BAZI BİYOKİMYASAL TESTLERİN REFERANS ARALIK BELİRLEME ÇALIŞMASI. Harun POLAT. Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı. Tez Danışmanı Prof. Dr.

Transkript

1 BAZI BİYOKİMYASAL TESTLERİN REFERANS ARALIK BELİRLEME ÇALIŞMASI Harun POLAT Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı Tez Danışmanı Prof. Dr. Ebubekir BAKAN Doktora Tezi 2014

2 T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAZI BİYOKİMYASAL TESTLERİN REFERANS ARALIK BELİRLEME ÇALIŞMASI Harun POLAT Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı Doktora Tezi Tez Danışmanı Prof. Dr. Ebubekir BAKAN ERZURUM 2014

3 T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI BAZI BİYOKİMYASAL TESTLERİN REFERANS ARALIK BELİRLEME ÇALIŞMASI Harun POLAT Tez Savunma Tarihi : 18 Şubat 2014 Tez Danışmanı Jüri Üyesi Jüri Üyesi Jüri Üyesi Jüri Üyesi : Prof. Dr. Ebubekir BAKAN (Atatürk Üniversitesi) : Prof. Dr. Yeşim ÖZARDA (Uludağ Üniversitesi) : Prof. Dr. Yaşar Nuri ŞAHİN (Atatürk Üniversitesi) : Prof. Dr. Mustafa GÜL (Atatürk Üniversitesi) : Prof. Dr. F. Zuhal UMUDUM (Atatürk Üniversitesi) Onay Bu çalışma yukarıdaki jüri tarafından Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Yavuz Selim SAĞLAM Enstitü Müdürü Doktora Tezi Erzurum-2014

4 İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR... IV ÖZET. V ABSTRACT. VI SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ.. VII ŞEKİLLER DİZİNİ. VIII TABLOLAR DİZİNİ... IX 1. GİRİŞ GENELBİLGİLER Normal Değer Terminoloji Referans Birey Referans Bireyin Tanımı Referans Bireylerin Seçilmesi Direkt ve İndirekt Yöntem Direkt (Doğrudan) Örnekleme Yöntemi İndirekt (Dolaylı) Örnekleme Yöntemi Referans Kitlesinin Gruplandırılması Birey Örneklerinin Toplanması ve Analitik Prosedür Preanalitik Evre Kan Örneklerinin Alınması Kan Örneklerinin Transferi ve Ayrılması Analitik Evre Postanalitik Evre Referans Değerlerin İstatistiksel Analizi Verilerin Toplanması Referans Değerlerin Gruplara Ayrılması Referans Gruplardaki Veri Sayısının Önemi Dağılımın İncelenmesi Aşırı Uçlarda Gözlenen Değerlerin (Sapan Değerler) Belirlenmesi Referans Kitlesinin Dağılım Tipinin Değerlendirilmesi Referans Sınırların Saptanması Parametrik Yöntemler Non-Parametrik Yöntemler Veri Transformasyonu Referans Aralıklarının Transfer Edilebilirliği Referans Aralıklarının Analitik Sistemler Arası Transferi MATERYAL VE METOT Örnek Toplanmasında İzlenen Prosedür Katılımcı Seçimi Kan Alınmasından Hemen Önce Gönüllülerin Hazırlanması 38 I

5 Kan Alma İşlemi Örneklerin Hazırlanması ve Saklanması Rutin Biyokimya Testleri Test Prensipleri ALB Test Prensibi ALP Test Prensibi ALT/GPT Test Prensibi AMLY Test Prensibi AST/SGOT Test Prensibi Fe Test Prensibi GGT Test Prensibi GLU Test Prensibi HDL-KOL Test Prensibi LDL-KOL Test Prensibi Ca Test Prensibi P Test Prensibi Mg Test Prensibi KOL Test Prensibi KREA Test Prensibi CK Test Prensibi CK-MB Test Prensibi LDH Test Prensibi T.BİL Test Prensibi D.BİL Test Prensibi TP Test Prensibi TG Test Prensibi URE Test Prensibi UA Test Prensibi ISE Testleri (Na, K Ve Cl) Test Prensibi Kullanılan Cihazlar Rutin Biyokimya Otoanalizörü Diğer Cihazlar Kalibrasyon Analitik Kalite Kontrol Tekrarlanabilirlilik İç Kalite Kontrol Dış Kalite Kontrol Referans Aralıkların Hesaplanması Seçilmiş Bireylerden Laboratuvara Başvuran Bireylerden İstatistiksel Analiz BULGULAR TARTIŞMA SONUC VE ÖNERİLER.. 84 KAYNAKLAR 86 II

6 EKLER. 91 EK-1. SQL ÖRNEK VERİ TARAMA ŞABLONU. 91 EK-2. ÖZGEÇMİŞ. 93 Ek-3. REFERANS ARALIK SAPTAMA ANKET FORMU.. 94 EK-4. ETİK KURUL ONAY FORMU. 96 EK-5. BHATTACARYA YÖNTEMİYLE RA NIN GRAFİKLERİ 98 III

7 TEŞEKKÜR Doktora tezi olarak sunduğum bu çalışmada, eğitim ve iş hayatım süresince değerli bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım, benden her türlü desteğini ve hoşgörüsünü esirgemeyen sorunların çözümünde yardımlarıyla yol gösteren Biyokimya Anabilim Dalı Başkanı aynı zamanda tez hocam Prof. Dr. Ebubekir BAKAN a en derin saygı ve şükranlarımı sunarım. Doktora eğitimim boyunca her zaman yakın ilgi ve bilimsel desteklerini gördüğüm, Prof. Dr. Yaşar Nuri ŞAHİN e, Prof. Dr. Nuri BAKAN a, Prof. Dr. Zuhal UMUDUM a, Prof. Dr. M. Sait Keleş e, Prof. Dr. Fatih AKÇAY a, Prof. Dr. Ahmet KIZILTUNÇ a, Prof. Dr. Hülya AKSOY a, Doç. Dr. Abdulkadir YILDIRIM a ve Yrd. Doç. Dr. Nurinnisa ÖZTÜRK e, tez çalışmamda büyük yardımları olan Prof. Dr. Yeşim ÖZARDA ya, biyokimya laboratuvarında görevli personel arkadaşlarıma, kan alma ünitesinde çalışan hemşire ve mesai arkadaşlarıma, doktora eğitimim boyunca desteklerini esirgemeyen ve arkadaşlıkları için bölümümüz çalışanları, Emrullah DORMAN ve diğer asistan, doktora ve yüksek lisans eğitimi yapan arkadaşlarıma, tüm hayatım boyunca her türlü fedakârlığı yapan aileme, anlayış ve desteğiyle hep yanımda olan eşim Betül ALKAN POLAT a teşekkür ederim. Harun POLAT IV

8 ÖZET Bazı Biyokimyasal Testlerin Referans Aralık Belirleme Çalışması Amaç: yaşları arasında sağlıklı bireylerde 27 klinik kimya testinin referans aralıklarını belirlemek. Direkt ve indirekt yöntemler kullanılarak belirlenen referans aralıklarını birbirleriyle ve cinsiyet açısından karşılaştırmak. Materyal ve Metot: IFCC nin önerileri doğrultusunda C28-A3 dokümanında belirtilen prosedürlere göre kabul ve dışlama kriterleri esas alınarak seçilen referans bireylerden kan alındı ve 27 klinik kimya testinin laboratuvarımızda mevcut analitik sistemlerle ölçümleri yapıldı. LIS te kayıtlı test verileri, veri tabanından SQL ile sorgulanarak analiz edildi. Analizler, direkt yöntemde MedCalc ve SPSS20 programları kullanılarak ve indirekt yöntemde Bhattacarya prosedürüne göre referans aralıkları bulundu. Bulgular: KOL, GLU, P ve Na testleri hariç diğer 23 biyokimya testte cinsiyet açısından istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı (P<0.05). Bu testler: ALP, GGT, AST, ALT, LDH, AMLY, CK, CK-MB, T. BİL, D.BİL, TG, KOL, HDL-KOL, LDL- KOL, ALB, Fe, Mg, ÜRE, KREA ve ÜA. Tespit edilen referans değerler kit prospektüslerinde verilen değerlerden farklılık gösterdi. Sonuç: Sonuçta farklı yöntemlerle yaptığımız bu çalışma gösterdi ki Direkt yöntem referans aralıkların belirlenmesinde ilk tercih edilen yöntemdir. İndirekt yöntem ise kolay ve ucuz olması sebebiyle alternatif bir yöntem olmaya devam etmektedir. aralık Anahtar Kelimeler: Biyokimya testleri, direkt metot, indirekt metot, referans V

