BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI;

Transkript

1 KURS SALGINLARIN İZLENMESİ VE MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİ BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin uygulamaları, problemleri ve sonuçların analizi Barış Otlu İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Malatya.

2 Modern epidemiyolojinin başlangıcı-john Snow Dr.John Snow

3 Modern epidemiyolojinin başlangıcı-john Snow

4 Moleküler epidemiyoloji için yöntemler AFLP RFLP PFGE AP-PCR RAPD Dizi analizi MLST

5 (PFGE) Bir çok mikroorganizma için halen «altın standart» genotiplendirme yöntemidir. Infect Genet Evol Oct;10(7): Epub 2010 Aug 6.

6 (PFGE) Kromozomal DNA polimorfizmine dayalı, tüm genomu hedef alan genotiplendirme yöntemidir. Bu yöntemlerle izolatlar arasındaki ilişkilerin belirlenmesinde; bant paternlerinin benzerlik yüzdesine ya da bant sayısı ve büyüklüğündeki farklılıklara göre değerlendirme yapılır.

7 (PFGE) PFGE kullanım alanları; hastane enfeksiyonlarının araştırılması ve bulaş kaynağının belirlenmesinde, özellikle gıda ile oluşan toplum kaynaklı salgınların incelenmesinde, laboratuvar kontaminasyonlarının doğrulanmasında hastaların izlenmesi rölaps yeniden infeksiyon ayrımı İnfeksiyonun kalıcılığının gösterilmesi kontaminasyon infeksiyon ayrımının yapılması

8 Geleneksel Jel Elektroforez

9 Geleneksel Jel Elektroforez DNA fragmentinin jel üzerindeki göçüne etki eden faktörler; - büyüklüğü - elektiriksel yükü ve üç boyutlu yapısı. Bunun yanında agaroz jelin konsantrasyonu ve por çapı DNA nın göçünü etkiler. University of Rochester

10 Geleneksel Jel Elektroforez Geleneksel elektroforezde 20 kb dan büyük DNA parçaları, jel üzerinde hemen hemen aynı hızda göç edeceklerinden birbirlerinden ayrıştırılamazlar

11 Büyük DNA fragmentleri jel üzerinde nasıl ayrıştırılabilir?

12 DNA nın elektroforetik alandaki haraketi akım yok akım yok

13 1984 de Schwartz and Cantor büyük DNA moleküllerinin daha iyi ayrışması için elektriksel alanın periyodik olarak değiştirildiği bir elektroforez yöntemi geliştirdiler.

14 PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması Field inversion gel electrophoresis (FIGE) Tek yönlü ve sabit akımlı en basit sistemdir. Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni önerilir. Özellikle kb aralıkta iyi ayırım gücüne sahiptir. -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+

15 PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması Orthogonal field alternation gel electrophoresis (OFAGE) Elektriksel alan jel boyunca homojen olarak dağılmaz. DNA fragmnetleri, jelin farklı bölgelerinde farklı hızda göçer. Tekrarlanabilirliliği düşüktür. Laboratuvarlar ve cihazlar arası standardizasyon güçtür. B- A+ A- B+ Proc Natl Acad Sci U S A Apr 28;95(9):

16 PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması Transverse alternating field electrophoresis (TAFE) Jel elektriksel alana vertikal bir şekilde yerleştirilmiştir. Basit bir elektrot yapısı vardır ve akım jel boyunca homojen olarak dağılır. Elektriksel açı, üst bölgeler 115 alt kısımlarda 165 olmak üzere jel boyunca farklılık gösterir. Bundan dolayı jelin alt kısımlarında DNA nın göçü yavaşlar ve bantlarda yığılma görülebilir. B- A+ 115 A- B+ Infect Immun Oct;59(10):

17 PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması Simultaneous tangential/rectangular inversion decussate electrophoresis (ST/RIDE) TAFE düzeneğine ilave olarak bir çift elektrod daha vardır. Elektriksel alan jelin eni boyunca homojendir ve 90 ile 180 arasında değiştirilebilir. Jelin alt kısımda band yığılmalarının oluşması önlendi. AB- B+ C- C+ A+ Infect Immun Oct;59(10):

