T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI

Transkript

1 T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI ÇAM KESETIRTILI (Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff)) (LEPIDOPTERA: THAUMETOPOEIDAE) NA KARŞI FARKLI ENTOMOPATOJEN FUNGUS İZOLATLARININ ETKİNLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMANMARAŞ Eylül-2006

2 KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI ÇAM KESETIRTILI (Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff)) (LEPIDOPTERA: THAUMETOPOEIDAE) NA KARŞI FARKLI ENTOMOPATOJEN FUNGUS İZOLATLARININ ETKİNLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI YÜKSEK LİSANS TEZİ Kod No: Bu Tez 29/ 08/ 2006 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oy Birliği ile Kabul Edilmiştir. İmza İmza İmza Prof. Dr. Doç. Dr. Doç. Dr. Cafer MART Hasan TUNAZ Ekrem ATAKAN DANIŞMAN ÜYE ÜYE Yukarıdaki imzaların adı geçen öğretim üyelerine ait olduğunu onaylarım. İmza ve Mühür Prof. Dr. Özden GÖRÜCÜ Enstitü Müdürü Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZET... I ABSTRACT... II ÖNSÖZ... III ÇİZELGELER DİZİNİ... IV ŞEKİLLER DİZİNİ V SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ. VI 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Yurt İçinde Yapılan Çalışmalar Yurt Dışında Yapılan Çalışmalar MATERYAL ve METOT Arazi Çalışmaları Laboratuar Çalışmaları Galleria mellonella Kültürü Tuzak Böcek Kullanılarak Topraktan Fungus İzole Edilmesi Topraktan Doğrudan Fungus İzole Edilmesi İzole Edilen Fungusların Zararlı Larvalarına Etkilerinin Test Edilmesi Spor Süspansiyonunun Hazırlanması Spor Süspansiyonlarının Böceklere Uygulanması Verilerin Değerlendirilmesi BULGULAR VE TARTIŞMA Elde Edilen Funguslar Elde Edilen Fungus İzolatlarının Thaumetopoea pityocampa Larvalarına Etkileri SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ. 23

4 ÖZET KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ ÖZET ÇAM KESETIRTILI (Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff)) (LEPIDOPTERA: THAUMETOPOEIDAE) NA KARŞI FARKLI ENTOMOPATOJEN FUNGUS İZOLATLARININ ETKİNLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI DANIŞMAN: Prof. Dr. Cafer MART Yıl: 2006 Sayfa: 23 Jüri: Prof. Dr. Cafer MART : Doç. Dr. Hasan TUNAZ : Doç. Dr. Ekrem ATAKAN Bu çalışma Kahramanmaraş ilinde, Kürtül ve Karacasu yörelerinde Thaumetopoea pityocampa larvalarının bulunduğu doğal ortamlarda topraklarda bulunan entomopatojen fungusların T. pityocampa larvalarına etkisini belirlemek için yapılmıştır. ve tuzak böcek yöntemi (Galleria mellonella ve T. pityocampa larvaları) kullanılarak Paecilomyces cinsine ait 16, Beauveria cinsine ait 19 tane olmak üzere toplam 35 entomopatojen fungus izolatı elde edilmiştir. Bunlardan seçilen Paecilomyces cinsine ait 3 (PKT2, PŞT6, PŞG11) ve Beauveria cinsine ait 5 (BŞT7, BŞG10, BKT15, BKG18, BKÇ19) fungus izolatı 1.5x10 7 konidi/ml konsantrasyonunda 5. dönem T. pityocampa larvalarına karşı daldırma yöntemi ile test edilmiştir. Deneme 3 tekerrürlü olarak kontrollü şartlarda (27±2 ºC sıcaklık, 16/8 ışıklanma, %60±5 nisbi nem) yapılmıştır. Larva ölümleri 5-6. günlerde başlamış olup BKT15 ve BKT18 izolatlarında 11. günde, BŞT7 ve BŞG10 izolatlarında 12. günde %100 e ulaşırken PŞT6 ve PŞG günde %82-84 de kalmıştır. Beauveria cinsine ait funguslar ölen larvaların %50-84 ünde Paecilomyces cinsine ait funguslar %28-31 inde fungal gelişim göstermiş ve sporulasyon yapabilmiştir. Bu bulgular, Paecilomyces cinsinden seçilen 3 ve Beauveria cinsinden seçilen 5 fungus izolatının 5. dönem T. pityocampa larvalarını öldürdüğünü göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Beauveria, Paecilomyces, Thaumetopoea pityocampa, Fungus izolasyonu, Tuzak böcek yöntemi. I

