Dr.A.Arzu Sayıner Dokuz Eylül Üniversitesi tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "Dr.A.Arzu Sayıner Dokuz Eylül Üniversitesi tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD arzu.sayiner@deu.edu.tr"

Metin Ölmez
8 yıl önce
İzleme sayısı:

1 Dr.A.Arzu Sayıner Dokuz Eylül Üniversitesi tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD

2 Yaklaşık 7 milyar insan hayat boyu ortalama 8-12 kronik viral enfeksiyon ile yaşıyor. Cell 2009;138:30-50

Viruslar insan mikrobiyomunun parçası Bazıları için enfekte olmayan kontol grubu bulmak mümkün değil. Hastalıktaki / sağlıktaki rolleri nedir?

3 Viruslar insan mikrobiyomunun parçası Bazıları için enfekte olmayan kontol grubu bulmak mümkün değil. Hastalıktaki / sağlıktaki rolleri nedir? Normal immun sistem üzerindeki rolleri nedir? Bir bütün olarak konakta Dokuda Viral enfeksiyonların birbirleri üzerine etkileri nelerdir? HIV + HCV HBV + HDV Viruslar insanı, insanın onları tanıdığından daha iyi tanıyor.

Normal immun sistem üzerindeki rolleri nedir?

4 Kronik Viral Enfeksiyonlar Çoğunluğu enfekte edenler genellikle hastalık oluşturmuyor (immunsupresyon dışında) Çalışmalar ve eldeki bilgiler Küçük bir grubu enfekte eden ancak enfekte olanların çoğunda hastalık oluşturan viruslar HIV HBV HCV Herpesviruslar HDV..

eldeki bilgiler Küçük bir grubu enfekte eden ancak enfekte

5 Virus, prevalans Doku Akut enf Kr Enf Normal konak Kr Enf İmmunsuprese Endojen retroviruslar %100 Tüm -?? Anellovirus/Circovirus % Birçok??? HHV-6 >%90 Lenfosit? Roseola? Meningoansefalit, HHV-7 >%90 Lenfosit? Roseola?? VZV >%90 Duyu ganglion h., lenfo Su çiçeği Zona Dissemine, pnö, hep,.. CMV %80-90 Myelomonositik h Mononükleoz Nadir Dissemine, pnö, hep,.. EBV %80-90 Farenks, B h. Mononükleoz Lenfoma, NP ca. SSS lenfoma,oral lökoplaki, lenfoproli.hst Polyomavirus BK %72-98 Böbrek?? Hemorajik sistit, nefropati Polyomavirus JC %72-98 Böbrek, SSS?? PMLE Adeno ilişkili virus %60-90 Birçok??? HSV-1 %50-70 Duyu ganglion h. Farenjit, keratit, ansefalit Uçuk, ansefalit, keratit Daha ciddi, pnömoni, hepatit Adenovirus %80 Adenoid, lenfosit ÜSYE, GE? Enterit, sistit, pnömoni, hepatit vb HSV-2 %20-50 Duyu ganglion h. Gen.herpes Gen. herpes, ansefalit Daha ciddi HHV-8 (Kaposi) %2-60 Endotel, B hücre? Sütçü hst, Kaposi s. Kaposi s., lenfoma HBV %5 Hepatosit Hepatit Siroz, CA Siroz, CA

. EBV %80-90 Farenks, B h. Mononükleoz Lenfoma, NP ca. SSS lenfoma,oral lökoplaki, lenfoproli.hst Polyomavirus BK %72-98 Böbrek?? Hemorajik sistit, nefropati Polyomavirus JC %72-98 Böbrek, SSS?

