Hastane infeksiyonlar nda moleküler biyolojik. Hastane nfeksiyonu Salg n nda Moleküler Biyolojik Yöntemler

Transkript

1 Hastane nfeksiyonlar Dergisi 2005; 9: Hastane İnfeksiyonları Hastane nfeksiyonu Salg n nda Moleküler Biyolojik Yöntemler Dr. R za DURMAZ* * nönü Üniversitesi T p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal, Malatya. Hastane infeksiyonlar nda moleküler biyolojik yöntemler gibi oldukça önemli ve kapsaml olan konunun ele al nd bu yaz bafll ca iki bafll k alt nda sunulacakt r. lk bölümde hastane infeksiyonu salg nlar nda moleküler biyolojik yöntemlerin yararlar, ikinci bölümde ise moleküler tiplemede kullan lan majör yöntemlerin prensip, avantaj ve dezavantajlar hakk nda bilgi verilecektir. Moleküler yöntemlerin hastane infeksiyonuna sebep olan etkenin k sa sürede gösterilmesi, tan mlanmas, belirli antibiyotiklere karfl direnç profillerinin belirlenmesi ve patogenezden sorumlu genlerin araflt r lmas ndaki katk lar bu yaz n n kapsam d fl nda tutulmufltur. Neden Moleküler Biyolojik Yöntem? Mikroorganizmalar n izolasyonu, tan mlanmas ve kökenler aras ndaki iliflkinin belirlenmesi infeksiyon hastal klar n n epidemiyolojisi, çevre ve endüstriyel mikrobiyoloji ve dolay s yla mikrobiyal ekolojik çal flmalarda oldukça önemlidir. DNA parmak izi oluflturmay hedefleyen moleküler tipleme yöntemleriyle epidemiyolojik olarak iliflkili, ayn tür içindeki izolatlar n genetik olarak da iliflkili olup olmad klar araflt r lmaktad r. zolatlar ayn m, farkl m sorusuna yan t aranmaktad r. Genel olarak epidemiyolojik yönden iliflkili izolatlar klonal olarak da iliflkili olup, ortak bir kaynaktan köken al r (1). Klonal iliflkinin ortaya konulmas yla epidemik izolatlar, sporadik veya endemik olanlardan ayr lmakta; salg nla iliflkili sufllar belirlenmekte; salg n n kapsam, kaynak ve rezervuar hakk nda bilgi edinilebilmekte; halk sa l kontrolünde kullanmak üzere ulusal ve uluslararas salg nlar n veri bankalar oluflturulabilmekte, herhangi bir yer ve zaman içindeki infeksiyonun özellikleri (lokal infeksiyonun reaktivasyonu veya yeni bir infeksiyonun kümeleflmesi gibi) tan mlanabilmektedir (2). Bu bilgiler, hastanelerde ve toplumda infeksiyonun yay lmas n anlamak ve kontrol alt na almada yararl olmakta, bunun sonucu olarak infeksiyon kontrol stratejilerinin etkinli i art r labilmektedir (3,4). Moleküler tiplemenin infeksiyon hastal klar nda en fazla gerekli oldu u alan, hastane infeksiyonlar n n irdelenmesidir. Moleküler tipleme yöntemleriyle salg nlar n kayna ve yay lma yollar hakk ndaki hipotezler sorgulanmaktad r. Salg n n özellikleri belirlenerek, kimin nerede, ne zaman, ne ile ve nas l etkilendi i, bulafl yollar, potansiyel kaynak ve vektörlerin tan m yap labilir (5,6). Endojen ve ekzojen kaynakl infeksiyonlar ay rt edilebilir. Moleküler tipleme yöntemleriyle patojen bakterilerin hastane ortam nda yayg nl k dereceleri ve kal fl süreleri araflt r labilir. 196

2 Hastane nfeksiyonu Salg n nda Moleküler Biyolojik Yöntemler Durmaz R. Birçok kiflinin hasta veya kolonize oldu u salg nlar ço unlukla yatak say s n n fazla oldu u klinikler, yo un bak m ve yenido an ünitelerinde görülmektedir. Bu tip salg nlar k sa süre içinde oluflur. S kl kla ayn klinik içindeki hastalar etkiler. Böyle durumlarda infeksiyonun kayna n araflt rmak önemlidir. Benzer fenotipik karaktere sahip nozokomiyal patojenlerin izolasyonundaki art fl, araflt rmac lar izolatlar aras nda ayn ve farkl olanlar n ayr m n yapabilecek etkin alt tipleme yöntemlerini kullanmaya yöneltir. Genelde ortak kaynaktan gelen salg nlar, tan ve tedavi amac yla kullan lan steril olmayan aletlerle (solunum yolu gereçleri, kateterler, endoskoplar) iliflkilidir. Sa l k personellerinin elleriyle ve nadiren direkt temas yoluyla da yay lma olmaktad r. Moleküler tipleme yöntemleriyle ayn klinikteki farkl hastalar n