Hacettepe Dişhekimliği Fakültesi Dergisi Cilt: 31, Sayı: 1, Sayfa: 19-24, 2007

Transkript

1 ARAŞTIRMA (Research) Hacettepe Dişhekimliği Fakültesi Dergisi Cilt: 31, Sayı: 1, Sayfa: 19-24, 2007 Periodontitisli Bireylerde Actinobacillus Actinomycetemcomitans in Tespitinde Kültür ve Direk İmmünofloresan Değerlendirme Yöntemlerinin Karşılaştırılması The Comparison of Culture and Direct Immunofluorescent Assay Methods in the Detection of Actinobacillus Actinomycetemcomitans in Periodontitis Patient *Dr. Gülçin AKCA, **Yrd.Doç.Dr.Diş Tbp. A.Eralp AKCA, ***Prof.Dr.Diş Tbp. Emel ÖKTE, *Prof.Dr. Nedim SULTAN *Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,**GATA Diş Hekimliği Bilimleri Merkezi Periodontoloji Anabilim Dalı ***Gazi Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Periodontoloji Anabilim Dalı ÖZET ABSTRACT Amaç: Periodontal hastalıkların etyolojisinde değişik bakteriler sorumlu tutulmaktadır. En önemli etkenlerden biri de Actinobacillus actinomycetemcomitans tır. Ancak bu bakteri varlığının gösterilmesinde altın standart olarak kabul edilen kültür yöntemi oldukça zor ve pahalı bir teknik olup deneyimli mikrobiyolog gerektirmektedir. Bu nedenle, laboratuvarların büyük çoğunluğunda yapılamamaktadır. Bu çalışmada DFD (direk immünfloresan değerlendirme) tekniğinin, bu yönteme bir alternatif olup olamayacağı değerlendirilmek istenmiştir. Gereç ve Yöntem: Bu çalışma, 48 periodontitisli diş bölgesinden elde edilen subgingival plak örneğinde, Actinobacillus actinomycetemcomitans tespitinde kültür ve direkt immünfloresan değerlendirme yöntemlerini karşılaştırmıştır. Bulgular: Kültür yöntemi ile 48 örnekten 23 ünde Actinobacillus actinomycetemcomitans tespit edilirken, DFD tekniği ile plak örneklerinin 28 inde Actinobacillus actinomycetemcomitans bulunmuştur. DFD tekniğinin duyarlılığı %91, özgüllüğü ise %72 olarak hesaplanmıştır. İki yöntemin istatistiksel olarak karşılaştırılmasında Cohen in kappa uyum katsayısı kullanılmıştır. Sonuç: Sonuçlar, DFD tekniğinin subgingival plak örneklerinde Actinobacillus actinomycetemcomitans tespitinde güvenilebilir bir yöntem olduğunu göstermiştir. ANAHTAR KELİMELER Direk immünfloresan değerlendirme, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Kültür metodu Aim: Different bacteria were accused to be responsible in the etiology of periodontal diseases. The most important cause was Actinobacillus actinomycetemcomitans. However, the culture method which was accepted as gold standard to detect this bacteria, was very expensive, difficult and needed an experienced microbiologist. Therefore, the technique could not be carried out in most of the laboratories. The aim of the present study is to determine whether DFA (direct immunofluorescent assay) could be an alternative for culture method. Materials and Method: The study compared the culture and DFA methods to detect Actinobacillus actinomycetemcomitans in subgingival microbial plaque samples which were taken from 48 periodontally diseased sites. Results: Actinobacillus actinomycetemcomitans was detected in 23 of 48 samples in culture method, and was found in 28 of 48 samples in DFA technique. The sensitivity and the specifity of the DFA technique was calculated 91% and 72%, respectively. Cohen s Kappa measure of agreement was preferred to compare the results of the two methods. Conclusion: The results revealed that the DFA technique might be a reliable method to detect Actinobacillus actinomycetemcomitans in subgingival microbial plaque samples. KEYWORDS Direct immunofluorescent assay, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Culture method

