EGE ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJE KESİN RAPORU EGE UNIVERSITY SCIENTIFIC RESEARCH PROJECT REPORT

Transkript

1 EGE ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJE KESİN RAPORU EGE UNIVERSITY SCIENTIFIC RESEARCH PROJECT REPORT PROJE NO:2009-DİŞ-23 (Araştırma) FARKLI PERİODONTAL HASTALIKLI DİŞETİ DOKULARINDA TLR-4 VE CD-14 ÜN İMMUNOHİSTOKİMYASAL ANALİZİ PROJE YÖNETİCİSİ Dr. Sema BECERİK ARAŞTIRMACI Dr Ali Gürkan Dr Nazan Özsan Dr Veli Özgen Öztürk Prof Dr Gül Atilla Prof Dr Gülnur Emingil Diş Hekimliği Fakültesi School of Dentistry Department of Periodontology Bornova-İZMİR 2011

2 Önsöz Periodontal hastalıklar, dişlere tutunmuş olan mikrobiyal dental plağın neden olduğu enfeksiyöz özellikler gösteren hastalıklardır. Sağlıklı bireylerde varolan mikrobiyal dental plak ile konak savunması arasındaki dengenin konak savunması aleyhine değişmesi sonucunda periodontitis gelişmektedir. Konak immun sistemi tarafından bakteri ve ürünlerinin tanınması immun cevabın başlatılması açısından çok önemlidir. Bu çalışmada bakteri ve ürünleri tanımada görevli reseptörler olan toll benzeri reseptör 4 ve mcd 14 ün immunohistokimyasal lokalizasyonu farklı periodontal hastalıklı ve sağlıklı dişeti dokularında incelenmiştir. Çalışmanın konak modülasyonu çalışmalarına ışık tutacağı düşünülmektedir. Bu araştırmanın gerçekleştirilmesine olanak sağlayan Ege Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Şube Müdürlüğü ne içtenlikle teşekkür ederim. İzmir, 2011 Dr. Sema Becerik

3 İçindekiler Şekil dizini......i Çizelge dizini..ii Kısaltma ve semboller dizini.iii Öz......VI Abstract..V 1.Giriş..1 2.Literatür Özeti..2 3.Materyal Ve Yöntem Klinik periodontal parametreler Doku örneklerinin alınması Doku kesitlerinin hazırlanması ve immünohistokimya İstatistiksel Analizler Bulgular Klinik bulgular TLR4 ekspresyonunun lokalizasyonu ve kuantifikasyonu mCD14 ekspresyonunun lokalizasyonu ve kuantifikasyonu.16 5.Tartışma, Sonuç Ve Öneriler Kaynaklar...22

4 Şekil dizini Şekil 1: TLR4 reseptör ilişkili aktivasyon yolları. Şekil 2: Bağ dokusunun zon 1 ve zon 2 bölgeleri Şekil 3: Farklı gruplardaki dokularıntlr4 ekspresyonları Şekil 4: Epitelin farklı tabakalarında TLR4 pozitif hücrelerin tüm hücrelere oranı. Şekil 5: Bağ dokusu zon 1 ve zon 2 de TLR4 pozitif hücrelerin tüm hücrelere oranı. Şekil 6:Farklı gruplardaki dokuların mcd14 ekspresyonları Şekil 7: Epitelin farklı tabakalarında mcd14 pozitif hücrelerin tüm hücrelere oranı. Şekil 8: Bağ dokusu zon 1 ve zon 2 de mcd14 pozitif hücrelerin tüm hücrelere oranı. - I -

5 Çizelge Dizini Tablo 1. Hastaların demografik özellikleri. Tablo 2. Örnekleme bölgelerine ait klinik parametreler. - II -

6 Kısaltma ve semboller dizini Toll benzeri reseptör ya da almaç (TLR) Gram- (Gr-) Patojenle ilişkili moleküler paternler (PAMP) Patern tanıyıcı reseptörler (PRR) Kronik periodontitis grubu (KP) Yaygın agresif periodontitis grubu (Y-AgP) Sondalanan cep derinliği (SCD) Klinik ataşman kaybı (KAK) Papil kanama indeksi (PKİ) Plak indeksi (Pİ) -III-

7 Öz Amaç: Bakteri ve ürünlerinin immun sistem tarafından tanınması immun cevabın başlatılmasında çok önemli rol oynamaktadır. Bu çalışmanın amacı toll benzeri reseptör 4 (TLR4) ve mcd14 ün farklı periodontal hastalıklarda dişeti TLR4 ve mcd14 ekspresyonunun incelenmesidir. Yöntem: 10 sağlıklı, 10 gingivitisli, 10 kronik periodontitisli (KP) ve 10 yaygın agresif periodontitisli (Y-AgP) gönüllüden dişeti doku örnekleri alınmıştır. Alınan doku örneklerinde immunohistokimya yöntemi ile TLR4 ve md14 ün varlığı ve lokalizayonu tayin edilmiştir. Bulgular: Tüm hastalıklı ve sağlıklı dişeti doku örneklerinde TLR4 ve mcd14 ekspresyonu izlenmiştir. TLR4 ve mcd14 pozitif hücrelerin kronik periodontisli dokularda sağlıklıya kıyasla daha çok epitel bağ doku birleşiminde yerleştiği ve epitelinde bazal tabakasında bulunduğu gözlenmiştir.(p<0,005) Sonuç: Sonuç olarak TLR4 ve mcd14 ekspreyonunun periodontal hastalıkla ilşkili olduğu düşünülmektedir. Anahtar sözcükler: CD14, TLR4, kronik periodontitis, agresif periodontitis, gingivitis. -IV - -IV -