izolatlar veya birçok klini i ilgilendiren salg n izolatlar, hastane çevresi ve sa l k personellerinin ellerinden üretilen izolatlar n DNA parmak izleriyle karfl laflt r larak bulafl n kayna saptanmaktad r (7). Mikroorganizmalar n moleküler tiplemesi, hastanelerdeki kapsaml bir infeksiyon kontrol program n n temel komponentlerinden biri olmal d r. Bu tip bir infeksiyon kontrol program ; epidemiyoloji ve klinik mikrobiyoloji laboratuvar na dayal aktif sürveyans kullanarak, belirli bir patojenin oluflturdu u infeksiyonlar n kümeleflmesini tan mlar. Sonra uygun tipleme yöntemlerinden birini kullanarak izolatlar aras ndaki klonal iliflkiyi ortaya koyar. Uygun epidemiyolojik ve moleküler verilere dayanarak, infeksiyonu önleme stratejisi gelifltirilir. Moleküler tipleme, bir epidemiyi k salt p önleyebilir, hastane infeksiyonlar n n maliyet ve s kl n azaltabilir (4). Amerika Birleflik Devletleri (ABD) nde moleküler tipleme yönteminin dahil edildi i entegre bir infeksiyon kontrol program n n hastane infeksiyonu oran na etkileri araflt r lm fl, hastane infeksiyonu oran her 1000 hasta günü için %10 dan daha fazla azalm fl, iki y lda 4 milyon dolardan fazla ekonomik kazanç elde edilmifltir (8). Moleküler tipleme sonucunda etkili infeksiyon kontrol program n n uygulanabilmesi için laboratuvar, klinik ve hemflirelik baflta olmak üzere birçok disiplinin ifl birli i halinde çal flmas na gerek vard r. Oluflturulan bu tak m koordineli bir biçimde çal flmal, sürekli geri bildirimler almal, uygulanmakta olan hijyen koflullar n de erlendirmeli ve e itim programlar düzenlemelidir. Laboratuvar, salg na neden olan etkeni tan mlamal, hastane personeli ve çevreden tarama kültürleri yaparak arka arkaya izole edilen benzer izolatlar n ayn sufl olup olmad n incelemeli ve infeksiyon kontrol komitesini, yayg n bir patojen içindeki gruplanmadan haberdar etmelidir. Haftal k toplant larla durum de erlendirmesi yap larak, toplum, sa l k personeli ve hastalar n e itimi, fiziksel bariyer, daha etkin antisepsi ve dezenfeksiyon uygulanmas için gerekli önlemler al nmal d r. Bilgilerin infeksiyon kontrol prati inde etkin kullan lmas sa lanmal d r. Hastane infeksiyonu kontrol önlemlerinin baflar s, oluflturulan bu tak m n ortak kararlar almalar ve iyi bir iletiflim kurabilmelerine ba l d r. Hangi Moleküler Biyolojik Yöntem? Salg nlar n de erlendirilmesinde olgular aras ndaki iliflkinin do ru biçimde ortaya konulmas önemlidir. Yeterli epidemiyolojik veri varl nda seçilecek en uygun alt tipleme yöntemiyle salg na neden olan izolatlar n birbiriyle iliflkileri araflt r lmal d r. Alt tipleme veya sufl klasifikasyonu olarak ifade edilen tiplemede baz fenotipik ve genotipik özelliklerden yararlan lmaktad r. Tiplendirmede kullan lan fenotipik yöntemlerin bafll calar ; 1. Biyotiplendirme, 2. Serotiplendirme, 3. Bakteriyofaj tiplendirmesi, 4. Bakteriyosin tiplendirmesi, 5. Antibiyotiklere duyarl l k profili, 6. Protein bazl yöntemlerdir. Bakteriyofaj tiplendirmesi Staphylococcus aureus, serotiplendirme ise Salmonella türleriyle ilgili epidemiyolojik çal flmalarda hala yararl yöntemlerdir (3). Ancak daha fazla bakteri türünün tiplendirilmesinde kullan labilecek metotlara ihtiyaç vard r. Ayr ca, fenotipik yöntemler, ifl yükü fazla, uzun zaman alan, ço unlukla de iflken sonuçlar veren yöntemlerdir (7). Bu durum araflt rmac lar, ayr m gücü daha yüksek olan genotipleme yöntemlerini kullanmaya yöneltmifltir. Moleküler tipleme yöntemlerinin ilk jenerasyonu plazmid profilinin belirlenmesidir. Bakterilerde bulunan plazmidlerin say ve molekül a rl klar ndaki benzerlikler araflt r lmaktad r. Bu metotta öncelikle her bir izolat n plazmid(leri)i elde edilerek agaroz jelde göç ettirilmekte ve daha sonra ortaya ç kan plazmidlerin say ve bü- Hastane nfeksiyonlar Dergisi 2005; 9: 4 197