2 20 GİRİŞ Periodontal hastalıklar içinde yer alan periodontitis, günümüzde diş kayıplarının en önemli nedenidir. Oral mikrobiyoloji hakkında araştırmalar spesifik mikroorganizmaların periodontal hastalığın başlamasıyla ve ilerlemesiyle yakın ilişkili olduğunu göstermektedir 1. Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus ve Campylobacter rectus erişkin periodontitis lezyonlarında yüksek oranda tespit edilen ve subgingival bölgede kolonize olarak periodontal hastalık oluşumuna neden olduğu kanıtlanmış mikroorganizmalardır 2. Bu çalışmanın kapsamı içinde periodontitis etyolojisinde önemli rol oynadığı düşünülen ve sahip olduğu pek çok virülans faktörü sayesinde oldukça patojen bir mikroorganizma olan A.ac tinomycetemcomitans ın agresif periodontitisli hastalarda görülme oranları belirlenmeye çalışılmıştır. Bu tip hastalıkların tedavisinin başarıya ulaşması, bu multibakteriyel etyoloji içinde esas etkenin doğru ve en hızlı şekilde saptanmasına bağlıdır. Ancak A.actinomycetemcomitans ın klasik kültür yöntemleri ile üretilmesi ve gösterilebilmesi hem zor hem de uzun zaman almaktadır. Ülkemizde halen birçok merkezde bu bakterinin kültür yöntemiyle araştırılması yapılamamaktadır. Kültür yöntemiyle gösterilmiş olsa bile daha kısa sürede tanımlama yapan PZT (Polimeraz Zincir Tepkimesi) benzeri ek ve pahalı yöntemlere gereksinim vardır. Bu çalışmada ülkemizde rutin yöntemler ile gösterilmesi zor olan A.actinomycetemcomitans ın, periodontitisli hastalardan alınan subgingival plak örneklerinde Direkt İmmünfloresan Değerlendirme (DFD) yöntemi ile gösterilmesi ve klasik kültür yöntemi ile güvenilirlik açısından karşılaştırılması amaçlanmıştır. Böylece periodontitisli bireylerde A.actinomycetemcomitans bulunma sıklığı da ayrıca belirlenmeye çalışılmıştır. Uygulanması, kültür yöntemlerinden daha kolay ve hızlı sonuç veren bir test olan DFD nin yeterince özgül ve duyarlı saptanması durumunda bu tip bakterileri araştıramayan merkezlerde sadece bir floresan mikroskobu bulunmasıyla ve uygun işaretli antikor temin edilmesiyle bu tip patojenlerin lezyonlarda gösterilmesi mümkün olacaktır. GEREÇ VE YÖNTEM Bu çalışma agresif periodontitisi bulunan 22 hasta üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu hastalardan ayrı diş kadranlarından 48 örnek alınarak incelenmiştir.hastalarda periodontitis tanısının konulması için hastanın ağzında her kuadranda en az iki dişte ve bir bölgede 5 mm ve üzeri periodontal cep olması, radyografik olarak kemik yıkımının belirlenmesi ve sondlamada kanamanın olması gerekli kriterler olarak kabul edilmiştir. Hastaların altı ay öncesine kadar sistemik antibiyotik veya antienflamatuar kullanmamış olması, sistemik bir hastalıklarının bulunmaması ve son 3 aylık dönemde dişlerinde detertraj işlemi yaptırmamış olmaları kabul kriterleri olarak değerlendirilmiştir. Hastaların seçimi bu şekilde yapıldıktan sonra, her hastada cep derinliği ölçümleri dişlerin dört yüzeyinden (bukkal,mezyal,distal,lingual) yapılmıştır. Hastaların ağzında, 5 mm üzerinde en derin cep derinliğine sahip dişler plak örneklerinin alınması için seçilmiştir. Plak örneklerinin alındığı dişin mezyal veya distal tarafındaki komşu dişlerden örnek alınmamıştır. Seçilen bölgelerden subgingival plak örnekleri, ceplere steril iki paralel peletin en derin kısımlarına yerleştirilip, 20 saniye beklenmesinden sonra alınmıştır. Peletlerden bir tanesi kültür diğeri DFD yöntemi için kullanılmıştır. Kültür Yöntemi Hastalardan alınan subgingival plak örnekleri önceden hazırlanmış TSBV sıvı besiyeri içeren ependorf tüpü içine konularak bekletilmeden mikrobiyoloji laboratuvarına getirilmiştir. Daha sonra bu besiyerinden anaerob şartlarda katı besiyerlerine ekim gerçekleştirilmiştir. Ekimler, Tryptic Soy-serum Bacitracin-Vancomycin Agar (TSBV), ve koyun kanlı agara yapılmıştır. Plaklar %5-10 CO 2 li etüvde saat inkübasyona