5 ABSTRACT UNIVERSITY OF KAHRAMANMARAŞ SUTCU IMAM INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF PLANT PROTECTION MSc THESIS ABSTRACT A RESEARCH ON THE EFFICIENCY OF DIFFERENT ENTOMOPATHOGENIC FUNGUS ISOLATES AGAINST PINE PROCESSIONARY MOTH (Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff)) (LEPIDOPTERA: THAUMETOPOEIDAE) Supervisor : Prof.Dr. Cafer MART Year :2006 Pages :23 Jury : Prof.Dr. Cafer MART : Assoc. Prof.Dr. Hasan TUNAZ : Assoc. Prof.Dr. Ekrem ATAKAN This study was carried out to isolate entomopathogenic fungi from soil samples taken from pine forests where Thaumetopoea pityocampa exist in there locations (, Kürtül and Karacasu) in Kahramanmaraş, and to demonstrate their effects to T. pityocampa larvae. A total of 35 entomopathogenic fungi (16 Paecilomyces and 19 Beauveria) were isolated by direct isolation and insect bait methods. Both Galleria mellonella and T. pityocampa were used as baits. The selected 3 Paecilomyces isolates (PKT2, PŞT6, PŞG11) and 5 Beauveria isolates (BŞT7, BŞG10, BKT15, BKG18, BKÇ19) were tested against the 5th larval instars by dipping into conidial suspensions at the concentration of 1.5x10 7 conidia/ml. The experiment was conducted three times in controlled laboratory contitions (27±2 ºC, 16/8, 95%). Larval mortality started 5-6 days after treatment and reached 100% on the 11th day for BKT15 and BKT18, and 12th day for BŞT7 and BŞG10 while the mortality was 82-84% for PŞT 6 and PŞG 11 on the 12th day. Fungal growth and sporulation occurred on the 50-84% and 28-31% of the dead larvae as a result of Beauveria and Paecilomyces infections respectively. The results showed that the selected 3 Paecilomyces and 5 Beauveria isolates are capable of killing the 5th larval instars of T. pityocampa. Key Words: Beauveria, Paecilomyces, T. pityocampa, Fungus isolation, Insect bait method. II

6 ÖNSÖZ ÖNSÖZ Bu çalışmada çam kesetırtılı (Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff)) (Lepidoptera: Thaumetopoeidae) nın doğal yaşam ortamlarında bulunan ve zararlıya karşı etkili olabilecek entomopatojen fungus izolatları araştırılmıştır. Her türlü desteklerini ve özverisini esirgemeyen danışman hocam Prof. Dr. Cafer MART a, istatistiki analizlerimde bana yardımlarını esirgemeyen Bitki Koruma Bölüm Başkanı Doç. Dr. Ali Arda IŞIKBER ve Doç. Dr. Hasan TUNAZ a, bana bu araştırma konusunu veren, Yüksek Lisans programı süresince yardımlarını esirgemeyen ve fungus izolatlarının teşhisini yapan ilk danışman hocam Yrd. Doç. Dr. M. Kubilay ER e şükranlarımı sunarım. Gerek arazi çalışmalarında gerekse laboratuar çalışmalarında bana yardımcı olan Bitki Koruma Bölümündeki Yüksek lisans yapan bütün arkadaşlarıma teşekkür ediyorum. Eylül 2006 KAHRAMANMARAŞ III

7 ÇİZELGELER DİZİNİ ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1.1 SAYFA Thaumetopoea cinsine bağlı türlerde hastalık oluşturduğu tespit edilen mikroorganizmalar... 1 Çizelge 4.1. Elde edilen Paecilomyces cinsi fungus izolatları.. 13 Çizelge 4.2. Elde edilen Beauveria cinsi fungus izolatları Çizelge 4.3. Fungus uygulaması sonucunda Thaumetopoea pityocampa larvalarında görülen ölü birey sayıları. 15 Çizelge 4.4. Seçilen fungus izolatları ve çimlenme oranları 16 Çizelge 4.5. Çizelge 4.6. Çizelge 4.7. Fungus uygulaması sonucunda ölen Thaumetopoea pityocampa larvalarında ölü birey oranları. 16 PKT 2 ve BKÇ 19 uygulaması sonucunda ölen Thaumetopoea pityocampa larvalarında ölü birey oranları. 17 Fungus uygulaması sonucunda ölen Thaumetopoea pityocampa larvaları üzerinde fungus gelişen birey oranları.. 17 IV

