer değiştirir. Bu basamakta ilk önce ticari ürün olan siklooligosakkaritin (heptakis (6-bromo-6-deoksi) siklomaltoheptoz) N- bromosüksinimid (NBS) / trifenilfosfin (TPP) sistemi ile hepta brominasyonu yapılmaktadır. Bunu takiben sezyum karbonatın N-Boc-sisteamin tarafından bromin ile nükleofilik yer değiştirmesi gerçekleşmektedir. Sentezin ikinci basamağında oligosakkaritin her bir sekonder hidroksil grubunun asetilasyonu gerçekleşmektedir. Bunun için N,N-dimetilformamid ve N,N-dimetilaminopridin varlığında yağ asidi anhidritleri kullanılmıştır. Sentezin üçüncü basamağında karbamat gruplarının hidrolizi gerçekleştikten sonra son basamakta katyonik uçların tiyoüre ileri modifikasyonu gerçekleştirilmiştir [153,154]. Polikatyonik βcdc6 nın yapısı Şekil 3.2 de gösterilmiştir. Şekil 3.2. Polikatyonik βcdc6 56

71 Boş Siklodekstrin Nanokürelerin Hazırlanması Amfifilik siklodekstrin nanokürelerin hazırlanmasında Bölüm te açıklanan nanopresipitasyon yöntemi kullanılmıştır. Literatürde amfifilik siklodekstrin nanoküre ve nanokapsül hazırlanmasında sıklıkla kullanıldığı ve kolay ve ekonomik bir yöntem olduğu için deneyler sırasında nanopresipitasyon kullanılmıştır [155,156]. İlaç taşıyıcı sistem olarak üç farklı amfifilik β- siklodekstrin türevi kullanılmıştır: 6-O-Capro β-cd, Kitosan kaplı 6-O-Capro β-cd Polikatyonik β-cdc6 Nanoküre formülasyonu geliştirme çalışmalarında her üç siklodekstrin formülasyonu için farklı konsantrasyonlarda sürfaktan (PF68), farklı organik çözücüler (aseton, etanol, diklorometan, metanol) kullanılmıştır. Bu amaçla herbir formülasyon için 1 mg siklodekstrin, 1 ml organik çözücüde 550 rpm de manyetik karıştırıcıda 30 dakika çözündürülür. Hazırlanan organik faz sürfaktan içeren ve içermeyen 2 ml ultrasaf su içine ependorf enjektörü yardımıyla manyetik karıştırıcıda 550 rpm de eklenerek 30 dakika karıştırılır. Bu işlem sonucunda nanopartiküller kendiliğinden oluşmaktadır. Formülasyon içinde bulunan organik çözücünün rotavapor kullanılarak vakum altında o C de uçurulması sonucu 2 ml sulu nanoküre dispersiyonu elde edilmiştir. Kitosan kaplı 6-O-Capro β-cd nanokürelerin hazırlanması sırasında diğer iki formülasyondan farklı olarak sulu faz içerisinde kitosanın suda çözünen türevi olan Protosan çözündürülmüştür. Nanopresipitasyon yöntemine göre, amfifilik siklodekstrin nanokürelerin hazırlanması Şekil 3.3. de şematize edilmektedir. 57

72 Amfifilik siklodekstrin (1 mg) Organik çözücü (1 ml) içinde çözündürülür Organik faz sulu faza(2 ml) eklenir Manyetik karıştırıcıda sürekli karıştırma Organik çözücü vakum altında uçurulur Şekil 3.3. Nanopresipitasyon yönteminin şematik gösterimi Farklı organik çözücüler ve sürfaktan varlığında hazırlanan ön formülasyon çalışmaları sonrası siklodekstrin nanopartiküllerden herbir siklodekstrin türevi için en uygun bir formülasyon seçilmiş ve ileri deneysel basamaklar bu formülasyonlar üzerinden yürütülmüştür Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu Partikül Büyüklüğü Analizi Siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü dağılımı ve polidispersite indeksi değerleri, Brown hareketlerinin ölçümüne dayanan dinamik ışık saçılması (foton korelasyon spektroskopisi) yöntemi kullanılarak 173 o açı ve 25 o C sıcaklıkta Malvern Zetasizer cihazı ile tanımlanmıştır. Partikül büyüklüğü ölçümleri herbir formülasyon için 3 er kez tekrarlanmıştır Zeta Potansiyel Ölçümü Siklodekstrin nanokürelerin zeta potansiyel ölçümleri, Malvern Zetasizer aleti ile 12 o açı ve 25 o C sıcaklıkta ve herbir formülasyon için 3 er kez olmak üzere gerçekleştirilmiştir. 58

73 Uzun Süreli Fiziksel Stabilite Çalışmaları Siklodekstrin nanokürelerin fiziksel stabilitelerinin belirlenebilmesi amacı ile 12 aylık süre boyunca stabilite çalışmaları yapılmıştır. Takip edilen süre boyunca örnekler, +4 o C de sulu dispersiyon halinde tutularak; 0., 2., 4., 8. ve 12. aylarda partikül büyüklüğü, polidispersite indeksi ve zeta potansiyel ölçümleri tekrarlanmıştır ve sonuçlar değerlendirilmiştir Taramalı Elektron Mikroskopu (SEM) SEM ile görüntüleme, Orta Doğu Teknik Üniversitesi Metalurji ve Malzeme Mühendisliği Bölümü'nde yapılmıştır. Örnek metal levhalar üzerine tesbit edilmiştir ve yüzey yükünü en aza indirmek için altın-palladyum alaşımı ile 100 o A kalınlığında kaplanmıştır Paklitakselin HPLC Yöntemi ile in vitro Miktar Tayini ve Validasyonu Paklitaksel için kullanılan ters faz HPLC yöntemi kullanılmıştır. Yöntemin özellikleri şu şekildedir [155]: Sabit faz: C-18 Oktadesil silika (ODS) kolon Mobil faz: Asetonitril: Su (70:30 h/h) Mobil faz akış hızı: 1 ml/dak. Enjeksiyon hacmi: 50 μl Dedektör: Diodearray (DAD) detektör Dalga boyu: 227,4 nm Bitiş Zamanı: 6 dakika Maksimum basınç: 300 bar Kolon sıcakliğı: 25 0 C 59

74 Analitik Yöntem Validasyonu Validasyon bir metot veya ölçüm prosedürünün belirlenen amaçlara uygunluğunun objektif olarak test edilmesidir [157]. Paklitaksel için analitik yöntem validasyonun saptanması için doğrusallık, doğruluk, kesinlik (tekrar edilebilirlik, tekrar elde edilebilirlik, günler arası farklılık), duyarlılık (alt tayin sınırı, tanıma değeri), özgünlük, stabilite parametreleri incelenmiştir Kalibrasyon Paklitakselin kalibrasyon denkleminin belirlenmesi için 200μg/ml lik 10 ml stok çözeltisi hazırlandı. Bunun için 2 mg Paklitaksel 10 ml asetonitril içinde çözündürüldü. Bu stok çözeltiden hareketle 200, 150, 100, 50, 25, 10, 5, 2 ve 1 μg/ml lik olacak şekilde asetonitril ile 9 dilüsyon yapılmıştır. Yukarıda belirtilen HPLC yöntemine göre farklı konsantrasyondaki Paklitaksel çözeltilerinin analizi yapılmış ve elde edilen veriler sonucunda kalibrasyon doğrusu çizilerek kalibrasyon denklemi bulunmuş ve korelasyon katsayısı hesaplanmıştır Doğrusallık Doğrusallık, örnek çözeltilerinin analit cevabının konsantrasyonla doğrusal orantılı olduğu, konsantrasyon aralığında bulunup bulunmadığını belirler. Analitik validasyonda doğrusallık parametresini göstermek üzere, Paklitakselin asetonitrilde hazırlanmış olan 200 μg/ml konsantrasyondaki ana stok çözeltisinden hareketle, μg/ml konsantrasyonlar elde edecek şekilde 9 adet dilüsyon yapılmıştır. HPLC analizi ile çözeltilerin konsantrasyon değerlerine karşı okunan alan değerleri kullanılarak kalibrasyon doğrusunun denklemi oluşturulmuş ve korelasyon katsayısı hesaplanmıştır Doğruluk Doğruluk parametresi gerçek değere yakınlığı ifade eder ve geri kazanım çalışmaları ile doğruluk değerlendirilebilir [157]. Kullanılan analitik yöntemin doğruluğunu göstermek amacıyla, kalibrasyon sınırları içerisinde bulunan, düşük, orta ve yüksek konsantrasyonda olmak üzere 3 farklı konsantrasyonda (1, 25 ve 200 μg/ml) 6 seri çözelti hazırlanarak HPLC analizi yapılmıştır. Analiz sonucu 60

75 bulunan ve hazırlanan konsantrasyonlardan geri kazanımlar hesaplanmış ve geri kazanımların ortalaması (X), standart sapması (SS) ve % varyasyon katsayısı (VK) hesaplanmıştır Kesinlik Kesinlik parametresi, bir yöntemin birbirini takip eden ölçümleri arasındaki yakınlığın derecesini ifade etmektedir. Sayısal değeri yoktur ve standart sapma (SS), varyasyon katsayısı (VK) ile ifade edilir [158]. Bir analitik yöntemin kesinliği, art arda istatistiksel açıdan anlamlı sayıda, aynı konsantrasyonda örneğin analitik yöntem kullanılarak ölçülen konsantrasyonlarının ortalama (X), SS ve VK nın hesaplanması ile değerlendirilmektedir. Bu nedenle; tekrar edilebilirlik, tekrar elde edilebilirlik ve günler arası farklılık incelenmiştir. Tekrar edilebilirlik: Tekrar edilebilirlik parametresi için kalibrasyon çalışmaları için hazırlanmış farklı Paklitaksel konsantrasyonlarından bir tanesi (50µg/ml) seçilerek 6 kez art arda HPLC analizi yapılmıştır. HPLC analizi ile elde edilen konsantrasyon değerlerinin ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı hesaplanmıştır. Tekrar elde edilebilirlik: Tekrar elde edilebilirlik parametresinin değerlendirilmesi amacıyla, stoktan (200 μg/ml) hareketle seyreltme ile elde edilen 6 adet aynı konsantrasyonda (50 μg/ml) hazırlanan çözeltinin HPLC analizi gerçekleştirilmiştir. HPLC analizi ile elde edilen konsantrasyon değerlerinin ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı değerleri hesaplanmıştır. Günler arası farklılık: Günler arası farklılık parametresinin değerlendirilmesi için aynı konsantrasyondan (50µg/ml) 3 gün ardı ardına hazırlanan Paklitaksel çözeltilerinin HPLC analizi yapılarak, elde edilen konsantrasyon değerlerinin ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı değerleri hesaplanmıştır Duyarlılık Analiz yönteminin duyarlılığının belirlenmesi için gözlenebilirlik sınırı (LOD) ve alt tayin sınırı (LOQ) değerleri saptanmıştır. Gözlenebilirlik sınırı, analitik yöntemde kullanılan cihazın saptayabildiği en düşük konsantrasyonu ifade eder. Alt tayin sınırı ise doğru ve tekrar edilebilen en düşük derişimdir. 61

76 LOD ve LOQ değerlerinin hesaplanmasında, kalibrasyondaki minimum konsantrasyon değerlerinden biri (1 μg/ml) seçilmiştir. Bu konsantrasyondaki HPLC spektrumunda, Paklitaksel pikinden önce ve sonra düzgün çıkan bölgeler tespit edilmiştir. Sinyal/Gürültü (S/G-Signal/Noise) oranına göre LOD ve LOQ değerleri saptanmıştır. S/G oranı 3 olan konsantrasyon gözlenebilirlik sınırını, S/G oranı 10 olan konsantrasyon ise alt tayin sınırını vermektedir Özgünlük Kullanılan analitik yöntemin paklitaksele özgün olduğunu kanıtlamak, formülasyon veya çözücülerdeki bileşenlerin ölçüm yapılan koşullarda Paklitaksel ile girişim yapan bir pik vermediğini göstermek amacıyla formülasyona giren her bir maddenin HPLC analizi yapılmıştır Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Hazırlanması Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanoküreler, boş nanoküreler gibi nanopresipitasyon yöntemi ile hazırlanmıştır. Siklodekstrin nanokürelere ilaç yüklerken konvansiyonel yükleme yöntemi uygulanmıştır. Her bir siklodekstrin formülasyonu için polimerin %1 i kadar Paklitaksel formülasyona ilave edilmiştir. Bunun için, Paklitakselin (2 mg), etanolde (10 ml) stok çözeltisi hazırlanmıştır. İlaç yüklü nanoküreleri hazırlamak için 1 mg siklodekstrin, 0,5 ml Paklitaksel stok çözeltisi içeren 0,5 ml saf etanol içinde çözündürülmüştür. Hazırlanan organik faz 2 ml ultra saf su içine ependorf pipeti kullanılarak manyetik karıştırıcıda 550 rpm de eklenerek 30 dakika karıştırılır. Bu işlem sonucunda nanopartiküller kendiliğinden oluşmaktadır. Formülasyon içinde bulunan organik çözücünün rotavapor kullanılarak vakum altında o C de uçurulması sonucu 2 ml sulu Paklitaksel yüklü nanoküre dispersiyonu elde edilmiştir. Kitosan kaplı siklodekstrin formülasyonu hazırlanırken yukarıda anlatılan yöntem kullanılmıştır ancak sulu faz %0,25 (a/h) Protosan TM içermektedir İlaç Yüklü Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu Partikül Büyüklüğü Analizi İlaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü dağılımı ve polidispersite indeksi değerleri, Brown hareketlerinin ölçümüne dayanan dinamik 62