3 Durmaz R. Hastane nfeksiyonu Salg n nda Moleküler Biyolojik Yöntemler yüklükleri karfl laflt r lmaktad r. Ayr ca, plazmid DNA s n n restriksiyon endonükleaz (RE) enzimle kesimi ve oluflan DNA parçalar n n agaroz jel elektroforezinde ayr flt r lmas yap lmaktad r. Yöntemin dezavantaj, hiç plazmid içermeyen ya da bir veya iki plazmid içeren izolatlarda ayr m gücünün düflük olmas d r. Yöntemde karfl lafl labilecek öncelikli problemlerden biri de, plazmidlerin ekstrakromozomal genetik eleman olmalar nedeniyle kolayca kaybedilebilmeleri veya bakterinin yeni bir plazmidle infekte olmas - d r. Tekni in avantaj ise sadece elektroforez yap lan malzemenin gerekli olmas d r. Bu nedenle, plazmid profil analizi zaman ve yer s n rlamas olan çal flmalarda tercih edilmektedir. Bir hastane ya da serviste antibiyotiklere dirençli izolatlar n yayg nl k derecesini belirlemek ve belirli bir periyodda hastanedeki epidemik-endemik sufllar n ayr m n yapmak amac yla kullan labilir (9). Özellikle nozokomiyal patojen olan bakterilerin ço unun tiplendirilmesinde en iyi yöntemler kromozomal DNA polimorfizmine dayal olanlard r. Ribotipleme, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCR- RFLP), repetitive extragenic palindromic element-pcr (rep-pcr), random amplified polymorphic DNA (RAPD), amplified ribozomal DNA restriction analysis (ARDRA) ve amplified fragment length polymorphism (AFLP) yayg n olarak kullan lan kromozomal DNA bazl tipleme yöntemleridir (10-17). Restriction fragment length polymorphism (RFLP): Yöntemde mikroorganizmalar n yo un kültürlerinden elde edilen veya moleküler yöntemlerle ço alt lan kromozomal DNA, uygun RE enzimle kesildikten sonra agaroz elektroforeziyle DNA parçalar n n ayr flt r lmas sa lanmaktad r. Yöntem, tekrarlanabilirli i yüksek, kolay, h zl ve ucuzdur. Fakat RE enziminin kromozomal DNA da çok say da kesim yapmas sonucu oluflan fazla say daki bantlar n n de erlendirilmesinde s k nt lar vard r. Bu s k nt lar aflmak için oluflan bantlar n belirli bir k sm yla hibridizasyona girebilecek problardan yararlan lmaktad r. Bunun için agarozdaki DNA parçalar - n n denatüre edilmesi, naylon membrana aktar lmas ve iflaretli problarla hibridizasyonu yap lmaktad r. Probla hibridize olan DNA parçalar n n oluflturdu u bant profili de erlendirilmektedir (9,18). Virülans genleri (Pseudomanos aeruginosa da ekzotoksin A geni), çoklu elementler (Mycobacterium tuberculosis tiplemesinde insertion sequences=is6110 RFLP ve transpozonlar), rrna veya rdna (ribotipleme) prob olarak kullan lan moleküllerden baz lar d r. Ribozomal DNA RFLP analizi (ribotipleme): Bakteriyel genom polimorfizminin Southern-blot analizi ile gösterilmesinin en yayg n kullan m fleklidir. Tekrarlanabilirlik ve stabilitesi iyi olan bir metottur. Ayr m gücü orta seviyededir. Her tür için uygun enzimler seçilmeli ve iki ya da üç enzimin kullan lmas yla ay rt edicilik artt r lmal - d r. Zaman al c ve oyalay c d r. Hibridizasyonu zay f olan bantlar n yorumlanmas nda genel kabul görmüfl kurallar ve optimal prosedür hakk nda ortak bir fikir birli i yoktur. 16S ve 23S rrna y kodlayan genleri k smen ya da tamamen içeren genomik DNA restriksiyon fragmentlerinin analizidir. Türler aras nda ribozomal RNA n n alt birimlerini kodlayan genler bakteri kromozomu boyunca da lmaktad r ve bunlar n aras ndaki DNA dizilimleri farkl uzunluklarda olabilmektedir. Endonükleaz enzimlerle kromozomal DNA n n kesilmesi sonucunda oluflan parçalar ribozomal RNA probuyla hibridizasyona sokuldu unda, kökene özgü DNA bant profilleri elde edilmektedir. rrna y kodlayan genler çok korunmufl oldu undan tek bir probla (16S ve 23S rrna Escherichia coli - üniversal prob) tüm bakterilerin alt tiplemesi yap labilmektedir. Ayr ca, bakterilerin ço u çok say da ribozomal operon içerdi inden elde edilen fragmentler türler içi ve türler aras ayr ma yetecek say dad r. Bu