8 ŞEKİLLER DİZİNİ ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Paecilomyces sp. fungus konidileri ve konidiofor yapısı. 8 Şekil 3.2. Şekil 3.3. Paecilomyces sp. kültürü (PDA ortamında 26±2 ºC sıcaklıkta ve 16/8 saat aydınlık karanlık ışıklanma ortamında inokulasyondan 3 hafta sonra) Beauveria sp. kültürü(pda ortamında 26±2 ºC sıcaklıkta ve 16/8 saat aydınlık karanlık ışıklanma ortamında inokulasyondan 3 hafta sonra).. 10 Şekil 3.4. Beauveria sp. fungus infeksiyonu sonucunda ölen Thaumetopoea pityocampa larvaları Şekil 3.5. Entomopatojen fungus süspansiyonu uygulanan Thaumetopoea pityocampa larvaları ve çam ibreleri olan kültür kutusu Şekil 3.6. İnokulasyondan 24 saat sonra su agar ortamında Beauveria sp konidilerinin çimlenmesi (27±2 ºC, 16/8 ışıklanma) 12 V

9 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ŞAHİN HÜSEYİN SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ Etoh :Ethanol μl :Mikrolitre hypo :Sodyum hipoklorit G. m. :Galleria mellonella T. p. :Thaumetopoea pityocampa IJ :İnfektif jüvenil VI

10 GİRİŞ 1. GİRİŞ Kahramanmaraş ta hektarlık ormanlık alanın hektarını kızılçam oluşturmaktadır. Ülkemizdeki ormanların 1.5 milyon hektar alanında zarar yapan çam kesetırtılı kızılçam ve diğer çam ağacı türlerinde %60 büyüme kaybına yol açmaktadır (Taşolar, 2002). Çam kesetırtılının Akdeniz bölgesindeki döl süresi 1 yıldır. Böcek toprakta pupa olmaktadır. Bazı bireylerin pupa dönemindeki diyapoz süresinin 1-3 yıl sürebildiği belirlenmiştir. Böyle durumlarda döl süresi 2-4 yıl olmaktadır (Özkazanç, 2002). Çam kesetırtılları çam yapraklarını yiyerek beslenir ve bir çam ağacında bulunan bir koloni tüm ağacı kurutabilir. Larva zararına uğramamış bir ağaç yapraklarının tamamı ile fotosentez yapabilirken, larva zararına uğramış bir ağaç sadece Nisan ayında çıkan yaprakları ile fotosentez yapabilmektedir (Babur, 2002). Çam kesetırtılı geniş alanlarda zarar yapmasından ve pirimer bir zararlı olmasından dolayı çeşitli savaş yöntemleri uygulanmaktadır. Çam kesetırtılı larva döneminde zarar vermesinden dolayı mücadelesi özelikle larva döneminde yapılmaktadır. Funguslar, bakteriler, virüsler gibi entomopatojenler çam kesetırtılını baskı altına almada kullanılabilecek mikroorganizmalardır. Çam kesetırtılında hastalık oluşturan mikroorganizmalar Çizelge 1.1. de belirtilmiştir. Çizelge 1.1. Thaumetopoea cinsine bağlı türlerde hastalık oluşturduğu tespit edilen mikroorganizmalar Hastalık etmeni Türü Grubu Kaynak Virüsler CPV Reoviridae Martignoni ve Iwai, 1981 NPV Baculoviridae Martignoni ve Iwai, 1981 Bakteriler Bacillus sp. Bacillaceae Battisti ve ark., 1998 Funguslar Metarhizium anisopliae Hypomycetes Welton ve Tyrell, 1990 Paecilomyces farinosus Hypomycetes Battisti ve ark., 1998 Beauveria bassiana Hypomycetes Battisti ve ark., 1998 Verticillum lecanii Hypomycetes Battisti ve ark., 1998 Protozoalar Pleistophora sp. Microsporodia Issi ve Lipa, 1968 P. schubergi Microsporodia Issi, 1971 P. schubergi suchubergi Microsporodia Sprague, 1977 Nosema bombycis Microsporodia Sprague,