8 Abstract Aim: Immune cell recognition of lipopolysacharides via CD14 and toll-like receptor 4 (TLR4) complexes plays a crucial role in linking innate and adaptive immune responses. This study was aimed to investigate the expression of TLR4 and membrane-bound CD14 (mcd14) in the gingival tissues of patients with gingivitis, periodontitis. Materials: Gingival tissues were obtained from 10 patients with chronic periodontitis, 10 generalized aggressive periodontitis, 10 gingivitis and 10 healthy subjects. Immunohistochemistry was performed in order to determine the localization of TLR4 and mcd14 in tissue specimens. Results: TLR4 and mcd14 expression were detected in all tissues including healthy gingival biopsies. TLR4 and mcd14 positive cells were predominantly confined to the epithelium-connective tissue interface area, and were highly expressed in the basal cell layer of patients with chronic periodontitis, compared to healthy group (P<0.005). Conclusion: The present study suggests that TLR4 and mcd14 protein expression may be interrelated and appear to be associated with periodontal disease. Key words: CD14, TLR4, chronic periodontitis, aggressive periodontitis, gingivitis - V -

9 1.Giriş Periodontitis, mikrobiyal plak ile konak savunma mekanizmaları arasındaki dengenin konak aleyhine bozulması sonucu başlayan ve ilerleyen kronik enflamatuvar bir hastalıktır. Yoğun enflamatuvar hücre birikimi, bağ dokusu yıkımı, periodontal cep oluşumu ve alveoler kemik rezorbsiyonu ile karakterizedir (1). Toll benzeri reseptör ya da almaç, (TLR), mikroplardan kaynaklanan, yapısal olarak korunmuş moleküller deri veya bağırsak mukozası gibi fiziki bariyerleri aştığında, bu molekülleri tanıyan tek membran boyunca uzanmış, katalitik-olmayan reseptörlerin bir sınıfıdır. Bu yapıların doğuştan gelen bağışıklık sisteminde anahtar rol oynadıkları düşünülmektedir. İsimlerini Drosophilada 1985'de Christiane Nüsslein-Volhard tarafından keşfedilen Tolla benzerliklerinden dolayı alırlar (2). TLR ler bakteriyel lipopolisakkarit, peptidoglikan, lipoprotein, bakteriyel DNA ve RNA gibi ligandları tanıyarak bakteriyel invazyonda enflamatuvar doku cevabını başlatırlar. Günümüzde insanda 10 farklı TLR bulunmuştur (3). Yapılan çalışmalarda farklı TLR lerin veya kombinasyonlarının tanıdıkları ligandlar tanımlanmıştır. Hücre yüzey reseptörleri olan TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 ve TLR6 daha çok mikrobiyal ürünleri, hücreler arası reseptörler olan TLR3, TLR7, TLR8 ve TLR9 ise nükleik asitleri tanımaktadır (4). Bu araştırmanın amacı TLR-4 ve CD14 in farklı periodontal hastalıklarda dişeti dokusunda immunohistokimyasal analizlerinin yapılması ve periodontal hastalıklarda bu reseptörlerin rolünün değerlendirilmesidir

10 2.Literatür Özeti Periodontal hastalıklar, dişlere tutunmuş olan mikrobiyal dental plağın neden olduğu enfeksiyöz özellikler gösteren hastalıklardır. Sağlıklı bireylerde varolan mikrobiyal dental plak ile konak savunması arasındaki dengenin konak savunması aleyhine değişmesi sonucunda periodontitis gelişmektedir. Periodontitis, dişi çevreleyen bağ dokusu ve alveol kemiği yıkımı sonucunda cep oluşumu ile karakterize bir hastalık olup, aktif yıkım ve duraklama dönemleri içeren bölgeye özgü bir hastalıktır (5,6). Hastalığın ilerleme hızı ve şiddeti bireyden bireye farklılık göstermektedir (5). Periodontitisin daha sıklıkla karşımıza çıkan formu olan kronik periodontitis, yavaş seyreder. Her yaşta görülebilmesi ile birlikte daha çok erişkinlerde karşımıza çıkar. Görülen yıkım miktarı doğrudan varolan plak, diştaşı ve iyatrojenik faktörler ile doğru orantılıdır. Özellikle P. gingivalis, T. forsythensis, T. denticola gibi Gram- (Gr-) bakterilerin subgingival alandaki birikimlerinin, kronik periodontitisteki ataşman ve alveol kemik kaybından sorumlu olduğu kabul edilmektedir. Kronik periodontitiste, diyabet gibi sistemik hastalıkların varlığı, sigara kullanımı ve stres gibi çevresel faktörlerin etkisi ve konak savunmasının cevabını etkileyebilecek genetik faktörlerin bulunması hastalığın; ortaya çıkma riskini, şiddetini ve ilerleme hızını arttırabilmektedir (7). Periodontitisin bir diğer türü olan agresif periodontitis genellikle 30 yaşından daha genç, sistemik olarak sağlıklı bireyleri etkileyen ileri doku yıkımı ile karakterize bir hastalıktır. Kronik periodontitisden; ortaya çıkma yaşı, ilerleme hızı, subgingival mikrofloranın içeriği, immun cevaptaki değişiklikler ve ailesel yatkınlık gibi özellikler ile ayrılmaktadır (8). Lokalize ve yaygın agresif periodontitis olmak üzere iki formu bulunmaktadır. Kronik periodontitise benzer şekilde yıkım episodik olarak gerçekleşmektedir. Ancak bu episodlar hafta veya ay olarak değişebilmektedir. Varolan plak miktarı ve iyatrojenik faktörler ile meydana gelen yıkım arasında doğru bir orantının olmadığı belirlenmiştir (9). Agresif periodontitisli bireylerden elde edilen plak örneklerinde sıklıkla P. gingivalis, Agregatibacter actinomycetemcomitans (A.a.), T. forsythensis bakterileri saptanmaktadır - 2 -