77 ışık saçılması (foton korelasyon spektroskopisi) yöntemi kullanılarak 173 o açı ve 25 o C sıcaklıkta Malvern Zetasizer cihazı ile tanımlanmıştır. Partikül büyüklüğü ölçümleri her bir formülasyon için 3 er kez tekrarlanmıştır Zeta Potansiyel Ölçümü İlaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin zeta potansiyel ölçümleri, Malvern Zetasizer ile 12 o açı ve 25 o C sıcaklıkta ve her bir formülasyon için 3 er kez olmak üzere gerçekleştirilmiştir Kısa Süreli Fiziksel Stabilite Çalışmaları İlaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin fiziksel stabilitelerinin belirlenebilmesi amacı ile 1 aylık süre boyunca stabilite çalışmaları yapılmıştır. Takip edilen süre boyunca örnekler, +4 o C de sulu dispersiyon halinde tutularak; 0., 1., 7. ve 30. günlerde partikül büyüklüğü, polidispersite indeksi ve zeta potansiyel ölçümleri tekrarlanmıştır ve sonuçlar değerlendirilmiştir İlaç Yükleme Etkinliğinin Belirlenmesi İlaç yükleme etkinliğinin belirlenmesi için Bölüm te açıklandığı şekilde ilaç yüklü siklodekstrin nanoküreler hazırlanmıştır. Nanopresipitasyon sonrası elde edilen dispersiyondaki serbest ilaç 3500 rpm de 15 dakika santrifüj sonrası uzaklaştırılmıştır. Süpernatant alınarak 48 saat dondurulduktan sonra 24 saat boyunca liyofilize edilmiştir. Liyofilizasyon sonrası elde edilen kuru toz 2 ml asetonitril: su (70:30) karışımında çözüldükten sonra Bölüm te açıklanan HPLC yöntemi ile analiz yapılmıştır. Her bir formülasyon için hapsolan ilaç miktarı, yükleme kapasitesi ve yükleme etkinliği bulunmuştur. Hapsolan ilaç miktarı, santrifüj ile serbest ilacın uzaklaştırılması sonrası HPLC analizi ile tayin edilen ilaç miktarıdır. Yükleme etkinliği ve Yükleme kapasitesinin belirlenmesinde ise aşağıda bulunan eşitlik kullanılmıştır: % Yükleme Etkinliği = Hapsolan İlaç Miktarı(µg) Toplam İlaç Miktarı (µg) 100 % Yükleme Kapasitesi = Hapsolan İlaç Miktarı (µmol) Nanopartikül Ağırlığı(µmol)

78 Nanopartiküllerden Paklitakselin In Vitro Salım Profilinin Belirlenmesi Paklitaksel yüklü nanopartiküllerin in vitro salım profilinin belirlenmesi için tüp yöntemi kullanılmıştır. Nanopresipitasyon yöntemi ile hazırlanan 2 ml ilaç yüklü nanokürelerden 3500 rpm de 15 dakika santrifüj sonrası serbest Paklitaksel uzaklaştırılmıştır. Süpernatant alınarak %0,1 Tween 80 içeren 50 ml ph 7,4 fosfat tampon çözeltisi içine eklenerek 37 o C de yatay çalkalayıcı su banyosunda inkübe edilmiştir. Belirli zaman aralıklarında her bir formülasyondan 0,5 ml örnek alınarak yerine aynı sıcaklıkta taze fosfat tampon çözeltisi eklenmiştir. Alınan örnekler HPLC ile analiz edilerek alınan sonuçlar varlığında zamana karşı % kümülatif ilaç salım grafiği çizilmiştir Paklitakselin Dilüsyon Testi Seyreltme faktörünün Paklitaksel salımı üzerindeki etkisini görmek için dilüsyon testi yapılmıştır. Bu amaçla, Bölüm te açıklandığı gibi nanopresipitasyon yöntemiyle hazırlanan ilaç yüklü nanopartiküller, serbest paklitakseli ortamdan uzaklaştırmak için 3500 rpm de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Ardından ph 7,4 fosfat tampon çözeltisi ile farklı oranlarda seyreltilmiştir. Salınan ilaç miktarını tayin etmek için Bölüm te tanımlanan HPLC yöntemi kullanılmıştır. Her bir formülasyon için seyrelme faktörüne karşılık salınan % ilaç miktarı hesaplanmıştır Boş Nanopartiküllerin in vitro Güvenilirlik Testi İlaç yüklü olmayan nanopartiküllerin güvenilirlik testi L929 fibroblast hücre hattı üzerinde hücre kültürü çalışmaları ile belirlenmiştir. L929 hücreleri üremeleri için 25 cm 2 lik flasklar içinde DMEM besiyeri varlığında 37 o C de % 5 CO2 li etüvde inkübasyona bırakılmıştır. Yeterli sayıda hücre ürediğinde flask içindeki besiyeri ortamdan uzaklaştırılarak tripsinizasyon işlemi uygulanmıştır. Flask içine 1,5 ml tripsin ilave edildikten sonra hücreler 2-3 dakika inkübe edilmiştir. Ardından yüzeyden ayrılan hücrelere 9 ml besiyeri ilave edilerek 2000 rpm de 3 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrası besiyeri ortamdan uzaklaştırılmıştır ve 4 ml yeni besiyeri eklendikten sonra hücrelerin tripan blue ile sayımı gerçekleştirilmiştir. L929 hücrelerinin, 96 kuyulu doku kültür plaklarına her bir kuyuya 5x10 3 hücre/ml olacak şekilde ekimi yapılmış ve 48 saat inkübe edilmiştir. Hazırlanan nanoküre formülasyonları besiyeri ile 6 farklı konsantrasyonda dilüe edilmiş ve her bir konsantrasyon için n=4 olacak şekilde çalışılmıştır. Aynı şartlarda sadece kültür 64

79 ortamı ile inkübe edilen fibroblast hücreleri kontrol olarak kullanılmıştır. 48 saatlik inkübasyon sonrası her bir kuyucuğa 10 µl WST-1(water soluble tetrazolium salt) eklenmiştir. WST-1 (4-(3-(4-lodofenil )-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzen disülfonat) hücre canlılığını kontrol etmekte kullanılan bir boyadır. Bu boyama yöntemi, boya ile canlı hücrelerin mitokondrileri aracılığıyla oluşturduğu reaksiyonda, boyada bulunan tetrazolium halkası hücre mitokondrilerinde bulunan dehidrogenaz enzimlerince parçalanarak renkli formazan kristalleri oluşması temeline dayanmaktadır. Boyama işlemi sonrası hücreler yaklaşık 2 saat inkübasyona bırakıldıktan sonra Eliza okuyucu ile kolorimetrik olarak 440 nm de absorbans değerleri okunmuş ve % hücre yaşayabilirlikleri hesaplanmıştır Paklitaksel Yüklü Nanopartiküllerin in vitro Etkinlik Testi Paklitaksel yüklü nanopartiküllerin in vitro etkinlik testi MCF-7 insan meme kanseri hücre hattı üzerinde hücre kültürü çalışmaları ile belirlenmiştir. MCF-7 hücreleri üremeleri için 25 cm 2 lik flasklar içinde DMEM besiyeri varlığında 37 o C de % 5 CO2 li etüvde inkübasyona bırakılmıştır. Yeterli sayıda hücre ürediğinde flask içindeki besiyeri ortamdan uzaklaştırılarak tripsinizasyon işlemi uygulanmıştır. Flask içine 1 ml tripsin ilave edildikten sonra hücreler 2-3 dakika inkübe edilmiştir. Ardından yüzeyden ayrılan hücrelere besiyeri ilave edilerek 2000 rpm de 3 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrası besiyeri ortamdan uzaklaştırılmıştır ve hücrelerin tripan blue ile sayımı gerçekleştirilmiştir. MCF-7 hücrelerinin, 96 kuyulu doku kültür plaklarına her bir kuyuya 5x10 3 hücre/ml olacak şekilde ekimi yapılmış ve 48 saat inkübe edilmiştir. Hazırlanan nanoküre formülasyonları besiyeri ile 6 farklı konsantrasyonda dilüe edilmiş ve her bir konsantrasyon için n=4 olacak şekilde çalışılmıştır. Aynı şartlarda sadece kültür ortamı ile ve %1 DMSO içeren kültür ortamı ile inkübe edilen MCF-7 hücreleri kontrol olarak kullanılmıştır. 48 saatlik inkübasyon sonrası her bir kuyucuğa 10 µl WST-1 eklenmiştir Boyama işlemi sonrası hücreler yaklaşık 2 saat inkübasyona bırakıldıktan sonra Elıza okuyucu ile kolorimetrik olarak 440 nm de absorbans değerleri okunmuş ve % hücre yaşayabilirlikleri hesaplanmıştır. L-929 fare fibroblast hücrelerine karşı sitotoksisitenin ve MCF-7 meme kanseri hücrelerine karşı antikanser aktivitenin değerlendirilmesi amacı ile gerçekleştirilen hücre kültürü çalışmaları, Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı nda gerçekleştirilmiştir. 65

80 4. BULGULAR 4.1. Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Ön Formülasyon Çalışmaları Uygun partikül büyüklü ve zeta potansiyeline sahip, stabil amfifilik siklodekstrin nanokürelerin hazırlanması için ön formülasyon çalışmaları sırasında farklı organik çözücüler kullanılmıştır: 6-O-Capro βcd nanoküreler için; Aseton Etanol Metanol CS-6-O-Capro βcd nanoküreler için; Aseton Etanol Polikatyonik βcdc6 nanoküreler için; Aseton Etanol Asetonitril Diklorometan Farklı organik çözücüler kullanılarak, sürfaktanlı ve sürfaktansız hazırlanan formülasyonlara ait karakterizasyon parametreleri Çizelge 4.1. de belirtilmiştir. 66

81 Çizelge 4.1. Ön formülasyon çalışmaları Organik çözücü PF68 konsantrasyonu Partikül büyüklüğü (nm) Zeta Potansiyel (mv) Polidispersite İndeksi Anyonik 6-O-Capro β-cd Aseton - 163, Aseton 0, Aseton 0, , Etanol Etanol 0, Etanol 0,5 200, Metanol Metanol 0, , Metanol 0,5 220,2-30,2 0,31 Katyonik Kitosan kaplı 6-O-Capro β-cd Aseton , Aseton 0, , Aseton 0, , Etanol Etanol 0, ,7 0,155 Etanol 0, ,4 0,33 Polikatyonik β-cdc6 Aseton , Aseton 0,1 284,9 +41, Aseton 0, , Etanol Etanol 0, , Etanol 0, , Asetonitril - 178,8 +59, Diklorometan ,545 Asetonitril: DCM - 205,3 +77,5 0,775 67

82 Şekil 4.1. Farklı sürfaktan konsantrasyonlarının boş amfifilik siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü üzerine etkisi (n=3) 4.2. Siklodektrin Nanokürelerin Karakterizasyonu Partikül Büyüklüğü Dağılımı Siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü dağılımı ve polidispersite indeksi değerleri, 173 o açı ve 25 o C sıcaklıkta Malvern Zetasizer aleti ile ölçülmüştür. Ölçümler, her bir formülasyon için 3 er kez tekrarlanmıştır. Nanopresipitasyon yöntemi ile hazırlanan siklodekstrin nanokürelere ait ortalama partikül büyüklüğü dağılımı ve polidispersite indeksleri Çizelge 4.2 de verilmiştir. Çizelge 4.2. Nanoküre formülasyonlarının ortalama partikül büyüklüğü dağılımı (nm) ve polidispersite indeksleri (± SS, n=3) Formülasyon Ortalama Partikül Büyüklüğü (nm) ± SS Polidispersite indeksi ± SS 6-O-CAPRO β-cd 103 ± 3,7 0,13 ± 0,01 CS-6-O-CAPRO β-cd 125 ± 2,3 0,22 ± 0,01 Polikatyonik β-cdc6 74 ± 1,8 0,16 ± 0,02 68

83 Zeta Potansiyeli Siklodekstrin nanokürelerin zeta potansiyel ölçümleri, Malvern Zetasizer aleti ile 12 o açı ve 25 o C sıcaklıkta ve her bir formülasyon için 3 er kez olmak üzere gerçekleştirilmiştir (Çizelge 4.3.). Çizelge 4.3. Nanoküre formülasyonlarının Zeta potansiyel değerleri (mv) (± SS, n=3) Formülasyon Zeta Potansiyel (mv) ± SS 6-O-CAPRO β-cd -29 ± 2,4 CS-6-O-CAPRO β-cd +44 ± 3,02 Polikatyonik β-cdc6 +61 ± 1, Uzun Süreli Stabilite Testi İlaç yüklenmemiş siklodekstrin nanokürelerin fiziksel stabilitelerinin belirlenebilmesi amacı ile 12 aylık süre boyunca stabilite çalışmaları yapılmıştır. Takip edilen süre boyunca örnekler, +4 o C de sulu dispersiyon halinde tutularak; 0., 2., 4., 8. ve 12. aylarda partikül büyüklüğü, polidispersite indeksi ve zeta potansiyel ölçümleri tekrarlanmıştır. Elde edilen bulgular Şekil te gösterilmiştir. 69

84 250 Partikül Büyüklüğü (nm) O-CAPRO β-cd CS-6-O-CAPRO β-cd β-cdc Ay 2 Ay 4 Ay 8 Ay 12 Ay 6-O-CAPRO β-cd CS-6-O-CAPRO β-cd β-cdc Şekil 4.2. Boş nanopartiküllerin zamana bağlı partikül büyüklüğü değişimi (± SS, n=3) Polidispersite indeksi Ay 2 Ay 4 Ay 8 Ay 12 Ay 6-O-CAPRO β-cd CS 6-O-CAPRO β-cd β-cdc O-CAPRO β-cd CS 6-O-CAPRO β-cd β-cdc6 Şekil 4.3. Boş nanopartiküllerin zamana bağlı polidispersite indeksi değerindeki değişim (± SS, n=3) 70

85 80 60 Zeta Potensiyel (mv) O-CAPRO β-cd CS 6-O-CAPRO β-cd β-cdc Ay 2 Ay 4 Ay 8 Ay Ay 6-O-CAPRO β-cd CS 6-O-CAPRO β-cd β-cdc Şekil 4.4. Boş nanopartiküllerin zamana bağlı zeta potansiyel değerindeki değişimi (± SS, n=3) 71

86 SEM Görüntüleri Nanopresipitasyon yöntemi ile hazırlanan boş nanokürelerin taramalı elektron mikroskop görüntüleri Şekil 4.5 ve Şekil 4.6 da gösterilmiştir. Şekil O-Capro β-cd nanokürelerine ait SEM görüntüleri Şekil 4.6. CS-6-O-Capro β-cd ve β-cdc6 nanokürelerine ait SEM görüntüleri 72

87 4.3. Paklitakselin HPLC Yöntemi ile in vitro Miktar Tayini ve Validasyonu Paklitakselin analizi için, sabit faz olarak C-18 Oktadesil silika, hareketli faz olarak ise polar özellikli asetonitril:su (70:30) karışımının kullanıldığı ters faz HPLC yöntemi kullanılmıştır. Hazırlanan bu yöntemle 227,4 nm de DAD dedektörü ile gerçekleştirilen deteksiyon sonucu, paklitaksele ait pik 4,57. dakikada saf olarak elde edilmiştir (Şekil 4.7). Şekil 4.7. Paklitaksele ait HPLC kromotogramı 4.4. Analitik Yöntemin Validasyonuna Ait Bulgular Kalibrasyon Denklemine Ait Bulgular Paklitakselin kalibrasyonu için 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 150 ve 200 μg/ml olmak üzere 9 farklı konsantrasyon kullanılmıştır. Sonuçta, elde edilen kalibrasyon doğrusu (konsantrasyona karşı alan grafiği) ve Paklitakselin seçilmiş olan farklı konsantrasyonları için gözlenen pikler (zamana karşı mau grafiği) Şekil 4.8 ve 4.9 da belirtilmektedir. Şekil 4.8. Paklitakselin farklı konsantrasyonlarına ait HPLC piklerin toplu gösterimi 73