9 ABSTRACT Study of Determination of Reference Interval of Some Biochemical Tests Aim: To determine the reference intervals of 27 clinical chemistry tests in healthy individuals whose ages vary from 18 to 85 and to compare the reference intervals, determined by both direct and indirect methods, with each other and in terms of gender. Materials and Method: Blood samples were taken from reference subjects selected on the basis of the inclusion and exclusion criteria with respect to procedures indicated in C28-A3 documentin accordance with the recommendations of IFCC then levels of 27 clinical chemistry tests were measured in our laboratory with current analytical systems. Test data recorded in LIS were analyzed using Structured Query Language (SQL) in database. Reference intervals were determined by direct method and indirect method using Bhattacharya procedure. For the calculations MedCalc and SPSS 20.0 statistical programs were used. Result: There were statistically significant differences between genders with respect to all selected biochemical tests (GGT, AST, ALT, LDH, AMLY, CK, CK-MB, T. BIL, D.BIL, TG, CHOL, LDL-C, ALB, Fe, Mg, URE, CREA, UA,CHOL, GLU, P, and Na)(P<0.05) except for CHOL, GLU, P and Na tests. Detected reference values exhibited significant differences when compared to kit prospectus. Conclusion: This study, performed by two distinct methods, showed that the direct method is the first method of choice for determining reference intervals, and the indirect method remains alternative to direct method, since it is inexpensive and simple. intervals. Key Word: Biochemistry tests, direkt method, indirekt method, reference VI

10 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ALB ALP ALT/GPT AMLY AST/GOT BCG Ca CK Cl CLIA C-RIDL D D.BIL Fe CG FRASER GGT GLU GSCC HDL-KOL IFCC K kd KKY KOL KREA LDH LDL-KOL Na NCBI NCCLS P RA RILIBAK SQL T.BIL TG TP UA URE WHO : Albumin : Alkalen fosfataz : Alanin transaminaz : Amilaz : Aspartat aminotransferaz : Brom kresol yeşili : Kalsiyum : Kreatin kinaz : Klorür : Clinical Laboratory Improvement Amendments : Committe of Reference Intervals and Decision Limits : Dalton : Direkt bilirubin : Demir : Interpretation of Clinical Chemistry Laboratory Data : Gama-glutamil transferaz : Glukoz : German Society for Clinical Chemmitry :Yüksek dansiteli lipoprotein kolesterol : International Federation of Clinical Chemistry : Potasyum : Kilo dalton : Konjestif Kalp Yetmezliği : Kolesterol : Kreatinin : Laktat dehidrogenaz : Low dansiteli lipoprotein kolesterol : Sodyum : (National Center for Biotechnology Information): Ulusal Biyoteknoloji Bilgilendirme Merkezi : NationalCommitte for Clinical Laboratory Standards : Fosfat : Referans Aralık : Quality Goals The German Way : (Structured Query Language): Yapılandırılmış Sorgu Dili : Total bilirubin : Trigliserid : Total protein : Ürik asit : Üre : Dünya Sağlık Teşkilatı VII

11 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil No Sayfa No Şekil 2.1. Referans Değerler Hesaplama Akış Şeması.. 7 Şekil 2.2. Normal Dağılım Örneği VIII

12 TABLOLAR DİZİNİ Tablo No Sayfa No Tablo 2.1. Referans Aralıkların Saptanma Aşamaları... 6 Tablo 2.2. Gruptan Ayırma Kriterleri.. 11 Tablo 2.3. Gönüllülerin Araştırmada Hariç Tutulma Kriterleri Tablo 2.4. Referans Bireylerin Seçimindeki Stratejiler 12 Tablo 2.5. Referans Kitlenin Gruplaşmasına Etki Eden Faktörler Tablo 2.6. Preanalitik Biyolojik Faktörler 18 Tablo 2.7. Preanalitik Metodolojik Faktörler Tablo 2.8. Referans Gruplarını Ayırma Kriterleri 22 Tablo 3.1. Katılımcı Yaş ve Sayısı.. 37 Tablo 3.2. Örnek Kodlaması 38 Tablo 4.1. Dağılım Frekansları. 57 Tablo 4.2. Varyasyon Katsayı Değerleri.. 58 Tablo 4.3. Genel Referans Aralık Değer Tablosu (Direkt Yöntem). 59 Tablo 4.4. Kolmogorov-Smirnov Testi ile Normallik ve RA Tablo 4.5. Cinsiyet Ortalamaları ve Independent Sample T Testi Sonuçları.. 61 Tablo 4.6. Normal Dağılım Göstermeyen Testlerin Analizi 62 Tablo 4.7. Direkt Yöntemle Bulunan Cinsiyet Farkına Göre RA Tablosu. 63 Tablo 4.8. Literatür ile Bulunan RA Karşılaştırılması. 65 Tablo 4.9. Hastane Verilerinden Taranan Birey Sayısı 67 Tablo4.10. Laboratuvar Verilerinden Bulunan Genel RA Tablo4.11. Laboratuvar Verilerinden Bulunan Erkeklere Ait RA 69 Tablo Laboratuvar Verilerinden Bulunan Erkeklere Ait RA Tablo Direkt ve İndirekt Yöntemle Elde Edilen Genel RA Tablosu 71 IX

13 1. GİRİŞ Laboratuvar sonuçlarının değerlendirilmesinde kullanılan referans değerleri ve aralıkları sağlıklı popülâsyondan hasta bireylerin ayrılmasına olanak sağlar. Testlerin çeşitliliği ve yorumlanması referans aralıklarının önemini artırmaktadır. Klinisyen laboratuvar sonuçlarını verilen referans aralığı değerlerine göre yorumlar. Bu nedenle tedavi ve tanı açısından güvenilir referans aralıkları, hastaya ait sonuçların doğru değerlendirilmesi için bir araçtır. Her bir test veya parametre için uluslararası referans aralıkları farklı kaynaklarda verilmiştir. Ayrıca kit prospektüslerinde üretici firmaların sunduğu referans aralıkları da mevcuttur ve laboratuvarlar tarafından kullanılmaktadır. Referans aralıklarının, toplumlar arası sosyo-ekonomik ve coğrafik farklılıklar göz önüne alındığında, değişiklik göstereceği muhakkaktır. Diğer taraftan, ülkemizde bölgesel ya da il bazında referans aralıklarını belirlemek için yapılan çalışmalar az sayıda ve sınırlıdır. Rutin laboratuvar testlerine ait referans değerleri, toplumlar arasındaki sosyoekonomik durum (beslenme alışkanlıkları, beslenme şekli, beslenme kalitesi vb.), spor yapma alışkanlığı ve tarzı, genetik yapı, yaşanılan bölgenin coğrafi yapısı gibi faktörlere bağlı olarak değişiklikler gösterir. Bu nedenle her laboratuvarın hizmet verdiği bölgedeki toplum için o bölgeye özgü referans değerlerinin standart yöntemlere göre saptaması gerekir. Kit üretici firmalar da kit prospektüslerinde referans değerleri verdikten sonra her laboratuvar kendi referans aralığını belirlemelidir şeklinde tavsiyede bulunmaktadır. Referans aralıklarının belirlenmesi; Klinik Laboratuvar Standartları Ulusal Komitesi (National Committee for Clinical Laboratory Standards: NCCLS) ile Uluslararası Klinik Kimya Federasyonu (The International Federation of Clinical Chemistry: IFCC) ve IFCC bünyesinde yer alan Referans Aralıkları ve Karar Sınırları 1