11 (10). Belirlenen plak miktarından bağımsız olarak ileri derecede ataşman kaybı ve alveol kemik yıkımı görülen bu hastalıkta dişeti çekilmesi sıklıkla görülmemekte, bununla birlikte sondalanan cep derinlikleri yüksek değerler ile karşımıza çıkmaktadır. Agresif periodontitisde iki farklı klinik tablo ile karşılaşılabilmektedir. Kemik yıkımının ve ataşman kaybının aktif olduğu dönemlerde dişetinde kanama, ödem ve süpürasyon gözlenirken, duraklama dönemlerinde dişeti pembe, kanamasız olup klinik olarak sağlıklı dişeti ile benzer özellikler gösterebilmektedir. 20 yıl öncesine kadar periodontal hastalıkların nedeninin diş yüzeyinde biriken dental plak olduğu ve plak içerisindeki bakteriler ve ürünlerinin ekstraselüler matris ile alveol kemiği yıkımına neden olduğu kabul edilmekteydi. Yapılan çalışmalar ile bu yıkımdan sadece bakterilerin sorumlu olmadığı, bu bakterilere karşı oluşan konak savunmasının da hastalığın oluşumu, ilerleyişi ve şiddetinde etkin bir role sahip olduğu görüşü kabul görmüştür. Kazanılmış immunite tarafından yabancı antijenin tanınmasından sorumlu major mekanizmaların yapılan çalışmalarla açıklığa kavuşturulmuş olmasına rağmen, mikroorganizmaların doğal immun sistem tarafından tanınma mekanizması henüz tam olarak açıklanamamıştır. Doğal immun tanıma stratejisi mikrobiyel metabolizmanın yapısal olarak varolan ve korunmuş ürünlerinin saptanması temeline dayanır. Bir cok metabolik yollar ve özel gen ürünleri mikroorganizmalara özgüdür ve konak hücrelerinde bulunmaz. Bu yolların bazıları yapısal olarak yer alır ve ürünleri ilgili mikroorganizma grubu icinde korunmuş olup yaşamları için esansiyeldir. Orneğin, LPS, lipoproteinler, peptidoglikan ve lipoteykoik asitlerin tümü bakteriler tarafından yapılır, fakat ökaryotik hücreler tarafından yapılamaz. Doğal immun tanımanın en onemli ozelliklerden biri hedeflerinin mikropların farklı türleri arasında kesinlikle idantik olmadığıdır. Bununla beraber, ince kimyasal yapıların ceşitli tür ve cins spesifik varyasyonları olmasına rağmen, bunlar daima ilgili mikroorganizma sınıfı icinde oldukça korunmuş ve invaryant olan ortak bir moleküler patern içinde bulunur. Doğal immun tanımanın hedefleri korunmuş moleküler paternler olduğu için, bu hedeflere patojenle ilişkili moleküler paternler (PAMP) denir. PAMP ları tanıyan doğal immun sistem reseptorlerine patern tanıyıcı reseptörler (PRR) adı verilir (11)