88 Pik Alanı 20,000 18,000 16,000 14,000 12,000 10,000 8,000 6,000 4,000 2,000 0 y = 88,665x + 36,086 r² = 0, Konsantrasyon(µg) Alan , , , , , , , ,4 Konsantrasyon (μg/ml) Şekil4.9. Paklitaksele ait kalibrasyon eğrisi ve denklemi Doğrusallık Paklitakselin asetonitrilde hazırlanan farklı konsantrayondaki çözeltilerinden hareketle hazırlanan kalibrasyon doğrusuna ait korelasyon katsayısı (r 2 ) 0,9999 olarak saptanmıştır (Bkz. Şekil 4.9). Korelasyon katsayısı değerinin 1 e çok yakın çıkması, Paklitaksel kalibrasyon doğrusunu oluşturan noktaların doğrusallığını ispatlamaktadır Doğruluk Paklitakselin validasyonunda doğruluk parametresini araştırmak için düşük, orta ve yüksek olmak üzere üç farklı konsantrasyon (1, 25 ve 200 μg/ml) belirlenerek art arda 3 gün analizi yapılmıştır. Geri kazanım yüzdeleri hesaplanarak ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı hesaplanmıştır (Çizelge 4.4). Varyasyon katsayısı her bir konsantrasyon için %2 den küçük çıkmıştır. Bu sonuç analitik yöntemin doğruluğunu göstermiştir. 74

89 Çizelge 4.4. Paklitakselin geri kazanım yüzdeleri ve varyasyon katsayıları (n=6) Örnek 1 µg/ml % geri kazanım 25µg/ml % geri kazanım 200 µg/ml % geri kazanım 1 98,4 96,98 100, ,5 98,41 97, ,65 96,12 101, ,74 98,91 99, ,23 96,17 99, ,83 99,88 99,48 Ortalama 99,23 97,74 99,6 Standart sapma 1,23 1,55 1,35 Varyasyon katsayısı 1,24 1,59 1, Kesinlik Paklitakselin analitik yöntem validasyonunda kesinlik parametresi için tekrar edilebilirlik, tekrar elde edilebilirlik ve günler arası farklılık incelenmiştir. Tekrar edilebilirlik: Tekrar edilebilirlik parametresi için kalibrasyon çalışmaları için hazırlanmış farklı Paklitaksel konsantrasyonlarından bir tanesi (50µg/ml) seçilerek 6 kez art arda HPLC analizi yapılmıştır. HPLC analizi ile elde edilen konsantrasyon değerlerinin ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı hesaplanmıştır. Varyasyon katsayısı %2 den küçük bulunmuştur. Veriler Çizelge 4.5. te gösterilmiştir. Bu sonuç analitik yöntemin tekrar edilebileceğini göstermektedir. Çizelge 4.5. Paklitaksele ait tekrar edilebilirlik değerleri ve varyasyon katsayıları (n=6) Konsantrasyon Örnek (µg/ml) 1 49,8 2 49,7 3 49,7 4 49,8 5 49,6 6 49,5 Ortalama Standart Sapma Varyasyon Katsayısı (%) 49,7 0,13 0,02 Tekrar elde edilebilirlik: Tekrar elde edilebilirlik parametresinin değerlendirilmesi amacıyla, stoktan (200 μg/ml) hareketle seyreltme ile elde edilen 6 adet aynı konsantrasyonda (50 μg/ml) hazırlanan çözeltinin HPLC analizi gerçekleştirilmiştir. HPLC analizi ile elde edilen konsantrasyon değerlerinin 75

90 ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı değerleri hesaplanmıştır. Varyasyon katsayısı %2 den küçük bulunmuştur. Veriler Çizelge 4.6. da gösterilmiştir. Çizelge 4.6. Paklitaksele ait tekrar elde edilebilirlik değerleri ve varyasyon katsayıları (n=6) Konsantrasyon Örnek (µg/ml) 1 49,8 2 50,9 3 50,9 4 49,7 5 51,0 6 51,1 Ortalama Standart Sapma Varyasyon Katsayısı (%) 50,6 0,6 0,4 Günler arası farklılık: Günler arası farklılık parametresinin değerlendirilmesi için aynı konsantrasyondan (50µg/ml) 3 gün ardı ardına hazırlanan Paklitaksel çözeltilerinin HPLC analizi yapılarak, elde edilen konsantrasyon değerlerinin ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı değerleri hesaplanmıştır. Veriler Çizelge 4.7. de gösterilmiştir. Çizelge 4.7. Paklitaksele ait günler arası farklılık değerleri ve varyasyon katsayıları (n=3) Konsantrasyon Örnek (µg/ml) 1 49,8 2 49,7 3 50,7 Ortalama Standart Sapma Varyasyon Katsayısı (%) 50,1 0,6 0, Duyarlılık Paklitakselin HPLC ile miktar tayininde kullanılan yöntemin duyarlılığı Bölüm te belirtildiği şekilde gerçekleştirilmiş olup gözlenebilirlik sınırı 0,056 µg/ml (S/N=3) ve alt tayin sınırı 0,18 µg/ml (S/N=10) olarak tespit edilmiştir. 76

91 Özgünlük Kullanılan analitik yöntemin paklitaksele özgün olduğunu kanıtlamak için her bir formülasyon hazırlama sırasında kullanılan maddelerin HPLC ile analizi yapılmıştır. HPLC analizinde belirlenen koşullarda 4,57. dakikada Paklitakselin verdiği pik ile çakışan başka bir pik olmadığı gösterilmiş ve yöntemin özgünlüğü test edilmiştir. Paklitaksele ve diğer formülasyon bileşenlerine ait pikler Şekil 4.10 da gösterilmiştir. 77

92 Paklitaksel Polikatyonik βcdc6 Kitosan 6-O-Capro βcd Asetonitril Şekil Paklitaksel ve formülasyondaki diğer maddelerin HPLC kromotogramının karşılaştırılması 78

93 4.5. Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonuna Ait Bulgular Partikül Büyüklüğü Dağılımı İlaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü dağılımı ve polidispersite indeksi değerleri, 173 o açı ve 25 o C sıcaklıkta Malvern Zetasizer aleti ile ölçülmüştür. Ölçümler, her bir formülasyon için 3 er kez tekrarlanmıştır. Nanopresipitasyon yöntemi ile hazırlanan siklodekstrin nanokürelere ait ortalama partikül büyüklüğü dağılımı ve polidispersite indeksleri Çizelge 4.8 de verilmiştir. Çizelge 4.8. Paklitaksel yüklü nanoküre formülasyonlarının ortalama partikül büyüklüğü (nm) ve polidispersite indeksleri (± SS, n=3) Formülasyon Ortalama Partikül Büyüklüğü (nm) ± SS Polidispersite indeksi ± SS 6-O-CAPRO β-cd 165 ± 7,0 0,19 ± 0,02 CS-6-O-CAPRO β-cd 176 ± 5,6 0,28 ± 0,01 Polikatyonik β-cdc6 92 ± 4 0,2 ± 0, Zeta Potansiyeli İlaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin zeta potansiyel ölçümleri, Malvern Zetasizer aleti ile 12 o açı ve 25 o C sıcaklıkta ve her bir formülasyon için 3 er kez olmak üzere gerçekleştirilmiştir. Veriler Çizelge 4.9 da gösterilmektedir. Çizelge 4.9. İlaç yüklü nanoküre formülasyonlarının zeta potansiyel değerleri (mv) (± SS, n=3) Formülasyon Zeta Potansiyel (mv) ± SS 6-O-CAPRO β-cd -35 ± 2,6 CS-6-O-CAPRO β-cd +56 ± 0,23 Polikatyonik β-cdc6 +67 ± 1,3 79

94 Kısa Süreli Stabilite Testi İlaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin fiziksel stabilitelerinin belirlenebilmesi amacı ile 1 aylık süre boyunca stabilite çalışmaları yapılmıştır. Takip edilen süre boyunca örnekler, +4 o C de sulu dispersiyon halinde tutularak; 0., 1., 7., ve 30. günlerde partikül büyüklüğü, polidispersite indeksi ve zeta potansiyel ölçümleri tekrarlanmıştır. Elde edilen bulgular Şekil de gösterilmiştir. 300 Ortalama Partikül Büyüklüğü Dağılımı(nm) O-CAPRO β-cd PCX- 6-O- CAPRO β-cd CS-6-O- CAPRO β-cd PCX-CS 6-O- CAPRO β-cd β-cdc6 PCX β-cdc6 0.Gün Gün Gün Gün Gün 1.Gün 7.Gün 30.Gün Şekil Boş ve ilaç yüklü nanopartiküllerin zamana bağlı partikül büyüklüğü değişimi (± SS, n=3) 80

95 0.4 Polidispersite İndeksi O-CAPRO β-cd PCX 6-O- CAPRO β- CD CS 6-O- CAPRO β- CD PCX CS 6-O- CAPRO β- CD β-cdc6 PCX β-cdc6 0.Gün Gün Gün Gün Gün 1.Gün 7.Gün 30.Gün Şekil Boş ve ilaç yüklü nanopartiküllerin zamana bağlı polidispersite indeksi değerindeki değişim (± SS, n=3) 80 Zeta Potansiyel (mv) O- CAPRO β- CD PCX 6-O- CAPRO β- CD CS 6-O- CAPRO β- CD PCX CS 6- O-CAPRO β-cd β-cdc6 PCX β- CDC6 0. Gün Gün Gün Gün Gün 1. Gün 7.Gün 30.Gün Şekil Boş ve ilaç yüksüz nanopartiküllerin zamana bağlı zeta potansiyel değerindeki değişim (± SS, n=3) 81

96 4.6. İlaç Yükleme Etkinliğinin Belirlenmesi Siklodekstrinlere yüklenen Paklitaksel miktarı HPLC yöntemi ile tayin edilmiştir. Her bir formülasyon için gerekli hesaplamalar aşağıda belirtilen formüller üzerinden hesaplanmıştır. % Yükleme Etkinliği = Hapsolan İlaç Miktarı (µg) Toplam İlaç Miktarı (µg) 100 % Yükleme Kapasitesi = Hapsolan İlaç Miktarı(µmol) Nanopartikül Ağırlığı(µmol) 100 Hesaplamalar sonrası elde edilen yükleme etkinlikleri ve yükleme kapasiteleri değerleri Çizelge 4.10 da verilmiştir. Çizelge Yükleme etkinliği ve yükleme kapasitesi değerleri (±SS, n=3) %Yükleme Etkinliği ± SS % Yükleme Kapasitesi ± SS 6-O-Capro β-cd 40,5±2,4 4,05±0,4 CS-6-O-Capro β-cd 62,33±4,6 4,16±1,3 Polikatyonik β-cdc6 63,9±2,1 6,39±0, Paklitaksel Dilüsyon Testi Amfifilik siklodekstrin nanoküreler içinde ve yüzeyinde bulunan Paklitakselin seyreltme faktörüne bağlı olarak değişimini incelemek amacıyla, nanoküreler farklı oranlarda ph 7,4 fosfat tampon çözeltisi ile seyreltilmişlerdir. Elde edilen nanopartiküller HPLC ile analiz edilmiştir. Veriler Şekil 4,14 te gösterilmiştir. 82

97 100 % Paklitaksel Miktarı Seyreltme Katsayısı 6-0-CAPRO CS-6-O-CAPRO PBO 234 Şekil Seyreltme faktörüne bağlı salınan Paklitaksel miktarı (±SS, n=3) 4.8. İlaç Salım Profilinin Belirlenmesi Siklodekstrinlerden salınan Paklitaksel miktarı tüp yöntemi ile tayin edilmiştir. Bunun için belirli zaman aralıklarında ph 7,4 fosfat tampon çözeltisi içindeki ilaç yüklü nanokürelerden 0,5 ml örnek vial içine alınmış ve yerine eşit hacimde yeni FTÇ eklenmiştir. HPLC yöntemi ile yapılan analiz sonucu Paklitakselin % kümülatif salım sonucu Şekil 4.15 te gösterilmiştir. 120 % Kümülatif Salınan Paklitaksel Miktarı O-Capro β-cd CS-6-O-Capro β-cd β-cdc Zaman (dakika) Şekil % Kümülatif salınan Paklitaksel miktarı(±ss, n=3) 83

98 4.9. Boş Siklodekstrin Nanopartiküllerin Güvenilirlik Çalışması Boş siklodekstrin nanopartiküllerin L929 hücreleri üzerindeki hücre yaşayabilirliğine etkisi Şekil 4.16 da gösterilmiştir. 160 % Hücre Yaşayabilirliği kontrol 6-o-Capro CS β-cdc6 250 nm 500 nm Şekil Boş siklodekstrin nanokürelerin L929 hücre yaşayabilirliğine etkisi (± SS,n=3) Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanopartiküllerin Etkinlik Çalışması İlaç yüklü amfifilik siklodekstrin nanopartiküllerin MCF-7 hücreleri üzerindeki hücre yaşayabilirliğine etkisi Şekil 4.17 de gösterilmiştir. 120 % Hücre Canlılığı nm 500nM Şekil İlaç yüklü ve boş siklodekstrin nanokürelerin MCF-7 hücre yaşayabilirliğine etkisi (± SS,n=3) 84

