Hastane enfeksiyonları ve moleküler epidemiyoloji: Hastane infeksiyonlarının gerçek-zamanlı takibi ve enfeksiyon oranlarına etkisi

Transkript

1

2 Hastane enfeksiyonları ve moleküler epidemiyoloji: Hastane infeksiyonlarının gerçek-zamanlı takibi ve enfeksiyon oranlarına etkisi Barış Otlu İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

3 Hastane İnfeksiyonları Tarihi 3. Yüzyıl Roma Şiiri, Bir hastanın Dr. Simmakus a seslenişi Hasta oluyordum ve sen hemen geldin Yanında yüz öğrenciyle, oh Simmakus Yüz soğuk el bana dokundu Hiç ateşim yoktu, oh Simmakus, şimdi var Kurtuluş Töreci, Hastane İnfeksiyonlarının tarihçesi Hastane İnfeksiyonları Kirabı, 2003

4 Hastane İnfeksiyonları Tarihi Hastane kavramı ile hastane infeksiyonları kavramının birlikte geliştiği düşünülebilir. 18.yy da Hotel Dieu; ampütasyonlardan ölüm oranı %60, salgın sırasında lohusalık hummasından ölüm oranı 19/20

5 Hastane İnfeksiyonları Tarihi 1840 Hastane İnfeksiyonlarının tespiti ve önlenmesi ile ilgili ilk bilimsel yaklaşım. El hijyenin önemi Ignaz Semmelweis

6 Hastane İnfeksiyonları Tarihi from Notes on Hospitals published in 1863

7 Yoğun Bakımlar 1952

8 Yoğun Bakım ve Salgınlar

9 Yoğun Bakım ve Salgınlar

10 PubMed de son 35 yılda 200 den fazla Acinetobacter spp. salgını yayın haline gelmiş!!! imipenem (MK0787)

11 Son dört ayda 112 Hastane Salgın

12 Hastane İnfeksiyonları ve direnç problemi FDA ve EMA tarafından onaylanan yeni antibiyotik sayısı

13 Hastane İnfeksiyonları-Sınıflandırma Endemik Hastane İnfeksiyonları Bir hastalığın belirli bir yerde (örneğin bir hastanede) her zaman beklenen görülme düzeyi. Hastane İnfeksiyonlarının %90-95 Epidemik Hastane İnfeksiyonları Hastane infeksiyonların yaklaşık %5-10 Görülme sıklığı: 1/ yatış

14 vaka sayısı Epidemik Hastane İnfeksiyonları-Salgınlar Kaos ve kargaşa başlar. Komplo teorileri üretilir ve gerçeklerden daha çok bu bilgilere inanılır. Suçlamalar başlar zaman

15 Epidemik Hastane İnfeksiyonları-Salgınlar

16 Hastane İnfeksiyonları ve Mikrobiyoloji Laboratuvarı İnfeksiyona neden olan etkenin belirlenmesi Etkenin hızla tespiti Antimikrobiyal duyarlılığın belirlenmesi Antibiyotik direnç genlerinin tespit edilmesi Virülans genlerinin belirlenmesi İzolatlar arasındaki klonal ilişkinin ve bulaş kaynağının araştırılması Hastane salgınlarının araştırılması Salgının kaynağının belirlenmesi Dirençli bakterilerin izlenmesi Re-aktivasyonun yeni bulaştan ayırt edilmesi Hastane ve toplum kaynaklı infeksiyonların ayırt edilmesi Endojen-ekzojen kaynaklı infeksiyonların ayrımı

17 Hastane İnfeksiyonlarının Hızla Belirlenmesi

18 Moleküler Epidemiyoloji Moleküler Epidemiyoloji 21. yüzyılın en önemli ve heyecan verici araştırma alanlarından biridir Hasnain SE. Molecular epidemiology of infectious diseases: a case for increased surveillance. Bull World Health Organ. 2003;81(7): 474.