12 Aslında PRR ler patojen ile kommensal mikroorganizmaları birbirinden ayıramaz. Bu özellik hayati bir önem taşır. Hepimiz kommensal mikroflora ile temas halinde olduğumuz için bunlar tarafından enflamatuvar yanıtların devamlı aktivasyonu konak icin ölümcül olaylara sebep olabilir. Ancak bu, normal fizyolojik durumlarda meydana gelmez. Konağın patojen olmayan mikroorganizmalara toleran kalmasını sağlayan asıl mekanizma hala tam olarak bilinmemektedir. Doğal immun sistem hücre yüzeyinde (MBL, CRP, SAP, LBP ve TLR), hücre içi kompartmanlarda (PKR ve NOD) eksprese edilen veya kan dolaşımı ve doku sıvılarına salınan (CD14, Makrofaj Mannoz Reseptoru vb.), çeşitli PRR leri kullanır (3). PRR lerin başlıca fonksiyonları opsonizasyon, kompleman ve koagulasyon kaskadlarının aktivasyonu, fagositoz, proenflamatuvar sinyal yollarının aktivasyonu ve apoptoz un induksiyonu olarak özetlenebilir (3). Toll benzeri reseptör ya da almaç (TLR), mikroplardan kaynaklanan, yapısal olarak korunmuş moleküller deri veya bağırsak mukozası gibi fiziki bariyerleri aştığında, bu molekülleri tanıyan tek membran boyunca uzanmış, katalitik-olmayan reseptörlerin bir sınıfıdır. TLR ler bakteriyel lipopolisakkarit, peptidoglikan, lipoprotein, bakteriyel DNA ve RNA gibi ligandları tanıyarak bakteriyel invazyonda enflamatuvar doku cevabını başlatırlar. Günümüzde insanda 10 farklı TLR bulunmuştur. (3). Yapılan çalışmalarda farklı TLR lerin veya kombinasyonlarının tanıdıkları ligandlar tanımlanmıştır. Hücre yüzey reseptörleri olan TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 ve TLR6 daha çok mikrobiyal ürünleri, hücreler arası reseptörler olan TLR3, TLR7, TLR8 ve TLR9 ise nükleik asitleri tanımaktadır (4). TLR-4 reseptörü antijen ile bağlandığında hücre içinde immun sistemi aktive ederek, doku yıkımına neden olacak birçok sitokinin ve medyatörün gen transkripsiyonunu ve dolaylı yoldan ekspreyonunu sağlar (Şekil 1). Bu araştırmanın amacı TLR-4 ve CD14 in farklı periodontal hastalıklarda dişeti dokusunda immunohistokimyasal analizlerinin yapılması ve periodontal hastalıklarda bu reseptörlerin rolünün değerlendirilmesidir

13 Şekil 1: TLR 4 reseptör ilişkili aktivasyon yolları

14 3. Materyal ve Yöntem Çalışmanın başlangıcında Ege Üniversitesi Etik Kurulu ndan etik kurul izni alındı. Ege Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi ne başvuran hastalar arasından klinik ve radyografik incelemeler sonucunda çalışmaya 10 agresif periodontitisli, 10 kronik periodontitisli, 10 gingivitisli ve 10 sağlıklı olmak üzere toplam 40 birey dahil edildi. Periodonsiyumu etkilediği bilinen herhangi bir sistemik hastalığı olan bireyler ve diyabet, miyokard enfeksiyonu, anjina gibi hastalığı olanlar ile dental tedavi için antibiyotik premedikasyonuna gereksinimi olan hastalar çalışmaya dahil edilmedi. Üzerinde derin çürük kaviteleri bulunan veya konservatif ya da protetik olarak restore edilmiş dişlerden örnekler alınmadı. Son 3 ayda antibiyotik kullanmış olan, son 3 ayda periodontal tedavi gören hastalar çalışmaya dahil edilmedi. Çalışmaya dahil edilen bireyler yapılan klinik periodontal muayene ve radyolojik inceleme sonucu aşağıdaki gibi gruplandırıldı (12): 1. Kronik periodontitis grubu (KP): En az iki ayrı kadranda ve en az dört bölgede 5 mm klinik ataşman kaybı olan, tüm ağız aproksimal bölgelerde sondalamada kanaması % 50 den fazla olan ve radyografide ilgili dişlerde horibölgetal kemik kayıpları olan, ağız içindeki plak ve lokal faktörlerin hastalığın şiddeti ile doğru orantılı 10 hasta dahil edildi. 2. Yaygın agresif periodontitis grubu (Y-AgP): En az 8 dişinde 5 mm klinik ataşman kaybı olan, tüm ağız aproksimal bölgelerde sondalamada kanaması % 50 den fazla olan ve radyografide ilgili dişlerde horibölgetal kemik kayıpları olan Ağız içindeki plak ve lokal faktörlerin hastalığın şiddeti ile doğru orantılı olmadığı 10 hasta dahil edildi

15 3. Gingivitis grubu: Klinik ataşman kaybı 3 mm yi geçmeyen, 3 mm den derin sondalanan cep derinliği olmayan ve en az %50 papilde papil kanama indeksi 2 ve üstü olan 10 hasta gingivitis grubuna dahil edildi. 4. Sağlıklı grup: 3 mm den derin cebi, dişeti büyümesi ve klinik ataşman kaybı olmayan ve %10 dan daha az papilde papil kanama indeksi 2 ve altı olan 10 gönüllü ise sağlıklı grubu oluşturdu. 3.1.Klinik periodontal parametreler: Araştırmaya alınan bireylerin 3. molar dişleri hariç tüm dişlerinden klinik periodontal parametreler tek araştırmacı tarafından değerlendirildi. Williams periodontal sondası kullanılarak ölçümler yapıldı. Sondalanan Cep Derinliği (SCD); dişeti kenarı ile periodontal cebin tabanı arasındaki mesafe olarak değerlendirildi. Klinik Ataşman Kaybı (KAK); mine-sement sınırı ile periodontal cebin tabanı arasındaki mesafe olarak ölçüm yapıldı. Papil kanama indeksi (PKİ) örnekleme yapılan bölgelerdeki kanama PKİ ile değerlendirildi (13). Plak İndeksi (Pİ); Tüm ağız bazik-fuksin ile boyanarak plak var/yok olarak belirlendi. Tüm ağız için % olarak saptandı. Ayrıca örnekleme bölgeleri için Quiley&Hein plak indeksi kullanılarak değerlendirme yapıldı (14). 3.2.Doku örneklerinin alınması: Hastalardan lokal anestezi altında bistüri yardımıyla dişeti epitelini ve bağ dokusunu içeren 3-4mm çapında dişeti doku örnekleri alındı. KP ve Y-AgP gruplarında doku örnekleri SCD 5 mm olan dişlerin aproksimallerinden alındı. Sağlıklı ve gingivitis gruplarında ise örnekler kron boyu uzatma operasyonu ve ortodontik çekim endikasyonu konan dişlerin aproksimalinden dahil edilme kriterleri göz önünde bulundurularak alındı. Doku örnekleri %10 formol solüsyonuna konulup 24 saat oda sıcaklığında bekletildikten sonra parafine gömüldü. 3.3.Doku kesitlerinin hazırlanması ve immünohistokimya: Parafin bloklardan 5 mikron kalınlığında kesitler alındıktan sonar parafin uzaklaştırıldı ve dereceli etanol ile rutin doku takibi işlemlerine tabi tutuldu. Kesitler daha sonra distile su - 7 -