11 GİRİŞ Entomopatojen funguslar içerisinde özellikle üretim ve uygulamadaki problemlerin daha az olması nedeni ile Hyphomycetes grubundaki türler üzerinde mikrobiyal mücadele için çalışmalar yürütülmüştür. Bu çalışmalar sonucunda bazı türlerin (örn; Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces fumosoroseus) izolatlarını içeren preperatlar ticari olarak kullanılabilecek aşamalara gelmiştir ( Butt ve ark., 1999). Entomopatojen fungusların özellikle uygulama sonrasında, çimlenme ve penetrasyon aşamalarında, bulundukları ortam koşullarından etkilenmeleri kullanım olanaklarını kısıtlamış ancak formulasyondaki ilerlemeler bu kısıtlamaların da aşılabilecek olduğuna işaret etmektedir. Aynı zamanda uygulamanın şekli ve zamanının iyi ayarlanması da bu sınırlamaların üstesinden gelmede yararlı olabilmektedir ( Butt ve ark., 1999; Wraigt ve Carruthers, 1999). Entomopatojenlerin mikrobiyal mücadelede kullanımları üzerine çalışmalar her ne kadar kimyasal ilaçlar gibi preperasyon hazırlanıp uygulanması yönünde olmakta ise de bu etmenler özellikle çok yıllık plantasyonlarda zararlının bulunduğu bölgeye yerleştirilmesi şeklinde de kullanılabilmektedir (Lacey ve Goettel, 1995). Orman arazilerinde öncelikli olarak bu yöntemin hedef alınması hem uygulamanın yapılabilirliği hem de sürekli olarak zararlı populasyonunun baskı altında tutulabilmesi açısından yararlı olacaktır. Çam ormanlarında ağaçlara en fazla zarar veren böcek çam kesetırtılıdır. Bu zararlının mücadelesinde kimyasal ilaçların kullanımındaki uygulama zorluklarının yanı sıra çevreye ve hedef olmayan canlılara olan negatif etkileri alternatif mücadele yöntemleri arayışına sürüklemiştir. Bu çalışmada ormanlara zarar veren böcekler içerisinden oldukça önemli bir zararlı olan çam kesetırtılı ile mücadele edebilmek için entomopatojen funguslar tespit edilerek zararlıya karşı denenmiştir. Zararlının bulunduğu topraklardan entomopatojen funguslar izole edilmiş ve zararlı üzerine öldürme etkileri araştırılmıştır. 8

12 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Yurt içinde Yapılan Çalışmalar Hızal ve Ayberk (2002) in bildirdiğine göre, Özkazanç (1986), Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi Tarım Ürünleri Teknolojisi Bölümü, Mikrobiyoloji Birimi tarafından üretilen ve içeriği Bacillus thuringiensis var. kurstaki olan preparatı Kilis- Hazaltepe ağaçlandırma sahasında Çam kesetırtılının 1-3 dönem larvalarına karşı uygulamıştır. 100 litre suya 150 gr B. t. var. kurstaki preparatı karıştırılmasıyla elde edilen süspansiyon (150gr/100lt) larvalara uygulandığında %96.8 oranında ölüme neden olduğunu bulmuştur. Er ve ark. (2004), beş farklı türden sekiz entomopatojen fungus izolatının ( iki Beauveria bassiana, iki Paecilomyces fumosoroseus, bir P. farinosus, bir Verticillum lecanii, iki Tolypocladium cylindrosporum) çam kesetırtılı nın son dönem larvaları üzerine etkisini araştırmışlardır. Denenen funguslar içerisinden en iyi sonucu P. fumosoroseus un bir ırkı vermiştir. Fungusun %95.0 ölüme neden olduğu ve Çam kesetırtılının yarısından fazlasında sporulasyon yaptığını bulmuşlardır Yurt Dışında Yapılan Çalışmalar Triggiani ve Sidor (1982), 1979 ve 1982 yıllarında İtalya da, Puglia da 15 yıllık bir Pinus halepensis plantasyonunda Bacillus thurungiensis in 5 ticari preperatını ve 2 virüs preperatını Thaumetopoea pityocampa ya karşı test etmişlerdir yılında Thuricide HP (B.t. subsp. kurstaki serotip 3a-3b) g/hl dozunda uygulanmış ve 12 günde tüm larvaların ölümü sağlanmıştır yılında ise Bactucide (B.t. serotip 3a-3b) 500 gr dozunda uygulanmış ve bu preperatın zararlıya karşı en etkili ürün olduğu sonucuna varılmıştır. Uygulanan virüsler içerisinde NPV ve CPV kombinasyonu (6x10 5 polyhedra/g) 10 gün sonunda %95 ölüm ile sonuçlanırken NPV ün tek başına kullanımı sonucunda larvalardaki ölüm oranının %70-75 olduğu tespit edilmiştir. Paparatti ve Fabozzi (1988), daha önce T. pityocampa yı enfekte ettiği rapor edilmiş olan V. lecanii nin zararlı larvaları üzerindeki patojenitesini ortaya koymak için, birisi oda koşullarında (6-19 C sıcaklık, 10/14 ışıklanma ve %94 nisbi nem) diğeri ise kontrollü şartlarda ( C sıcaklık, 16/18 ışıklanma ve %94 nisbi nem) iki deneme yürütmüşlerdir. Çalışma sonucunda fungusun patojenitesinin düşük sıcaklık koşullarında daha yüksek olduğu ve tüm larvaların 6. gün sonunda öldüğü bildirilmiştir. Vargas-Osuna ve ark., (1994), yıllarında, İspanya da, T. pityocampa larvalarının parazitoit ve patojenlerini belirlemek için bir survey çalışması yapmışlardır. Çalışma sonucunda ikisi Tachinidae familyasından (Phryxe caudata ve Compsilura conninnata), birisi Braconidae familyasından (Meteorus versicolor) üç parazitoid ve iki hiperparazitoit (Pteromalus chrysos ve Gelis sp.) tespit edilmiş olup zararlı larvalarında iki Bacillus thurungiensis subsp. aizawai, bir B.t. subsp. konkukian, bir CPV (cytoplasmic polyhedrosis virus) ve bir Beauveria bassiana izolatı elde edilmiştir. Battisti ve ark., (1998), İtalya da çam kesetırtılı savaşında tarama testlerini geçen ve rutin uygulamalarda kullanılabilecek olan bir mikrobiyal mücadele etmeni olarak sadece 9