18 PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması Rotating gel electrophoresis Elektriksel alanın yönü yerine, jelin kendisi ya da elektrotlar döndürülür. B mekanik düzenek gerektirir. Mekanik olarak değişiklik hızı, elektriksel alan değişikliklerine göre daha yavaştır. Toplam elektroforez süresi uzundur Ziegler A, Volz A Rotating Field Gel Electrophoresis (ROFE) In: Methods in Molecular Biology, 1992, Volume 12, Part I, 63-72

19 PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması Contour- clamped homogenous electrıc fıeld (CHEF) Hekzagonal yerleşime sahip toplam 24 (6 x 4) elektrota sahiptir. Homojen elektriksel alan sağlar. Elektriksel alanın açısı sabit veya değişken olabilir. DRII sisteminde sabit 120 dir. DRIII sisteminde arasında CHEF Mapper: sisteminde ise arasında değişkendir. A- B120 B+ A+ CHEF DRII

20 PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması Contour- clamped homogenous electrıc fıeld (CHEF)

21 Başlarken nelere dikkat edilmeli? Tüm kimyasallar üreticinin önerdiği şekilde depolanmış olmalı. Hesaplamalar doğru yapılmalı. Tartımlar doğru yapılmalı. Tamponlar için ultra saf su kullanılmalı. Kullanılacak tüm cam malzemeler temiz olmalı. Tüm cihazların doğru çalıştığı kontrol edilmeli. Doğru kimyasallar (enzim, deterjan) kullanılmalı.

22 Tüm genom hedef alındığından DNA nın kırılmamış olarak elde edilmesi gereklidir. Aksi taktirde hatalı bant profilleri oluşacaktır.

23 Standart yöntemlerle bakterinin ekstraksiyonu sırasında DNA nın tam ve kırılmamış olarak elde edilmesi mümkün değildir. Fiziksel Yöntemler Kaynatma Dondurma-çözme Enzimler Proteinaz K Lizozim Lysostaphin Deterjanlar SDS Tween-80

24 Bu sebeplerden dolayı PFGE yönteminde DNA eldesi için farklı bir yol izlenmektedir.

25 Yöntemin ana basamakları Bakteri Kalıplarının hazırlanması 10 mm Bakterilerin Parçalanması ve diyaliz RE ile kesim Elektroforez Sonuçların Analiz

26 Bakteri kalıplarının hazırlanması İlk olarak bakteri süspansiyonları hazırlanır. Bunun için tür düzeyinde tanımlaması yapılmış mikroorganizmanın, saf kültürüne ihtiyaç vardır.

27 Bakteri kalıplarının hazırlanması. Öncelikle tiplendirilecek bakteri türü dikkate alınarak uygun kültür yöntemi kullanmak gereklidir. Örneğin; PFGE için C. difficile suşları Schaedler s anaerobic broth da üretilmelidir. Schaedler s anaerobic broth J Clin Microbiol Sep;40(9):3546-7; author reply 3547.

28 Bakteri kalıplarının hazırlanması. Önerilen; katı besiyerinde saf olarak üremiş tek bir koloninin alınarak sıvı besiyerinde üretilmesidir. Ancak, katı besiyerinde saf olarak üretilen bakteri kolonileri de doğrudan kullanılabilmektedir.

29 Bakteri kalıplarının hazırlanması. Bakteriler için kullanılacak tüm kültürler 24 saatlik olmalıdır.

30 Bakteri kalıplarının hazırlanması. Bakteriler hücre süspansiyon tamponu içerinde süpanse edilir. Hücre süspansiyon tamponu çoğunlukla Tris-HCl, NaCl ve EDTA içermektedir. Ancak bazı bakteriler; yüksek EDTA konsantrasyonlarından ve NaCl ile oluşabilecek ozmotik basınç yüzünden daha kalıp içerisine gömülmeden parçalanabilir. Enterococcus spp. için; 100 mm Tris-HCL, 100 mm EDTA 1M NaCl içeren hücre süspansiyon tamponunda ozmatik dengesizliğe maruz kalırlar. S. aures için; 10 mm Tris, 1M NaCL EDTA konsantrasyonlarına karşı oldukça hassasdır ve eğer mutlaka gerekli ise düşük miktarlarda kullanılmalıdır.