19 Moleküler Epidemiyoloji

20 Moleküler Epidemiyoloji

21 Moleküler Epidemiyoloji Bugün için ise moleküler epidemiyoloji terimi; genellikle moleküler biyolojik yöntemlerle suş tiplendirme çalışmalarına verilen ortak bir isim gibi kullanılmaktadır.

22 Moleküler Epidemiyoloji Moleküler epidemiyolojinin sınırlarını; - etken mikroorganizmanın tespiti - bulaşma yollarının araştırılması - virülanslarından sorumlu genlerin belirlenmesi ve - izolatlar arası klonal ilişkilerin araştırılmasını kapsayan geniş bir yelpazede çizilmiştir.

23 Nezaman? Moleküler Epidemiyoloji Ne? Nasıl? Niçin? Moleküler Epidemiyoloji

24 Moleküler Epidemiyoloji Etkenin belirlenmesi ve izolatların moleküler karekterizasyonu İzolatlar arasındaki klonal ilişkinin araştırılması

25 İzolatların Moleküler Karakterizasyonu İzole edilen mikroorganizmaların; antimikrobiyal direnç genleri virülans genleri mobil genetik elemanları plazmid transpozon İntegron hücre duvar yapıları araştırılmalıdır.

26 İzolatların Moleküler Karakterizasyonu Yoğun bakım ünitesinden izole edilen; zaman ve mekan açısından kümeleşme gösteren 27 P. aeruginasa izolatı.

27 İzolatların Moleküler Karakterizasyonu Karbapenem dirençli 16 P. aeruginasa izolatında (karbapenemaz +) karbapenem ile ilişkili olduğu bildirilen direnç genleri in-house PCR ile araştırıldı. - OXA-48 - OXA-23 - OXA-2 - VIM - KPC - NDM - GES - SMP - GIM - SIM - OXA-10 +

28 İzolatların Moleküler Karakterizasyonu Orijinal OXA-10 gen ürünün alfa yapısı beta ya döndüğünde OXA-48 benzeri karbapenemaz benzeri etkin gösteriyor.

29 İzolatların Moleküler Karakterizasyonu OXA-10 geninin PCR ile gösterilmesi ve dizi analizi 16 izolatta

30 İzolatların Moleküler Karakterizasyonu Class I İntegron üzerinde taşınıyor.

31 İzolatların Moleküler Karakterizasyonu Class I İntegronun karakterizasyonu

32 İzolatların Moleküler Karakterizasyonu Class I Integronun karakterizasyonu

33 İzolatların Moleküler Karakterizasyonu Karbapenemaz aktivitesinin araştırılması Karbapenemaz (-)

34 İzolatların Moleküler Karakterizasyonu Karbapenem direncinin nedeni OXA-10 olamaz! Hücre duvarından karbapenem geçişini etkileyecek bir değişim var mı?

35 İzolatların Moleküler Karakterizasyonu Karbapenem direncinin tek nedeni bu olabilir mi? Hücre duvarından karbapenem geçişini etkileyecek bir değişim var mı? CR-Pa CR-Pa

36 OMP İzolatların Moleküler Karakterizasyonu OXA-10 taşıyan Class I İntegrona sahip izolatlarda 47 kda OMP eksiklik var. Class I İntegron bakteri genomu

37 İzolatların Moleküler Karakterizasyonu Neden sadece OXA-10 taşıyan izolatlar karbapenem direncine sahip? Class I İntegron genomda hemen her zaman aynı yere insersiye oluyor karbapenem geçini sağlayacak dış membran proteinin sentezini önlüyor (47 kda)

38 İzolatların Moleküler Karakterizasyonu Nedensadece OXA-10 taşıyan izolatlar karbapenem direncine sahip? Class I İntegron

39 İzolatların Moleküler Karakterizasyonu Suşla ilgi tüm veriler ve sekans bilgisinin GenBank kaydı yapıldı.