13 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bacillus thurungiensis subsp. kurstaki nin bulunduğunu bildirmektedir. Bakterinin zararlıya karşı arazi uygulamalarındaki düzensiz performansının (%20-85 ölüm oranı) hem uygulama dozunda hem de zararlı populasyonun bazı parametrelerindeki büyük farklılıklarla ilişkili olduğunu belirtmişlerdir. Bakterilerin ibrelerde sınırlı bir süre kalmasından dolayı zararlının en hassas dönemlerine (1. ve 2. larva dönemleri) karşı tek bir uygulamanın yeterli olmadığını, yumurtadan çıkış sürecinin bir aydan uzun olduğu yerlerde mücadele için iki uygulamanın gerekli olduğunu bildirmişlerdir. Zararın kısmen tolere edilebileceği yerlerde ise daha yüksek dozlarda 3. ve 4. larva dönemlerine karşı kış uygulamasının alternatif bir yöntem olabileceğini öne sürmüşlerdir. Avtzis (1998), 1993 yılı Ekim ve Kasım aylarında Yunanistan ın Thessaloniki yakınlarındaki Kedrinos Lofos bölgesindeki yaşındaki kızılçamlarda bulunan Thaumetopoea pityocampa nın yeni çıkmış larvaları ve yumurtalarına iki uygulamada içeriği Bacillus thurungiensis var. kurstaki olan Foray 48B ve Bactospeine (16.00 IUAK/mg) ile Diflubenzuron 25 WP uygulamışlardır. Yapılan uygulama sonucunda bu ilaçların yumurta ölümüne yol açmadığını, yumurtadan çıkışı belirgin şekilde engellemediğini bulmuşlardır. Aynı insektisitlerin larvalar üzerinde %90 ölüme neden olduğunu ve ilk uygulamada yumurtadan çıkmış yeni larvalar üzerinde de etkili olduğunu bulmuşlardır. Triggiani ve Tarasco (2001), 2000 yılında güney İtalya da bir Pinus halepensis plantasyonunda bulunan çam kesetırtıllarına karşı 3 steinernematid entomopatojen nematod ırkı ile bir ön çalışma yürütmüşlerdir. Çalışmada bir keseye IJ/20 ml jel (Idrosorb SR Nigem) süspansiyonu enjekte edilmiş ve ölümler 10 gün ara ile 30 gün takip edilmiştir. Steinernema feltiae nin bu yöntem ile kışlayan zararlı populasyonlarını düşürmek için uygulanabilir olduğu, nematodun 20 günden fazla keselerde kaldığı, bir kısım nematodun hayat döngüsünü tamamlama ihtimalinin bulunduğu ve çam kesetırtılı paraziti Phryxe caudata ya çok düşük etkisinin bulunduğu sonuçlarına varılmıştır. Triggiani ve Tarasco (2002), yıllarında yürüttükleri bir çalışmada kışlayan T. pityocampa ya karşı Steinernema feltiae, S. carcocapsea ve Heterorhabtitis bacteriophora ın su ve jel (Idrosorb SR (Nigem) ve Compex) süspansiyonları keselere uygulanarak test edilmiştir. Çalışma sonuçları, jel süspansiyonunun keselerden sızmadığını ve suyun jelden yavaş bırakılmasının nematodlara yaşama olanağı ve hayat döngülerini tamamlama olanağı sağladığını ortaya koymuştur. Ayrıca bu yöntemin kışlayan larva populasyonlarını düşürmede uygulanabilir olduğu ve Phryxe caudata ya negatif etkisinin bulunmadığı gösterilmiştir. Triggiani ve Tarasco (2003), 2001 yılında Güney İtalya da Thaumetopoea pityocampa nın kışlayan larvalarına karşı 3 nematod türünü (Steinernema feltiae, S. carcocapsea ve Heterorhabtitis bacteriophora) jel süspansiyonu halinde keselere enjeksiyon ile test etmişlerdir. En iyi sonucu populasyonun %50 sinden fazlasını etkileyen S. feltiae vermiş olup, uygulanan nematod böcek üzerinde hayat çemberini tamamlayabilmiştir. Hozzank ve ark. (2003), 1998 ve 1999 yıllarında Avusturya nın alçak bölgelerindeki ormanlık araziden, bağ arazisinden meyve bahçesinden, yol kenarındaki çalılık araziden, nadasa bırakılmış araziden ve ekim yapılmış araziden aldıkları toprak 10