14 Komitesinin (C-RIDL; Committe of Reference Intervals and Decision Limits) önerilerine göre yapılmaktadır. Aynı şekilde referans bireylerinin secimi de NCLSS ve IFCC ilgili dokümanlarında standardize edilmiştir. 1-3 IFCC, referans değerlerinin ve aralıklarının her laboratuvar tarafından belirlenmesi gerektiğini önermiş ve bunun belirlenmesine yönelik uyulacak kural ve yöntemlerle ilgili bir seri kılavuz düzenlemiştir. 2 IFCC bu kılavuzların makale serisinde referans değerleri ile ilgili temel kavramları, referans olacak sağlıklı bireylerinin seçimi ile ilgili yöntem ve kriterleri, örneklerin alınması ve işlenmesi ile ilgili usulleri, analitik işlemlerin kontrol ve geçerliğinin sağlanması için gerekli yaklaşımları, referans değerlerin saptanmasında kullanılacak istatistiksel yöntemleri ve referans değerlerinin sunumu ile ilgili bilgileri 2, 4, 5 tarif etmiştir. IFCC nin önerilerine göre farklı yöntemlerle yapılan referans aralık belirleme yöntemlerinin yanı sıra, laboratuvara başvuran bireylerin sonuçları kullanılarak da referans değerlerin hesaplanabileceği rapor edilmiştir. 6 Hazırlanan bu tezin amacı, yaşları arasında oluşturulan değişik yaş gruplarındaki sağlıklı bireylerden 27 klinik kimya testinin referans aralıklarını belirlemekti. Değerler belirlenirken cinsiyete göre de değerlendirme yapıldı. Direkt ve indirekt yöntemler kullanılarak belirlenen referans aralıkları birbirleriyle karşılaştırıldı. Direkt yöntem için seçilen subjeler genellikle Erzurum ilinde yaşayan kişilerdi. İndirekt yöntem için kullanılan sonuçlar ise Erzurum ili yanı sıra kısmen de olsa Doğu Anadolu Bölgesi ni yansıtmakta idi. 2

15 2. GENEL BİLGİLER Sağlık olgusu göreceli bir kavramdır. Bireylerin içinde bulunduğu şartlara ve çeşitli etkenlere bağlıdır. Anamnez, klinik muayene ve ileri tetkikler sonucu toplanan veriler, referans veriler ile karşılaştırılarak yorumlanmalıdır. Klinisyen, bireyin sağlıklı ya da hasta olduğuna karar verebilmek için anamnez, fizik muayene, destek tetkikler ve laboratuvar verilerinden oluşan bilgileri kullanır ve referans verilerle karşılaştırır. Laboratuvar verilerinin yorumu, bu karşılaştırmalar sonunda yapılan karar verme işlemidir. 7 Hastanın durumunun tipik bir hastalığa benzediği düşünülüyorsa klinisyen tanısını bu gözleme dayalı olarak yapacaktır. Laboratuvar verileri özellikle ikilemde kalınan durumlarda çok daha önemli hale gelir. Bu da güvenilir referans değerlerinin önemini bir derece daha arttırır. Değerlendirmeler bazen kalitatif bazen de kantitatif formda olabilir. Laboratuvar verilerine dayalı karar verme olasılık ve istatistik kurallarına ya da bu kuralları içeren bilişim sistemlerine odaklı tıbbi bilgilere dayanarak da olabilir. Tıbbi laboratuvar verilerini karşılaştırma yoluyla yorumlamak karar verme sürecini etkiler. Dolayısıyla klinik laboratuvarda çalışılan bütün testler için sağlıklı bireylerin yanında ilgili hastalıklar için de referans değerler gereklidir. Referans aralıkları sağlıklı kişiler, hastane popülasyonları, tipik hastalıklı kişiler, ayaktan tedavi alan hastalar veya kişinin önceki bilinen değerleri gibi farklı yöntemlerle belirlenebilir. İdeal olanı bireysel referans değerleridir. Bireye ait yeni bulgunun elimizdeki değerleriyle ilişkili olması önemlidir. Bu veriyi elde etmek oldukça zahmetli olup ve çok zaman alır. Bu yüzden diğer yöntemlerle referans aralıklarının bulunması daha kolaydır. Laboratuvar verileri tanı koymanın yanı sıra tedavinin takibinde, prognozda, taramada, toksikolojide ve daha birçok klinik amaçla kullanılmaktadır. Bütün bu değerlendirmelerde referans veriler, karşılaştırma yapmak için başvurulacak bir veri 3

16 tabanı oluşturmaktır. 7 Kullanılacak terimleri normal değer, referans aralık, referans bireyler ve referans değer kavramlarıyla tanımlamak gerekir Normal Değer Referans değerlerin hesaplanmasıyla ilgili kaynaklar eski tarihlere kadar uzanmaktadır lı yılların sonlarında, normal aralık (normal değerler) olarak adlandırılmış ve istatistiksel hesaplama yolları tartışılmıştır. Fakat normal kelimesi farklı anlamları da çağrıştırdığı için bu terim karışıklığa yol açmıştır. 8 Çünkü normal terimi oldukça göreceli bir kavramı ifade etmektedir. Günümüzde normal terimini açıklamak için bazı tanımlamalar yapılmıştır. Bu tanımlamalar şu şekilde sıralanabilir. a- Bireyin kendi normali: Bireyin sağlıklı döneminde elde edilmiş değerleridir. Optimum sağlık durumunda bireylerden elde edilmiş veriler bu değerleri oluşturur. Şüphesiz bireyin kendi referans değeri ile karşılaştırma yapmak en sağlıklı olanıdır. 9 b- Cohort (eş gruplar) normalleri: Hastanın grubunu temsil eden sağlıklı toplumdan elde edilmiş değerlerdir. c- Genel toplum normalleri: Hastanın geldiği toplumun tüm fertlerini temsil eden gruptan elde edilmiş normal değerlerdir. Normal teriminin diğer açıdan anlamları: 1. İstatistiksel anlam: Değerler, istatistiksel normal dağılım (Gaussian olasılık dağılımı) gösteriyorsa bu dağılım genellikle normal kabul edilir. Normal in bu şekilde kullanımı, biyolojik verilerin de Gaussian dağılımı gibi simetrik ve çan eğrisi şeklinde olduğu algısı oluşturabilir. Yakın incelemede de bu anlaşılmaktadır. Bu algıdan kurtulmak için Elveback ve arkadaşları normal sınırlar teriminin kullanılmamasını tavsiye etmiştir. 10 Bu yüzden normal dağılım terimi yerine Gaussian dağılımı terimi kullanılması istenmiştir. 4