6 Virus, prevalans Doku Akut enf Kr Enf Normal konak Kr Enf İmmunsuprese GB virus C %1-4 Lenfosit??? Papillomavirus < %5 Deri epitel hücresi? Papilloma, ca Daha ciddi ve sık HCV %2,5 Hepatosit Hepatit Siroz, ca Siroz, ca HIV %0,5 CD4 T lenfo, monosit, makro. Akut ateşli hst AIDS AIDS HDV %0,2 Hepatosit? KBH alevlenmesi? HTLV 1 %0,2 T hücre? Lösemi, myelopati, dermatit, tropikal spastik paraparezi XMLV? Prostat? Prostat ca?? HTLV II, III, IV? T hücre??? Polyomavirus MC? Merkel hücreli ca? Merkel hücreli ca?? Polyomavirus KI? Akciğer??? Polyomavirus WU? Akciğer??? Rubella virus nadir SSS Rubella, artrit Progresif panansefalit? Parvovirus B19 nadir Kİ eritroid öncül h. 5.hst, artrit Aplastik kriz, hidrops fötalis, Kİ yetmezliği Kızamık virusu nadir SSS nöron-destek h Kızamık SSPE, inklüzyon cisim ansef. Koksakivirus nadir Miyokard h. El ayak ağız hst, herpanjina? Eritrosit aplazisi Miyokardit??

Lösemi, myelopati, dermatit, tropikal spastik paraparezi XMLV? Prostat? Prostat ca?? HTLV II, III, IV? T hücre??? Polyomavirus MC? Merkel hücreli ca? Merkel hücreli ca?? Polyomavirus KI? Akciğer?

7 Sunum Planı Laboratuvarın rolü Tanıda İzlemde VİRAL YÜK testleri özellikler, sıkıntılar Antijen testleri Genotiplendirme testleri Direnç mutasyonlarının saptanması Ufukta ne var?

8 Kr. Enfeksiyonların Mikrobiyolojik Tanısı Antijen-antikor testleri HBsAg >6 ay pozitiflik Ag+Ab, Antikor testleri p24 Ag +Anti-HIV Anti-CMV Anti-HCV Hastalığın patogenezine ve amaca göre tanı algoritmaları Konağın özellikleri Patojenin özellikleri Anti-parvovirus B19 Antikor testlerinin yetersiz kaldığı durumlar Erken dönem enfeksiyonda tanı (Tanısal pencere dönemi) Yenidoğanlarda konjenital enfeksiyon tanısı İmmunsupresyonda tanı Nükleik Asid Testleri HPV tanısı HCV tanısı Polyomaviruslar tanısı Herpesvirusların tanısı

Anti-parvovirus B19 Antikor testlerinin yetersiz kaldığı durumlar Erken dönem enfeksiyonda tanı (Tanısal pencere dönemi)

9 Kr. Viral Enfeksiyonlarda İzlem Viral Yük NAT ve Antijen testleri Hastalığın prognozu Tedavi başlama kararı Tedavi içeriğini ve süresini belirleme Tedavi başarısını izleme İlaç direncini saptama Genomik farklılıklar Re-aktivasyonları/re-enfeksiyonları saptama Genotipleme Hastalığın prognozu Tedavi seçeneklerine karar verme İlaç direncini saptama Alternatif tedavi seçeneklerini belirleme Viral yük Prognoz

farklılıklar Re-aktivasyonları/re-enfeksiyonları saptama Genotipleme Hastalığın prognozu Tedavi

10 KBH de Viral Testlerin Kullanımı - 1 Tedaviye başlama Sirozu olmayan hastalarda 2000 IU/ml (+diğer kriterler) Tedavi seçeneklerini belirleme IFN lehine HBV DNA < IU/ml Genotip A veya B

11 Tedavi başarısını belirleme KBH de Viral Testlerin Kullanımı - 2 Primer yanıtsızlık: 3. ayda <1log 10 azalma Virolojik yanıt: IFN için 6. ayda <2000 IU/ml, NA için 6. ayda viral yükte >1log 10 düşüş olması ve 12. ayda HBV DNA saptanmaması Virolojik kırılma direnç veya diğer tedavi sorunları Viral yükte, tedavide ulaşılan en düşük viral yüke göre >1log 10 artış olması Kalıcı viral yanıt Tedavi kesildikten 6-12 ay sonraki yanıt

ayda viral yükte >1log 10 düşüş olması ve 12.