31 Bakteri kalıplarının hazırlanması. Bakteriler hücre süspansiyon tamponu içerinde süpanse edilirken en önemli nokta bakteri yoğunluğunun ayarlanmasıdır. Spektrofotometre, turbidometre, kolorimetre gibi optik yoğunluk temelli yöntemler sıklıkla kullanılmaktadır.

32 Bakteri kalıplarının hazırlanması. Bakteri yoğunluğunun ayarlanmasında en ideal yöntem hemocytometer.

33 Bakteri kalıplarının hazırlanması. Bakteri süspansiyonu hazırlanırken; koloniler pamuklu çubuklarla alınmamalı, mutlak suretle öze kullanılmalı ve bakteri kolonisi çözücü içerisinde iyice homojenize edilmelidir. X

34 Bakteri kalıplarının hazırlanması Her bakteri türü kendine özgü yoğunlukta hazırlanmalıdır. Örneğin; 560 nm dalga boyunda Pseudomonas türleri için 1.0 Streptococcus türleri için 1.0 Acinetobacter türleri için 0.7 absorbans yeterli olmaktadır.

35 Bakteri kalıplarının hazırlanması. A. boumannii, bakteri yoğunluğu 590 nm 0.7 absorbans 1.0 absorbans

36 Bakteri kalıplarının hazırlanması. E. coli McFarland 4 McFarland 7 P. aeruginosa McFarland 3 McFarland 4 McFarland 7

37 Bakteri kalıplarının hazırlanması. 250 l HST 250 l LMP agroz 250 l HST+250 l LMP agaroz içerisinde uygun yoğunlukta bakteri olan hücre süspansiyon tamponu Bakteriler HST içerisinde tamemn çözülmeli ve partikül olmamalıdır. aynı hücre süspansiyon tamponu içerisinde hazırlanan %2 lik low melting agarose LMP agaroz mikrodalgada, kaynatılmadan yavaş yavaş eritilmeli İçerisinde bakteri bulunan %1 lik LPM agaroz Hücre/agaroz karışımının ısısı 50 C yi geçmemelidir. Aksi taktirde hücreler kalıp içerisine tam olarak gömülmeden parçalanacaktır. plug molds

38 Bakteri kalıplarının hazırlanması. Hücre/agaroz karışımı kalıplara pipetlenirken, kabarcık ve boşluk kalmamasına özen gösterilmelidir.

39 Bakteri kalıplarının hazırlanması. Agaroz kalıpların hazırlanması için; standart kalıplar kullanılabileceği gibi cam veya parafilm üzerine damlalar oluşturacak şekilde dökülerek de hazırlanabilir.

40 Bakteri kalıplarının hazırlanması. Kalıplardaki agarozun nihayi yoğunluğu, restriksiyon enzimleri ile kesimden oluşacak DNA fragmentlerini büyüklükleri göz önüne alınarak seçilmelidir. Örneğin; Enterokoklar için (SmaI ile kesimde) %1 lik, Streptokoklar için (ApaI ile kesimde) %0,5 lik agaroz kalıpları hazırlanmalıdır.

41 Bakteri kalıplarının hazırlanması. Bazı durumlarda bakteri hücresinin parçalanmasını arttırmak için, kalıp içerisine enzim ve deterjanlar da eklenebilir. - Proteinaz K - Lizozim - Lyticase veya Zymolase gibi enzimler - SDS gibi deterjanlar kullanılmaktadır.

42 Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA nın saflaştırılması Bakteri parçalama tamponu; Proteinaz K ve lizozim gibi enzimler ve deterjanlar, agaroz içerisine gömülü bakterilerin hücre duvarını parçalar.