16 ve fosfat tamponu ile ile 10 dakika yıkandı ve 37ºC de 15 dakika 50mM Tris tamponunda %2 tripsinle işleme tabi tutuldu. Kesitlerin sınırları Dako kalemi ile belirlenerek %3 H2O2 solüsyonunda endojen peroksit aktivitesinin inhibisyonu için15 dakika bekletildi. Kesitler daha sonra TLR-4 ve CD14 e (1:1000) spesifik primer antibodylerle 18 saat +4ºC de inkübe edildi. Bu işlemi takiben kesitler önce biotinli ikincil antibodyler ile daha sonra streptavidin konjüge horseradish peroksidaz ile 30 ar dakika inkübe edildi. Son olarak kesitler 5 dakika diaminobenzidine ile muamele edildi. TLR-4 ve CD14 in monoklonal antikorlarıyla işaretlenen bu kesitler mikroskop altında incelenerek reseptörlerin dişeti dokularında varlığı ve lokasyonu epitel ve bağ dokusu için ayrı ayrı tespit edildi. Epitelin bazal, spinoz ve superfisiyal tabakaları ayrı ayrı değerlendirilirken bağ dokusu da bölge 1 ve bölge 2 olarak 2 ye ayrıdı. (Şekil 2) Şekil 2: Bölge 1:Cep epitelin hemen altındaki bağ dokusu Bölge 2: Daha derin bağ doku - 8 -

17 3.4.İstatistiksel Analizler İstatistiksel analizler Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyoistatistik ve Tıbbi Bilişim Anabilim Dalı nda SPSS 17.0 (for Windows) paket programı kullanılarak yapıldı. Tüm hipotez testleri α=0.05 önem seviyesinde uygulandı. Çalışma gruplarının cinsiyet, yaş özellikleri ki-kare testi ile değerlendirildi. Verilerin normal dağılışa uyumları Kolmogorov-Simirnov testi ile kontrol edildi. Gruplar arası SCD, Pİ ve PKİ değerleri arasındaki farklar ANOVA testi ile değerlendirildi. Grupların ortalama TLR4 veya mcd14 pozitif hücre sayısı arasındaki farklar ANOVA ile analiz edildi. 2 grup arasında anlamlı fark bulunduğunda Bonerroni düzeltmesi yapıldı. Spearman korelasyon analizi TLR4 ve CD14 arasında korelasyonun saptanmasında kullanıldı

18 4. Bulgular Çalışma gruplarındaki hastaların yaşları ve cinsiyet dağılımları birbirine benzer bulunmuştur. Çalışma gruplarındaki hastaların demografik özellikleri Tablo 1 de verilmiştir. Tablo 1. Hastaların demografik özellikleri KP Y-AgP Gingivitis Sağlıklı N Yaş 42.85± ± ± ±8.48 Cinsiyet 5 K / 5 E 5 K / 5 E 5 K / 5 E 5 K / 5 E KP: Kronik periodontitis, Y-AgP: Yaygın agresif periodontitis

19 4.1.Klinik bulgular: Farklı çalışma gruplarındaki hastaların SCD, PKİ ve Pİ içeren klinik periodontal parametleri tablo 1 de verilmiştir. SCD KP ve Y-AgP gruplarında gingivitis ve sağlıklı gruptan anlamlı farklı bulunmuştur (p<0,001). PKI KP, Y-AgP ve gingivitis gruplarında sağlıklı gruptan yüksek bulunmuştur. Pİ KP ve Y-AgP gruplarında gingivitis ve sağlıklı gruptan anlamlı farklı bulunurken gingivitis grubunda da sağlıklı gruptan farklı bulunmuştur. Tablo 2: Örnekleme bölgelerine ait klinik parametreler KP Y-AgP Gingivitis Sağlıklı SCD 7±1.6* 7.2±0.7* 1.6± ±0.5 PKI 3.6(3-4)* 3.5(2-4)* 2.2(1-3)* 0 PI 3.4(3-5)* 3.5(3-4)* 2.4(1-3)* 0.3(0-1) KP: Kronik periodontitis Y-AgP: Yaygın agresif periodontitis SCD: sondalanan cep derinliği PKI: papil kanama indeksi PI: plak indeksi *: Sağlıklı gruptran anlamlı farklı (P<0,001) : Gingivitisli gruptan anlamlı farklı (P<0,001)