12 Kantitatif HBV DNA mı HBsAg mi? X IF N PEG-IFN SVR için NPV % ayda HBsAg düşüş olmaması ve HBV DNA <2log10 X Hepatoselüler ca gelişim riski HBeAg (-) X Nükleos(t)id HBsAg <1000 IU/ml HBV DNA <2000 IU/ml HBV DNA HBsAg analogları Liver Int 2013;33(Suppl 1) :

13 HBV de antiviral ilaç direnci Lancet Infect Dis 2012;12:341-54

14 HBV de ilaç direnci mutasyonları Genotipik yöntemler Dizi analizi Hibridizasyon Realtime PCR Fenotipik yöntemler Lancet Infect Dis 2012;12:

15 Genotip belirleme HCV PEG-IFN + Ribavirin Tip 1 ve 4 48 hft Tip 2 ve 3 24 hft PEG-IFN + Ribavirin + Direkt etkili antiviral (Boceprevir, telaprevir) Tip 1 Yöntemler Dizi analizi Hibridizasyon Realtime PCR

16 Viral Yük

17 Viral Yük Testleri Duyarlılık Analitik Klinik Özgüllük Analitik Klinik Kesinlik Çalışma içi Çalışmalar arası Doğruluk Kantitasyon aralığı (Doğrusallık = Linearite) BİYOLOJİK DEĞİŞİKLİK - Teknik Değişkenler T Nolan, J Huggett, E Sanchez, Good practice guide for the application of quantitative PCR (qpcr), LGC (2013)

(Doğrusallık = Linearite) BİYOLOJİK DEĞİŞİKLİK - Teknik Değişkenler T Nolan, J

18 HBV Viral Yük Testleri (RealTime PCR) Üretici Roche Kitin adı COBAS TaqMan HBV test v2.0 COBAS Ampliprep TaqMan HBV test v2.0 NA ekstraksiyon Manüel High Pure Cobas Ampliprep Örnek hacmi Duyarlılık IU/ml Kantitasyon IU/ml ,7x 10 8 Abbott RealTime HBV m2000sp Qiagen Artus HBV QS-RGQ QiaSymphony ,2 31,6 2x10 7

0 NA ekstraksiyon Manüel High Pure Cobas Ampliprep Örnek hacmi 650 650 Duyarlılık IU/ml

19 HCV Viral Yük Testleri (RealTime PCR) Üretici Roche Abbott Kitin adı COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 COBAS Ampliprep TaqMan HCV Test,v2.0 RealTime HCV NA ekstraksiyon Manüel High Pure Cobas Ampliprep m2000sp Örnek hacmi Duyarlılık IU/ml Kantitasyon IU/ml 25 4x x x10 8 Qiagen Artus HCV QS-RGQ QiaSymphony ,7x10 7 Siemens VERSANT HCV RNA 1.0 Assay SP Modül x10 8

0 RealTime HCV NA ekstraksiyon Manüel High Pure Cobas Ampliprep m2000sp Örnek hacmi 650 650 200 500

20 Yerli üreticilerin kitleri

21 Analitik duyarlılık %95 olasılıkla saptanabilen en düşük analit miktarı

22 Servikal ca - Tanı testleri Sitolojik Virolojik Pap smear HPV DNA nın saptanması Sıvı bazlı sitoloji Hibridizasyon esaslı PCR esaslı (PPV )

23 Kantitasyon Aralığı Güvenilir kantitasyon yapılabilen en düşük ve en yüksek değerlerin arası testte bulunan değer (log10) 10,00 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 VQC değeri (log10) kopya/ml y = 0,9899x - 0,0922 R 2 = 0,9829

24 Test raporu HCV RNA pozitif < 25 IU/ml HCV RNA saptanmadı Negatif Kantitasyon alt sınırı (LLOQ) Saptama alt sınırı (LOD) <Kantitasyon alt sınırı >Saptama alt sınırı < Saptama alt sınırı Kantite edilebilen en düşük analit miktarı %95 saptanabilir, %5 saptanamaz analit miktarı Kantitasyon alt sınırı ile aynı veya daha düşük olabilir. Analit saptanabilir ancak kantite edilemez Reaksiyon yok Saptanabilir ve kantite edilebilir Saptanabilir, kantite edilebilir veya edilemez Saptanabilir ama kantite edilemez Analit yok veya saptanamayacak düzeyde

25 Kesinlik (Tekrarlanabilirlik) ve Doğruluk Tekrarlanan çalışmalardan elde edilen değerler birbirlerinden ne kadar farklı? Doğru Tekrarlanabilir - Kesin Kesin değil SD veya varyasyon katsayısı Test içi Doğru değil Testler arası Belirlenen değer gerçek değer mi? Referans materyal kullanımı