yöntem yayg n olarak P. aeruginosa, Acinetobacter spp., Neisseria meningitidis ve Enterobacteriaceae üyeleri gibi birçok gram-negatif bakterinin tiplemesinde kullan lmakla birlikte, Enterococcus spp., Streptococcus pyogenes, S. aureus gibi gram-pozitif bakteriler için de kullan lmaktad r. Fakat bu yöntem Mycoplasma türleri ve mikobakteriler gibi yaln zca bir veya iki ribozomal RNA (rrn) lokusu bulunduran baz bakterilerin tiplemesinde faydal olmayabilir (9,19). PCR bazl ribotipleme: 16S-23S ribozomal RNA genleri aras ndaki boflluklar n ( intergenic spacer bölgelerinin) PCR ile ço alt lmas sonucu oluflan DNA parçac klar n n, jel elektroforezinde ayr flt r lmas sonucu oluflan bant profillerinin analizidir. PFGE den daha az ayr m gücüne sahip olmakla birlikte, kolay ve h zl olmas ve 198 Hastane nfeksiyonlar Dergisi 2005; 9: 4

4 Hastane nfeksiyonu Salg n nda Moleküler Biyolojik Yöntemler Durmaz R. Clostridium difficile sufllar n n tiplemesinde kullan - lan geçerli bir alternatif metottur (9). PFGE: Agaroz içine gömülü haldeki bakteri ve ökaryotik hücrelerden yap sal bütünlü ü bozulmadan izole edilen kromozomun, restriksiyon enzim profilinin belirlenmesi esas na dayan r. Geleneksel agaroz jel elektroforezde kilobaz (kb) dan daha büyük DNA parçalar etkili olarak göç edememektedir. Büyük parçalar n yürütülmesi, ak m oryantasyonunun periyodik bir flekilde de ifltirilmesiyle (pulsed-field gel electrophoresis) mümkün olabilmektedir. PFGE de belirli aral klarla elektrik ak m n n yönü de ifltirilerek; RE enzimle kesilmifl kromozomal DNA dan oluflan kb aras nda uzunlu a sahip parçalar, etkin bir flekilde göç ettirilmekte ve bunun neticesinde yaklafl k 5-20 kadar, farkl büyüklükte DNA bant profili ortaya ç kmaktad r (9). Yöntemde; DNA izolasyonu ve restriksiyon enzimi ile kesim ifllemleri agaroz kal plar içinde yap lmakta, daha sonra içinde kesime u rat lm fl DNA parçalar bulunan kal plar, elektroforez uygulanacak agaroz içindeki uygun çukurlara yerlefltirilerek belirli aral klarla yönü de ifltirilen elektrik ak m na tabi tutulmaktad r. Halen birçok gram-pozitif ve gram-negatif bakteri ve mayalar n tiplendirilmesinde alt n standart olarak kabul edilmektedir. Di er yöntemlerle k yasland nda ayr m gücü onlara eflit veya daha fazlad r. Zaman al c, laboratuvar n kurulmas pahal d r. Ancak üstün adaptasyon kolayl, tekrarlanabilirli i ve ayr m gücü nedenleriyle majör nozokomiyal patojenlerin ve baz toplum kaynakl patojenlerin tiplendirilmesinde geçerli olan bir tipleme yöntemidir (20). PCR bazl tipleme yöntemleri: PCR bazl tipleme yöntemleri k sa süre içinde geliflen salg nlarda baflar yla uygulanabilmektedir. Ancak uzun zaman periyodunda izole edilen sufllar n tiplendirilmesinde bu yöntemlerin stabilitesi ve etkinli i hakk ndaki bilgiler s n rl d r. PCR-RFLP, repetitive extragenic palindromic element (REP)- PCR, enterobacterial repetitive intergenic consensus elements (ERIC)-PCR, random amplified polymorphic DNA (RAPD), arbitrarily primed (AP)-PCR, DNA amplification fingerprining (DAF), single strand confirmation polymorphism (SSCP), amplified fragment lenght polymorphism (AFLP) genotiplendirmede kullan lan bafll ca PCR bazl metotlard r (7,21). AP-PCR, RAPD ve DAF tipleme yöntemleri: Bu tipleme yöntemlerinde hedefe ba l kal nmadan, rastgele seçilmifl, k sa primerler kullan - larak, agaroz jel elektroforezinde farkl bant profilleri oluflturabilecek, de iflik uzunluklarda DNA amplifikasyon ürünleri elde edilmektedir. Uygulama kolayl, k sa sürede sonuç verebilme özellikleri ve nispeten ucuz olmalar ndan dolay yayg n kullan m alan bulan bu yöntemlerin en önemli dezavantaj henüz standardizasyonun sa lanamam fl olmas d r. Ayr m gücü primerlerin baz dizilimi ve amplifikasyon koflullar na göre de iflmektedir. Patern farkl l n n yorumlanmas nda kabul görmüfl bir kural