3 21 bırakılmıştır. Bu sürede üreme olmayan kültürler 5 güne kadar bekletilmiştir. Bu besiyerlerinde üreyen bakterilerin koloni morfolojileri ışık mikroskobu yardımıyla incelenmiş ve şüpheli görülenlerden gram boyama yapılarak uygun boyanma özelliği ve morfoloji görülen kolonilerin saf koloni kültürü yapılmıştır. Üreyen bakterilerin A.actinomycetemcomitans olduğu katalaz, oksidaz testleri ile doğrulanmıştır. Işık mikroskobunda koloninin yüzeyinde yıldız şeklinde görülen tipik yapıların görülmesi tanımlamada belirleyici bir rol oynamıştır. Antikor elde edilmesi TSBV agar besiyerinde çoğaltılıp ısı ile inaktive edilmiş standart A. actinomycetemcomitans ATCC (29523) suşu kullanılmıştır C da 1 saat bekletilerek inaktive edilen çok yoğun hazırlanmış bakteri süspansiyonu, standart ağırlıkta, beyaz, erkek ve sağlıklı tavşana verilerek bağışıklama yapılmıştır. Bu amaçla 0.2 ml bakteri süpansiyonu ile 0.2 ml complete Freund adjuvanı birlikte tavşanın kalçasından steril şartlarda kas içine verilmiştir. Bir hafta sonra adjuvansız 1 ml bakteri süsüpansiyonu tavşanın kulak venine verilmiştir. Tekrar bir hafta sonra aynı şekilde 2 ml bakteri süspansiyonu tavşanın kulak venine verilmiş bir hafta sonra da kulak venine 3 ml bakteri süspansiyonu enjeksiyonu yapılarak bağışıklama tamamlanmıştır. Dört haftanın sonunda tavşandan kan alınıp antikor titresine bakılmıştır. Daha güçlü bir antikor tiresi elde edebilmek için 4 ml bakteri süspansiyonu aynı şekilde verilmiştir. İki hafta sonra tavşandan kan alınarak serumu ayrılmıştır. Poliklonal olarak A.actinomycetemco mitans a karşı çok miktarda antikor içeren serum bu bakteri ile çapraz reaksiyon verebilecek Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, E.coli, viridans streptokoklar, difteroid,, klebsiella ve psödomonas suşlarıyla ayrı ayrı adsorbsiyona tabi tutulmuştur. Bunun için elde edilen 5 ml serum 37 0 C de 1 saat süre ile her bakteri suşu ile ayrı ayrı inkübasyona bırakılmış ve daha sonra 2000 rpm da 10 dakika santrifüj edilerek bakterilerin uzaklaştırılması sağlanmış ve milipor filtreden geçirilerek steril olması sağlanmıştır. Örneklerin alınması ve DFD Tekniğinin uygulanması Hastadan alınan plak örnekleri önceden steril edilen 2 ayrı lam üzerine konulup, üzerlerine aseton eklenerek tespit edilmiştir. Bir tanesinin üzerine bağışık tavşan serumundan 25 µl antiserum konulmuş, diğerine negatif kontrol amacıyla bağışıklanmamış tavşan serumu konulup ışık almayan, kapalı bir kap içinde buharlı ortamda 30 dakika inkübasyona bırakılmıştır. Süre bitiminde lamlar çıkarılıp ph:7.2 olan PBS (Phosphat-buffer-saline) solüsyonu ile 10 dakika yıkanmış ve daha sonra PBS de steril distile su ile yıkanmıştır. Sonra üzerine FITC (fluorescein isothioncyanat) ile işaretli keçi kaynaklı antitavşan IgG (Sigma) den 25µl konulup 30 dakika aynı koşullarda inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda aynı yıkama işlemleri yapılmış ve floresan mikroskopta bakteri varlığı incelenmiştir (Resim-1). Sonuçlar flöresan ışıma gücüne göre 1+ ile 4+ arasında değerlendirilmiştir. İstatistiksel değerlendirme Deney sonunda eldeki verilerin tablo haline getirilmesi sonucunda, her bir testin duyarlılığının belirlenmesinde, gerçek pozitif değerler, gerçek pozitif değerler ile yanlış negatif değerlerin toplamına bölünmüştür. Özgüllüğün belirlenmesinde ise gerçek negatif değerler, gerçek negatif değerler ile yanlış pozitif değerlerin toplamına bölünmüştür. Testlerin doğruluk oranının de- RESİM 1 DFD ile A.actinomycetemcomitans ın görüntülenmesi