99 5.TARTIŞMA 5.1. Amfifilik β-siklodekstrin Türevleri Amfifilik siklodekstrinler, ilaç taşıma sistemlerinde çok sayıda araştırmanın yapıldığı, doğal siklodekstrinlerden hareketle farklı yöntemlerle sentezlenen siklodekstrin türevleridir [159]. Son yıllarda ilaç ve gen taşıyıcı sistemler olarak amfifilik siklodekstrinler sıklıkla çalıılmaktadır. Bu türevlerin farmasötik alanda ilgi görmesinin başlıca sebebi, sulu ortamda ara yüzeylerde amfifilik siklodekstrinlerin kendiliğinden düzenlenebilme (self-organization) özelliğine sahip olmalarıdır [160]. Bu özellik nedeniyle amfifilik siklodekstrin türevleri spontan olarak nano ölçekte taşıyıcı sistemler oluşturabilmektedirler. Amfifilik siklodekstrinler genellikle doğal β- CD lerden sentezlenir [159] ve sentez sırasında farklı yöntemler kullanılabilir [159,161]. Tez çalışması kapsamında, nanoküre oluşturmak için kullanılan Heptakis (6-Oheksanoil) siklomaltoheptoz β-cd olan 6-O Capro β-cd, primer yüz modifiye amfifilik β-cd türevidir. Sentezi, makrosiklik halkasının 6. Pozisyonuna, 6C lu yağ asiti zincirinin bağlanması ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, nanopartikül oluşturan model amfifilik β-cd molekülü olarak 6-O-CAPRO-β-CD şeçilmesinin başlıca nedeni Memişoğlu ve ark. [152] tarafından önceki yıllarda yapılan çalışmada, β-cdlerin primer yüzeyinde 6 karbonlu düz alifatik zincirlerle gerçekleştirilen modifikasyon sonucu oluşan amfifilik siklodekstrin türevlerinin, uygun nanopartikül oluşturabilen moleküller olduklarının belirtilmesidir. Negatif yüzey yüküne sahip 6-O-CAPRO-β-CD in yüzey yükünü pozitif hale getirebilmek için, çalışmalar sırasında kitosanın suda çözünen türevi olan Protasan kullanılmıştır. Kitosan, böcek ve kabukluların çoğunlukla dış iskelet sistemini oluşturan kitinin N-deasetilasyonu sonucu elde edilen doğal bir polimerdir [162]. Nanopartiküllerin yüzey yüklerini değiştirmek amacıyla poli-l-lizin, poli- Ɛ- kaprolakton gibi farklı katyonik polimerle ile modifikasyonu söz konusudur [163]. Ancak poli-l-lizin ve polietilen imin gibi katyonik hidrofilik polimerlerin toksik etkisi bilinmektedir [ ]. Çalışmalarımız sırasında yüzey modifiye edici polimer olarak kitosanın seçilmesinin nedenleri arasında kitosanın toksik olamaması ve biyoparçalabilir bir doğal polimer olmasıdır. Kitosan mukoadezif etkiye sahiptir. Bu 85

100 etkiyi hem biyoadheziv etkisi ile hem de epitel hücreleri arasındaki sıkı bağlantıları geçici olarak açması ile sağlamaktadır [167]. Ayrıca Kitosan süspansiyonları ve mikropartikülleri immün tetikleyici etki yaparak makrofaj ve polimorf nukleer hücrelerin sayısını ve aktivasyonunu artırdığı bilinmektedir [168]. Çalışmalar sırasında kullanılan diğer amfifilik siklodekstrin türevi ise yine β- CD in modifikasyonu ile elde edilmiş polikatyonik β-cdc6 dır. İspanya da Sevilla Üniversitesi nde Dr. J. Benito tarafından sentezlenen amfifilik siklodekstrini yine Benito ve ark. tarafından [154], gen taşınım sistemi olarak polipleks formunda kullanılmıştır. Aynı grup tarafından yapılan çalışmalarda DNA ile polipleks oluşturularak gen taşınımında etkinliği, saflığı ve toksisitesi gösterilmiştir. Sentezlenen polikatyonik βcdc6 nın DNA ile polipleks oluşturabildiği, BLN-CL2 murin karaciğer hücre hattı ve COS-7 maymun böbrek fibroblast hücre hattı üzerinde yapılan çalışmalar sonucu toksik olmadığı, hücre yaşayabilirliğinin %95 ve üzerinde olduğu gösterilmiştir Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Ön Formülasyon Çalışmaları Amfifilik siklodekstrin nanokürelerin hazırlanmasında kullanılan nanopresipitasyon yöntemi, nanopartikül oluşturmak için kolay ve ekonomik bir yöntemdir. Formülasyon geliştirme çalışmaları sırasında, siklodekstrinleri çözmek için aseton, etanol ve metanol organik faz çözücüsü olarak kullanılmıştır. Formülasyonlarda etkisi incelenen bir başka parametre sürfaktan ve sürfaktan konsantrasyonudur. Çalışmalar sırasında bütün formülasyonlarda sıcaklık, organik çözücünün hacmi, siklodekstrin miktarı, karıştırma süresi ve hızı sabit tutularak, formülasyonlar ortalama partikül büyüklüğü dağılımı, zeta potansiyeli ve polidispersite açısından karşılaştırılmıştır. 6-O-Capro β-cd için aseton ile hazırlanan sürfaktan içermeyen partiküllerin ortalama partikül büyüklüğü 163,6 nm, polidispersite indeksi 0,62 ölçülürken %0,1 (a/h) Pluronic F68 içeren formülasyon için partikül büyüklüğü dağılımı 140,9 nm, polidispersite indeksi ise 0,30 ölçülmüştür. İki formülasyonda partiküllerin zeta potansiyelleri sırasıyla -26,2 ve -23,5 mv ölçülmüştür. Sürfaktan kullanılarak hazırlanan formülasyonda ortalama partikül büyüklüğü ve polidispersite indeksinde istatistiksel olarak anlamlı (p<0,05) bir azalma görülmektedir. Bu durum 86

101 sürfaktanın formülasyonu stabilize ettiği ve daha homojen nanopartiküllerin oluşmasına neden olmasıyla açıklanabilir. Yapılan bir çalışmada hidrofilik sürfaktan olan Pluronic F 68 kullanıldığında, elde edilen nanopartiküllerin daha küresel olduğu ve monodispers bir partikül büyüklüğü dağılımı elde edildiği bildirilmiştir [169]. Çözücü olarak etanolün kullanıldığı formülasyonda ise yukarıda açıklanan sonuçların tam tersi durum söz konusu olmuştur. Sonuçlara göre, sürfaktansız hazırlanan formülasyonların partikül büyüklüğü 134,3 nm ölçülürken; sürfaktan olarak %0,1 (a/h) Pluronic F68 içeren formülasyonlarda partikül büyüklüğü dağılımı 190,2 nm ye yükselmiştir. Oluşan nanopartiküller stabil ve homojen (PI= 0,08) olduğu için kullanılan sürfaktan, oluşan nanopartiküllerin yüzeyinde bir tabaka oluşturarak partikül büyüklüğünde istatistiksel olarak anlamlı (p<0,05) bir artışa neden olmuştur. Amfifilik siklodekstrinlerin sürfaktan gerektirmeden kendiliğinden nanopartikül oluşturma özellikleri bilinmektedir [ ]. Kitosan kaplı 6-O-Capro β-cd nanokürelerin aseton ile hazırlanan sürfaktansız formülasyonlarında partikül büyüklüğü 284,6 nm (PI= 0,34) ölçülmüştür. Aynı formülasyonun %0,1 (a/h) sürfaktan ile hazırlanması partikül büyüklüğünde anlamlı (p<0,05) bir azalmaya ve daha homojen partiküllerin oluşmasına neden olmuştur (197,2 nm; PI=0,23). Organik çözücü olarak etanolün kullanıldığı formülasyonlarda sürfaktan içermeyen nanopartiküllerin ortalama partikül büyüklüğü dağılımı 163,4 nm (PI=0,04); sürfaktanın kullanıldığı formülasyonda 167,9 nm (PI= 0,15) ölçülmüştür. Diğer bir amfifilik siklodekstrin türevi olan β-cdc6 formülasyonlarında ise organik çözücü olarak asetonun kullanıldığı sürfaktansız hazırlanan ve %0,1(a/h) sürfaktan kullanılarak hazırlanan formülasyonlarda ortalama partikül büyüklüğü sırasıyla 179,5 nm ve 284,9 nm dir. Sürfaktan içermeyen formülasyonun etanol ile hazırlanması sonucu partikül büyüklüğü 82,9 nm olmuştur ve bu farklar istatistiksel olarak anlamlıdır (p<0,05). Formülasyon geliştirme sırasında kullanılan organik solvanın polaritesinin ve su ile karışabilirliğinin nanopartikül çapı üzerinde doğrudan etkisi vardır. Çünkü nanopartikül oluşumu Marangoni etkisi ve dolayısıyla organik fazın sulu faz içine 87

102 difüze olurken yaratılan türbülansın derecesine bağlıdır. Bu nedenle farklı sürfaktan varlığı ve yokluğunda birbiriyle çelişen sonuçlar elde edilebiliyor. Bu çalışmada tüm formülasyonlarda sürfaktana gerek kalmadan en uygun sonuçları veren organik çözücü olan etanol tercih edilmiştir. Ortalama partikül büyüklüğü dağılımı sonuçları iki siklodekstrin türevi için de etanolün iyi bir çözücü olduğu göstermektedir. Yine sonuçlar değerlendirildiğinde sürfaktan olarak kullanılan Pluronic F68 in etanol ile hazırlanan formülasyonlarda partikül büyüklüğü üzerinde arttırıcı etkisi olduğu görülmüştür. İleri çalışmalarda daha sağlıklı karşılaştırma yapmak amacıyla üç formülasyon arasındaki farklılıklar en az seviyede tutulmaya çalışılmıştır. Bu amaçla, Kitosan kaplı amfifilik β-cd formülasyonlarında sürfaktan kullanılarak hazırlanan aseton formülasyonları etanole göre daha düşük partikül büyüklüğü ve daha düşük polidispersite indeksi vermesine rağmen, çalışmaların devamında etanol ile hazırlanan formülasyonların kullanılmasına karar verilmiştir Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu Nanopartiküler ilaç taşıyıcı sistemlerin etkinliğinde rol oynayan en önemli özelliklerinden birisi oluşan partiküllerin büyüklüğü ve dağılımıdır. Kullanılan polimerin moleküler ağırlığı ve konsantrasyonu; organik çözücü/polimer oranı; organik faz/ sulu faz oranı, formülasyonda kullanılan sürfaktanın özellikler ve konsantrasyonu, hazırlama sırasındaki parametreler (sıcaklık, karıştırma hızı ve süresi) oluşan nanopartiküllerin büyüklüğünü doğrudan etkilemektedir [82]. Bu çalışmada kullanılan amfifilik siklodekstrin nanokürelerin tümü Bilensoy ve ark. [155,156] tarafından yapılan çalışmalar temel alınarak polimer/ organik faz oranı 1/1; organik faz/ sulu faz oranı 1/2 olacak şekilde hazırlanmıştır Partikül Büyüklüğü Dağılımı Nanopresipitasyon yöntemi ile hazırlanan amfifilik siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü dağılımı Malvern Zetasizer ile yapılan ölçümler sonucunda değerlendirilmiştir. Nanopartikül hazırlamada kullanılan amfifilik siklodekstrinler içerisinde en küçük partikül büyüklüğü dağılımına sahip siklodekstrin türevi polikatyonik β-cdc6 dır ve ortalama partikül büyüklüğü 74 nm dir. 88

103 Kitosanla kaplı 6-O-Capro β-cd nanokürelerin partikül büyüklüğünde (125 nm), 6-O Capro β-cd nanokürelerin partikül büyüklüğüne (103 nm) göre anlamlı (p<0,05) bir artış görülmektedir. Kitosan hazırlanan nanokürelerin dış yüzeyini kapladığı için partikül büyüklüğündeki bu artış beklenen bir sonuçtur. Formülasyon sırasında kullanılan kitosan miktarının seçiminde, partikül büyüklüğü dağılımındaki değişimler temel alınan parametre olmuştur. Her üç formülasyonda hazırlanan nanokürelerin partikül büyüklüğü dağılımlarının 200 nm den küçük olması, hazırlanan nanopartiküllerin tümörlü bölgede EPR etkisi olarak bilinen özellikten yararlanarak, tümör içinde birikmesine neden olabilir. Literatürde nanopartiküllerin EPR etkisi ile tümörlü bölgede birikebilmeleri için gerekli partikül büyüklüğünün 200 nm den az olması gerektiği belirtilmektedir [143,144]. Özellikle 100 nm nin altına inildiğinde RES tarafından tanınması engellendiği için hem kanda dolaşım süresi artabilmekte hem de lenf nodlarında tutulma ve hücre içine giriş özellikleri artmaktadır Zeta Potansiyel Zeta potansiyel değeri, partikülün sahip olduğu yüzey yükünü belirten bir değerdir [173] ve hazırlanan nanopartiküllerin stabilitesi ve biyolojik membranlarla etkileşimi açısından oldukça önemlidir. Hazırlanan nanokürelerin zeta potansiyel değerleri Malvern Zetasizer ile ölçülmüştür. Nanoküre hazırlamada kullanılan amfifilik 6-O-Capro β CD nanokürelerin zeta potansiyel değerleri -29 mv ölçülmüştür. Bu değer literatürde 6-O-Capro β CD ile hazırlanan nanokürelerin zeta potansiyel değeri ile örtüşmektedir [45]. 6-O-Capro β CD nanokürelerin yüzeylerinin kitosan ile kaplanması zeta potansiyel değerini +45 mv a yükseltmiştir. Kitosanın pozitif yüzey yüküne sahip olduğu ve bu nedenle mukoadheziv özellik gösterdiği literatürde çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir [174]. Bu sonuç çalışmamız sırasında hazırladığımız nanokürelerin yüzeyinin kitosan ile kaplanması sonucu zeta potansiyelinin artması ile de doğrulanmıştır. Formülasyonlarda kullanılan β-cdc6 polikatyonik özelliktedir ve daha önceki çalışmalarda DNA ile polipleks oluşturulmuştur. Yapılan zeta potansiyel ölçüm sonuçları β-cdc6 için +61 mv bulunmuştur. Bu sonuç literatürle örtüşmektedir 89

104 [153,154]. Pozitif yük hücresel etkileşim açısından avantajlıdır. Ancak kan dolaşımında proteinlerce tanınarak opsonize edilme açısından dezavantajlıdır SEM Görüntüleri Siklodekstrin nanokürelerin görüntülenmesinde taramalı elektron mikroskobu kullanılmıştır. Metal levha üzerine sabitlenen örnek altın-palladyum karışımı ile kaplanmıştır. Her üç siklodekstrin türevi için de SEM görüntülerinde yüzeyi düzgün, küresel yapılar görülmüştür. Ancak siklodekstrinler ve kitosan şeker türevi olmaları nedeniyle elektron bombardımanına hassas oldukları için görüntüleme sırasında kısmi bozuklukların oluşmasına neden olmuştur. SEM görüntüleri, partikül büyüklüğü sonuçlarını doğrulayıcı niteliktedir. Görüntüleme sonucu en küçük partikül büyüklüğü polikatyonik β-cdc6 nanokürelerde, en büyük partikül büyüklüğü kitosan kaplı siklodekstrin nanokürelerde görülmüştür Uzun Süreli Stabilite Tez çalışması sırasında hazırlanan boş siklodekstrin nanokürelerin uzun süreli stabilite çalışmaları yapılmış ve bu kapsamda 12 ay süreyle zamana karşı partikül büyüklüğü dağılımı, polidispersite indeksi ve zeta potansiyel değerleri ölçülmüştür. Bu ölçümlere bağlı olarak şu sonuçlar elde edilmiştir: 6-O-Capro β-cd nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğünde 4. Aya kadar belirgin bir artış olmamıştır. Ancak 4,8 ve 12. aylarda partikül büyüklüğü ortalama 220 nm olmuştur. Hazırlanan 6-O-Capro β-cd nanokürelerin 12 ay boyunca istenilen büyüklük sınırları içerisinde olduğu gözlenmiştir. Partikül büyüklüğü dağılımına bağlı olarak polidispersite indeksi değerlerinin 0,13 ve 0,20 arasında değişmektedir. Zeta potansiyel değerleri - 24 mv ile -32 mv arasında değişmiştir. Kitosan kaplı 6-O-Capro β-cd nanokürelerin 12 aylık stabilite çalışmaları süresince ortalama partikül büyüklüğü değerlerindeki artışın en fazla 8. ayda olduğu görülmektedir ve 200 nm olarak ölçülmüştür. Ön formülasyon çalışmaları sırasında uygun kitosan konsantrasyonunun belirlenerek formülasyonlarda uygulanmasıyla, kitosan kaplı nanopartiküllerin partikül 90