17 2. Epidemiyolojik anlam: Normal in diğer bir anlamı da serumda gamma glutamil transferaz (GGT) aktivitesini 7 ila 47 IU/L arasında bulmak normal dir. Bu sınırların dışı da anormal olarak anlaşılmaktadır. Daha kesin bir ifade ile sağlıklı bireylerden toplanan serumların GGT aktivitesi değerlerinin yaklaşık %95 i, 7 ila 47 arasında ölçülmüştür. Terk edilmiş kavram olan normal değerler kısmen bu anlamı taşımaktadır. Bu anlamda genel, yaygın, rutin, tipik gibi ifadeler normal e alternatif ifadelerdir Klinik anlam: Normal terimi, belli bir hastalığın yokluğunu veya o hastalığın gelişim riskini taşımadığını belirtmek için de kullanılır. Bu bağlamda normal bir değer sağlıklı olmanın belirtisidir. Böyle değerler için daha açıklayıcı ifade sağlıklı, patolojik olmayan ve zararsızdır şeklinde ifade edilir. 6 Normal in farklı anlamlarından kaynaklanan karışıklıktan dolayı normal değerler ifadesi terk edilmiştir ve kullanılmamaktadır. Normal değerler teriminin barındırdığı belirsizlikleri önlemek için, referans değerler kavramı getirilmiş ve 1980 lerde uygulamaya konulmuştur. 1, 11 Laboratuvar verilerinin klinik açıdan yorumlanması için bilimsel temelin oluşturulmasında bu önemli bir aşama olmuştur. 12 Laboratuvar verilerinin hastalıklara tanı koymada kullanımında her bireyin yaşadığı topluma göre değerlendirmeye alınmasının önemi vurgulanmakta, her laboratuvarın kendi toplumunun referans değerlerini saptaması gerektiği savunulmakta ve önerilmektedir. Fakat her laboratuvarın bunu uygulaması oldukça zordur. Bu nedenle, belirli kriterlere göre seçilmiş bölgelerde (coğrafi bölgeler gibi), gelişigüzel seçilerek ve homojen referans grupları oluşturularak referans aralıklar hesaplanabilir. Laboratuvarlar arasında kullanılan analiz yöntemlerine ve kullanılan analitik sistemlere 5

18 göre çapraz analizler yapılarak ortak referans aralıkların kullanımı doğrulanabilir. Önemli olan, referans aralıklarının, kullanıldıkları toplumu temsil etmeleridir. 13 Referans aralıklarını saptanmak birçok basamağı kapsamaktadır. Referans aralık hesaplama akış şeması Şekil 2.1. de ve genel olarak referans aralıklarının saptanma aşamaları ise hesaplama analiz şeması Tablo 2.1. de verilmiştir. Tablo 2.1. Referans Aralıkların Saptanma Aşamaları Referans aralık saptanması şeklinin belirlenmesi 2. Referans bireylerin seçilme yönteminin belirlenmesi 3. Standart anket formunun oluşturulması 4. Referans aralığı saptanacak analitlerin özelliklerinin belirlenmesi (Bu aşama çeşitli konuları kapsar: Örnek alınmadan önce referans bireylerin nasıl hazırlanacağı; örneğin alınma ve saklanmasının hangi koşullarda yapılacağı; analit ölçüm yöntemine girişim oluşturan etkenlerin saptanması gibi) 5. Laboratuvar koşullarının hazırlanması 6. Analitik kontrolün değerlendirilmesi ve sürdürülmesinin sağlanması 7. Belirlenmiş kriterlere göre verilerin toplanması 8. Verilerin istatistiksel analizinin değerlendirilmesi 9. İstatistiksel yönteme göre referans aralıkların hesaplanması 6

19 Referans verileri alt gruplara göre topla Dağılımı görsel İncele Tekrar alt gruplara ayırmak gerekli mi? Evet Hayır Aşırı uç değerleri sapta Değerlendir Karar ver Nonparametrik Parametrik İstatistiksel yöntem Aşırı uç değerleri sapta Değerlendir Karar ver Evet Parametrik Gaussian Dağılım Hayır Transformasyon Yöntemi Referans Değer Referans Değer Transforme edilmiş veri Parametrik Evet Gaussian Hayır Dağılım Geri Transform Nonparametrik Referans Değer Şekil 2.1. Referans değerler hesaplama akış şeması 14 7

20 2.2. Terminoloji Referans değerin tanımı NCCLS nin ilgili dokümanında şöyle yapılmaktadır: Bir referans bireyinde belirli bir fenotipin gözlenmesi ya da ölçülmesi yolu ile elde edilen değerdir. 2 IFCC ise referans değerler terimini, belirli bir kantite için tanımlanmış tek bir bireyden veya gruptan elde edilen değerlerdir olarak tanımlar ve bu terimin kullanılmasını önerir. Bununla ilişkili olarak referans birey, referans değer, referans dağılım, referans sınır, referans aralık ve gözlenen değerler terimlerini de önermiştir. 9 Dolayısıyla ile örnek bir gruptan seçilen referans bireyler bir araya getirilerek, bir referans kitlesi oluşturulabilir. Bu bireylerden ölçüm yoluyla elde edilen değerler bir dağılım oluşturur. Bu dağılım istatistiksel analize tabi tutulduğunda dağılımın belli bir bölümünü sınırlandıran alt ve üst değerlerin içine aldığı kesim, dağılımın belli bir yüzdesini ifade eder. 15 Bu arada, yukarıda adı geçen terimlerin, 2, 6, 14, IFCC nin ve önerdiği terminolojiye göre tanımını yapmak yerinde olacaktır. Referans değer: Referans örnek grubundaki bireylerde yapılan özel ölçümler veya gözlemlerin sonucunda elde edilen değerlerdir. Örneğin; net olarak tanımlanmış kriterlere göre seçilen bir referans grubundan toplanan serumlarda GGT aktivitesi 6, 18, 19 ölçüldüğünde GGT sonuçları referans değerler olarak dikkate alınır. Gözlenen değerler: Gözlem ve ölçüm yapılarak belirlenen, tıbbi referans değerler, referans dağılım, referans sınırları ve aralıklarıyla karşılaştırılarak tıbbi karar vermek için kullanılan sayısal değerdir. Diğer bir deyimle bir gözlenen (observed) değer, klinik inceleme altındaki bir bireyden alınan numunenin analiziyle elde edilen laboratuvar sonucudur. Test değerleri gibi bazı ifadeler kullanılmaktadır. Fakat test sözcüğü konusunda belirsizlik mevcuttur (Laboratuvar testi mi? İstatistiki test mi?) ve 6, 18 bundan kaçınılmalıdır. Referans dağılım: Referans değer verilerinin istatistiksel dağılımıdır. 8

21 Referans aralığı: Alt ve üst referans sınırları içine alan aralıktır. Bazı durumlarda tek bir referans sınır önemli olabilir. Bu durumlarda, genellikle üst sınır önemlidir ve referans aralık, sıfır ile üst sınır arasındadır. Referans değerler terimi, önüne değerlerin hangi temele göre elde edildiğini veya neyi / hangi grubu temsil ettiğini gösterir bir niteleyici sıfat eklenerek kullanılmaktadır. Örneğin; sağlıkla ilişkili referans değerler, diyabetik hastalar, yatan diyabetik hastalar ve ayakta tedavi gören diyabetik hastalar gibi... Bu sıfatlar her referans değerin sağlıklı popülasyonla ilişkili olmadığını kanıtlamaktadır. 15 Diğer bir ayrım da bireyin ve popülasyonun referans değerleri arasındadır. Bireyin referans değeri bireyin daha önce tanımlanmış sağlık durumuna ilişkin kendisinin değeridir. Popülasyonun referans değeri ise, tanımlanmış sağlık durumundaki birey grubundan elde edilmiş değerlerdir ve referans değerlerin başına hiçbir sıfat konmadan kullanıldığı zaman popülasyonun referans değerleri kastedilmektedir. IFCC nin tavsiye ettiği referans aralığı terimi yerine bazen referans ranjı (range) terimi kullanılmaktadır. İstatistiksel olarak ranj (range) terimi, bir dağılımda maksimum ve minimum değerler arası farkı ifade ettiği için bu kullanım doğru değildir Referans Birey Referans Bireyin Tanımı Referans birey: Karşılaştırma için belli kriterlerde seçilen bireydir. Daha önce de bahsedildiği gibi klinik inceleme altındaki bir bireyden elde edilen değerlerin yorumlanması için uygun karşılaştırma değerlerine ihtiyaç vardır. Bu değerleri sağlamak için uygun bireyler seçilmelidir. Karşılaştırma için seçilen her bir gruptaki bireylerin özellikleri net olarak tanımlanmalıdır. Numune toplama koşulları ile birlikte yaş ve cinsiyetleri, sağlıklı veya belli bir hastalığı olup olmadıkları belirtilmelidir. 9