4 22 ğerlendirilmesinde ise gerçek pozitif değerler ile gerçek negatif değerlerin toplamı örnek sayısına bölünmüştür. Elde edilen bulguların istatistiksel değerlendirmeleri Cohen in Kappa uyum katsayısı (SPSS 13.0 SPSS Inc.) ile yapılmıştır. BULGULAR Mikrobiyoloji laboratuvarına getirilerek incelemeye tabi tutulan 48 örneğin yapılan klasik kültür yöntemleri sonucunda 23 ünde A.actinomycetemcomitans üremesi (%47,91) gözlenirken, DFD yöntemi ile 48 örneğin 2 sinde 4(+), 2 sinde 3(+), 8 inde 2(+) 16 sında 1(+) olmak üzere toplam 28 tanesinde (%58,3) A.actinomycetemcomitans varlığı bulunmuştur. Gerçek pozitif değer 21 örnekte, gerçek negatif değer ise 18 örnekte gözlemlenmiştir. 7 örnekte DFD ile A.actinomycetemcomitans varlığı gözlenirken, kültürde üreme olmamıştır (%14,5). 2 örnekte DFD ile A.actinomycetemcomitans izlenemezken, kültürde üreme olmuştur (% 4,1) (Tablo I). Bu çalışmanın sonuçlarına göre kültür yöntemi referans alındığında, DFD tekniğinin duyarlılığı ise % 91, özgüllüğü % 72 olarak bulunmuştur. DFD testinin doğruluk oranı ise %81 gibi yüksek bir oranda tespit edilmiştir (Tablo II). Ayrıca iki testin sonuçlarının arasındaki uyumun incelenmesinde kullanılan Cohen in Kappa uyum katsayısının sonucu DFD ve kültür yöntemleri arasında istatistiksel olarak anlamlı kabul edilebilen bir uyumu ortaya koymuştur TABLO I Örneklerdeki A.actinomycetemcomitans varlığının kültür yöntemi standart alınarak DFD yöntemi ile belirlenmesi n=48 DFD (+) DFD (-) KÜLTÜRN(+) 21 (GP) 2 (YN) KÜLTÜR(-) 7 (YP) 18 (GN) n : çalışmada işleme alınan örnek sayısı GP: Gerçek pozitif değerler: Her iki testtede pozitif olan değerler YP: Yanlış pozitif değerler : standart test değeri negatif iken test değeri pozitif olanlar YN: Yanlış negatif değerler: Standart test değeri pozitif iken test değeri negatif olanlar, GN: Gerçek negatif değerler: Her iki testtede negatif olan değerler (K=0,628 p=0,0005). Bu sonuç DFD tekniğinin A.actinomycetemcomitans tespitinde başarı ile kullanılabilecek bir yöntem olduğunu göstermektedir. TARTIŞMA TABLO II Test Yöntemi DFD yönteminin A.actinomycetemcomitans tespitinde duyarlılık, özgüllük ve doğruluk değerleri DFD Doğruluk Duyarlılık Özgüllük 0,81 0,91 0,72 A.actinomycetemcomitans ın ve serotiplerinin mikrobiyal dental plak içinde varlığının araştırılmasında çok değişik yöntemler kullanılmıştır (3,4). Bakteri ve serotiplerinin belirlenmesinde hızlı, güvenilir ve ucuz yöntemler tercih edilmelidir. Bu çalışmada uzun zamandır kullanılan DFD yönteminin, periodontitis etyolojisinde ana etken olarak suçlanan A.actinomycetemcomitans ın 5,6 tespitindeki başarısı araştırılmıştır. Yapılan çalışmalar 7,8 A.actinomycetemcomitans ın prevalansının agresif periodontitiste kronik periodontitise göre daha yüksek oranda bulunduğunu göstermiştir. Agresif periodontitis çoğunlukla yaşları arasındaki genç yetişkinler arasında görülen bir hastalıktır. Bu nedenle çalışma grubu bu yaşlar arasındaki bireylerden seçilmiştir. Bununla beraber, bu yaş grubunda bu hastalığa sahip bireyleri bulmakta karşılaşılan zorluk, araştırmamızdaki örnek sayısını olumsuz yönde etkilemiştir. Eskiden beri, kültür yöntemleri subgingival mikrofloranın içeriğinin değerlendirilmesinde sıklıkla kullanılmıştır. Kültür yönteminin temel avantajı, üretilen türün koloni morfolojisi özelliklerinin incelenmesi ve koloni sayısının belirlenmesidir. Bu avantajlarının yanında, kültür işleminde birçok sorunla karşılaşılmıştır 4. Anaerobik kültür işleminde kullanılan seyreltmeler plaktaki mikroorganizmalara zarar verebilmektedir 9,10. Buna ek olarak, kullanılan kültür ortamı 11,12, uygun anae-