yoktur. Laboratuvar içi ve laboratuvarlar aras tekrarlanabilirlik oran yüksek de ildir. Bu sorunlar gidermek için kullan lan hedef DNA ekstraksiyon protokolü, DNA konsantrasyonu, primerlerin baz dizilimi ve konsantrasyonu, MgCl 2 konsantrasyonu, tampon ve Taq DNA polimeraz enziminin çal flma süresince sabit tutulmas gerekmektedir. Laboratuvarlar aras standardizasyonu sa lamak için, M13 olarak bilinen üniversal primerin kullan lmas ; sonuçlar n güvenilirli ini artt rmak için standardize edilmifl amplifikasyon kar fl m, ayn thermalcycler da standart bir amplifikasyon protokolüyle uygulanmal, tüm salg n izolatlar ayn anda çal fl lmal d r (21). AP-PCR yönteminin bakterileri tiplemede tarama testi olarak kullan labilece i, bu yöntemle iliflkisiz bulunan kökenlerin ileri bir tipleme yöntemine gerek olmad, ancak iliflkili bulunan kökenler aras ndaki klonal iliflkinin PFGE gibi ayr m gücü daha iyi olan bir tipleme yöntemiyle tekrardan test edilmelerinin gereklili i vurgulanm flt r (22). Tekrarlayan DNA dizilerine dayal PCR (rep- PCR) tiplemesi: rep-pcr tipleme yönteminde; ço u bakterinin genomu boyunca da l m gösteren tekrarlanan DNA dizilimlerine komplementer olan primerler kullan larak tekrarlar aras nda kalan DNA dizilimlerinin amplifikasyonu yap lmaktad r. Sufllar aras nda tekrar elementlerinin say s ve lokalizasyon fark moleküler tipleme için gerekli olan tipe özgü bant profilini oluflturmaktad r. Tekrarlayan dizilimlerin üç grubu tan mlanm flt r. Bunlar; REP dizilimler, ERIC dizilimler ve S. pneumoniae n n BOX elementidir. rep-pcr; kültürden oldu u gibi direkt klinik örneklerden yap lan DNA ekstraksiyon ürünleriyle de çal fl labilir. Tekrarlanan elementlerin dizilimlerin ve kul- Hastane nfeksiyonlar Dergisi 2005; 9: 4 199

5 Durmaz R. Hastane nfeksiyonu Salg n nda Moleküler Biyolojik Yöntemler lan lacak primerlerin baz diziliminin bilinmesi zorunlu de ildir. S kl kla tek bir primer seti kullan larak gram-negatif ve gram-pozitif birçok bakteride tiplendirmeyi sa layacak yeterlikte bant profili oluflturulmaktad r. S kl kla BOX primerleri seçilmektedir. REP primerlerinin oluflturdu u bant profilleri yeterli düzeyde kompleks de il, ERIC primer seti ise PCR koflullar ndan fazlaca etkilenmektedir. Bu üçlü tekrarlayan bölgenin primerleri kombine halde de kullan lmaktad r. rep- PCR, AFLP gibi moleküler tipleme yoluyla sufllar aras ndaki iliflkiyi ortaya ç karmada en s k kullan lan PCR bazl tipleme yöntemlerindendir. rep- PCR tipleme kolay uygulanabilmesi, çok say da izolat ile çal fl labilmesi ve ay rt edicili inin yüksek olmas nedeniyle bakteriyel popülasyonlar n filogenetik yap lar ve taksonomik farkl l klar n belirlemede de kullan labilmektedir (21). Amplified fragment length polymorphism (AFLP) : Bu yöntem, selective restriction fragment amplification (SRFA) olarak da bilinir. Genomik DNA n n genellikle iki restriksiyon enzimi ile kesimi sonucu oluflan DNA parçalar n n bir grubunun selektif amplifikasyonu esas na dayan r. Restriksiyon için çeflitli enzimler seçilebilir. Fakat ço unlukla EcoRI-MseI kombinasyonu kullan lmaktad r. DNA konsantrasyonu ve safl k derecesi test performans n etkileyen iki ana faktördür. Yöntem yüksek ayr m gücüne sahiptir. Radyoaktif madde veya floresans veren maddeler kullan l r ve pahal olan DNA dizilim cihaz gerektirir. Di er PCR bazl tipleme yöntemlerinde oldu u gibi çevresel DNA kontaminasyonu ve konak DNA s n n amplifikasyon tüpüne kar flmas na ba l olarak zemin kirlili i (background contamination) oluflabilir. Bu durum sonuçlar n yorumlanmas nda s k nt oluflturur. Önemli avantaj DNA virüsleri, bütün bakteriler ve ökaryotik hücreler için ortak bir protokol kullan lmas d r. Hedef organizman n baz diziliminin bilinmesine gerek yoktur (21). Ampisiline dirençli enterokoklar, Legionella pneumophila serogroup 1 ve Bacillus anthracis gibi birçok