20 4.2.TLR4 ekspresyonunun lokalizasyonu ve kuantifikasyonu: TLR4 ün farklı çalışma gruplarındaki dokularda immunlokalizasyonu Şekil 3 te verilmiştir. TLR4 ekspresyonu tüm hastalıklı ve sağlıklı grupların hem epitel hemde bağ dokularında tespit edildi. TLR4 ekspresyonu çoğunlukla epitel- bağ dokusu birleşiminde ve kan damarlarına yakın yerlerdeki polimorfonükleer hücrelerde, makrofajlarda, lenfositlerde ve plazma hücrelerinde, ayrıca fibroblastik ve endotelyal hücrelerde izlendi

21 Şekil 3: (a) Kronik periodontitis; 1. Epitel Bağ doku birleşimi 2. Bağ dokusu (b) Yaygın agresif periodontitis; 1. Epitel Bağ doku birleşimi 2. Bağ dokusu (c) Gingivitis; 1. Epitel Bağ doku birleşimi 2. Bağ dokusu (e) Sağlıklı; 1. Epitel Bağ doku birleşimi 2. Bağ dokusu

22 Tüm hastalıklı gruplarda, epitelin bazal tabakasındaki TLR4 pozitif hücre sayısı spinoz ve superfisiyal tabakalardan daha yüksek bulundu (P<0.05) (Şekil 4). Spinoz ve superfisiyal tabalardaki TLR4 pozitif hücre sayıları tüm hastalıklı gruplarda benzer bulundu (p>0.05). Sağlıklı grubun epitel tabakaları arasında TLR4 pozitif hücre sayıları açısından fark bulunamadı (p>0.05). KP grubun bazal tabakasında ki TLR4 ekspresyonu sağlıklı gruptan yüksek bulundu (P<0.05). Epitelin spinoz ve superfisiyal tabakalarında ki TLR 4 ekspresyonu farklı çalışma gruplarında benzer bulundu (p>0.05). * KP Y-AgP Gingivitis Sağlıklı Şekil 4: Epitelin farklı tabakalarındaki TLR4 pozitif hücrelerin tüm hücrelere oranı. KP: Kronik periodontitis, Y-AgP: yaygın agresif periodontitis *: Bazal hücre tabakasındaki pozitif hücre sayısı sağlıklı gruptan farklı (P<0.05) : Grup içinde bazal hücre tabakasından farklı (P<0.05)

23 Çalışma gruplarının faklı bölgelerinde birim alanda ki ortalama TLR 4 pozitif hücrelerin tüm hücrelere oranı Figür 5 te verilmiştir. Tüm hastalıklı grupların bölge 1 deki TLR4 pozitif hücre sayısı sağlıklı gruptan yüksek bulunurken(p<0.05), KP, Y-AgP ve gingivitis grupları arasında benzer bulundu. Gingivitis grubunun bölge 2 bölgesindeki TLR4 ekspresyonu sağlıklı gruptan yüksek bulundu (p<0.05). Tüm gruplardaki TLR4 pozitif hücre sayısı bölge 1 de bölge 2 den yüksek bulundu ve bu fark KP ve Y-AgP gruplarında anlamlıydı (sırasıyla P=0.03 ve P=0.002) (Şekil 5) * * * Bölge 1 Bölge KP Y-AgP Gingivitis Sağlıklı Şekil 5: Farklı grupların bağ dokusu bölge 1 ve bölge 2 deki TLR4 pozitif hücrelerin tüm hücrelere oranı. KP: Kronik periodontitis, Y-AgP: Yaygın agresif periodntitis. *= Aynı bölge için sağlıklı gruptan farklı P<0.05 = Aynı grupta bölge 1 den farklı P<

24 4.3.mCD14 ekspresyonunun lokalizasyonu ve kuantifikasyonu: mcd14 ün farklı çalışma gruplarındaki dokularda immunlokalizasyonu Şekil 6 da verilmiştir. mcd14 ekspresyonu tüm hastalıklı ve sağlıklı grupların hem epitel hemde bağ dokuların da tespit edildi. TLR4 ekspresyonu çoğunlukla epitel- bağ dokusu birleşiminde ve kan damarlarına yakın yerlerdeki polimorfonükleer hücrelerde, makrofajlarda, lenfositlerde, ve plazma hücrelerinde, ayrıca fibroblastik ve endotelyal hücrelerde izlendi

25 Şekil 6: (a) Kronik periodontitis; 1. Epitel Bağ doku birleşimi 2. Bağ dokusu (b) Yaygın agresif periodontitis; 1. Epitel Bağ doku birleşimi 2. Bağ dokusu (c) Gingivitis; 1. Epitel Bağ doku birleşimi 2. Bağ dokusu (e) Sağlıklı; 1. Epitel Bağ doku birleşimi 2. Bağ dokusu

26 Çalışma gruplarındaki dokuların farklı epitel tabakalarındaki mcd14 pozitif hücre ayıları Şekil 7 de verilmiştir. Tüm çalışma gruplarda mcd14 pozitif hücre sayısı bazal tabakada diğer epitel tabakalarından yüksek bulundu (P<0.05) KP Y-AgP Gingivitis Sağlıklı Şekil 7: Epitelin farklı tabakalarındaki mcd14 pozitif hücrelerin tüm hücrelere oranı. : Grup içinde bazal hücre tabakasından farklı (P<0.05) KP: Kronik periodontitis Y-AgP: Yaygın agresif periodontitis