43 Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA nın saflaştırılması Bakteri parçalama tamponu; Kullanılacak enzimin çeşidi ve konsantrasyonu bakteri türüne göre farklılık gösterebilir. Örneğin; - Proteinaz K yaygın olarak kullanılan enzimlerden biridir ve 4 günü aşkın inkübasyonunda bile DNA ya zarar vermez. - S. aureus gibi bazı bakterilerde lizozim yerine lizostafin daha etkilidir. - Mantarlarda ise; zymolase veya lyticase kullanılmalı.

44 Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA nın saflaştırılması Bakteri parçalama tamponu; - Bakteri parçalama tamponu büyük hacimli tüplerin içerisinde olmalıdır. - İnkübasyonlar sırasında çalkalamalı benmari kullanılmalı ve tüpler yarı yatık olmalıdır. Örneğin; 5 ml parçalama tamponu 50 ml lik tüp içerisinde olmalı. X

45 Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA nın saflaştırılması Bakteri parçalama tamponu; P. aeruginosa, A. baumannii, E. coli ve Klebsiella spp.için ortak parçalama tamponu Hücre parçalama tamponu-1 50 mm Tris-HCl [ph 8.0], 50 mm EDTA, 2.5 mg/ml lizozim, 1.5 mg/ml proteinaz K 37 C de 1 saat Hücre parçalama tamponu M EDTA, %1 sarkozil, 400 g/ml proteinaz K 55 C de 2 saat Tubitak Proje No: 106S211 (SBAG-3459). Durmaz R, Otlu B, Koksal F, Hosoglu S, Ozturk R, Ersoy Y, Aktas E, Gursoy NC, Caliskan A Jpn J Infect Dis Sep;62(5):372-7.

46 Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA nın saflaştırılması Hücrelerin parçalanmasından sonra agaroz kalıpların yıkanması ; agaroz kalıpların içerisindeki hücresel kalıntıların uzaklaştırılması başarılı elektroforez için oldukça önemlidir. diyaliz Yetersiz diyaliz

47 Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA nın saflaştırılması Hücrelerin parçalanmasından sonra agaroz kalıpların yıkanması ; parçalama tamponu döküldükten sonra agaroz kalıplar su ve TE tamponu ile yıkanır. Böylece içinde saflaştırılmış DNA bulunan agaroz, restriksiyon enzimi ile kesime hazır hale getirilmiş olur. İçinde agaroz kalıp bulunan tüpe, steril ultra saf sudan (Reagent Grade Type 1) 4 ml eklenerek, 50 C çalkalamalı su banyosunda 15 dakika bekletilir. Su tamamen aspire edilir ve bu işlem üç kez daha tekrarlanır. Daha sonra agaroz kalıpları üç defa (her biri 50 C de 15 dakika olmak üzere), 4 ml TE (10 mm Tris-HCl, 0.1 mm EDTA, ph 7.6) tamponuyla yıkanır Tubitak Proje No: 106S211 (SBAG-3459). Durmaz R, Otlu B, Koksal F, Hosoglu S, Ozturk R, Ersoy Y, Aktas E, Gursoy NC, Caliskan A Jpn J Infect Dis Sep;62(5):372-7.

48 Agaroz kalıpları içindeki DNA nın RE enzimi ile kesilmesi Çift zincirli DNA yı özgül dizilerden tanıyarak kesen enzimlerdir. Bugüne kadar yaklaşık 250 kadar farklı diziyi tanıyabilen 3600 kadar restriksiyon enzimi saptanmıştır.

49 Agaroz kalıpları içindeki DNA nın RE enzimi ile kesilmesi Uygun enzim seçimi önemlidir. İyi bir ayrım için bant sayısı en az 10 en fazla olmalıdır. EcoR I Kesim Noktaları 175 bp 200 bp Kesim noktaları arasında kalan DNA fragmentleri büyüklüklerine göre elektroforetik alanda, jel içinde göç ederler. 500 bp 600 bp 800 bp 1000 bp Klonal olarak ilişkili suşlar, benzer bant profilleri oluşturacaktır.