40 İzolatlar Arasındaki Klonal İlişkilerin Araştırılması AFLP RFLP PFGE AP-PCR RAPD Dizi analizi MLST

41 Moleküler epidemiyoloji için yöntemler Sağlık bakımı ile ilişkili mikroorganizmaların moleküler tiplendirilmesinde; kromozomal DNA polimorfizmine dayalı olan yöntemler, hızlı ve güvenilir olmalarıyla ön plana çıkmaktadırlar. - Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) - PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) - Random amplified polymorphic DNA (RAPD) - Arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR) - Repetitive extragenic palindromic element-pcr (rep-pcr) - Amplified ribozomal DNA restriction analysis (ARDRA)

42 Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Bir çok mikroorganizma için halen «altın standart» genotiplendirme yöntemidir. Infect Genet Evol Oct;10(7): Epub 2010 Aug 6.

43 Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Kromozomal DNA polimorfizmine dayalı, tüm genomu hedef alan genotiplendirme yöntemidir. Sağlık bakımı ile ilişkili salgınların araştırılması ve bulaş kaynağının belirlenmesinde Bu yöntemlerle izolatlar arasındaki ilişkilerin belirlenmesinde; bant paternlerinin benzerlik yüzdesine ya da bant sayısı ve büyüklüğündeki farklılıklara göre değerlendirme yapılır.

44 10 mm Pulsed Field Gel Electrophoresis Yöntemin ana basamakları En iyi ihtimalle 2-3 ya da üç gün Bakteri Kalıplarının hazırlanması Bakterilerin Parçalanması ve diyaliz RE ile kesim Elektroforez Sonuçların Analiz

45 Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Görüntüleme Fotoğraflar dijital kamerayla ve programların çoğunun kabul ettiği TIFF formatında çekilmelidir. İyi görüntülenememiş tiplendirme sonucu veri olarak değer kazanmamaktadır.

46 Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Sonuçların analizi ve yorumlanması

47 Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Sonuçların analizi ve yorumlanması İlk defa Tenover ve arkadaşları 1995 yılında PFGE sonuçlarının yorumlanması için belirli kriterler önermişlerdir. aynı yakın ilişkili muhtemel ilişkili ilişkisiz

48 Pulsed Field Gel Electrophoresis Sonuçların analizi ve yorumlanması

49 Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Sonuçların analizi ve yorumlanması Bu amaçla en çok kullanılan bilgisayar programları; - Gel-Compar (Applied Maths, Kortfijk, Belgium) - Dendron (Solltech, Oakdale, Iowa) - Diversity Database Fingerprinting Software (Bio-Rad) - Gene Profiler (Scanlytics, Fairfaz, Va) - Phoretix 1-D (Nonlinear USA, Durham, N.C.) - Quantar Pro (KeyGene Producrts, Wageningen, Netherlands) - Taxotron (Taxolab, Institut Pasteur, Paris, France)

50 Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Sonuçların analizi ve yorumlanması Genotip P-VIII -Suşlar anestezi-reanimasyon yoğun bakım ünitesinden, beş aylık bir dönemde izole edilmiştir.

51 Arbitrarily Primed- PCR (AP-PCR) Moleküler epidemiyolojik çalışmalar için kullanılan bir hızlı DNA fingerprinting yöntemidir. Kısa primerler kullanılarak DNA daki benzer bölgelerin amplifikasyonu yapılır. PCR Reaksiyonu ürün 1 ürün 2 ürün 3 ürün 4 ürün 5 ürün 6

52 Arbitrarily Primed- PCR (AP-PCR) Otlu B, Durmaz R. Farklı bakteri ve maya türlerinin alttiplendirilmesinde için ortak bir arbitrary primed polimeraz zincirleme reaksiyon (AP-PZR) protokolü. Durmaz R (editör). Uygulamalı Moleküler Mikrobiyoloj. 2. Baskı. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri, 2001:

53 Arbitrarily Primed- PCR (AP-PCR) Bu yöntemin başarısı ; - kullanılan primerlere - amplifikasyon karışımının içeriğine - ısı döngülerine - elektroforez koşullarına - ve sonuçların yorumlanmasında kullanılan kriterlerden önemli ölçüde etkilenmektedir. Standardizasyon zor