bakterinin tiplemesinde kullan lmaktad r (23,25). Floresanla kombine edilmifl olan uygulamas gelecek için umut vermektedir. Di er PCR bazl tipleme metotlar ribozomal operonlar n spesifik k s mlar n hedef almaktad r. Bunlar; 16S veya küçük-alt birim ribozomal DNA (rdna) amplifikasyonunu takiben restriksiyon enzimleriyle kesimi (ARDRA) ve inter-rrna veya inter-16s-23s rrna gen bölgelerinin amplifikasyonuna dayal parmak izi ç karma (trna- PCR veya ITS) yöntemleridir. Ayr ca, amplifiye rdna veya di er DNA fragmentleri spesifik elektroforez koflullar nda ayr flt r larak mikroorganizmalar n tiplemesi yap labilir. Singe-stranded conformation polymorphism (SSCP) analizi ve s cakl k veya denatüre gradient jel elektroforezi (TGGE veya DGGE) bu tip tipleme yöntemlerindendir (21). Multilocus sequence typing (MLST) : Geleneksel multilokus enzim elektroforezinin genom bazl versiyonudur y l nda tan mlanan yöntemde; nükleotid dizi analizi ile birkaç temel metabolik fonksiyonu kodlayan genin (housekeeping gene) allelleri araflt r lmaktad r. Yöntem; genellikle yedi tane housekeeping genin (lokusun) aras nda kalan gen parçalar n n (internal fragments) PCR ile ço alt lmas ve dizi analizlerinin ç kar lmas aflamalar ndan oluflmaktad r. Allel profili veya sufla özgü karakteri oluflturmak için, her bir lokus için, her farkl dizilim, farkl bir allel numaras yla gösterilir. Böylece yedi lokustaki allel numaralar oluflturulur. Her bir özgü allel kombinasyonu suflun dizi tipini belirler. Birbirleriyle iliflkisiz iki suflun ayn allellik profili oluflturma olas l oldukça düflüktür. Bu nedenle MLST yönteminin ayr m gücü oldukça yüksektir. Bu yöntemin avantaj kültüre gerek duymamas (direkt klinik örnekten çal fl labilmekte) ve dizi analiz verilerinin aç k, standardizasyonu kolay ve elektronik olarak saklanabilmesidir. Farkl laboratuvarlar ve co rafi bölgelerden elde edilen izolatlar n karfl laflt rmalar nda bir referans yöntem olarak kullan lmaktad r. Global epidemiyolojide ideal bir yöntem oldu u gibi, salg nlar ve k sa süreli epidemilerin de erlendirilmesinde de faydal bilgiler sa lamaktad r (26). Dezavantaj yo un laboratuvar çal flmas gerektirmekte ve ço unlukla referans veya araflt rma laboratuvarlar nda uygulanabilmektedir. Campylobacter jejuni, S. aureus, Enterococcus faecium ve Acinetobacter baumannii gibi birçok patojenin moleküler tiplemesinde denenmektedir (26-28). High-density DNA array ve DNA chips : DNA chip ve DNA array teknolojisinin geliflmesiyle gelecekte mikrobiyal genom daha ayr nt l olarak çal fl labilecektir. Bu yöntemlerle mikroorganizmalar n varl n n gösterilmesi, tan mlanmas ve tiplendirilmesi yan nda antibiyotiklere direnç profillerinin belirlenmesi ve virülans fak- 200 Hastane nfeksiyonlar Dergisi 2005; 9: 4

6 Hastane nfeksiyonu Salg n nda Moleküler Biyolojik Yöntemler Durmaz R. törleri efl zamanl olarak araflt r labilecek duruma gelecektir. fiimdilik pahal olmas nedeniyle s n rl say da mikroorganizma (mikobakteriler, Helicobacter pylori, mantarlar gibi) için uygulanm fl ve güvenilir sonuçlar vermifltir. Sonuç Geçen 10 y l aflan sürede moleküler biyolojideki geliflmeler, onlarca DNA bazl tipleme tekni inin infeksiyon hastal klar n n epidemiyolojisinde kullan ma girmesi sonucunu do urmufltur. Çok say da yöntemin h zla uygulamaya sokulmas ne yaz k ki, her birinin yeteri kadar birbirleriyle k yaslamal çal fl lmas flans n zora sokmufltur. Bugün her koflulda her mikroorganizman n tiplendirilmesinde kullan labilecek ideal bir yöntem yoktur. Moleküler yöntemleri kullanacak olan araflt rmac lar, laboratuvar ve klinik çal flmalar n her ikisinin de beklentilerini karfl layacak uygulanabilir yöntem(ler)i seçmek durumundad r. Uygulanacak yöntemlerin seçilmesinde flu özellikler dikkate al nmal d r: 1. Yöntem mümkün oldu unca genifl mikroorganizma grubuna uygulanabilmeli, 