27 Çalışma gruplarının faklı bölgelerinde birim alanda ki ortalama mcd14 pozitif hücrelerin tüm hücrelere oranı Şekil 8 te verilmiştir. Tüm hastalıklı grupların bölge 1 deki mcd14 pozitif hücre sayısı sağlıklı gruptan yüksek bulunurken(p<0.05), KP, Y-AgP ve gingivitis gruplarında birbirleri ile benzer bulundu. Y-AgP grubundaki mcd14 ekspresyonu bölge 2 de sağlıklı gruptan yüksek bulundu (p<0.05). KP ve Y-AgP gruplarının bölge 1 indeki mcd14 pozitif hücre sayısı bölge 2 den yüksekti (P=0.02 ve P=0.03). TLR4 ve mcd14 ekspresyonu bölge1 ve bölge 2 de pozitif korelasyon gösterdi (P=0.0004, r=0.729, ve P<0.0001, r=0.843) * * * KP Y-AgP Gingivitis Sağlıklı Şekil 8: Farklı grupların bağ dokusu bölge 1 ve bölge 2 deki TLR4 pozitif hücrelerin tüm hücrelere oranı. *= Aynı bölge için sağlıklı gruptan farklı P<0.05 = Aynı grupta bölge 1 den farklı P<0.05 KP: Kronik periodontitis, Y-AgP: Yaygın agresif periodontitis

28 5.Tartışma, Sonuç Ve Öneriler KP, Y-AgP, gingivitis ve sağlıklı hastaların dişeti biyopsilerindeki TLR4 ve mcd14 ekspresyonunun incelendiği bu çalışmada hastalıklı gruplarda sağlıklı gruba kıyasla hem TLR4 ve hemde mcd14 pozitif hücre sayısının yükseldiği gösterilmiştir. TLR4 ve mcd14 ekspresyonunun daha çok epitelin bazal tabakasında ve epitelin hemen altındaki bağ dokuda lokalize olduğu izlenmiştier. Bu çalışmada Beklen ve arkadaşlarının (15) çalışmasına benzer olarak TLR4 ekspresyonu sağlıklı dokuda da izlenmiştir. Buna karşın Ren ve arkadaşları (16) sağlıklı dokuda TLR4 ün eksprese olmadığını bildirmişlerdir. Bu çalışmada sağlıklı dokuda TLR4 ekspresyonunun gösterilmesi sağlıklı dişetinde enflamasyonun klinik belirtileri olmasa dahi subklinik düzeyde bir enflamsayonun olması ile açıklanabilir (17, 18). mcd14 ünn dişetindeki ekspreyonunu araştıran sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Sağlıklı bireylerin sağlıklı dişetinden elde edilen biyopsilerde mcd14 ekspresyonunun kronik periodontitisli bireylerin dişetindeki ekspresyondan daha fazla olduğu gösterilmiştir (16,19). Buna karşın bu çalışmada mcd14 ekspresyonu periodontitisli dokularda sağlıklı dokulardan daha fazla bulunmuştur. Çalışmaların sonuçlarındaki farklılık önceki çalışmalarda örnek alımından önce periodontal başlangıç tedavisinin yapılmış olması ile açıklanabilir. KP ve Y-AgP farklı etiyoloji ve patogenize sahip hastalıklardır (20, 21). Bu çalışmada Kp ve Y-AgP hastalarının klinik periodontal parametreleri birbirine benzer bulunmuştur. Y-AgP hastalarında TLR4 ekspresyonu KP hastalarından düşük bulunmuştur ancak bu fark istatistiksel anlamlı seviyeye ulaşmamıştır. TLR4 ekspresyonu KP grubunda sağlıklı ve gingivitisli gruplardan yüksek bulunmuştur ancak Y-AgP ile sağlıklı ve gingivitisli gruplarınn TLR4 ekspresyonu benzerdir. Farklı periodontal hastalık gruplarının TLR4 ekspresyonundaki bu varyasyon lokal immun cevaptaki farklılığı göstermektedir. Dişeti epiteli, hem periodontal patojenlere karşı fiziksel bir bariyer oluşturmaktadır hem de immun cevabın düzenlenmesinde aktif olarak rol oynamaktadır (17, 22). Bu çalışmada