54 Rep-PCR Hastane salgınlarının hızlı tespiti için geliştirilmiş olan Diversilab Sistemi (Biomerieux, Fransa) Rep-PCR tabanlı otomatize bir tiplendirme sistemidir. Tekrarlanan gen bölgelerini hedef alır. REP-PCR (DiversiLab Sistemi)

55 Rep-PCR REP-PCR (DiversiLab Sistemi) Hızlı Tekrarlanabilirliği yüksek Amplifikasyon ve elektroforez aşamaları standardizde edilmiş Bant pattern analizleri için yazılama sahip

56 Moleküler Epidemiyolojiye Başlarken İzolatlar tür düzeyinde doğru olarak tanımlanmalı Klasik epidemiyolojik veriler eksiksiz olarak toplanmalı En uygun yöntemler seçilmeli - Hızlı - Uygulaması kolay - Ayrım gücü ve tekrarlanabilirliliği yüksek - Sonuçları kolay yorumlanabilmeli Çalışılacak mikroorganizmanın genom özellikleri iyi bilinmeli.

57 Moleküler Epidemiyolojiye Başlarken Çalışılacak mikroorganizmanın genom özellikleri iyi bilinmeli. Yoğun bakımdaki 4 hastanın trakeal aspiratından ve 5 hastanın balgamında S. maltophilia üretildi Çevre kültürlerinden, 1 nebulizatörde aynı organizma üretildi.

58 Moleküler Epidemiyolojiye Başlarken

59 Moleküler Epidemiyolojiye Başlarken S. maltophilia suşları hiper mutasyona sahip

60 Moleküler Epidemiyolojiye Başlarken S. maltophilia suşları hiper mutasyona sahip. Aynı suşun seri pasajları;

61 Moleküler Epidemiyolojiye Başlarken S. maltophilia suşlarının moleküler karakterizasyonu. Class I integron PCR Miniprep ile Plazmid DNA ekstraksiyonu 500 bp Class I Integron Plazmid profil analizine ihtiyaç var