14 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR örneklerindeki entomopatojen fungus ve entomoparazit nematod türlerini Galleria mellonella ve Tenebrio molitor (L.) larvalarını tuzak böcek olarak kullanılarak tespit etmişlerdir. Entomopatojen fungus türleri toprak örneklerinin önemli bir kısmında (%84 ünde) bulunmuştur. En yaygın olarak iki fungus türü, Beauveria bassiana (%74), Metarhizium anisopliae (%29) bulunmuştur. Paecilomyces fumosoroseus ise örneklerin sadece %3 ünden izole edilmiştir. Entomoparazit nematod türlerinin tüm toprak örneklerinin % 25 inde bulunduğu ortaya konulmuştur. 11

15 MATERYAL ve METOT 3. MATERYAL ve METOT 3.1. Arazi Çalışmaları Bu çalışmada, toprak örneklerindeki entomopatojen fungusları izole edebilmek için Thaumetopoea pityocampa ve Galleria mellonella larvaları olmak üzere iki böcek türü kullanılmıştır. Ayrıca yarı seçici bir ortam kullanılarak topraktan doğrudan fungus izolasyonda yapılmıştır. Her iki böcek ile ve yarı seçici besi ortamı ile örneklerden izole edilen entomopatojen fungusların 5. dönem T. pityocampa larvalarına karşı etkileri test edilmiştir. Toprak temin etmek için Kahramanmaraş ilinde, çam kesetırtılının yoğun olarak bulunduğu birbirinden uzak üç farklı bölge olan yöresi, Karacasu yöresi ve Kürtül yöresinde, üç farklı orman arazisinden 2005 yılı ilkbahar (Mart-Nisan) aylarında toprak örnekleri alınmıştır. Toprak örnekleri bir bölgenin 10 farklı yerindeki çam kesetırtılının bulunduğu çam ağaçlarının altından, toprak yüzeyinin ilk 5 cm tabakasından ve toprak burgu aleti ile tesadüfi olarak alınmış, alınan topraklar plastik poşetlere konulmuş ve iyice karışması sağlanarak laboratuara getirilmiştir. Her bir bölgeden ortalama 2 kg toprak örneği laboratuara getirilmiştir. T. pityocampa larvaları temin etmek için 2005 yılı ilkbahar aylarında (Mart-Nisan), böceğin yoğun olarak bulunduğu çam ağaçlarındaki keseler toplanmıştır. Toplanan keseler plastik poşetlere bırakılmış ve laboratuarda buz dolabında muhafaza edilmiştir Laboratuar Çalışmaları Galleria mellonella kültürü Galleria mellonella larva kültürleri oluşturmak amacı ile Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Zootekni Bölümünden G. mellonella pupaları alınmıştır. G. mellonella pupaları 1 litre hacminde kültür kavanozlarına bırakılmış ve kavanozların ağzı 2 kat tül ile kapatılmış ve Bitki Koruma Bölümü iklim odasında (27±2ºC sıcaklık, %60±5 nisbi nem) gelişmeye bırakılmıştır. Pupalardan çıkan erginler her gün ayrı ayrı kültür kavanozlarına alınmıştır. Kelebeklerin yumurta bırakabilmesi için her kavanoza zig-zag şeklinde katlanmış kurutma kağıtları yerleştirilmiştir. Yumurtadan çıkan larvalar için besin ortamı (200 ml süzme bal, 250 ml gliserin, 100 ml saf su, 200 ml kıyılmış bal peteği ve 2 lt buğday kepeği homojen karışımı) hazırlanmış ve kültür kavanozlarına konulmuştur. Bu sayede yaşları aynı G. mellonella larvaları elde edilmiştir Tuzak Böcek Kullanılarak Topraktan Fungus İzole Edilmesi Ormanlardan laboratuara getirilen topraklar ayrı ayrı plastik küvetlerde iyice karıştırılmış, içerisinde bulunan yabancı maddelerden (yaprak, taş, odun parçası vb.) arındırmak amacı ile iklim odasında (20±2 ºC) 4 gün tutularak iyice kurutulmuş, kurutulan toprak örnekleri 2 mm eleklerden geçirilmiştir. Hazırlanan üç toprak örneği her bir steril petriye 50 şer gram gelecek şekilde petrilere konulmuştur. Her bir petrideki toprağa otoklavda steril edilen saf sudan şırınga kullanılarak 10 ar ml ilave edilmiştir. 12