29 sağlıklı dokuda TLR4+ hücrelerin tüm hücreler oranı epitelin farklı tabakalarında benzer bulunmuştur. Buna karşın hastalıklı dokularda TLR4+ hücrelerin oranının epitelin bazal tabakasında diğer tabakalara oranla daha fazla olduğu gösterilmiştir. TLR lerin ekspresyonlarının epitelin farklı tabakalarında değişiklik gösterdiği yapılan önceki çalışmalarda bildirilmiştir ve dişeti epitelinin farklı tabakalarında konumlanmış hücrelerin farklı hücre safhalarında olmalarından kaynaklanabileceği bildirilimiştir (23). Beklen ve arkadaşları (15) ayrıca TLR4 ekspresyonunun bazal tabakada fazla olmasının TLR4 sentezinin özellikle bazal hücrelerde gerçekleştiğini ve superfisiyal tabakaya doğru gidildikçe azaldığını gösterdiğini göstermiştir. Ayrıca periodontitisli dokularda superfasiyel tabakalarda downregule olduklarını kendilerine özgü mikrobiyal PAMP lara bağlanarak maskelendiklerini bildirmişlerdir (15). Bu çalışmada da yapılan önceki çalışmalara benzer şekilde TLR4 ekspresyonu epitelin bazal tabakasında diğer tabakalardan yüksek bulunmuştur (15). TLR4 ve CD14 ekspresyonu periodontal hastalıklı grupların bağ doku-epitel birleşiminde yüksek bulunmuştur. Periodontal hastalığın ilerlemesinde bu bölgedeki enflamatuar yanıtın yoğunluğu düşünüldüğünde bu sonuç beklenen bir sonuçtur. TLR4 pozitif hücrelerin hastalıklı periodontal dokularda bölge1 de bölge 2 ye göre daha fazla olması farklı bakteriyel plak komponentlerinin ve enflamatuar sitokinlerin etkisi ile açıklanabilir (22,24). TLR4 ve mcd14 ekspresyonunun özellikle epitel-bağ doku bileşiminde fazla olması ve birbiri ile korelasyon göstermesi, bu reseptörlerin konak cevabının başlamasında ve dişeti enflamasyonunun ilerlemesinde etkin olmasını işaret etmektedir. Bu çalışmanın sınırları dahilinde TLR4 ve mcd14 ün periodontal dokularda eksprese olduğu ve periodontal patojenlere karşı enflamatuar cevapta görev aldığı söylenebilir. Verilerimize dayanarak periodontitisin tedavisine yönelik konak modelasyonu çalışmaları için TLR4 ve mcd14 ün uygun hedefler olduğu düşünülmektedir

30 6.Kaynaklar 1. Page RC, Offenbacher S, Schroder HE, Seymour GI, Kornman, KS (1997). Advances in pathogenesis of periodontitis: summary of developments, clinical implications, future directions. Periodontol : Hansson GK, Edfeldt K (2005). Toll to be paid at the gateway to the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol 25 (6): Beutler B (2002). Toll-like reeptors: how they work and what they do. Curr. Opin. Hematol 9: Mahanonda R, Pichyangkul S (2007). Toll-like receptors and their role in periodontal health and disease. Periodontol : Kornman KS, Page RC, Tonetti MS (1997). The host response to ther microbial challenge in periodontitis: assembling the players, Periodontol 2000, 14: Meyer DD, Fives-Tyler PM (1993). Evidence that extracellular componenets function in adherence in Actinobacillus actinomycetemcomitans to epithelial cells, Infect Immun 61: Dixon DR, Bainbridge BW, Darveau RP (2004). Modulation of the innate immune response within the periodontium. Periodontol : Hart TC (1996). Genetic risk factors for early onset periodontitis. J Peridontol 67: Butler JH (1969). A familial pattern of juvenile periodontitis (periodontosis), J Periodontol 40: Saglie R, Marfany A, Camargo P (1988). Intragingival occurrence of Actinobacillus actinomycetemcomitans and Bacteriodes gingivalis in active destructive periodontal lesions. J Peridontol 59: Underhill DM, Ozinsky A (2002). Toll-like receptors: key mediators of miccrobe detection. Curr.Opin. Immunol 14: Armitage GC (1999). Development of classification system for periodontal diseases and conditions. Ann Periodontol 4:

31 13. Saxer UP, Muhlemann HR (1975). Motivation and education, SSO Schweiz Monatsschr Zahnheilkd,85(9): Quigley GA, Hein JW (1962). Comparative cleansing efficiency of manual and power brushing. J Am Dent Assoc 65: Beklen A, Hukkanen M, Richardson R, Konttinen YT (2008). Immunohistochemical localization of Toll-like receptors 1-10 in periodontitis. Oral Microbiol Immunol 23: Ren L, Leung WK, Darveau RP, Jin L (2005). The expression profile of lipopolysaccharide-binding protein, membrane-bound CD14, and toll-like receptors 2 and 4 in chronic periodontitis. J Periodontol 76: Bartold PM. (1995). Turnover in periodontal connective tissues: dynamic homeostasis of cells, collagen and ground substances. Oral Disease 1: Dale BA (2002). Periodontal epithelium: a newly recognized role in health and disease. Periodontol : Jin L, Ren L, Leung WK, Darveau RP (2004). The in vivo expression of membranebound CD14 in periodontal health and disease. J Periodontol 75: Armitage GC, Cullinan MP (2010). Comparison of the clinical features of chronic and aggressive periodontitis. Periodontol : Ford PJ, Gamonal J, Seymour GJ (2010). Immunological differences and similarities between chronic periodontitis and aggressive periodontitis. Periodontol : Schroeder HE, Listgarten MA (2003). The junctional epithelium: from strength to defense. J Dent Res 82: Kusumoto Y, Hirano H, Saitoh K (2004). Human gingival epithelial cells produce chemotactic factors interleukin-8 and monocyte chemoattractant protein-1 after stimulation with Porphyromonas gingivalis via toll-like receptor 2. J Periodontol 75: Darveau RP, Tanner A, Page RC (1997). The microbial challenge in periodontitis. Periodontol :