22 Bireye dayalı referans değerler konusunda anlatılacağı üzere referans birey tanımı klinik inceleme altındaki bireyin kendi referans değerlerini de kapsar Referans Bireylerin Seçilmesi Referans bireyler grubuna hangi bireylerin seçileceği bir dizi kriter ile belirlenir. Bu kriterler referans popülasyonun tanımını, sağlık durumu veya ilgilenilen hastalık için spesifikasyonları içerir. 6 Dünya Sağlık Örgütü (WHO), sağlığı hastalık ve sakatlığın olmaması yanında fiziksel, mental ve sosyal olarak iyi olma olarak tanımlamıştır. Cinsiyet ve yaş gruplarında olduğu gibi diğer referans grupları alt gruplara ayırma kriterleri için de referans değerlerin ayrı olması gerekmektedir. Referans birey grubunun da bundan dolayı daha fazla homojen alt gruplara bölünmesi gerekebilir. Bu amaçla bölünme için sınıflama veya bölümleme kriterleri olarak da bilinen özel kurallara ihtiyaç vardır. Seçim ve bölümlere ayırma, sınıflama kriterlerinin ayrımının yapılması için önemlidir. Referans birey grubu elde etmek için ilk olarak seçim kriterleri uygulanır. Daha sonra bölümleme kriterleri kullanılarak bu referans grubu alt gruplara bölünür. Bir kriter yürütülen projenin amaçları doğrultusunda seçim kriteri veya bölümleme (partitioning) kriteri olabilir. Örneğin; referans değerlerini sadece kadınlar oluşturacaksa burada cinsiyet bir seçim kriteridir. 6 Tablo 2.2. de sağlıkla ilişkili referans bireylerinin seçimi için önemli olan gruptan ayırma kriterleri belirtilmiştir. Gruptan ayırma kriterleri C28-A3 dokümanında verilen tablodur. Ayrıca gönüllülerin araştırmaya alınmama (hariç tutulma) kriterleri uygulama safhasında aşağıdaki şekliyle sıralamıştır. 10

23 Tablo 2.2. Gruptan Ayırma Kriterleri 2 1. Kan donörü olma 9. Gebelik 2. İlaç bağımlılığı 10. Laktasyon 3. Son geçirilen hastalık 11. Transfüzyon 4. Meslek veya Çevresel Riskler 12. Ameliyat: Son zamanlarda 5. Açlık ve tokluk durumu 13. Şişmanlık 6. Genetik faktörler 14. Tütün kullanımı 7. Hipotansiyon veya hipertansiyon durumu 15. Vitamin kullanımı 8. Oral kontraseptifler 16. Alkol alımı Tablo 2.3. Gönüllülerin Araştırmadan Hariç Tutulma Kriterleri 1. BMI Alkol tüketimi 70g/gün 3. Sigara kullanımı >20 sigara/gün 4. Düzenli bir tedavi gerektiren sistemik hastalık (DM, hipertansiyon, hiperlipidemi, allerjik hastalıklar, depresyon) 5. Son zamanlarda ( 14 gün) geçirilmiş akut hastalık, yaralanma ya da hastaneye yatış gerektiren ameliyat 6. Bilinen HBV, HCV ya da HIV taşıyıcılığı 7. Gebelik ya da doğum sonrası ilk yılında olan bireyler 2.4. Direkt ve İndirekt Yöntem IFCC ve NCCLS'nin referans değerlerinin belirlenmesi ilgili standartları referans bireylerin Direkt yöntemle seçilmelerini önermektedir. Ancak, yüksek maliyetli ve 11

24 pratiğinin de zor olması nedeniyle başka yollar da önerilmektedir. 2, 6 Genel olarak seçme yöntemleri şu şekildedir: 1. Direkt-İndirekt yöntem 2. Test öncesi örnekleme - Test Sonrası örnekleme (Priori-Posteriori) yöntem 3. Rastgele-rastgele olmayan yöntem Referans bireylerin Direkt yöntemle seçimi ile ilgili dışlama kriterleri Tablo 2.3. te verilmiştir. Tüm yöntemlerde bu esaslar uygulanır. Tablo 2.4. Referans Bireylerin Seçimindeki Stratejiler 6 a) Direkt: Bireyler belli kriterler kullanılarak ana popülasyondan seçilir. b) İndirekt: Bireyler dikkate alınmaz, bunun yanında veriler elde etmek için özel kriterler doğrultusunda bir laboratuvar bilgi sisteminden analitik değerlere belli istatiksel metotlar uygulanır. c) Priori: Numune toplama ve analiz işlemleri için katılım kriterlerinin tam olarak yerine getirildiği ve bireylerin seçildiği Direkt metottur. d) Posteriori: Analiz sonuçlarını ve çok sayıda bireyden alınan bilgiyi içeren mevcut veri tabanından istifade eden Direkt metot. Birey değerleri istenen katılım kriterlerini tam olarak yerine getirmektedir. e) Rastgele: Seçim süreci her birey ya da test sonucu için eşit bir seçilme şansı vermektedir. f) Rastgele olmayan: Seçim süreci her birey ya da test sonucu için eşit bir seçilme şansı vermemektedir Direkt (Doğrudan) Örnekleme Yöntemi Bireylerin ana toplumdan tanımlanmış kriterlere göre seçimidir. IFCC ve NCCLS nin referans değerlerinin hesaplanmasıyla ilgili standartları, referans bireylerin Direkt örnekleme ile seçilmelerini önermektedir. Bu yöntemde, belirlenmiş kriterler doğrultusunda hazırlanan anket formları doldurulur ve sonra bireylerin tetkikleri yapılır. 12

25 NCCLS, C28-A3 standartlarına uygunluğu gözetilerek, örnek anket formundan yararlanılarak hazırlanan anket formu EK-3. teki gibidir. 2 Bireyler seçilirken tablo 2.4. le ilişkili olup olmadıkları belirlenir; bu kriterler seçim esnasında uygulamanın yönüne göre iki şekilde kullanılabilir: 6 a- Test öncesi örneklem (Priori): Örneklem içinden, tanımlanmış katılım kriterlerine uygunluklarına göre bireylerin Direkt metotla seçilmesidir. 7 Analiz yöntemi ile ilgili bilgiler çok sayıda ve çok iyi biliniyorsa bu yöntem tercih edilir. İleriye dönük 14, 21 bir ayıklama olacaktır. b- Test sonrası örneklem (Posteriori): Çok sayıda bireyin sonuçlarını içeren iyi düzenlenmiş, elimizdeki tüm koşulları sağlayan demografik bir veri tabanından tanımlanmış katılım kriterlerine uyan bireylerin Direkt metotla seçilmesidir. 6, 7 Analiz yöntemi ayrıntılı bilinmiyor ve hakkında yeterli bilgi toplanamıyorsa önce bireylerden 14, 22 örnek alınır. Analiz yapıldıktan sonra, ayırma ve alt gruplara bölme işlemi yapılır. Eğer veri tabanı iyi düzenlenmemişse, yüzeysel ve duyulan bilgilerle referans bireyin seçimi yapılamaz. Böyle bir durum karşısında indirekt örneklendirme yapmak ve istatistiksel analiz metodunu da buna göre seçmek daha yerinde olacaktır. 15 Priori ve posteriori örneklem yaparken bireyler iki şekilde seçilir: a- Rastgele örneklem: Her bireye eşit seçilme şansı veren bir işlemdir. Referans grup oluşturulmasında bireylerin rastgele olması daha uygun olacaktır. Çünkü grubun tümünün referans grubu kriterlerini sağladığı düşünülür. Elde edilen veriler istatistiksel analizlerle değerlendirilir. Fakat böyle bir çalışmanın uygulamaya geçirilmesi zordur. Bu amaçla genellikle kan dönerlerinden ve hastane çalışanlarından grup oluşturularak referans aralık hesaplanması sık yapılan ancak rastgele örneklem tanımına uymayan bir işlemdir