50 Agaroz kalıpları içindeki DNA nın RE enzimi ile kesilmesi DNA içeren agaroz kalıbı bir lam üzerine alınarak bir bistürü yardımıyla ¼ oranında kesilir. Kesilen kalıp, önce restriksiyon enziminin tamponu ile yıkanır. Daha sonra enzim ile, uygun ısıda benmaride inkübe edilir. Her agaroz kalıbı için aşağıdaki karışım hazırlanır. 10x EcoRI tamponu l, EcoRI enzimi (10 U / l)-- -3 l Steril ultra saf su l Toplam hacim l

51 Agaroz kalıpları içindeki DNA nın RE enzimi ile kesilmesi Kalıpların içerisindeki genomik DNA lar restriksiyon enzimi ile kesildikten sonra, kalıplar elektroforez için hazırdır.

52 Elektroforez Tercihan PFGE sertifikalı agaroz kullanılarak %1 lik agaroz kalıp hazırlanır.

53 Elektroforez Agaroz kalıplar iki şekilde jel içerisine yerleştirilebilir.

54 Elektroforez Agaroz kalıplar iki şekilde jel içerisine yerleştirilebilir.

55 Elektroforez Elektroforezde kullanılacak 0.5X TBE tamponu titizlikle hazırlanmalıdır. Tüm çalışma dizisi sırasında değişmemelidir.

56 Elektroforez Restriksiyon enzimi ile kesimden sonra oluşacak DNA fragmentlerinin büyüklüğüne göre uygun elektroforez koşulları uygulanmalıdır. Başlangıç zamanı: 1 saniye Bitiş zamanı: 20 saniye Toplam süre: 20 saat Akım : 6 V/cm², 14 C Vuruş Açısı: 120

57 Görüntüleme Elektroforezden sonra jel, 5 g/ml etidyum bromür içeren 400 ml ultra saf su içine alınırak 20 dakika boyanır ve UV ışığa altında görüntülenir. Fotoğraflar dijital kamerayla ve programların çoğunun kabul ettiği TIFF formatında çekilmelidir. İyi görüntülenememiş tiplendirme sonucu veri olarak değer kazanmamaktadır.

58 Karşılaşılabilecek sorunlar Restriksiyon endonüleaz enzimi kesim yapmamış. uygun enzim seçilmemiş olabilir uygun ısıda inkübe edilmemiş olabilir enzim uygun depolanmamış olabilir enzimin çalışmasını engelleyecek inhibitör bulunabilir bakteri tür düzeyinde yanlış tiplendirilmiş dolayısıyla enzimin kesim bölgesine sahip olmayabilir

59 Karşılaşılabilecek sorunlar P. aeruginosa DNA kesim enzimi: Xba-I Agaroz jel: %1 Elektroforez koşulları: Başlangıç zamanı: 15 saniye Bitiş zamanı: saniye Toplam süre: saat Akım : 6 V/cm² 165 ma, 14 C Vuruş Açısı: 120 Cihaz: CHEF DR II (Biorad)

60 Karşılaşılabilecek sorunlar A. baumannii ,11,14. örnekler yanlış tanımlanmış.

61 Karşılaşılabilecek sorunlar Bakteri yoğunlukları iyi ayarlanmamış Bakteri yoğunlukları iyi ayarlanmamış ve kalıplar hasar görmüş

62 Karşılaşılabilecek sorunlar

63 Karşılaşılabilecek sorunlar

64 Karşılaşılabilecek sorunlar Elektroforez sırasında kullanılan tampon ve uygulanan akımın şiddetinde problem. su/elektroforez tamponu problemli Başlangıç vuruş: 1 sn Son vuruş: 30 sn Elektroforez süresi: 22 saat 6V/cm2 135 ma ph= 8 Başlangıç vuruş: 1 sn Son vuruş: 30 sn Elektroforez süresi: 22 saat 6V/cm2 150 ma ph= 8