5 23 orobik şartların oluşturulması 9, ve bakteri tanımlama işlemleri ile ilgili sorunlar 1,13 bu yöntemin başarısını olumsuz yönde etkilemektedirler. Ayrıca, bu yöntemin oldukça zaman alıcı olması, eğitimli personel gerektirmesi ve pahalı bir yöntem sayılması dezavantajı olarak görülebilir 1. Savit ve ark. 14, A.actinomycetemcomitans prevalansında kültür metodunun DNA prob yöntemine göre daha az duyarlı olduğunu savunmaktadır. DFD tekniği, incelenmek istenen patojen bakterinin tespit edilmesinde ve mikrobiyal dental plak içindeki oranını belirlemekte kullanılmaktadır. DFD tekniği, A.actinomycetemcomitans ın tespitinde de kullanılabilecek bir yöntemdir. Zambon ve ark. 15,16 bu tekniği bakteriyel kültür yöntemine bir alternatif olarak göstermişlerdir. Gerçekte, DFD tekniği, kültür yöntemi ile karşılaştırıldığında bakteri türlerinin tespitinde daha büyük bir başarı göstermiştir. Karşılaştırmalı çalışmalar, bu yöntemin duyarlılığının A.actinomycetemcomitans tespitinde %82 ila %100 arasında değiştiğini göstermektedir 17,18. Listgarten ve ark da 19 A.actinomycetemcomitans tespitinde DFD yönteminin bakteriyel kültür yönteminden daha başarılı olduğunu ortaya koymuştur. DFD ve kültür yönteminin karşılaştırıldığı başka bir çalışmada 4 ise kültür yönteminin duyarlılığı %45 de kalırken, immünfloresan değerlendirme yönteminin duyarlılığı %67,4 bulunmuştur. Ayrıca, araştırmacılar 19 bu yöntem ile P.gingivalis,. T.forsythensis gibi diğer oral bakterilerinin tespitinde de DNA prob yöntemlerine göre daha etkili olduğunu saptamışlardır. İmmünfloresan değerlendirme yönteminin başarılı bir tanı yöntemi olduğunu vurgulayan bu çalışmalar, araştırmamızın bulguları ile benzerlik göstermiştir. Bununla beraber, çalışmamızda DFD yönteminde daha yüksek duyarlılık, daha düşük özgüllük değerleri elde edilmiştir. Bu başarılı sonuçlara rağmen, DFD yönteminde diğer bakterilere karşı oluşan antikorlar ile meydana gelebilecek çapraz reaksiyonlar bu yöntem ile elde edilen duyarlılık sonuçlarının güvenirliliğini etkileyebilmektedir. Bu çalışmada, çapraz reaksiyonların önlenmesi için tavşandan elde edilen serum, değişik bakterilerle adsorbsiyon testine tabi tutularak yanlış pozitifliklerin önüne geçilmeye çalışılmıştır. SONUÇ A.actinomycetemcomitans gibi geç ve zor üreyebilen bir bakteri ile çalışıldığında mikrobiyolojik teknikler içinde altın standart olarak bilinen kültür yönteminin zorluğu ve tecrübeli mikrobiyolog gerektirmesi bu tekniğin bir çok yerde yapılamamasına neden olmaktadır. Buna karşılık kronik periodontitisi olan hastalarda, etkeni göstermeye yönelik çalışmalarda DFD nın ucuz, kolay uygulanabilen ve kültüre göre çok kısa sürede sonuç alınabilen bir yöntem olması, floresan mikroskobuna sahip olan her laboratuarda kolaylıkla yapılabilmesi bu yöntemi kültür tekniğine göre daha avantajlı olmasını sağlamaktadır. Sonuçlarımız, DFD yönteminin kültür yöntemi ile karşılaştırıldığında yüksek duyarlılık ve doğruluğa sahip bir yöntem olduğunu vurgulamaktadır. İstatistiksel değerlendirmede kullanılan Cohen in kappa uyum katsayısı da, A.actinomycetemcomitans tespitinde DFD yönteminin de altın standart olarak kabul edilen kültür yöntemi gibi güvenilir bir yöntem olduğunu göstermiştir. TEŞEKKÜR Bu araştırma Gazi Üniversitesi Rektörlüğü Bilimsel Araştırmalar Projeler Birimi tarafından TF. 01/ proje no su ile desteklenmiş ve etik kurul tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmanın yapılmasında değerli katkıları bulunan, Refik Saydam Hıfzısıhha Merkez Başkanlığı Antijen-Antiserum üretim araştırma laboratuarında görevli olan Sayın İsmail Kutlu ve diğer bölüm personeline teşekkür ederiz. KAYNAKLAR 1. Sanz M, Lau L, Herrera D, Morillo JM, Silva A. Methods of detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis and Tanneralla Forsythensis in periodontal microbiology, with special emphasis on advanced molecular techniques: A review. J Clin Periodontol 2004; 31(12):