26 b- Rastgele olmayan örneklem: Bireylere eşit olmayan seçilme şansı veren bir işlemdir. Bu, çoğunlukla uygulanan bir yöntemdir İndirekt (Dolaylı) Örnekleme Yöntemi Örneklendirme yönteminin uygulama zorluğu nedeniyle Direkt yöntem yaygın bir kullanım kazanamamış ve birçok araştırmacıyı uygulama açısından daha kolay olan yöntemler bulmaya zorlamıştır. İlk olarak 1999 yılında Ferré-Masferrer ve arkadaşları 23, 24 hasta verisinin istatistiksel olarak aşırı karışık ve geniş dağılım göstermediği takdirde, referans aralığı belirlemesinde kullanılabileceğini ileri sürmüşlerdir. Nitekim takip eden çalışmalarda, klinik laboratuvarların hizmet verdikleri hasta kitlelerini kendi referans popülasyonları olarak almalarının daha güvenilir olacağını savunan araştırmacıların 6, 25 sayısı da artmıştır. Bu sistem, bireyler dikkate alınmaksızın, laboratuvardan test istemi yapılmış kişilere ait analiz sonuçlarının kayıtlı bulunduğu veri tabanından belli kurallara uygun şekilde test sonuçlarının seçimidir. 7 Bu yöntem daha pratik bir yöntemdir; ancak toplanan veri kitlesinin istatistiksel analizi daha farklı işlemler gerektirir. 6 İndirekt örneklendirmenin temel prensibi şöyledir: Klinik laboratuvarlarda üretilen sonuçların çoğunluğu tam olarak Gaussian bir dağılım göstermeseler bile, dağılımları normale yakındır. Çok sayıda sapma veya herhangi bir gruplaşma olmamak şartı ile bu dağılımın içinde gerçekte Gaussian tipe uyan bölümleri bulunarak hesaplamada bunlar kullanılabilir. Bu amaçla, İndirekt örneklendirme ile toplanan verileri değerlendirebilen çeşitli istatistiksel analiz yöntemleri geliştirilmiştir. Bu metotlar bilişim sistemlerinin yardımı ile kolay uygulanabilir hale gelmiş ve yaygınlaşmışlardır Ancak bu yöntemlerin de bazı dezavantajları bulunmaktadır. Çünkü bu konuda tanımlanmış birden fazla yöntem vardır ve elde edilen alt ve üst referans limitleri tamamıyla o yöntemde kullanılan matematiksel metoda bağlı 14

27 kalmaktadır. Bazı araştırmacılar tarafından ileri sürülen bir diğer dezavantaj da elde edilen referans aralıkları o hastanenin belli bir dönemini yansıtması ve değerlerin hastaneden hastaneye farklılıklar gösterebilmesidir. 26 Bu şekilde saptanan referans aralıklarının daha genel bir hasta popülasyonuna uygulanması sakıncalı görülmektedir. İndirekt örneklendirme yoluyla veri toplanmasında da uyulması gereken bazı hususlar vardır: Kullanılan örnek dağılım, referans popülasyonunun bir parçası olmalıdır. Bunun için en uygun yöntem hasta verileri seçilirken hastane kayıtlarının kullanılmasıdır. Buradan hareketle taburcu edildiği andaki tanısı ve demografik bilgileri elde edilebilir. 2. Örnek referans dağılımı ünimodal olmalıdır; ancak dağılım yatık bir dağılım olabilir. Dağılımın içinde homojeniteyi bozacak gruplaşmalar olmamalıdır. 3. Verilerin yoğunlaştığı bölge, dağılımın moduna uymalıdır. Moddan uzak bölgedeki birikmeler büyük olasılıkla hastalıkla ilişkili verilerdir. 4. Total dağılım ile örnek dağılımın modları birbirlerine yakın olmalıdır. Görüldüğü gibi indirekt yöntem, direkt yöntemden daha kolaydır. Sonuçta herhangi bir veri seçimi yapılmamaktadır. Ancak dağılımda bimodal görünüm ortaya çıkarsa, kesinlikle hasta tanısı ve demografisi kullanılarak muhtemel gruplaşmalar engellenmelidir. Referans değerler belirlenirken projenin amacına göre bu örneklem stratejilerinden biri, diğerlerine üstün olabilir. Buna göre hangi metodun kullanıldığı, uygulama sonrası belirtilmelidir. 7 Sonuç olarak, her iki yolla da örneklendirme yapılabilir ve bunlara göre seçilen referans bireyler farklı istatistiksel metotlarla değerlendirilebilir. Sağlıklı bir veri seçimi yapılırsa daha sonraki basamaklarda, dağılımlarda gruplaşmaya ve uç değerlere çok daha az rastlanır. Sıklıkla kullanılan bir diğer kriter de hastanın taburcu olduğu andaki 15

28 kaydına tanısının işlenmesidir. Genellikle bu tanı kullanılarak hastanın tüm test sonuçları yerine, bu tanı ile ilgili test sonuçları dışlanmakta ve o tanıda belirtilen patolojinin etkilemediği test sonuçları örnek referans kitlesine dahil edilebilmektedir. 28 Bu yöntem aslında bir çeşit posteriori örneklendirmedir ve yapılan şey hastanın demografik bilgilerinin yanı sıra tanısının da kullanılmasıdır Referans Kitlesinin Gruplandırılması Veri setinin gruplandırılması referans aralığı hesaplanmasında önemli bir noktadır. Gaussian dağılımlara uyan ve modülasyona uğramayan verilerde gruplandırmaya gerek yoktur. Ancak biyolojik veriler genellikle Gaussian dağılımlara uymazlar ve sağa ya da sola yatık dağılırlar. Çünkü biyolojik verilerde modülasyona yol açan faktörler çok fazladır. Dağılımlardaki bu gruplaşmanın nedeni olan faktörler aşağıda sıralanmıştır. Tablo 2.5. Referans Kitlenin Gruplaşmasına Etki Eden Faktörler 1. Yaş 8. Açlık ve tokluk 2. Irk 9. Gebelik 3. Cinsiyet 10. Egzersiz 4. Kan grubu 11. Örnek alım saati 5. Biyoritm 12. Sigara kullanımı 6. Coğrafi yerleşim 13. Örnek alınırken ki postür 7. Diyet 14. Menstrual siklus Bu faktörler de ilgili NCCLS dokümanında belirtilmiştir. 2 Dikkat edilirse bazı faktörler Tablo 2.2. de belirtilen dışlama kriterleri ile aynıdır. Bu faktörlerin etkileri değişebilmektedir. Yaş ve cinsiyet en fazla kullanılan kriterlerdir. Bir çalışmada dışlama kriteri kabul edilen bir faktör başka bir çalışmada dağılımları gruplara ayırmada kullanılabilir. Çalışmanın sonunda istatistiksel olarak gruplar arasında önemli bir fark 16