16 MATERYAL ve METOT Tuzak böcek yöntemi ile izolasyonda iki böcek türü (G. mellonella ve T. pityocampa) iki deneme düzeni kurularak kullanılmıştır. G. mellonella larvaları yaşadıkları ortamda ağ (kokon) oluşturmaktadırlar. Larvalar 50 C lik ısıda 38 sn kaldıklarında ağ oluşturmamaktadırlar. Elektrikli su ısıtıcısına 2 lt saf su konulmuştur. Su içerisine termometre batırılarak sıcaklığının 50 C de sabit kalması sağlanmıştır. Kültür kavanozlarından büyüklükleri aynı olan 300 tane G. mellonella larvası 10 arlı gruplar halinde bir tül içerisine konulmuş ve hazırlanan sıcak suda 38sn bekletilmiş, hemen ardından 3.5 dk soğuk saf suya bırakılarak larvaların ağ oluşturması engellenmiştir. Her bir bölge için 5 tekerrürlü olarak, büyüklükleri aynı olan G. mellonella larvaları her bir petriye 10 ar tane gelecek şekilde bırakılmıştır. Petrilerin kenarı parafilm ile kapatılmıştır. Petriler iki iklim odasında ayrı ayrı (20±2 ºC ve 27±2 ºC sıcaklık, 16/8 saat aydınlık/karanlık ışıklanma) kültüre alınmıştır. Petriler her gün alt üst edilerek böceklerin toprak ile teması sağlanmıştır. İkinci deneme düzeninde, tuzak böcek olarak T. pityocampa kullanılmış olup böceklerin sıcak su ile muamelesi haricindeki yöntem aynen tekrarlanmıştır. Her iki denemede de üçüncü günden sonra böceklerin olduğu petriler her gün açılarak kontrol edilmiş, ölen böceklerin her biri bir petriye gelecek şekilde nem çemberlerine alınmıştır. Üzerinde fungus gelişimi olmayan ölü böcekler %2 lik Sodyum hypo kloritde 1 dk, %70 lik alkolde (ethanol) 20 sn bekletildikten sonra saf steril sudan geçirilmiş ve sonra kurutma kağıdı kullanılarak böceklerin üzerindeki fazla su alınarak nem çemberine bırakılmıştır. Her bir steril petriye iki tane steril kurutma kâğıdı bırakılmış ve 5 ml steril saf su ile nemlendirilmiştir. Petrilerin kenarı parafilm ile kapatılarak ölen böcekler üzerinde fungal gelişimi desteklemek için inkübasyona bırakılmıştır (27±2 ºC sıcaklık, 16/8 saat aydınlık/karanlık ışıklanma). Sporulasyon yapan funguslar mikroskop altında incelenmiş ve üzerinde saprofit fungus gelişen böcekler elemine edilmiştir. Diğer fungusları izole etmek için PDA (Merck Lot no: VM ) besi ortamı hazırlanmıştır. PDA üretici firmanın talimatına uygun olarak hazırlanmış ve 121 C de 20 dk otoklavda tutularak steril edilmiştir. Her bir petriye ortalama 20 ml hazır besin ortamı laminar hava kabininde dökülmüştür. İnokulasyon işlemi steril inokulasyon iğnesi ile yapılmıştır. Sporlar besin ortamının 5 farklı yerine dokundurularak fungus sporlarının besin ortamına inokulasyonu sağlanmış ve petrilerin kenarı parafilm ile kapatılmıştır. Funguslar inkübatörde 25±2 C de inkübasyona alınmıştır. İzole edilen fungus kültürlerinden geçici preperatlar hazırlanmış ve faz kontrast ışık mikroskobunda fungusların oluşturduğu sporulasyon yapıları incelenmiştir. Elde edilen 17 fungus izolatının Beauveria ve Paecilomyces (Şekil 3.1) cinslerine ait oldukları Yrd. Doç. Dr. M. Kubilay ER tarafından teşhis edilmiştir Topraklardan Doğrudan Fungus İzole Edilmesi entomopatojen fungus izolasyonu yönteminde yulaf agar ortamı (1 litreye 20 gr yulaf ezmezi, 20 gr agar) kullanılmış olup saprofit fungusların gelişimini engellemek amacı ile 650 μl dodin (N-dodecylguanidine acetate) besin ortamına kaynatıldıktan sonra ilave edilmiştir (Boucias and Pendland, 1998). Besin ortamı steril edildikten sonra ılık iken içerisine bakteriyel gelişimi engellemek amacı ile 10 ml antibiyotik stok solüsyonu (6gr. streptomycin sülfat IU penicilin) ortam içerisine 13