62 Moleküler Epidemiyoloji Ne Zaman Kullanılmalı? Her zaman

63 similarity line %90 similarity line %95 cluster 5 cluster 6 cluster 5a Genotype 10 Genotype 15 Moleküler Epidemiyoloji Ne Zaman Kullanılmalı? Real-time monitorization of nosocomial infections in intensive care units with molecular epidemiologic tools: Impact on infection rate. Real- me monitoriza on of nosocomial infec ons in intensive care units with molecular epidemiologic tools: Impact on infec on rate. Baris Otlu 1, Yasemin Ersoy 2, Çigdem Kuzucu 1, Yasar Bayindir 2, Uner Kayabas 2, Funda Yetkin 2, Emine Tunc 1, Nalan Parmaksiz 3, Canan Kizilkaya 4, Yusuf Yakupogullari 1 1 Medical Microbiology, Inonu University Faculty of Medicine, Malatya, Turkey. 2 Infectious Diseases and Clinical Microbiology, Inonu University Faculty of Medicine, Malatya, Turkey. 3 Infection Control Nurse, Inonu University Faculty of Medicine, Malatya, Turkey. 4 Medical Microbiology, Ankara University Faculty of Medicine, Ankara, Turkey. INTRODUCTION Yoğun bakımlardan izole edilen sağlık bakımı ilişkili tüm etkenleri aynı gün Rep- Ac ve surveillance programs are required for rapid detec on of outbreaks and transmission sources to reduce nosocomial infec on rates. Molecular epidemiological inves ga ons have played an important part in exposing the rela onship between causa ve agents (1). However, the retrospec ve nature of such studies limit their relevance in rou ne clinical prac ce. Our aim is to determine the clonal rela onship between nosocomial infec on agents isolated from our hospital's Intensive Care Unit (ICU) in real me (on the day of isola on) and to inform the Hospital Infec on Control Commi ee (HICC) to promptly take necessary precau ons and ac ons. The preliminary results of the first nine months are presented. MATERIAL AND METHOD RESULTS PCR ile tiplendirdik. This study was carried out in Inonu University Turgut Ozal Medical Center with a capacity of 255 ICU beds out of 1140 total beds. Isolated A. baumannii, P. aeruginosa, E. coli or K. pneumonia microorganisms from ICU's have been subjected to the Rep-PCR-based DiversiLab system for molecular typing in real me since January 1 st, Briefly, the DNA of the isolates was extracted using the Ultra Clean Microbial DNA Isola on kit (MoBio Laboratories, Solana Beach, CA, USA) kits, then, the rep-pcr was performed using Geneamp PCR System 9700 thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) and DiversiLab Kit. The amplified fragments, ranging bp in size, were separated electrophore cally with the microfiluid labchip. Electrophorograms were downloaded and automa cally analyzed by the DiversiLab (version 3.4). Finally, the so ware created a customized report presen ng a dendogram, electrophorograms, virtual gel images, and sca er plots. Clonal rela onships of the isolates were determined according to previously described criteria (2).Each newly typed isolate was inves gated for clonal rela onship between the previously typed isolates using DiversiLab so ware, and HICC was informed when a new isolate was included in any cluster. The epidemiological links between clonally related strains were analyzed by HICC, routes of transmission inves gated, precau ons taken and mee ngs appointed as required. Only clonally similar strains with rep-pcr genotyping were confirmed with pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) following a rapid PFGE protocol described previously with minor modifica on (3). Briefly, bacterial colonies grown in the nutrient agar were collected and suspended in 1 ml cell suspension buffer, and then re-suspended in 2% low-mel ng point agarose (Gibco BRL, Paisley, UK) plugs, and were lyzed in the cell lysis solu on-1 and cell lysis solu on-2. A. baumannii, P. aeruginosa, E. coli and K. pneumonia DNA was digested respec vely with using ApaI, SpeI and XBAI enzyme (Promega Corpora on, US). Fragmented DNA was electrophoresed in 1% pulsed-field cer fied agarose (Bio-Rad Laboratories, US) by using with a CHEF-DR II system (Bio-Rad Laboratories, Belgium). The DNA bands on the gel were visualized under the UV light, photographed using the Gel Logic 2200 imaging system (Kodak, USA), and the band profiles were analyzed using the GelCompare so ware (Applied Maths, Belgium). Dendograms of the PFGE banding pa erns were created by using Dice similarity coefficient and Unweighted pair group method with mathema cal averaging (UPGMA) and cluster analysis was performed. The isolates with Dice similarity coefficient 90% (tolerance of 1% in band posi on) were designated as clonally related 8 while they were classified as indis nguishable, closely related and possibly related when they had Dice similarity coefficient values of 100%, % and %, respec vely. During the study period, a total of 5340 pa ents and pa ents days were monitored in ICU's. In 251 of these pa ents, 310 (5.8%) hospital-onset infec ons were detected, reflec ng a decrease of 2.6% compared to the previous year (p=0,006). Eighty-four A. baumannii isolates were assigned to 34 different sets with a clustering rate of 67.8%. For 32 P. aeruginosa, 23 E. coli and 29 K. pneumoniae isolates, the clustering rate was calculated respec vely as 6.5%, 25% and 13%. When comparing the infec on rates with the previous year an increase was observed from 8 to 10 per 1000 pa ent days in the first quarter. However, in the second quarter, the infec on rate decreased from 12.2 to 7.9, and from 11 to 9.7 per 1000 pa ent days in the third quarter. The total infec on rate from 10.7 to 9.2 per 1000 pa ent days compared to the previous year (Z=1.8 p=0,036). DiversiLab Typing Confirma on with PFGE A B Figure 1. A) rep-pcr-based dendogram and virtual gel image fingerprints obtained from A. baumannii strains with using the DiversiLab system. B) Found similar with Diversilab of strains confirmed by PFGE. A B Figure 1. A) rep-pcr-based dendogram and virtual gel image fingerprints obtained from E. coli strains using the DiversiLab system. B) Found similar with Diversilab of strains confirmed by PFGE. Klonal ilişki konusunda HİKK ne hızla bilgi verip, ilişkili bulunan suşları PFGE ile doğrulama çalışmaları başlatıldı. Dirençli izolatların moleküler karakterizasyonları yapıldı. CONCLUSION Together with the addi onal ac ons held, annual infec on rate decreased to from 10.7 to 9.2 per 1000 pa ent days compared to the previous year. Molecular epidemiological data has become a convincing evidence to encourage the clinician to embrace the precau ons to be taken towards an outbreak. Our results shows that molecular typing would shorten or even prevent an epidemic and the reduce the incidence of nosocomial infec ons. In our hospital intensive care units, the most frequent isolated species was A. baumannii. These isolates also displayed significantly higher clustering ra o. We were not able to ameliorate A. baumanii infec on rates to desired levels, opposed to other pathogens which share similar transmission routes. Therefore, these findings suggest the possibility of alterna ve transmission routes for A. baumanii wai ng to be unveiled. Our results emphasize that, rapid molecular typing of microorganisms in hospitals with molecular epidemiology tools should be one of the essen al components of a comprehensive infec on control program. Obviously, epidemiological and molecular typing data should be evaluated together to develop effec ve infec on preven on strategy. REFERENCES 1- Sabat AJ, Budimir A, Nashev D, Sá-Leão R, van Dijl Jm, Laurent F, Grundmann H, Friedrich AW; ESCMID Study Group of Epidemiological Markers (ESGEM). Overview of molecular typing methods for outbreak detec on and epidemiological surveillance.euro Surveill Jan 24;18(4): Ariane Deplano, Olivier Denis, Hector Rodriguez-Villalobos, Raf De Ryck, Marc J. Struelens, Marie Hallin. Controlled Performance Evalua on of the DiversiLab Repe ve-sequence-based Genotyping System for Typing Mul drug-resistant Health Care-Associated Bacterial Pathogens. J Clin Microbiol October; 49(10): Durmaz R, Otlu B, Koksal F, Hosoglu S, Ozturk R, Ersoy Y, Aktas E, Gursoy NC, Caliskan A. The op miza on of a rapid pulsed-field gel electrophoresis protocol for the typing of Acinetobacter baumannii, Escherichia coli and Klebsiella spp. Jpn J Infect Dis 2009; 62(5):