29 olup olmadığına bakılabilir. Bu amaçla Student s t-test kullanılan en yaygın analiz yöntemidir. Bu test iki farklı grubu karşılaştırmada kullanılır; ANOVA (Analysis Of Variance: Varyans Analizi) yöntemi ise ikiden fazla grubun olduğu durumlarda 29, 30 kullanılmaktadır. Hastane şartları göz önünde bulundurulduğunda iyi hazırlanmış formlar kullanılarak bu kriterler tek tek uygulanabilir. Bu formların priori örneklendirmede kullanılması birey seçimini olumlu yönde etkileyecektir. Ancak bu işlemlerin kan alımından önce gerçekleştirilmesi gerekir Birey Örneklerinin Toplanması ve Analitik Prosedür Referans aralığı belirlenecek analitin analitik parametreleri ve karakteristikleri iyi bilinmelidir. Ayrıca laboratuvar koşulları ile ölçüm cihazı iyi laboratuvar uygulamaları çerçevesinde standardize edilmelidir. Referans değerlerin belirlenmesi için yapılan analizlerle normal rutin analizlerin çalışılma şartları aynı olmalıdır. Ancak bu durumda elde edilen bir referans değerle bir hastanın değeri tutarlı karşılaştırılabilir. Başka bir değişle, referans değer tespit edilecek diye tüm analitik şartları optimize edilerek titiz çalışma yapmak ve hastaların testleri çalışılırken bu özeni göstermemek yanlış bir karşılaştırmaya neden olacaktır. Bir testin analiz evresi klinisyen tarafından testin istenmesinden test sonuçlarının klinisyene ulaşmasına kadar geçen süreyi kapsar. Referans aralığı belirleme çalışmalarında da buna benzer bir prosedür uygulanır. Bu evre üç aşamadan oluşur Preanalitik Evre Örnekler toplanmadan önce bireylerin hazırlanması, laboratuvar koşullarının sağlanması ve analizden önceki işlemler gibi preanalitik standardizasyonun sağlanması hem biası engeller veya minimize eder, hem de bu etkenlerden dolayı varyasyonun ortaya çıkmasına engel olur. 1 Preanalitik faktörler biyolojik ve metodolojik olarak iki 17

30 ana başlık altında etki ederler. 14 Tablo 2.7. ve tablo 2.8. de bu değişkenler sistematik olarak sıralanmıştır. 6, 7, 14, 16 Tablo 2.6. Preanalitik Biyolojik Faktörler İnternal Faktörler Yaş Irk Eksternal Faktörler Gebelik, menstrüel siklus Egzersiz, fiziksel aktivite Hastaneye yatma ve hareketsizlik Sirkadiyen değişiklikler Şişmanlık Örnek alınırken ki vücut post ürü Diyet ve yenilen şeylerin etkisi Tütün kullanımı Cinsiyet Kişisel değişimler İlaç etkileşimleri Başka hastalıklarla etkileşim Çevre şartları Ateş, şok, travma, stres Transfüzyon ve infüzyon Seyahat Mevsimsel değişimler Alkol kullanımı Görüldüğü gibi preanalitik etkenler oldukça fazladır. Bu yüzden her aşamada önlemler alınmalıdır. Bu önlemler biyolojik kaynaklı sapmaları azaltır. Test sonuçlarının beklenen referans değerlerinden farklılığını gösteren sistematik sapmadır. Hastalık, risk göstergeleri veya tedavinin etkileri gizlenmemiş olur. 1 Laboratuvarda örneklerin tiplerine göre toplanma / alınma, transport, analize hazırlık ve saklama konusunda prosedürler oluşturulmalıdır. Referans bireylerden örnekler prosedürlere uygun alınmalıdır. Örneğin; referans değerler belirlenirken, vücut postürü diffüze analitler için çok önem arz ederken, sodyum gibi diffüze olmayanlar için önemsizdir. 9 Analitlere göre değişiklik gösteren işlemler de ayrıca not edilmelidir

31 6, 7, 14, 16 Tablo 2.8. Preanalitik Metodolojik Faktörler A- Örnek alımı evresini etkileyen faktörler Örnek alınmadan önceki dinlenme süresi Ekipman Örneğin alındığı zaman Örnek alındığı yer ve alınma şekli Kullanılan malzemenin temizliği Kan alınan tüp ve kullanılan antikoagulan B- Örneğin Analize Hazırlık Aşamasındaki Faktörler Örneğin taşınma şekli Pıhtılaşma süresi Örneğin etiketlenmesi Serum / plazmanın ayrılması Örneğin korunma ve saklanması Analize Hazırlık Kan Örneklerinin Alınması Standardizasyon kan örneklerinin alınmasında önemli bir ölçüttür. Her ölçümden önce preanalitik faktörlerin değerlendirilmesi (gözden geçirilmesi veya sorgulanması) ve tüm aşamaların standardize edilmesi dağılımların gruplaşmaya neden olmaması için gereklidir. 32 NCCLS, bu tip örneklerin ve hasta örneklerinin nasıl alınması gerektiğini çeşitli prosedürlerle belirlemiştir. 9 Ayrıca acil hastalar için gerekirse ayrı referans kriterleri tanımlanması uygun bir yaklaşımdır. 32 Kan alımından bir gün öncesi referans subjelerin yapması ve yapmaması gerekenler bir liste halinde kendilerine verilir. Ertesi gün tam olarak hangi saatte kan alma biriminde olacakları bildirilir

32 Kan Örneklerinin Transferi ve Ayrılması Alınan kan örnekleri laboratuvara hızlı bir şekilde transfer edilmeli ve tetkik edilecek analite uygun şartlarda taşınmalıdır. Sıcaklığa duyarlı analitler için kan örnekleri soğutulmuş santrifüjlerde çevrilmelidir. Alınan kan örneği dakika bekletildikten sonra iki saat içinde santrifüj edilmelidir. Erken ayrılan serumlarda fibrin oluşumu devam ettiğinden otoanalizörde tıkanma veya hatalı ölçümlere neden olabilir. Ayrılan serumlar ışıktan korunmalı ve bekletilmeden analiz edilmelidir. Bu şekilde, bekletilme ile serum analitlerinin hipokonsantre olması engellenecektir. Eğer hemen analiz işlemi yapılmayacaksa 2-8 C de saklanabilir; daha uzun süre saklanacaksa -80 C lik dolaplar kullanılmalıdır. Bu örnekler çıkartıldığında tamamen çözününceye kadar 25 C de bekletilmeli, homojenite sağlanması için çalkalayıcı ile karıştırılmalı ve 6, 16 ardından kullanılmalıdır. Sıvılaştırılmış örnekler yeniden dondurulmamalıdır Analitik Evre Referans değerlerin kullanılabilmesi için analitik performansı etkileyen faktörler tanımlanmalıdır. Bu faktörler: Ekipmanın tanımlanması, kullanılan suyun kalitesi, reaktifler, ham verinin tipi ve hesaplama yöntemleri, analiz yöntemi, kalite kontrol ve uygunluk kriterleri, gün içi ve günler arası değişkenler, kalibrasyon standartları sayılabilir. 9, 14 Eksternal kalite değerlendirme programları sonuçları ile doğruluk verileri de değerlendirilir. 14 Açıklanan bu özellikler diğer araştırıcıların aynı çalışmayı yapabileceği ve rutin laboratuvarlarda hasta sonuçları alındığı zaman referans değerlerin karşılaştırılabileceği şekilde olmalıdır. Referans ve gözlenen değerlerin karşılaştırılabilir olması için aynı analitik yöntem kullanılmış olmalıdır Postanalitik Evre Postanalitik evre, test sonuçlarının çıkmasından klinisyene veya araştırmacıya ulaşmasına kadar geçen evredir. Bu evrede otomatize cihazlarla donatılmış laboratuvar 20