105 büyüklüğünde çok büyük bir değişim olmasının önüne geçilmiştir. Aynı zamanda 6-O-Capro β-cd anyonik bir siklodekstrin türevidir. Bu nedenle yüzeyini kaplayan pozitif yüklü kitosan ile elektriksel etkileşimi sayesinde stabil kalmıştır. Nanopartiküllerin polidispersite indeksi değerlerinde 12 aylık süre boyunca 0,23 ten 0,33 e artış görülmüştür. Literatürde nanopartiküllerin stabil kalması için en uygun zeta potansiyel değerlerinin -35mV ile +35 mv arasında olması gerektiği belirtilmektedir [175]. Kitosan kaplı nanopartiküllerin zeta potansiyel değerleri 12 ay boyunca +44 mv ile +51 mv arasında değişmektedir. Polidispersite indeksindeki meydana gelen değişikliğin nedeninin kitosan kaplı nanopartiküllerin yüksek pozitif zeta potansiyeli olduğu düşünülmektedir. β-cdc6 amfifilik siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü dağılımının 4. aya kadar ortalama 80 nm iken 4-12 aylar arası ortalama 170 nm ölçülmüştür. Zeta potansiyel değerinde anlamlı bir artış (p>0,05) olmamakla beraber 12 ay boyunca zeta potansiyel değeri 61mV-66mV arasında ölçülmüştür. Çeşitli kaynaklarda +35 mv zeta potansiyeline sahip nanopartiküllerin stabilite sorunu olduğu belirtilmiştir. β-cdc6 nanokürelerindeki partikül büyüklüğündeki artışın kuvvetli yüzey yüküne bağlı olduğu düşünülmektedir. Her üç siklodekstrin nanoküre formülasyonunda sulu dispersiyon halinde saklandığında partikül büyüklüğünde ve zeta potansiyelinde değişimler olmasına rağmen 12 ay boyunca partikül büyüklüğü dağılımları ve zeta potansiyel değerleri istenilen aralıkta ölçülmüştür Paklitaksel in Analitik Yöntem Validasyonu Paklitaksel in analitik yöntem validasyonu çalışmaları HPLC kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Paklitaksel e ait kromatogram Şekil 4.7 de verilmiştir. Kromatogramdan da görüldüğü gibi Paklitaksel e ait pik düzgün bir şekilde elde edilmiş olup, alıkonma zamanı 4,57 dakika olarak bulunmuştur. Hazırlanan kalibrasyon doğrusu μg/ml aralığında çalışılmıştır. Deney bulguları incelendiğinde, belirtilen konsantrasyon aralığında, HPLC ile analiz 91

106 sonucu elde edilen pik alanı arasında doğrusal ilişki saptanmıştır. Elde edilen kalibrasyon doğrusunun r 2 değeri 0,9999 olarak bulunmuştur. Kullanılan analiz yönteminin doğruluğunun saptanması için seçilen üç farklı konsantrasyonda ( μg/ml) geri kazanımları ve bu geri kazanımların ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayıları hesaplanmıştır. Literatürde benzerlik ve farklılıklarının incelendiği çalışmalarda varyasyon katsayısının %2 den daha küçük olması gerektiği bildirilmiştir [176]. Bizim çalışmamızda elde edilen varyasyon katsayıları sırasıyla %0,7; %1,16 ve %0,88 bulunmuştur ve %2 nin altında olduğu için kriterlere uygun bulunmuştur. Analiz yönteminin kesinliğinin tayini için tekrar edilebilirlik, tekrar elde edilebilirlik ve günler arası farklılık değerleri tayin edilmiş ve elde edilen sonuçların ortalama değerleri ile standart sapma ve varyasyon katsayıları hesaplanmıştır. Her üç değerlendirme sonucunda da seçilen konsantrasyon değeri olan 50 μg/ml için ortalama konsantrasyon sırasıyla 49,7 µg/ml, 50,6 µg/ml ve 50,1 µg/ml hesaplanmıştır. Bu ortalamalar üzerinden hesaplanan varyasyon katsayıları sırasıyla 0,02, 0,4 ve 0,3 olarak hesaplanmış ve %2 nin altında bulunmuştur. Yöntemin duyarlılığı için gözlenebilirlik sınırı 0,056 μg/ml ve alt tayin sınırı 0,18 μg/ml olarak tayin edilmiştir. Bu veriler seçilen analitik yöntemin çalışmamızın amacına uygun duyarlılığa sahip olduğunu göstermiştir. Paklitaksel için kullanılan analitik yöntemin özgünlüğü için yapılan çalışmalarda nanopartikül formülasyonlarında kullanılan yardımcı maddelerin ve salım ortamlarının Paklitaksel ile aynı şartlarda ve aynı alıkonma zamanında pik verip vermediği değerlendirilmiş ve herhangi bir girişime rastlanmamıştır Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu Partikül Büyüklüğü Dağılımı Paklitaksel yüklü amfifilik siklodekstrin nanokürelerin hazırlanması ve karakterizasyonunda boş nanoküreler için uygulanan metotlar uygulanmış ve sonuçlar değerlendirilmiştir. 92

107 Paklitaksel yüklü 6-O-Capro β-cd, kitosan kaplı 6-O-Capro β-cd ve β-cdc6 nanoküreler için ortalama partikül büyüklüğü dağılımı sırasıyla 165 nm, 176 nm ve 92 nm bulunmuştur. İlaç yüklü nanokürelerin partikül büyüklüklerinin, ilaç yüklü olmayan nanokürelerin partikül büyüklüğünden fazla olmasının nedeni olarak Paklitakselin ekseriyetle siklodekstrin nanokürelerin yüzeyine adsorbsiyonu düşünülmektedir. Literatürde konvansiyonel yükleme tekniğinde, ilacın matriks enkapsülasyonundan çok, nanokürelerin geniş yüzeyinde adsorbe halde bulunduğunun açıklanması sonucumuzu desteklemektedir [177] Zeta Potansiyeli Paklitaksel yüklü amfifilik siklodekstrin nanokürelerin zeta potansiyel değerleri ölçülmüştür ve her üç siklodekstrin türevi için de istenilen yüzey yüküne sahip partiküller elde edilmiştir Kısa Dönemli Stabilite Paklitakselin konvansiyonel uygulamada karşılaşılan en büyük problem uygun şekilde dilüe edildikten sonra kısa süreli fiziksel ve kimyasal stabilitesi bulunmaktadır. Seyreltme ile bazı konsantrasyonlarda aşırı doymuş çözeltiler elde edilmektedir ve bunun sonucunda Paklitaksel kristaller halinde çökelti oluşturmaktadır. Bu nedenle Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanokürelerin stabilite çalışmaları için hazırlanan partiküller sulu dispersiyon halinde saklanmışlardır. Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanokürelerin 30 gün süreyle partikül büyüklüğü değerleri, polidispersite indeksleri ve zeta potansiyel değerleri ölçülerek yorumlanmıştır. Stabilite çalışmaları sonucunda Paklitaksel yüklü nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü 6-O-Capro β-cd için nm, kitosan kaplı 6-O-Capro β-cd için nm ve βcdc6 için nm arasında değişmektedir. Her üç siklodekstrin formülasyonunun 1 aylık süre içindeki polidispersite indeksi 0,3 olarak bulunmuştur. Bu sonuç oluşan ilaç yüklü nanopatiküllerin homojen olduğunu göstermektedir. Zeta potansiyel değerlerine bakıldığında, ilaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin 1 ay boyunca zeta potansiyel değerlerinde çok az artış olduğu bununla birlikte boş 93

108 nanokürelerin zeta potansiyel değerleri ile aynı değerlere sahip oldukları görülmüştür. Bütün bu değerlendirmeler sonucu Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanokürelerin 1 aylık süre içerisinde sulu dispersiyon halinde rekristalize olmadıkları sonucuna varılabilir İlaç Yükleme Etkinliğinin Belirlenmesi Amfifilik siklodekstrin nanokürelere Paklitaksel konvansiyonel yöntemle nanopartikül hazırlama sırasında yüklenmiştir. Yükleme etkinliği değerleri Bölüm de belirtilen % yükleme etkinliği ve % yükleme kapasitesi formüllerine göre hesaplanmıştır. Her iki formül için de ilk olarak formülasyon hazırlama aşaması sonrası serbest ilaç ortamdan uzaklaştırılarak siklodekstrin nanokürelere yüklenen Paklitaksel miktarı üzerinden hesaplamalar yapılmıştır. Siklodekstrin nanokürelere yüklenen ilaç miktarı HPLC yöntemi ile tayin edilmiş elde edilen veriler formüllere uygulanarak yükleme değerleri bulunmuştur. Santrifüj ile serbest Paklitakselin uzaklaştırılması sonucu HPLC analizi ile elde edilen Paklitaksel miktarının, toplam ilaç miktarına bölünmesi ile yükleme etkinliği; toplam siklodekstrin miktarına bölünmesi ile de yükleme kapasitesi değerleri elde edilmiştir. Yapılan hesaplamalar sonucu yükleme etkinliği 6-O-Capro βcd, kitosan kaplı 6-O- Capro βcd ve βcdc6 için sırasıyla % 40,5, %62,3 ve % 63,9 olarak hesaplanmıştır. Bununla birlikte yükleme kapasitesi yine aynı sıra ile % 4,05, %4,16 ve %6,4 bulunmuştur. Bu sonuçlar doğrultusunda en yüksek yükleme etkinliği βcdc6 siklodekstrin nanokürelere aittir. Nanopartikülleri hazırlama sırasında formülasyonlarda siklodekstrin/ Paklitaksel oranı 10/1 olacak şekilde Paklitaksel konulmuştur. Yükleme kapasiteleri sonucunda βcdc6 formülasyonunda % 10 ilacın % 6 sının, diğer iki formülasyonda ise %4 ünün siklodekstrinlerce hapsedildiği görülmüştür. Her iki hesaplama sonucu en etkili formülasyonun βcdc6 siklodekstrin nanokürelere ait olmasının nedeni, bu siklodekstrin türevinin yüzey yükü ile ilişkili olmasına bağlanmaktadır. βcdc6 literatürde DNA ile polipleks oluşturmak için kullanılmıştır ve bu çalışmalarda DNA gibi negatif yüklü moleküllerle kompleks yeteneğinin güçlü olduğu belirtilmektedir [154]. Buna ek olarak bizim çalışmalarımız sırasında da Paklitakselin zeta potansiyel değeri -12mV bulunmuştur. Daha önce de belirtildiği gibi Paklitakselin 94

109 nanokürelerin yüzeyinde adsorbe olduğu düşünülürse yükleme etkinliğindeki farkın siklodekstrinlerin yüzey yüklerinden kaynaklandığı söylenebilir İn-vitro Salım Çalışmaları Amfifilik siklodekstrin nanopartiküler sistemlerden Paklitaksel salım çalışmalarında %0,1 Tween 80 içeren ph 7,4 fosfat tampon çözeltisi kullanılarak salım yatay çalkalayıcı su banyosunda gerçekleştirilmiştir. Bu yöntem seçilirken literatürde yer alan nanopartiküllerden Paklitaksel çalışmaları dikkate alınmıştır [ ]. Salım ortamının Tween 80 içermesinin nedenleri ise; sink salım koşullarını sağlamak ve Paklitakselin yapılan tüpe yapışmamasıdır [181]. İn vitro salım çalışmaları sırasında belirli zaman aralıklarla nanopartikül örneğinin eşit hacimde fosfat tampon çözeltisi ile yer değiştirilerek HPLC ile analizi yapılmıştır. Her bir siklodekstrin formülasyonu için yükleme etkinliği ve HPLC sonucu elde edilen konsantrasyon değerlendirilerek Paklitaksel in kümülatif salım grafiği çıkarılmıştır. Bu grafiğe göre ilk 15 dakikada ilacın 6-O-Capro βcd nanokürelerden %82 si, kitosanla kaplı nanokürlerden % 80 i, βcdc6 nanokürelerden ise %86 sı salınmıştır. Paklitakselin nanokürelerden kısa sürede salınmasının iki temel nedeni olabilir. Bunlardan birincisi nanopartiküllerin küçük boyutları nedeniyle yüzey alanlarının geniş olmasıdır. Nanopartiküllerin geniş yüzey alanı ilacın kısa sürede salım ortamına geçmesine neden olmuştur [146,182]. Salım sonuçları ortalama partikül büyüklüğü dağılımı ile birlikte incelendiğinde en hızlı salımın en küçük partikül büyüklüğü dağılımına (92 nm) sahip βcdc6 nanokürelerde, en yavaş salımın en büyük partikül büyüklüğü dağılımına (176 nm) sahip kitosan kaplı 6-O-Capro βcd nanokürelerde olduğu görülmektedir. Paklitakselin nanokürelerden hızlı salınmasının ikinci bir nedeni ise daha önce de açıklandığı gibi Paklitakselin nanokürelerin yüzeyine adsorbe olmasıdır. Yüzeyde bulunan Paklitaksel salım ortamına kısa sürede geçebilmektedir. 60 dakikanın sonunda polikatyonik amfifilik siklodekstrinlerden Paklitakselin %92 si, kitosan kaplı siklodekstrinden % 86 sı, anyonik siklodekstrin nanokürelerden ise % 84 i salınmıştır. 95