26 Dış Kalite Kontrol Sonuçları (HBV DNA) 231 katılımcının 219 u ticari real-time PCR (%94,8) Pozitif örneklerde doğru saptama oranları % arası Sonuçlarını IU/ml olarak bildirenlerde (n:231) SD 0,206-0,290 log10 IU/ml Sonuçlarını kopya/ml olarak bildirenlerde (n:21) SD 0,396 0,644 log10 IU/ml QCMD HBV DNA paneli, 2013

27 Dış Kalite Kontrol Sonuçları (HCV RNA) 235 katılımcı SD to log10 IU/ml QCMD HCV RNA paneli, 2013

28 NAT STANDARTI GELİŞTİRME ÇALIŞMALARI Amaç: Laboratuvarlar arası doğru ve karşılaştırılabilir ölçümü sağlayacak standartlar üretmek The International SoGAT Clinical Diagnostics Working Group

29 CMV Standardı İki farklı yaklaşım NIST (ABD) ve NIBSC (WHO) NIST Yöntemden bağımsız değer Saf viral DNA SI ( Système International ) değerine fosfor kantitasyonu ile ulaşılabilirlik Materyalin kopya sayısı ve tüm özelliklerini tanımlanmış Sonsuz üretim NIBSC Yönteme bağımlı değer WHO standardı, matriks içinde virus Limitli üretim IU yapılan çalışmalardan elde edilen konsensus değer

30 DSÖ - NAT Standartları HIV-1 RNA 3. standart HIV-2 RNA HCV RNA 4. standart HBV DNA 3. standart Parvovirus B19 DNA 2. standart HAV RNA CMV DNA EBV DNA VZV DNA HSV tip 1 ve 2 İnsan adenovirus serotip2 HPV DNA tip 16 HPV DNA tip 18 Norovirus GI ve GII Solunum virusları İnfluenza virus (A/Christchurch/1/2003, H1N1) İnfluenza virus (B/Jiangsu/10/2003) İnsan metapneumovirus İnsan parechovirus İnsan rhinovirus genotip A Parainfluenza virus tip 1 ve 4 RSV A2

31 Ufukta ne var?

32 Yeni kuşak sekanslama testleri Yeni virusların kültürden ve sekansdan bağımsız olarak keşfi Tx ilişkili yeni arenavirus Uganda da Bundibugyo Ebola virus İnsan viromu araştırmaları Viral genomun bütününün dizisinin çıkarılması HIV, inf, Türümsülerin saptanması, kinetik analizler ( ultradeep sequencing ) HCV, HIV, HBV Çeşitli değişkenlerin türümsüler üzerine etkileri Türümsülerin tedavi üzerine etkileri HIV de tropizm açısından türümsüler ve CCR5 antagonist (maraviroc) tedavisindeki etkileri HBV ilaç direnci gelişiminde türümsüler Salgınların izlenmesi IV ilaç bağımlılarında HCV salgını Clin Microbiol Infect 2013; 19: Virus rezervuarlarının oluşumunda türümsüler

33 Yeni kantitasyon yöntemleri Dijital PCR Referans veya standartlara gerek yok. Kompleks karışımlar incelenebilir. Konsantrasyondaki çok küçük değişiklikler saptanabilir. Daha doğru ve hassas kantitasyon Minor mutasyonlar saptanabilir. Reaksiyon, yüzlerce binlerce küçük kompartmana bölünerek gerçekleştirilir ve son nokta analizi yapılır. Poisson dağılımına göre ana örnekteki DNA miktarısaptanır.

34 Yeni Saptama Yöntemleri

Benzer belgeler

VİRAL HEPATİTLER 5. Sınıf Entegre Ders. Prof. Dr. Fadıl VARDAR Prof. Dr. Sema AYDOĞDU

VİRAL HEPATİTLER 5. Sınıf Entegre Ders Prof. Dr. Fadıl VARDAR Prof. Dr. Sema AYDOĞDU Kronik Viral Hepatitler Sporadik Enfeksiyon ENDER HBV HCV HDV Ulusal Aşılama Programı Erişkinlerin Sorunu HFV, HGV,