64 Moleküler Epidemiyoloji Ne Zaman Kullanılmalı? Yoğun bakım hastaları kültürde üreme ve identifikasyon Hastane infeksiyon kontrol komitesi Hastane infeksiyonu İzolatın moleküler karakterizayonu Karbapenemaz aktiviteisi Direnç genlerini OXA-48, NDM1, VIM, IMP, GES Mobil genetik elementler İzolatın genotiplendirilmesi Kümeleşme yok İzolatlar ayrı Rep-PCR ile tiplendirme ve izolatlarla karşılatırma Kümeleşme var İzolatlar benzer Komiteye bilgi ver ve ilişkiyi PFGE ile doğrula

65 Moleküler Epidemiyoloji Ne Zaman Kullanılmalı?

66 Moleküler Epidemiyoloji Ne Zaman Kullanılmalı? Hastane infeksiyon kontrol komitesinin haftalık toplantılarına katıldık. Yoğun bakımlarda salgınlardan etkilenen hasta sayısı artmadan müdahale edilmesine katkıda bulunduk. Vaka sayısının arttığı ancak klonal ilişkili bulunmayan durumlarda HİKK farklı yollar izledi Örneğin;

67 Moleküler Epidemiyoloji Ne Zaman Kullanılmalı? Hastane infeksiyon kontrol komitesinin çalışmaları ve aldığı önlemler ile; 30 Hasta günü Hastane İnfeksiyonu Hızı % *DEĞER+,1 21,41 15,98 14, ,01 9,3 9 8,

68 Eldeki tüm imkanlar kullanılmalı

69 Ne yapmak gerekiyor? Hastane İnfeksiyonları, sık görülen komplikasyonlar olduğundan bu enfeksiyonlar sürekli olarak takip edilmeli ve salgınların önlenmesi için stratejiler geliştirilmelidir.