33 informasyon sistemi bulunan laboratuvarlarda hata olasılığı oldukça düşüktür. Ancak çıkan sonuçlar el ile kaydediliyorsa laboratuvar çalışanının dikkatsizliği veya dalgınlığı hata oranını artırmaktadır Referans Değerlerin İstatistiksel Analizi Referans için alınan birey örneklerinin analizinden sonra veriler bir araya toplanarak istatistiksel olarak incelenir. Bu incelemeler referans değerlerinin uygun gruplara ayrılmasını, her grubun dağılımının değerlendirilmesini, aşırı uç değerlerinin belirlenmesini ve referans aralıklarının saptanmasını içerir Verilerin Toplanması Analiz sonrası elde edilen referans verileri hangi bireylerden oluşursa oluşsun, tıbbi geçerlilik için tanımlanmış uygun koşullarda elde edilen verilerden hesaplanmalıdır. Hastaların laboratuvar sonuçları ile referans değerleri 11 arasında doğru bir karşılaştırma için belli koşullar aranır. Bunlar: 6 1. Tüm referans birey grupları açık şekilde tanımlanmalıdır. 2. İlgili hasta hastalığı dışında referans bireylerle her bakımdan yeterince benzerlik göstermelidir. 3. Analiz edilecek numunelerin alınma ve işleme konulma şartları bilinmelidir. 4. Karşılaştırılan her nicelik aynı türden olmalıdır. 5. Tüm laboratuvar sonuçları kalite kontrolü yapılmış uygun standart metotlar kullanılarak elde edilmelidir. Karar verme aşamasında ileri düzey teknikler uygulandığında bu genel gereksinimlere aşağıdaki eklemeler yapılabilir; 6 1. Hastalığın patogenezindeki evreler teşhisin amacı doğrultusunda iyice ayrılmalıdır. Örneğin; bazı çakışan noktalar olsa da N-terminal (NT)- 21

34 probnp65 seviyelerindeki kademeli artışın gösterilmesi ile konjestif kalp yetmezliği (KKY) için klinik sınıflama yapılabilmektedir. 2. Kullanılan tüm laboratuvar testleri için klinik tanısal sensitivite ve spesifisite, prevalans ve yanlış sınıflandırmanın klinik maliyeti bilinmelidir. Örneğin; bazı durumlarda klinisyen verilen BNP (veya NT-proBNP) değerinin sağlıklı olup olmadığını bilmek isteyebilir. Bu durumda klinisyen yaş-cinsiyet uyumlu KKY bulgusu olmayan birey referans değerlerini kullanarak karar vermek isteyebilir Referans Değerlerin Gruplara Ayrılması Referans değerler yaş, cinsiyet ve diğer karakteristiklere göre alt gruplara ayrılabilirler (Tablo 2.9.). Gruplara ayırma, tabakalama, kategorizasyon veya alt gruplara ayırma olarak da adlandırılmaktadır. Gruplara ayırmanın amacı; bireyler arasındaki varyasyonların en aza indirilmesidir. Sınıf içi varyasyon ne kadar az ise o kadar dar ve duyarlı referans aralık hesaplanır. Genel olarak, sınıflar arasında istatistiksel olarak farklılık varsa referans değerler alt gruplara ayrılmalıdır. 4 Tablo 2.9. Referans gruplarını mümkün olan alt gruplara ayırmak için kullanılan gruplama kriterlerine örnekler verilmiştir. 9 Tablo 2.8. Referans Gruplarını Ayırma Kriterleri 1. Yaş 8. Menstrüel döngü evresi 2. Cinsiyet 9. Gebelik evresi 3. Genetik faktörler 10. Fiziksel durumlar 4. Irk (etnik köken) 11. Kronobiyolojik 5. Kan grupları (ABO) 12. Sosyoekonomik 6. Histokompatibilite antijenleri 13. Çevresel 7. Fizyolojik faktörler 14. Diğer faktörler 22

35 Gruplara ayırmada en önemli ve en sık kullanılan iki ölçüt cinsiyet ve yaştır. Sıklıkla postnatal, infant, puberte, premenopozal menopozal ve yaşlılık hallerinde değişim daha belirgindir. 14 NCBI (National Center for Biotechnology Information; Ulusal Biyoteknoloji Bilgilendirme Merkezi) tarafından yaşa göre gruplara ayırılması gösterilmiştir. Referans aralıklarının alt gruplara ayrılmasında daha önce yapılan çalışmalarda alt gruplara bilimsel ayırma yöntemleri uygulanmasına rağmen, tam olarak araştırmacılar fikir birliği sağlayamamışlardır. Birçok araştırmacı farklı yöntemlerle ayrım yapmaktadırlar Referans Gruplardaki Veri Sayısının Önemi Referans grupları değerlendirilirken elimizde yeteri kadar verinin olması gerekir. Çünkü veri sayısının çokluğu kullanılacak metodun güvenirliliğini artırır. Dağılımı etkileyen faktörler uç değerler ve veri sayısıdır. Özellikle uç değerler veri sayısının azlığında dominant hale geçerler ve dağılıma olumsuz etki ederler. Dağılımın iyi tanımlandığı Gaussian dağılımlarda kullanılan veri sayısı daha düşük olabilir. Ancak laboratuvar verileri genelde Gaussian dağılımına uymaz. Bu durumda düşük veri sayıları oldukça anormal sonuçlar verebilmektedir. 33 Referans sınırlarının saptanmasında kullanılan yöntemlerde NCCLS, kaç veri olması gerektiğini ilgili dokümanında belirtmektedir. Buna göre parametrik olmayan yöntemlerde %90 güven aralığı için 120, %95 güven aralığı için 153, %99 güven aralığında ise 198 verinin yeterli olduğu ileri sürülmektedir verinin altında ise modifiye non-parametrik yöntemler kullanılarak daha iyi sonuçlar alınabilir. Gaussian dağılım gösteren verilerde uygulanan parametrik yöntemlerde ise minimum 30 veri ile çalışma yapmanın yeterli olacağı ileri sürülmektedir. 24 Veri sayısı arttıkça Gaussian dağılıma uygunluk da artar; ancak aşırı uç değerlerde artar. Bu durum dağılımın iyi analiz edilmesi ve uç değerlerin iyi bir şekilde ayıklanması ile önlenebilir

36 Hastane verileri kullanılarak yapılan referans aralığı çalışmalarında ise veri sayısının ne olması gerektiği hakkında net bir görüş yoktur. Ancak bir çalışmada Yeteri kadar birikmiş veri ifadesi kullanılmıştır. 23 Gerçekten de birçok hastanenin gelişmiş bilgisayar programları sayesinde birkaç yıllık yeteri kadar birikmiş verisi zaten mevcuttur. Örneğin biz bu çalışmamızda yaklaşık veriyi taradık. Dikkat edilmesi gereken ise hastane verileri hasta popülasyonunu yansıttığı için bu veriler içinde çok sayıda aşırı uç değerler ihtiva ederler. Bu nedenle aşırı uç değerlerin çok iyi analiz edilip veri setinden çıkarılması veya iyi filtre edilmesi gerekir Dağılımın İncelenmesi Referans dağılımın histogramı çizilerek grafiksel olarak gözle değerlendirilmesi 7, 9, 13 önerilir. Dağılım aşağıda belirtilen maddeler dikkate alınarak değerlendirilmelidir. 1. Dağılım sınırlarından çok fazla sapan veriler (aşırı uç değerler) yanlış değerleri gösterebilir. Aşırı uç değerlerin araştırılarak, nedenlerinin belirlenmesi ve hesap dışı bırakılması gerekir. 2. Dağılımın bimodal veya polimodal olması, birden fazla alt grubun bulunduğunu gösterir. Bu durumda referans bireylerinin seçimindeki kriter yeniden değerlendirilmeli veya yaş, cinsiyet ve diğer faktörlere göre gruplara ayırma gözden geçirilmelidir. 3. Dağılımda asimetri ve normalden farklı tepeleşmelerde, diklik veya basıklık birlikte değerlendirilmelidir. 4. Görsel incelemenin diğer yararı da hesaplamalardan elde edilecek aralıklar hakkında bilgi vermesidir Aşırı Uçlarda Gözlenen Değerlerin (Sapan Değerler) Belirlenmesi Dağılımlar değerlendirilirken gözlenen, dağılımdan uzaklaşmış aşırı değerler hesaplamalara alındığında sonuçlar olumsuz etkilenir. 14 Dağılımlarda aşırı uç değerler 24