110 5.8. Paklitakselin Dilüsyon Çalışması İlaçlar vücuda verildiğinde yüksek bir seyreltme hacmine maruz kalmaktadır. Ortalama olarak 70 kg ağırlığındaki bir insan için bu değer 3,5 litredir. Bu durumda 1 ml lik CD formülasyonu uygulandığında seyreltme faktörü 1:3.500 olacaktır [182]. Bu durumda sink koşul altında yapılan salım çalışmasından çok dilüsyon çalışması daha gerçekçi olmaktadır. Bu bilgiler doğrultusunda hazırlanan siklodekstrin nanokürelerin farklı konsantrasyonlarda ph 7,4 fosfat tampon çözeltisi ile seyreltilmiştir. Her konsantrasyon için alınan örnekte bulunan Paklitaksel analizi için HPLC yöntemi kullanılmıştır. Elde edilen seyreltme faktörüne karşı Paklitaksel konsantrasyonu grafiği çizilerek yorumlanmıştır. 2:1000 oranında seyreltme sonucuna göre, nanokürede bulunan Paklitaksel miktarının seyreltme ile azaldığı söylenebilir. Kullanılan üç farklı siklodekstrin formülasyonunda ilacın neredeyse tamamı ph 7,4 fosfat tampon çözeltisinde 1000 kez seyreltildiğinde salınmıştır Boş Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin in vitro Güvenilirlik Çalışması Paklitakselin suda çözünürlüğü çok düşük olduğu için ticari preparatlarında taşıyıcı olarak çözünürlüğünü arttırmak amacıyla Cremophor EL: etanol (1:1h/h) kullanılmaktadır. Ancak Cremophor EL un ciddi toksisiteye neden olduğu bülünmektedir [44,57-60]. Bu çalışmadaki amaç Cremophor EL içermeyen bu nedenle daha güvenilir taşıyıcı sistem geliştirmektedir. Bu nedenle hazırlanan boş amfifilik siklodekstrin nanokürelerin güvenilirlik çalışması L-929 fare akciğer fibroblast hücre hattında WST-1 yöntemi ile çalışılmıştır. Boş siklodekstrin nanoküre içeren formülasyonlarının L-929 hücre hattı üzerinde yapılan çalışmalarda, 48 saat sonunda hücre canlılığı değerleri kontrol grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı (p>0,05) bir farkın olmadığı görülmüştür. ile aynı ve kontrole yakın sonuçlar bulunmuştur. L929 hücrelerindeki yüksek yaşayabilirlik oranı siklodekstrinlerin taşıyıcı olarak güvenilir olduklarını göstermektedir. Kitosan kaplı siklodekstrin nanokürelerde, hücre canlılığının kontrole göre daha fazla olmasının kitosandan kaynaklandığı düşünülmektedir. Literatürde kitosanın, konsantrasyonuna ve deasetilasyon derecesine bağlı olarak L929 fibroblast hücre hattı üzerinde proliferatif etkisinin gösterildiği çalışmalar mevcuttur [183,184]. 96

111 5.10. Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Etkinlik Çalışması Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanokürelerin etkinlik testi MCF-7 insan meme kanseri hücre hattında yapılan çalışmalarla belirlenmiştir. 48 saat sonucu elde edilen veriler doğrultusunda % hücre yaşayabilirliği hesaplanmıştır. Kontrol grubu olarak sadece besiyeri içeren grup seçilmiştir. 48 saatin sonunda, Paklitakselin DMSO içindeki çözeltisinin uygulandığı grupta hücre yaşayabilirliği %72 hesaplanmıştır. Paklitaksel içeren 6-O-Capro β-cd için hücre yaşayabilirlik değeri %53 bulunurken bu değer kitosan kaplı nanokürelerde % 47 bulunmuştur. En düşük hücre yaşayabilirliğinin β-cdc6 amfifilik siklodekstrin nanokürelerde olduğu görülmüştür (%31). Tüm nanopartikül formülasyonları ve Paklitaksel çözeltisi arasında istatistiksel olarak anlamlı (p<0,05) bir fark bulunmuştur. Sonuçların siklodekstrin türevlerinin yüzey yükü ile ilgili olduğu düşünülmektedir. Çünkü bütün tümör hücreleri gibi MCF-7 hücrelerinin yüzeyi negatif yüklüdür Literatürde MCF-7 hücrelerinin yüzey yüklerinin -20 mv olduğu belirtilmiştir [185]. Bu nedenle pozitif yüzey yüküne sahip polikatyonik βcdc6 amfifilik siklodekstrin nanopartiküllerinin hücreler ile etkileşiminin daha fazla olduğu düşünülmektedir. MCF- 7 hücre hattı üzerinde yapılan çalışmada, Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanoküreler ile birlikte boş siklodekstrin nanokürelerin sitotoksik etkisi de değerlendirilmiştir. Boş nanopartiküllerden βcdc6 MCF-7 hücre hattında Paklitaksel solüsyonunu ile aynı toksik etkiyi gösterirken; kitosan kaplı ve düz 6-O- Capro βcd nanokürelerin MCF-7 hücre hattında Paklitaksel solüsyonundan anlamlı (p<0,05) bir şekilde daha az hücre yaşayabilirliğine neden olduğu görülmüştür. Boş siklodekstrin nanokürelerin L929 hücre hattında herhangi bir toksik etkisi olmamasına rağmen, MCF-7 hücre hattında paklitaksele eş ve ya daha az hücre yaşayabilirliğine neden olması, siklodekstrinlerin kendilerinin antikanserojen etkisinin olabileceği düşüncesine neden olmuştur. Literatürde MeβCD lerin, metillenme derecesine bağlı olarak hücre membranlarının biyolojik yapısını bozduğu bu nedenle proliferasyonda azalmaya neden olduğu belirtilmiştir [186]. 97

112 6.SONUÇLAR VE ÖNERİLER Bu tez kapsamında başlangıçta belirlenen amaçlar doğrultusunda 6-O-Capro βcd, kitosan kaplı 6-O-Capro βcd ve polikatyonik βcdc6 olmak üzere üç farklı yüzey yüküne sahip amfifilik siklodekstrin nanoküreler taşıyıcı sistem olarak kullanılmıştır. Nanopresipitasyon yöntemi ile hazırlanan amfifilik siklodekstrin nanokürelerin in vitro karakterizasyonu yapılmıştır. Bu amaçla formülasyonların ortalama partikül büyüklüğü dağılımı ve zeta potansiyel değerleri ölçülmüştür. Hazırlanan boş amfifilik siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü dağılımı her üç formülasyon içinde istenilen aralıktadır (<200 nm) ve her biri homojen dağılım göstermektedir.6-o-capro βcd nanokürelerin yüzey yükü negatif (-30mV), kitosanla kaplı 6-O-Capro βcd ve βcdc6 nanokürelerin yüzey yükü pozitif (+44mV,+60mV) bulunmuştur. Bununla birlikte karakterizasyon için taramalı elektron mikroskobu görüntülemeleri yapılmıştır. Her üç formülasyonun küresel ve düzgün bir yüzeye sahip oldukları görülmüştür. Boş siklodekstrin nanokürelerin uzun dönem stabilitelerinin değerlendirilmesi amacıyla 12 ay boyunca in vitro karakterizasyonları yapılmış, nanoküreler ortalama partikül büyüklüğü, polidispersite indeksi ve zeta potansiyel değişimleri açısından karşılaştırılmıştır. Her üç formülasyonun da 12 ay süreyle stabil oldukları gözlemlenmiştir. Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanokürelerin in vitro karakterizasyonu sonucu, hazırlanan her üç formülasyonun da istenilen ortalama partikül büyüklüğü dağılımına (<200 nm) sahip olduğu görülmüştür. Paklitaksel yüklü amfifilik siklodekstrin nanokürelerin fiziksel stabilitesini değerlendirmek amacıyla 30 gün boyunca nanokürelerin in vitro karakterizasyonu yapılmıştır. Ortalama partikül büyüklüğü dağılımı ve polidispersite indeksi sonuçlarına göre Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanokürelerin stabil oldukları belirtilmiştir. İlaç yükleme etkinliği sonuçlarına göre formülasyonların yükleme etkinlikleri %40- %64 arasındadır. İlaç yükleme kapasitesi sonuçlarına göre de, formülasyona 98

113 eklenen %10 Paklitakselin %4-6 sının siklodekstrin nanoküreler tarafından hapsedildiği gözlemlenmiştir. İlaç salım profilinin değerlendirilmesi amacıyla tüp yöntemi kullanılmıştır. Her formülasyon için 1 saatlik salım % kümülatif salım profili çıkartılmıştır. Buna göre Paklitakselin %80-90 ının ilk 30 dakikada salındığı sonucuna varılmıştır. Ayrıca her bir formülasyon için dilüsyon testi uygulanmıştır. Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanoküreler farklı konsantrasyonda fosfat tampon çözeltisi ile seyreltilmiştir kat seyreltme sonucunda siklodekstrinlerdeki ilacın % 90 ının salındığı görülmüştür. L929 fare fibroblast hücre hattı üzerinde yapılan güvenilirlik çalışmaları sonucu boş amfifilik siklodekstrin nanokürelerin toksik etkisinin olmadığı görülmüştür. İlaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin antikanser etkinlik değerlendirme çalışmaları MCF-7 insan meme kanseri hücre hattında çalışılmıştır. Bu çalışmalar sonucunda aynı konsantrasyonda Paklitaksel içeren siklodekstrin nanokürelerin, Paklitaksel solüsyonuna göre daha fazla antitümöral etkinlik göstermiştir. İlaç taşıma sistemi olarak ilk kez çalışmamızda kullanılan polikatyonik βcdc6 amfifilik siklodekstrinlerden istenilen partikül büyüklüğü ve zeta potansiyeline sahip nanoküreler elde edilmiştir. βcdc6 nanokürelerin ilaç yükleme ve salım çalışmalarında etkili sonuç verdiği ve ilaç taşıma sistemi olarak güvenilir oldukları çalışmalarımız sonucunda gösterilmiştir. Gelecekte bu konu ile ilgili yapılacak çalışmalarda her üç amfifilik siklodekstrin türevinin nanokapsül formülasyonları hazırlanarak ilaç yükleme etkinlikleri ve ilaç salım profilleri belirlenerek nanoküre formülasyonları ile karşılaştırılabilir. Bununla birlikte hazırlanan amfifilik siklodekstrin nanoküre formülasyonlarının in vivo antitümöral etkinliklerinin ve biyodağılımlarının belirlenebilmesi için hayvan deneyleri yapılmalıdır. Ayrıca doz belirleme ve toksisite çalışmaları yürütülmelidir. 99

114 KAYNAKLAR DİZİNİ 1. NCI, What You Need To Know About: Breast Cancer, NIH Publication No , U.S. 2. Yalav, O., 2009, Erken Evre Meme Kanserli Hastalarda Sentinel Lenf Nodu Biyopsisinin Yeri, Uzmanlık Tezi, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalı, Adana, s Netter,F. H., Atlas of Human Anatomy 3th Edition. ISBN: p. 4. Russo, J. and Russo, I., 2004, Development of Human Breast. Maturitas 49, pp Lanfranchi, A. and Brind J.,2005, Breast Cancer: Risks and Prevention, Breast Cancer Prevention Instıtute, USA. _Booklet.html 6. Tot, T. 2011, Breast Cancer A Lobar Disease. Springer, London. pp Shier, D., Butler, J., Lewis, R.,2012. Hole s Essentials of Human Anatomy & Physiology 11th Edition. McGraw-Hill ISBN : p 8. Ruddon, W. R., Cancer Bıology. Oxford University Press ISBN-13: p. 4, Peppas, L. and Blanchette, J., Nanoparticle and Targeted Systems for Cancer Therapy. Advanced Drug Delivery Reviews 56. pp Roses, F.D., Breast Cancer. Elsevier ISBN Philadelphia. pp

115 11. Alteri, R. et.al., Breast Cancer Facts & Figures, American Cancer Society, Atlanta. 1 p. 12. Özmen, V Dünya da ve Türkiye de Meme Kanseri. Meme Sağlığı Dergisi 4: National Cancer Instıtute, Surveillance Epidemiology and End Results, DeSantis, C., Siegel, R., Bandi, P., Jemal, A., 2011, Breast Cancer Statistics. CA Cancer J. Clin. 61 pp MMWR, 2012, Vital Signs: Racial Disparities in Breast Cancer Severity United States, Centers for Disease Control and Prevention, Morbidity and Mortality Weekly Report, 3p 16. Groep, P., Wall, E., Diest, P., Pathology of Hereditary Breast Cancer. Cell Oncol. 34: Öztürk, M., 2006, Meme Kanserinin Genetiği ve Risk Faktörleri. İ. Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Sürekli Tıp Eğitimi Etkinlikleri Meme Kanseri Sempozyum Dizisi No: 54, s Couch, F., DeShano, M., Blackwood, M., 1997, BRCA1 mutations in women attending clinics that evaluate the risk of breast cancer. N Engl J Med 336. pp Berry, D., Parmigiani, G., Sanchez, J., 1997, Probability of carrying a mutation of breast ovarian cancer gene BRCA1 based on family history. J Natl Cancer Ins 89. pp Phillips, K.A., Andrulis, I.L., Goodwin P.J., 2001, Current Perspectives on BRCA1- and BRCA2-Associated Breast Cancers. Intern Med J p. 101

116 21. King, M.C., Marks, J.H., Mandell, J.B., 2003, Breast and Ovarian Cancer Risks Due to Inherited Mutations in BRCA1 and BRCA2. Science 302. pp Kelsey,J., Gammon, M.D., Reproductive Factors and Breast Cancer. Epidemiol Rev. 15. pp Pike, M.C., Henderson, B.E., Casagrande, J.T., Oral Contraceptives Use and Early Abortion as Risk Factors For Breast Cancer in Young Women. Br J Cancer 43. pp Trichopoulos, D., Mac, M. B., Cute, P The menapause and breast cancer risk. JNCI 48. pp Ekbom, A., Hsieh, C.C., Lipworth, L., Adami, H.Q.,1997. Trichopoulos D. Intrauterine Environment and Breast Cancer Risk in Women: A Population- Based Study. J Natl Cancer Inst. 89: Miler, W.R., Oestrogens and Breast Cancer. Biological considerations. Br Med Bull 47. pp American Joint Committee on Cancer, Breast Cancer Staging. 7th Edition Singletary, S.E., Allred, C, Ashley, P Revision of the American Joint Committee on Cancer Staging System for Breast Cancer. J Clin Oncol 20 (17): Edge, S.B., Byrd, D.R., Compton, C.C., AJCC Cancer Staging Manual. 7th ed. New York, NY: Springer. pp Aydıner, A., Topuz, E., Meme Kanseri Tanı-Tedavi-Takip, İstanbul Konsensusu Nobel Tıp Kitapevleri ISBN:

117 31. Tanaka, T., Decuzzi, P., Cristofanilli, M., Sakamoto, J., Tasciotti, E., Robertson, F., Ferrari, M., Nanotechnology for Breast Cancer Therapy. Biomed Microdevices 11: Utkan, Z., Esen, G., Yavuz, E., Meme Kanserinde Tanı. Meme Sağlığı Dergisi 2007 Cilt: 3 Sayı: Yoshimoto, M., Kasumi, F., Iwase, T., Takahashi, K., Tada, T., Uchida, Y Magnetic resonance galactography for a patient with nipple discharge. Breast Cancer Research and Treatment 42: Bayol, Ü., Meme Kanseri Tanısında İnce İğne Aspirasyon Biyopsisi (İİAB) nin Yeri. Türkiye Ekopatoloji Dergisi 1 (1-2): Burbank, F., Stereotactic Breast Biopsy of Atypical Ductal Hyperplasia and Ductal Carcinoma In situ Lesions: Improved Accuracy With Directional, Vacuum-Assisted Biopsy. Radiology 202: Fentiman, I. S., 1999, Breast Cancer. Blackwell Science ISBN: :2 p Akdeniz, A., 2010, Triple Negatif Meme Kanserlerinin Demografik Klinik ve Patolojik Karakteristikleri. Uzmanlık Tezi. Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Anabilim Dalı s Smith, I. E., Dowsett, M Aromatase Inhibitors in Breast Cancer. N Engl J Med ; 348: Smith, J The Third-Generation Aromatase Inhibitors. U.S. Pharm. ; 33(4): University of Maryland Medical Center. st_cancer_000006_11.htm 103

118 41. EMRO Tehnical Publication Series Guidelines for Management of Breast Cancer. World Health Organization ISBN: Terwogt, J.M.M., Nuijen, B., Huinink, T., Beijnen, J. H., Alternative Formulation of Paclitaxel. Cancer Treatment Reviews 23, Singla, A., K., Garg, A., Aggarwal, D Paclitaxel and Its Formulatins. International Journal of Pharmaceutics 235, Panchagnula, R Pharmaceutical Aspects of Paclitaxel.. International Journal of Pharmaceutics 172, Gürkaynak, O Paklitakselin Siklodekstrin Bazlı Sistemlerle Formülasyon Geliştirme Ve Değerlendirilmesi. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi 46. Adams, J. D., Flora, K., Goldspiel, B. R., Wilson, J. W., Finley, R., Taxol:a History of Pharmaceutical Development and Current Pharmaceutical Concerns, J. Nat. Cancer Inst. Monogr., 15, Lee, W. L., Shiau, J.Y., Shyur, L. F Taxol, Camptothecin and Beyond for Cancer Therapy. Advances in Botanical Research, Erdemoğlu N., Şener, B Taksan Sınıfı Bileşiklerin Antitümör Etkileri. Ankara Eczacılık Fakültesi Dergisi 29 (1) Campbell, N., Reece, J., Biyoloji. Palme Yayınları ISBN: s Akhmanova, A., Steinmetz, O Microtubule Structure and Dynamic Instability. Nature Reviews Molecular Cell Biology 9,

119 51. Horwitz, S. B Taxol (Paclitaxel): Mechanism of Action. Annals of Oncology : Official Journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO 5, 6:S Belotti, D., Vergani, V., Drudis, T The Microtubule-Affecting Drug Paclitaxel Has Antiangiogenic Activity. Clin cancer Res 2: 1843: Mastropaolo, D., Camerman, A., Luo, Y., Brayer,G.D., Camermantt, N Crystal and molecular structure of paclitaxel (taxol). Proc Natl Acad Sci 92, pp Soy, N Doku Kültüründe Paklitaksel in Apoptotik ve Antiproliferatif Etkileri. İatanbul Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi. s Blagosklonny, M., Fojo, T Moleculer Effects of Paclitaxel: Myths and Reality. Int J Cancer: 83, Gelderblom, H., Verweij, J., Nooter, K., Sparreboom, A Cremophor EL: The Drawbacks And Advantages Of Vehicle Selection For Drug Formulation. Eur J Cancer. 37(13): Dorr, R. T., Pharmacology and Toxicology of Cremophor EL Diluent. Ann. Pharmacother. 28, Pfeifer, R.W., Hale, K.N., Precipitation of Paclitaxel During Infusion by Pump. Am. J. Hosp. Pharm. 50, Song, D., Hsu, L.F., Au, J.L.S., Binding of Taxol to Plastic Glass Containers and Protein Under in vitro Conditions. J. Pharm. Sci. 85,

120 60. Venkataraman, R., Hurckart, G.J., Ptachcinski, R.J., Bhahe, R., Logue, L.W., Bahnson, A., Gian, C., Brady, J.E., Leaching of Diethylhexaphathalate from Polyvinylchloride Bags Into Intravenous Cyclosporin Solution. Am. J. Hosp. Pharm. 43, Rowinsky, E., Donehower, C Paclitaxel (Taxol). The New England Journal of Medicine 332: Dombernowsky, P., Gehl, J., Boesgaard, M., Paaske, T., Jensen, BV Doxorubicin and Paclitaxel, a Highly Active Combination in The Treatment of Metastatic Breast Cancer. Semin Oncol. 23: Rowinsky, E.K., Eisenhauer, E.A., Chaudhry, V., Arbuck, S.G., Donehower, R.C Clinical Toxicities Encountered with Paclitaxel (Taxol). Seminars in Oncology 20: Tamura, T., Sasaki, Y., Nishiwaki, Y., Saijo, N., Phase I Study of Paclitaxel by Three Hour Infusion: Hypotension Just After Infusion Is One of The Major Dose Limiting Toxicities. Jpn. J. Cancer Res. 12, Boylan, J.C., Liquids. In: Lachman, L., Lieberman, H.A., Kanig, J.L. (Eds.), The Theory and Practice of Industrial Pharmacy. Varghese Publishing House, Bombay, pp Tarr, B.D., Yalkowsky, S.H., A New Parenteral Vehicle for The Administration of Some Poorly Soluble Anti-Cancer Drugs. J. Parentral Sci. Technol. 41, Adams, J. D., Flora, K. P., Goldspiel, B. R Taxol: A History of Pharmaceutical Development and Current Pharmaceutical Concerns. J. Natl. Cancer lnst. 15: Mellado, W., Magri, N. F., Kingston, D. G. I. et al Preparation and Biological of Taxol Acetates. Biochem. Siophys. Res. Corn. 124:

121 69. Skwarczynskia, M., Noguchia, M., Hirotab, S., Sohmaa, Y., Kimuraa, T Development of First Photoresponsive Prodrug of Paclitaxel. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 16:17, pp Vyas, D. M. (1995) Paclitaxel (Taxol) Formulation and Prodrugs. In: Farina, V. ed., The Chemistry and Pharmacology of Taxol and ıts Derivatives. Amsterdam: Elsevier Science SK pp Surapaneni, M.S., Das, S.K., Das, N. G Designing Paclitaxel Drug Delivery Systems Aimed at Improved Patient Outcomes: Current Status and Challenges. ISRN Pharmacology, Sharma, A., Mayhew, E. & Straubinger, R. M Antitumour Effect of Taxol-containing Liposomes in a Taxol-Resistant Murine Tumor Model. Cancer Res. 53: Straubinger, R. M., Sharma, A., Murray, M Novel Taxol Formulations: Taxol Containing Liposomes. J. Nat. Cancer Inst. Mon. 15: Yokoyama, M., Miyauchi, M., Yamada, N., Okano, T., Sakurai, Y., Kataoka, K., Inoue, S., Characterization and Anticancer Activity of The Micelle- Forming Polymeric Anticancer Drug Adriamycin Conjugated Poly (ethyleneglycol)-poly (aspartic acid) Block Copolymer. Cancer Res. 50, Miele, E., Spinelli, G., Miele, E., Tomao, F., Tomao, S Albumin-bound Forulation of Paclitaxel (Abraxane ABI-007) in The Treatment of Breast Cancer. International Journel of Nanomedicine.,4, Kragh, H.U Structure and Ligand Binding Properties of Human Serum Albumin. Danish Medical Bulletin 37(1):

122 77. Sudlow, G., Birkett D.J., Wade, D. N., 1976, Further Characterization of Specific Drug Binding Sites on Human Serum Albumin. Molecular Pharmacology November. 12: 6, Paál, K., Müller, J., Hegedûs L., High Affinity Binding Of Paclitaxel To Human Serum Albumin. 268:7, Cserhati, T., Forgacs, E., Hollo, J., Interaction of Taxol and Other Anticancer Drugs With alpha-cyclodextrin. J.Pharm. Biomed. Anal. 13, Hirayama, F., Uekama, K Cyclodextrin-based Controlled Drug Release System. Advanced Drug Delivery Reviews 36: Kumar, M.N.V.R Cyclodextrin Nanoparticle for Drug Delivery. Handbook of Particulate Drug Delivery. American Scientific Publishers Knoerr, A.L.L., Gref, R., Couvreur, P Cyclodextrins for Drug Delivery. Journal of Drug Targeting; 18(9): Bilensoy, E Cyclodextrins in Pharmaceutics, Cosmetics, and Biomedicine: Current and Future Industrial Applications. New Jersey, ABD.s. 3-6, Loftsoon, T., Duchene, D., Cyclodextrin and Their Pharmaceutical Applications. International Journal of Pharmaceutics 329: Szejtli, J Past, Present, and Future of Cyclodextrin Research. Pure Appl. Chem., Vol. 76:10. pp Szejtli, J Introduction and General Overview of Cyclodextrin Chemistry. Chem. Rev. 98. pp

123 87. Cserhati, T., Forgacs, E Cyclodextrin in Chromatography. The Royal Society of Chemistry. ISBN: , Cambridge. 88. Valle, E. M. M., Cyclodextrins and Their Uses: A Review. Process Biochemistry 39: Bilensoy, E., Hıncal, A.A., Cyclodextrin-Based Nanomaterials in Pharmaceutical Field. Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Production and Process. Gad. S. C. (ed). Wiley-Interscience. USA Duchene, D., Wouessidjewe, D., Pharmaceutical Uses of Cyclodextrins and Derivatives. Drug Development and Industrial Pharmacy. 16(17) : Loftsson, T., Brewster, M. E., Pharmaceutical Application of Cyclodextrins. 1. Drug Solubilization and Stabilization. Journel of pharmaceutical Sciences. 85: Duchene, D., Ponchel, G., Wouessidjewe, D Cyclodextrin in Targeting Application to Nanoparticles. Advanced Drug Delivery. 36: Sallas, F., Darcy, R Amphiphilic Cyclodextrins Advances in Synthesis and Supramolecular Chemistry. Eur. J. Org. Chem Pun, S., Bellocq, N., Liu, A., Jensen, G., Machemer, T., Quijano, E., Davis, M. E Cyclodextrin-Modified Polyethylenimine Polymers for Gene Delivery. Bioconjugate Chem. 15, Moscoso, A., Gourrierec, M., Garcia, G., Benito,M.J., Balbuena, P., Caballero,F., Guilloteau, N., Giorgio, C., Vierling,P., Defaye, J., Mellet, C.O., Fernandez, J Polycationic Amphiphilic Cyclodextrins for Gene Delivery: Synthesis and Effect of Structural Modifications on Plasmid DNA Complex Stability,Cytotoxicity, and Gene Expression. Chem. Eur. J.15,

124 96. Moscoso,A., Balbuena, P., Garcia, M., Mellet, C.O., Benito, J., Fernandez, G Rational Design of Cationic Cyclooligosaccharides as Efficient Gene Delivery Systems, Chem.,Commun., Dubes, A., Bouchu, D., Lamartine, R., Parrot-Lopez, H An Efficient Regio-Specific Synthetic Route to Multiply Substituted Acyl-Sulphated β- Cyclodextrins, Tetrahedron Lett., 42, Loftsson, T., Brewster, M Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: Basic Science and Product Development. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 62: Uehata, K., Anno, T., Hayashida, K.,Motoyama, K., Arima,H Effects of Selected Anionic β-cyclodextrins on Persistence of Blood Glucose Lowering by Insulin Glargine After Subcutaneous Injection to Rats. Journal of Drug Delivery , s Tiwari, G., Tiwari, R., Rai, A Cyclodextrin in Delivery Systems: Applications. J Oharm Bioallied Sci. 2(2): Rajewski, R.A., Stella, V.J Pharmaceutical applications of cyclodextrins. 2. In vivo drug delivery. J Pharm Sci;85: Lantz, A.W., Rodriguez, M.A., Wetterer, S.M., Armstrong, D.W Estimation of Association Constants Between Oral Malodor Components and Various Native and Derivatized Cyclodextrins. Anal Chim Acta, 557, Tokumura, T., Muraoka, A., Machida, Y Improvement of Oral Bioavailability of Flurbiprofen From Flurbiprofen/beta-cyclodextrin Inclusion Complex by Action of Cinnarizine. Arch Pharm Res, 32,

125 104. Patel, S.G., Rajput, S.J Enhancement of Oral Biavailability of Cilostazol by Forming Its Inclusion Complexes. Eur J Pharm Biopharm, 73, Sathigari, S., Chadha, G., Lee, Y.H Physicochemical Characterization of Efavirenz-Cyclodextrin Inclusion Complexes. AAPS PharmSciTech, 10, Agüeros, M., Ruiz-Gatón, L., Vauthier, C Combined Hydroxypropylbeta-Cyclodextrin and Poly(anhydride) Nanoparticles Improve The Oral Permeability of Paclitaxel. Eur J Pharm Sci, 38, Agüeros, M., Zabaleta, V., Espuelas, S., Campanero, M.A., Irache, J.M Increased Oral Bioavailability of Paclitaxel by Its Encapsulation Through Complex Formation With Cyclodextrins in Poly(anhydride) Nanoparticles.145-1: Hea,D., Denga,P., Yangb, L., Tanc, Q., Liua, J., Yanga, M., Zhanga, J Molecular Encapsulation of Rifampicin As An Inclusion Complex of Hydroxypropyl-β-cyclodextrin: Design; Characterization And in vitro Dissolution. 103: Phillip, Y.H., Sathigari, S., Jean Lin, Y.J Gefitinib Cyclodextrin Inclusion Complexes: Physico-Chemical Characterization and Dissolution Studies. Drug Dev Ind Pharm, 35, , 110. Wu, J., Shen, Q., Fang, L Sulfobutylether-β-Cyclodextrin/Chitosan Nanoparticles Enhance The Oral Permeability and Bioavailability of Docetaxel Mazzaferro, S., Bouchemal, K., Skanji, R., Gueutin, C., Chacun, H., Ponchel, G Intestinal Permeation Enhancement of Docetaxel Encapsulated into Methyl-β-cyclodextrin/poly(isobutylcyanoacrylate) Nanoparticles Coated With Thiolated Chitosan. Journal of Controlled Release 162 :