2. Yüksek ayr m gücü ve tekrarlanabilir özelliklere sahip olmal, 3. Sonuçlar kolayca yorumlanabilir olmal, 4. Kurulmas ve uygulanmas kolay olmal, 5. Kullan lan alet ve çözeltileri ucuz olmal d r (22). Tiplendirmede kullan lan tekni in güvenilir oldu unu söylemek için epidemiyolojik olarak iliflkisiz izolatlar n özgü, iliflkili olanlar n ise ayn ya da nadiren yak n profil oluflturdu u gösterilmelidir. Ayr m gücü ve tekrarlanabilirlik, bir tiplendirme sistemi için en önemli niteliklerdir (29). Bu kriterlerin tamam n karfl layacak tek bir yöntem olmad için sistemlerin kombinasyonunu kullanmak gerekli bir kural gibidir (15-17). Moleküler tiplemede do ru de erlendirme yap labilmesi için tipleme sonuçlar klasik epidemiyolojik bilgiler ve klinik verilerle birlikte de- erlendirilmelidir. Ço u DNA bazl tipleme yöntemleri, dikkatli bir epidemiyolojik araflt rma varl nda, hastane infeksiyonlar n n araflt r lmas nda kullan labilir. Ancak, epidemiyolojik bilgi yoklu unda, en güçlü ve sofistike tiplendirme metodu bile uyumsuz ve yan lt c bilgi verir (4). Söylenebilecek son söz, hangi moleküler tipleme yöntem(ler)i kullan l rsa kullan ls n, hiçbiri klasik epidemiyolojik verilerin yerini alamam flt r, epidemiyolojik veriler olmadan moleküler tipleme yapman n bir anlam yoktur. KAYNAKLAR 1. Durmaz R. Moleküler epidemiyolojinin prensipleri. Durmaz R (editör). Uygulamal Moleküler Mikrobiyoloji. 2. Bask. stanbul: Nobel T p Kitabevleri, 2001: Wu F, Della-Latta P. Molecular typing strategies. Semin Perinatol 2002;26: Tompkins LC. Molecular epidemiology in infectious diseases. In: Gorbach SL, Bartlett JG, Blacklow NR (eds). Infectious Diseases. 2 nd ed. Philadelphia: WB Saunders Company, 1998: Pfaller MA. Molecular approaches to diagnosis and managing infectious diseases: Practicality and costs. Emerg Infect Dis 2001;7: Pfaller MA, Herwaldt LA. The clinical microbiology laboratory and infection control: Emerging pathogens, antimicrobial resistance, and new technology. Clin Infect Dis 1997;25: Tassios PT. Integration of molecular typing in nosocomial infection control-a Greek experience. Uzun M, Erturan Z, An Ö (editörler). Microbiologica Balcanica 2003, Proceedings and Abstract Book. stanbul: Balkan Society for Microbiology and Turkish Microbiological Society 2003: Soll DR, Lockhart SR, Pujol C. Laboratory procedures for the epidemiologic analysis of microorganims. In: Muray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology. 8 th ed. Washington DC: ASM Press, 2003: Hacek DM, Suriano T, Noskin GA, Kruszynski J, Reisberg B, Peterson LR. Medical and economic benefit of a comprehensive infection control program that includes routine detection of microbial clonality. Am J Clin Pathol 1999;111: Zaidi N, Konstantinou K. The role of molecular biology and nucleic acid technology in the study of human infection and epidemiology. Arch Pathol Lab Med 2003; 127: Swaminathan B, Matar GM. Molecular typing methods. In: Persing DH, Smith TF, Tenover FC, White TJ (eds). Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications. Washington DC: ASM Press, 1993: Köksal F. Moleküler biyolojik tiplendirme yöntemlerinin hastane infeksiyonlar nda kullan m. Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1999;3: Matsumoto C, Okuda J, Ishibashi M, et al. Pandemic spread of an O3:K6 clone of Vibrio parahaemolyticus and emergence of related strains evidenced by arbitrarily primed PCR and toxrs sequence analyses. J Clin Microbiol 2000;38: De La Puente-Redondo VA, Del Blanco NG, Gutierrez-Martin CB, Garcia-Pena FJ, Ferri EFR. Comparision of different PCR approaches for typing of Hastane nfeksiyonlar Dergisi 2005; 9: 4 201