6 24 2. Carranza FA: Clinical periodontology. Haake SK, Newman MG, Nisengard RJ, Sanz M. Periodontal microbiology, p 96, W.B. Saunders Company, Philedelphia Jervoe-Storm PM, Koltzscher M, Falk W, Dorfler A, Jepsen S. Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periodontopathogenic bacteria in subgingival plaque samples. J Clin Periodontol 2005; 32(7): Loesche WJ, Lopatin DE, Stoll J, Poperin N, Hujoel P. Comparison of various detection methods for periodontopathic bacteria: Can culture be considered the pirmary reference standard. J Clin Microbiol 1992; 30(2): Slots J. Bacterial specificity in adilt periodontitis. J Clin Periodontol 1986; 13(10): Slots S, Tıng M. A. actinomycetemcomitans and P.gingivalis in human periodontal disease: occurence and treatment. Periodontol ; 20: Mandell R, Socransky SS. A selective medium for isolation A. actinomycetemcomitans and the incidence of the organism in juvenile periodontitis. J Periodontol 1981; 52(10): Zambon JJ, Slots J, Genco RJ. Serology of oral A. actinomycetemcomitans and serotype distribution in human periodontal disease. Infect Immun 1983; 41(1): Gordon DF, Stauman M, Loesche WJ: Improved isolation of anaerobic bacteria from the gingival crevice area of man. Appl Microbiol 1971; 21: Mombelli A, Minder CE, Gusberti FA, Lang NP. Reproducibility of microscopic and cultural data in repeated subgingival plaque samples. J Clin Periodontol 1989; 16(7): Moore WEC. Microbiology of periodontal disease. J Perd Res 1987; 22(5): Socransky SS, Haffajee AD, Smith GLF, Dzink JL. Difficulties encountered in the search for the etiologic agents of destructive periodontal diseases. J Clin Periodontol 14(10): Salvador SL, Syed Sa, Loesche WJ. Comparison of there dispersion procedures for quantitative recovery of cultivable species of subgingival spirochetes. J Clin Microbiol 1987; 25(11): Savitt ED, Strzempko MN, Vaccaro KK, Peros WJ, French CK. Comparison of cultural methods and DNA probe analysis for the detection of A. actinomycetemcomitans, B. Gingivalis and B. İntermedius in subgingival plaque samples. J Periodontol 1988; 59(7): Zambon JJ. A.actinomycetemcomitans in human periodontal disease. J Clin Periodontol 1985; 12(1): Zambon JJ, Umemoto T, De Nardin E, Nakazawa F, Christersson LA, Genco RJ. A. actinomycetemcomitans in the pathogenesis of human periodontal disease. Adv in Dent Res 1988; 2(2): Zambon JJ, Bochacki V, Genco RJ. Immunological assays for putative periodontal pathogens. Oral Microbiol Immun 1986; 1(1): (1986). 18. Zambon JJ, Reynolds HS, Chen P, Genco RJ. Rapid identification of periodontal pathogens in subgingival dental plaque: comparison of indirect immunofluorescence microscopy with bacterial culture for detection of B.gingivalis. J Periodontol 1985; 56(11): Listgarten MA, Wong MY, Lai CH. Detection of A. actinomycetemcomitans, P.gingivalis, and B. forsythus in an A. actinomycetemcomitans positive patient population. J Periodontol 1995; 66(2): İLETİŞİM ADRESİ A.Eralp AKCA GATA Dişhekimliği.Blm.Mrk.Periodontoloji Anabilim Dalı Etlik/ANKARA akcaeralpy@yahoo.com