126 112. Masahiko, K., Fumitoshi, H., Kaneto, U Improvement of Oral and Rectal Bioavailabilities of Carmofur by Methylated β-cyclodextrin Complexations. International Journal of Pharmaceutics. 38, 1 3: Pathak, S. M., Musmade, P., Dengle, S., Karthik, A., Bhat, K., Udupa, N Enhanced Oral Absorption of Saquinavir With Methyl-Beta- Cyclodextrin Preparation and in vitro and in vivo Evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences 41, 3 4: Koizumi, K., Okada, Y., Kubota, Y., Utamuta, T Inclusion Complexes of Poorly Water-Soluble Drugs With Glucosyl-Cyclodextrins. Chem Pharm Bull, 35, Lang, J.C Ocular Drug Delivery Conventional Ocular Formulations. Adv Drug Deliv Rev, 16, Loftsson, T., Järvinen, T Cyclodextrins in Ophthalmic Drug Delivery. Adv Drug Deliv Rev, 36, Loftsson, T., Stefánsson, E Cyclodextrins in Eye Drop Formulations: Enhanced Topical Delivery of Corticosteroids To The Eye. Acta Ophthalmol Scand, 80, Palma, S.D., Tartara, L.I., Quinteros, D., Allemandi, D.A., Longhi, M.R., Granero, G.E An Efficient Ternary Complex of Acetazolamide with HP-ss-CD and TEA for Topical Ocular Administration. J Control Release, 138, Matsuda, H., Arima, H Cyclodextrins in Transdermal and Rectal Delivery. Adv Drug Deliv Rev, 36, Uekama, K., Hirayama F., Irie T Cyclodextrin Drug Carrier Systems. Chem. Rev. 1998, 98,

127 121. Watanabe, Y., Matsumoto, Y., Seki, M., Takase, M., Matsumoto, M Absorption Enhancement of Polypeptide Drugs by Cyclodextrins. I. Enhanced Rectal Absorption of Insulin from Hollow-Type Suppositories Containing Insulin and Cyclodextrins in Rabbits. Chemical & Pharmaceutical Bulletin 40(11): Uekama, K., Kondo, T., Nakamura, K., Irie, T., Arakawa, K., Shibuya, M., Tanaka, J Modification of Rectal Absorption of Morphine From Followtype Suppositories with a Combination of α-cyclodextrin and Viscosity- Enhancing Polysaccharide. Journal of Pharmaceutical Sciences. 84,1: Alexanian, C., Papademou, H., Vertzoni, M., Archontaki, H., Valsami, G Effect of ph and Water-Soluble Polymers on The Aqueous Solubility of Nimesulide in the Absence and Presence of Betacyclodextrin Derivatives. J Pharm Pharmacol, 60, Matsudaa, H., Arimab, H Cyclodextrins in Transdermal and Rectal Delivery. Advenced Drug Delivery Reviews. 36: Brewster, M.,E., Loftsson, T Cyclodextrins as Pharmaceutical Solubilizers. Advanced Drug Delivery Reviews. 59: Roco, M.C National Nanotechnology Initiative- Past, Present, Future. Handbook of Nanoscience, Engineering and Technology EPA, United States Environmental Protection Agency. Nanotechnology Jain, K.K Advances in The Field of Nanooncology. Jain BMC Medicine. 8: Sattler, K.D Handbook of Nanophysics, Nanomedicine and Nanorobotics. CRC Press, USA 113

128 130. Peer, D., Karp, M.J., Hong, S., Farokhzad, O., Margalit, R., Langer, R Nanocarriers as an Emerging Platform for Cancer Therapy. Nature Nanotechnology Rastogi, A Nanooncology: The Breast Cancer Story. UTMJ. 88: Martin, F.J., Melnik, K., West, T. J., Cohen, M. S. et al Acute Toxicity of Intravenously Administered Microfabricated Silicon Dioxide Drug Delivery Particles in Mice: Preliminary Findings Drugs. 6, Sharifi-Salamatian, V., Pesquet-Popescu, B., Simony-Lafontaine,J., Rigaut,J.P Index For Spatial Heterogeneity in Breast Cancer J. Microsc. 216, Marusyk, A., Polyak, K Tumor Heterogeneity: Causes and Consequences. Biochim Biophys Acta. 1805(1): Nathanson, S.D., Nelson, L Interstitial Fluid Pressure in Breast Cancer, Benign Breast Conditions, and Breast Parenchyma Ann. Surg. Oncol.1, Parveen, S., Misra, R., Sahoo, S.,K Nanoparticles: a Boon to Drug Delivery, Therapeutics, Diagnostics and Imaging. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 8: Nie, S., Xing, Y., Kim, G.J., Simons, J.W Nanotechnology Applications in Cancer. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9: Portney, N., Özkan, M Nano-oncology: Drug Delivery, Imaging and Sensing. Anal Bioanal Chem. 384: Singh, R., Lillard, J.,W Nanoparticle- based Targeted Drug Delivery. Experimental and Molecular Pathology. 86 : Parboosing, R., Maguire, M., Govender, P., Kruger, H.G Nanotechnology and the Treatment of HIV Infection. Viruses. 4, Cho, K., Wang, X., Nie, S Therapeutic Nanoparticles for Drug Delivery in Cancer. Clin Cancer Res. 14:

129 142. Heath, J., Davis, M. E Nanotechnology and Cancer. Annu. Rev. Med.59: Peppas, L.B., Blanchette, J Nanoparticle and Targeted Systems for Cancer Therapy. Advanced Drug Delivery Reviews 56: Maeda, H The Enhanced Permeability and Retention ( E P R ) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role Of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting. Advan. Enzyme Regul. 41: Prakash, S., Malhotra, M., Shao, W., Tomaro-Duchesneau, C., Abbasi, S Polymeric Nanohybrids and Functionalized Carbon Nanotubes as Drug Delivery Carriers for Cancer Therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 63:14 15, Mora-Huertasa, C.E., Fessi, H., Elaissari, A Polymer-based Nanocapsules for Drug Delivery. International Journal of Pharmaceutics 385: Letchford, K., Burt, H A Review of The Formation and Classification of Amphiphilic Block Copolymer Nanoparticulate Structures: Micelles, Nanospheres, Nanocapsules And Polymersomes. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65: Guterres, S. S., Alves, M.P., Pohlmann, A.R Polymeric Nanoparticles, Nanospheres and Nanocapsules, for Cutaneous Applications. Drug Target Insights. 2 : Elaissari, A Colloidal Biomolecules, Bomaterials and Biomedical Applications. Mercel Dekker, İsviçre Lassalle, V., Ferreira, M. L PLA Nano- and Microparticles for Drug Delivery: An Overview of the Methods of Preparation. Macromol. Biosci. 7: Gürsoy, A.Z Kontrollü Salım Sistemleri. Kontrollü Salım Sistemleri Derneği Yayını İstanbul s

130 152. Memisoglu, E., Bochot, A., S en, M., Charon, D., Duchene, D., Hıncal, A.A., Amphiphilic β-cyclodextrins Modified on The Primary Face: Synthesis, Characterization and Evaluation of Their Potential as Novel Excipients in The Preparation of Nanocapsules. J. Pharm. Sci. 91 (5), Caballero, F., Mellet, C.O., Gourrierec, L., Guilloteau, N., Giorgio, C., Fernandez, G Tailoring β-cyclodextrin for DNA Complexation and Delivery by Homogeneous Functionalization at the Secondary Face, Org. Lett. 10: Moscoso, A., Balbuena, P., Garcia, M., Mellet, C.O., Benito, J., Fernandez, G Rational Design of Cationic Cyclooligosaccharides as Efficient Gene Delivery Systems, Chem.,Commun., Bilensoy, E., Gürkaynak, O., Doğan, A.L., Hıncal, A.A Safety and Efficacy of Amphiphilic β-cyclodextrin Nanoparticles for Paclitaxel Delivery. International Journal of Pharmaceutics 347: Bilensoy, E., Gürkaynak, O., Ertan, M., Şen, M., Hıncal, A.A Development of Nonsurfactant Cyclodextrin Nanoparticles Loaded With Anticancer Drug Paclitaxel. Journal of Pharmaceutıcal Scıences. 97: İnal, B. B., Topkaya, Ç Klinik Biyokimya Labotaruvarlarında Akreditasyona Geçiş. İstanbul Tıp Dergisi Ertaş, Ö. S., Kayalı, A Analitik Yöntem Geçerliliğine Genel Bir Bakış. Ankara Ecz. Fak. Derg. J. Fac. Pharm, Ankara. 34 (1) Sallas, F., Darcy, R Amphiphilic Cyclodextrins Advances in Synthesis and Supramolecular Chemistry. Eur. J. Org. Chem Peroche, S., Parrot-Lopez, H Novel Fluorinated Amphiphilic Cyclodextrin Derivatives: Synthesis of mono-, di- and heptakis- (6-deoxy-6- perfluoroalkylthio)-β-cyclodextrins. Tetrahedron Letters

131 161. Dubes, A., Degobert, G., Fessi, H., Parrot-Lopez, H Synthesis and Characterisation of Sulfated Amphiphilic α-, β- and γ-cyclodextrins: Application to The Complexation of Acyclovir. Carbonhydrate Research Kumar, M.N.V.R A Review of Chitin and Chitosan Applications. Reactive & Functional Polymers Calvo, P., Vila-Jato, J.L., Alonso Evaluation of Cationic Polymer- Coated Nanocapsules as Ocular Drug Carriers. International Journal of Pharmaceutics Kafil, V., Omidi, Y Cytotoxic Impacts of Linear and Branched Polyethylenimine Nanostructures in A431 Cells. BioImpacts 1(1), Isaksson, K., Åkerberg, D., Said, K., Tingstedt, B Cationic Polypeptides in a Concept of Oppositely Charged Polypeptides as Prevention of Postsurgical Intraabdominal Adhesions. J. Biomedical Science and Engineering, 4, Florea, B., Meaney, C., Junginger, H.,Borchard, G Transfection Efficiency and Toxicity of Polyethylenimine in Differentiated Calu-3 and Nondifferentiated COS-1 Cell Cultures. AAPS PharmSci. 4 (3) : Agnihotri, S.A., Mallikarjuna, N.N., Aminabhavi, T.M., 2004, Recent Advances on Chitosan-based Micro- and Nanoparticles in Drug Delivery, Journal of Controlled Release, 100, Seferian, P.G., Martinez, M.L., 2000, Immune Stimulating Activity of Two New Chitosan Containing Adjuvant Formulations. Vaccine, 19 (6), Duchene,D., Wouessidjewe, D., Ponchel, G Cyclodextrins and Carrier Systems. Journal of Controlled Release Wouessidjewe, D., Skiba, M., Leroy-Lechat, F., Lemos-Senna, E., Puisieux, F., Duchene, D A New Concept in Drug Delivery Based on Skirt- Shaped Cyclodextrin Aggregates: Present State and Future Prospects, S.T.P. Pharma Sci., 6,

132 171.Memişoğlu, E., Bochot, A., Şen, M., Duchêne, D., Hıncal, A.A Nonsurfactant Nanospheres of Progesterone Inclusion Complexes With Amphiphilic β-cyclodextrins, Int. J. Pharm., Memişoğlu-Bilensoy, E., Vural, İmran, Bochot, A., Renoir, J. M., Dominique, D., Hıncal, A. A Tamoxifen Citrate Loaded Amphiphilic β- cyclodextrin Nanoparticles: In vitro Characterization and Cytotoxicity, J.Controlled Release, 104, Xu, R Progress in Nanoparticles Characterization: Sizing and Zeta Potential Measurement. Particuology Rinaudo, M Chitin and Chitosan: Properties and Applications. Progress in Polymer Science. 31-7: Muller, R.H., Jacobs, C.,Kayser, O. (2001) Nanosuspensions as Particulate Drug Formulations in therapy. Rationale for development and what we can expect for the future. Advanced Drug Delivery Reviews, 47 (1), Shabir, G.A Validation of High-Performance Liquid Chromatography Methods for Pharmaceutical Analysis. Understanding the Differences and Similarities Between Validation Requirements of The US Food and Drug Administration, The US Pharmacopeia and The International Conference on Harmonization. Journal of Chromatography. A, 987 (1-2), Lemos-Senna, E., Wouessidjewe, D., Lesieur, S., Duchêne, D Preparation of Amphiphilic Cyclodextrin Nanospheres Using The Emulsification Solvent Evaporation Method: Influence of The Surfactant on Preparation and Hydrophobic Drug Loading, Int. J. Pharm., 170, Singh, R., Lillard, J.W., Jr Nanoparticle-Based Targeted Drug Delivery. Experimental and Molecular Pathology, 86:3, Fonseca, C., Simões, S., Gaspar, R Paclitaxel-loaded PLGA Nanoparticles: Preparation, Physicochemical Characterization and in vitro Anti-Tumoral Activity, J. Controlled Release, 83,

133 180. Dong, Y., Feng, S. S Methoxy poly(ethylene glycol)-poly(lactide) (MPEG-PLA) Nanoparticles for Controlled Delivery of Anticancer Drugs, Biomaterials, 25, Yang, T., Cui, F., Choi, M., Choc, J., Chungb, J., Shimb, C., Kimb, D Enhanced Solubility and Stability of PEGylated Liposomal Paclitaxel: In vitro and in vivo Evaluation. International Journal of Pharmaceutics 338: Chorny, M., Fishbein, I., Danenberg, H., Golomb, G Lipophilic Drug Loaded Nanospheres Prepared by Nanoprecipitation: Effect of Formulation Variables on Size, Drug Recovery and Release Kinetics. Journal of Controlled Release. 83-3: Prasitsilp, M., Jenwıthısuk, R., Kongsuwan, K., Damrongchai, N Cellular Responses to Chitosan in vitro: The Importance of Deacetylation. Journel of Material Science: Materials in Medicine. 11: Tangsadthakun, C., Kanokpanont, S., Sanchavanakıt, N., Banaprasert, T., Damrongsakkul, S Properties of Collagen/Chitosan Scaffolds for Skin Tissue Engineering. Journal of Metals, Materials and Minerals. 16-1: Zhang, Y., Yang,M., Portney, N.G., Cui, D., Budak, G., Ozbay, E., Ozkan, M., Ozkan, C Zeta potential: A Surface Electrical Characteristic to Probe The Interaction of Nanoparticles with Normal and Cancer Human Breast Epithelial Cells. Biomed Microdevices 10: Grosse, P.Y., Bressolle, F., Rouanet, P., Joulia, M., Pinguet, F Methylβ-Cyclodextrin and Doxorubicin Pharmacokinetics and Tissue Concentrations Following Bolus Injection of These Drugs Alone or Together in the Rabbit. International Journal of Pharmaceutics 180:

134 EKLER 120

135 EK-1: Poster Tebliğleri 121

136 122

137 123

138 124

139 125

140 126

141 127

142 128