65 Sonuçların analizi ve yorumlanması

66 Sonuçların analizi ve yorumlanması İlk defa Tenover ve arkadaşları 1995 yılında PFGE sonuçlarının yorumlanması için belirli kriterler önermişlerdir. bant farklı olanlar muhtemel ilişkili aynı sayıda ve büyüklükte içeren izolatlar aynı 2-3 farkı olanlar ilişkili 74-6 veya daha fazla bant yakın farkıbant olanlar ilişkisiz

67 Sonuçların analizi ve yorumlanması Bu kriterler özellikle hastane enfeksiyonları için, sınırlı bir sürede (1-3 ay) gerçekleşen salgınlar için geliştirilmiştir. Bir yıl ve daha uzun süreyi içeren, geniş kapsamlı çalışmalar için uygun değildir. Durmaz R. Pulsed-field gel electrophoresis. In: Durmaz R, eds. Uygulamalı moleküler mikrobiyoloji kitabı, 2. baskı, Ankara: Nobel Kitap Evi, 2001:

68 Sonuçların analizi ve yorumlanması Tenover ve arkadaşları PFGE sonuçlarını etkileyecek mutasyonların önemini ve tiplendirme sonuçlarına etkisini de vurgulamışlardır. - Tek bir genetik olay----->izolatlar aynı - İki genetik olay-----> muhtemel ilişkili - Üç veya daha fazla genetik olay-----> ilişkisiz İnsersiyonlar Delesyonlar Yeniden düzenlenmeler ve tek baz değişiklikleri PFGE paternlerini etkileyebilecek genetik olaylardır. Goering RV. Pulsed-field gel electrophoresis. In: Persing DH, Tenover FC, Versalovic J, Tang Y-W, Unger ER, Relman DA, White TJ, eds. Molecular Microbiology: Diagnostic Principles and Practice. Washington, D.C: ASM Pres, 2004;

69 Sonuçların analizi ve yorumlanması Nokta mutasyonlar-yeniden düzenlenmeler. Kromozom üzerinde bu şekilde gerçekleşecek minör değişiklikler PFGE profiline yansımayacaktır RE RE salgın izolatı RE Bir genetik olay bant farkı yok RE RE Bakteri kromozomu

70 Sonuçların analizi ve yorumlanması Nokta mutasyonlar-yeniden düzenlenmeler. Bu nedenle, tiplendirilen izolatlar arasında bant farkı olmadığında; aynı (identical) değil, ayırt edilemez (indistinguishable) olarak adlandırılmalıdır.

71 Sonuçların analizi ve yorumlanması Delesyon salgın izolatı Bir genetik olay bir bant farkı

72 Sonuçların analizi ve yorumlanması Insersiyon salgın izolatı Bir genetik olay İki bant farkı

73 Sonuçların analizi ve yorumlanması Insersiyon salgın izolatı Bir genetik olay üç bant farkı

74 Sonuçların analizi ve yorumlanması Insersiyon salgın izolatı Bir genetik olay dört bant farkı

75 Sonuçların analizi ve yorumlanması Bu yaklaşıma göre; gerçekleşecek bir mutasyonel olay kesim bölgelerini etkileyerek iki izolat arasında 0 4 bant farklılığına yol açabilir. Yani buna göre iki mutasyonel olay 2 8 arası bant farkı oluşturabilir.

76 Sonuçların analizi ve yorumlanması Tenover kriterlerine göre 4 bant farkına sahip izolatlar olası ilişkili olarak kabul edilmektedir. Oysa oluşan 4 bant farkı 4 genetik olay sonucu gerçekleşmiş olabilir. 5-8 bant farklılığı en az 2 genetik olay sonucunda oluşabilir ve bu durumdaki suşların da alttip olarak ifade edilmeleri gerekir. Bu durumda 9 veya daha fazla bant farklılığı olan suşlar ise ilişkisiz olarak tanımlanabilir.