7 Durmaz R. Hastane nfeksiyonu Salg n nda Moleküler Biyolojik Yöntemler Francisella tularensis strains. J Clin Microbiol 2000; 38: Sloos JH, Dijkshoorn L, Vogel L, van Boven CPA. Performance of phenotypic and genotypic methods to determine the clinical relevance of serial blood isolates of Staphylococcus epidermidis in patients with septicemia. J Clin Microbiol 2000; 38: Tenover FC, Arbeit R, Archer G, et al. Comparison of traditional and molecular methods of typing isolates of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1994;32: Preston MA, Johnson W, Khakhria R, Borczyk A. Epidemiologic subtyping of Escherichia coli serogroup O157 strains isolated in Ontario by phage typing and pulsed-field gel electrophoresis. J Clin Microbiol 2000;38: Shimizu A, Fujita M, Igarashi H, et al. Characterization of Staphylococcus aureus coagulase type VII isolates from staphylococcal food poisoning outbreaks ( ) in Tokyo, Japan, by pulsed-field gel electrophoresis. J Clin Microbiol 2000;38: Ya c A. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) ve polimeraz zincir reaksiyon (PZR) bazl tipleme yöntemleri. Durmaz R (editör). Uygulamal Moleküler Mikrobiyoloj. 2. Bask. stanbul: Nobel T p Kitabevleri, 2001: Pfaller MA, Hollis RJ. Automated ribotyping. In: Persing DH, Tenover FC, Versalovic J, Tang YW, Unger ER, Relman DA, White TJ (eds). Molecular Microbiology: Diagnostic Principles and Practice. Washington DC: ASM Press, 2004: Durmaz B, Durmaz R. Pulsed-field gel electrophoresis. Durmaz R (editör). Uygulamal Moleküler Mikrobiyoloji. 2. Bask. stanbul: Nobel T p Kitabevleri, 2001: Rademaker JLW, Savelkoul P. PCR amplificationbased microbial typing. In: Persing DH, Tenover FC, Versalovic J, Tang YW, Unger ER, Relman DA, White TJ (eds). Molecular Microbiology: Diagnostic Principles and Practice. Washington DC: ASM Press, 2004: Durmaz R, Durmaz B, Bayraktar M, et al. Prevalence of group a streptococcal carriers in asymptomatic children and clonal relatedness among isolates in Malatya, Turkey. J Clin Microbiol 2003;41: Jureen R, Harthug S, Sornes S, Digranes A, Willems RJ, Langeland N. Comparative analysis of amplified fragment length polymorphism and pulsed field gel electrophoresis in a hospital outbreak and subsequent endemicity of amphicillin-resistant Enterococcus faecium. FEMS Immunol Med Microbiol 2004;40: Fry NK, Afshar B, Visca P, et al. Assessment of fluorescent amplified fragment length polymorphism analysis for epidemiological genotyping of Legionella pneumophila serogroup1. Clin Microbiol Infect 2005;11: Ryu C, Lee K, Hawng HJ, Yoo CK, Seong WK, Oh HB. Molecular characterization of Korean Bacillus anthracis isolates by amplified fragment length polymorphism analysis and multilocus variablenumber tandem repeat analysis. Appl Environ Microbiol 2005;71: Hanage WP, Feil EJ, Brueggemann AB, Spratt BG. Multilocus sequence typing: Strain characterization, population biology, and patterns of evolutionary descent. In: Persing DH, Tenover FC, Versalovic J, Tang YW, Unger ER, Relman DA, White TJ (eds). Molecular Microbiology: Diagnostic Principles and Practice. Washington DC: ASM Press, 2004: Bartual SG, Seifert H, Hippler C, Luzon MA, Wisplinghoff H, Rodriguez-Valera F. Development of a multilocus sequence typing scheme for characterization of clinical isolates of Acinetobacter baumannii. J Clin Microbiol 2005;43: Vautor E, Jay C, Chevalier N, Visomblin N, Vernet G, Pepin M. Characterization of 26 isolates of Staphylococcus aureus, predominantly from dairy sheep, using four different techniques of molecular epidemiology. J Vet Diagn Invest 2005;17: Struelens MJ. Hospital infection control. In: Armstrong D, Cohen J, Berkley SF, et al (eds). Infectious Diseases. London: Mosby and Imprint of Harcourt Publishers Ltd, 1999;10:1-14. YAZIfiMA ADRES Prof. Dr. R za DURMAZ nönü Üniversitesi T p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal MALATYA Makalenin Gelifl Tarihi: Kabul Tarihi: Hastane nfeksiyonlar Dergisi 2005; 9: 4