77 Sonuçların analizi ve yorumlanması Bu nedenle iki izolat arasındaki bant farklılığının üç ile sınırlandırmanın (üç bant kuralı) en iyi sonucu vereceğini bildiren yayınlar vardır. Goering RV. Pulsed-field gel electrophoresis. In: Persing DH, Tenover FC, Versalovic J, Tang Y-W, Unger ER, Relman DA, White TJ, eds. Molecular Microbiology: Diagnostic Principles and Practice. Washington, D.C: ASM Pres, 2004;

78 Sonuçların analizi ve yorumlanması Daha net bir değerlendirme yapabilmek için türlerin mikro çevresel baskılar altındaki mutasyon oranının bilinmesi önemlidir. van Belkum A, Tassios PT, Dijkshoorn L, et al. Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology. CMI 2007;13(Suppl. 3):1-46.

79 Sonuçların analizi ve yorumlanması Aşağıdaki öneriler izlenebilir; Bant farkı olmayan suşlar; salgın suşu 1-4 arası bant farklılığı; aynı tipin subtipi 5 bant farkı olan izolatlar; farklı tipler van Belkum A, Tassios PT, Dijkshoorn L, et al. Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology. CMI 2007;13(Suppl. 3):1-46.

80 Sonuçların analizi ve yorumlanması Moleküler epidemiyolojik çalışmalarda incelenen izolat sayısı artıkça bant profillerinin değerlendirilmesi için bilgisayar programlarına ihtiyaç duyulmaktadır.

81 Sonuçların analizi ve yorumlanması Bu amaçla en çok kullanılan bilgisayar programları; - Gel-Compar (Applied Maths, Kortfijk, Belgium) - Dendron (Solltech, Oakdale, Iowa) - Diversity Database Fingerprinting Software (Bio-Rad) - Gene Profiler (Scanlytics, Fairfaz, Va) - Phoretix 1-D (Nonlinear USA, Durham, N.C.) - Quantar Pro (KeyGene Producrts, Wageningen, Netherlands) - Taxotron (Taxolab, Institut Pasteur, Paris, France)

82 Sonuçların analizi ve yorumlanması

83 Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları

84 Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları Elde edilen fotoğrafların bilgisayar ortamına aktarılması ve işlenmesi analizin ilk basamağını oluşturur.

85 Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları

86 Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları Normalizasyon; elektroforez ile aynı büyülükte DNA parçalarının, aynı sürede eşit yol almaları beklenmektedir.

87 Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları Normalizasyon

88 Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları Bantların işaretlenmesi

89 Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları Bantların işaretlenmesi

90 Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları İzolatlar arasındaki ilişkilerin değerlendirilmesi

91 Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları İzolatlar arasındaki ilişkilerin değerlendirilmesi Sıklıkla «Dice benzerlik katsayısı» kullanılmaktadır. Benzerlik katsayısı hesaplanırken bant ve profil toleransı, en fazla %1 1.5 olarak belirlenmelidir.

93 Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları İzolatlar arasındaki ilişkilerin değerlendirilmesi dendogramlarının oluşturulması için; - UPGMA (unweighted pair group method with arithmeti caveraging) - neighbor joining gibi analiz alogaritmaları kullanılabilir.

95 Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları İzolatlar arasındaki ilişkilerin değerlendirilmesi benzerlik derecesinin eşik değerine (cut-off similarity level) önceden karar vermek ve çalışmanın tamamında aynı eşik değerini kullanmak gereklidir. Suş no toplam 24 suşun 17 tanesi bir küme içinde yer almakta kümeleşme oranı %71 genotip farklı farklı SI SI SI farklı SII SIIb SIII SIIIa SIIIb farklı farklı SIV SIVb SV SV SV SV SV SV SVa farklı farklı

96 Analiz programlarının sonuçları her zaman çıplak gözle konfirme edilmelidir.

97 Moleküler tiplendirme sonuçları, epidemiyolojik araştırmaların bir parçasıdır ve ancak klasik epidemiyolojik veriler varlığında değerlidir.