17 MATERYAL ve METOT katılmıştır (Boucias, and Pendland, 1998). Besin ortamı steril cam petrilere yaklaşık 20 ml olacak şekilde dökülmüştür. Üç farklı bölgeden getirilen ve önceden elenmiş olan toprak örneklerinin her birisinden 10 ar gr alınmış ve 90 ml steril saf suya eklenmiştir. Her muamele ayrı ayrı 250 ml lik erlenler içerisinde orbital çalkalayıcıda 6 ncı çalışma hızında 60 dk karıştırılmıştır. 200 ml süspansiyon ortam üzerine cam çubuk ile homojen bir biçimde yayıldıktan sonra petrilerin kenarları parafilm ile kapatılarak 25±2 C de inkübasyona bırakılmıştır. Her toprak örneği için bu şekilde 10 adet petri hazırlanmıştır. Şekil 3.1. Paecilomyces sp. konidileri ve konidiofor yapısı Faz kontrast bir mikroskop kullanılarak fungusların sporulasyon yapıları incelenmiş elde edilen 18 fungus izolatının Paecilomyces ve Beauveria cinslerine ait oldukları Yrd. Doç. Dr. M. Kubilay ER tarafından teşhis edilmiştir İzole Edilen Fungusların Zararlı Larvalarına Etkisinin Test Edilmesi Elde edilmiş olan 35 fungusun hepsinin zararlıya etkisinin test edilebilmesi için kısıtlı olan iş gücü ve zamanın yeterli olmayacağı anlaşıldığından dolayı bu funguslardan 8 tanesi ( Paecilomyces cinsine ait PKT2, PŞT6 ve PŞG11; Beauveria cinsine ait BŞT7, BŞG10, BKT15, BKG18 ve BKÇ19) sonraki denemeler için seçilmiştir. İzolatlar seçilirken; en azından her bölgeden ve her fungus cinsinden izolat olmasına, her yöntemden elde edilen fungus cinsinden en az birer tane olmasına dikkat edilmiş ve ayrıca fungusların ortamda gelişimleri ve spor yoğunlukları da göz önünde bulundurulmuştur. 14

18 MATERYAL ve METOT Spor Süspansiyonu Hazırlanması Böceklere uygulamak için yeterli miktarda spor süspansiyonu elde etmek amacı ile funguslar PDA besi ortamında alt kültürlere alınarak çoğaltılmıştır (Şekil 3.2 ve 3.3). Bu kültürlerin bulunduğu petrilere daha sonra mikro pipet ile 5 ml %0,05 lik Tween 80 solüsyonu eklenmiş, cam çubuk ile yayılarak fungus sporlarının iyice karışması sağlanmıştır. Her bir izolattaki süspansiyon tekrar mikro pipet ile alınmış ve süspansiyon içerisindeki partiküllerden arındırmak için 3 kat steril tülbentten süzülerek cam tüplere aktarılmıştır. Ayrı ayrı cam tüplere alınmış olan 8 tane fungus süspansiyonu, içerisindeki guruplaşan fungus sporlarının ayırılması için Vartex çalkalayıcıda 5 dk çalkalanmıştır. Spor yoğunluğunun hesaplanabilmesi için her bir süspansiyondaki spor sayısı Thoma lamı ve ışık mikroskopu kullanılarak belirlenmiştir. 200x büyütmede 3 tekerrürlü olarak spor sayımı yapılmıştır. Süspansiyonlardan seyreltme yapılarak herbir izolat için 1.5x10 7 konidi/ml yoğunluktaki süspansiyonlar hazırlanmıştır Spor Süspansiyonlarının Böceklere Uygulanması Hazırlanan her bir izolattan 1.5x10 7 konidi /ml yoğunlukta 100 ml spor süspansiyonu hazırlanmıştır. 5. dönem T. pityocampa larvaları 15 erli gruplar halinde süspansiyon içine daldırılmış ve süspansiyon içerisinde 8-10 sn bekletildikten sonra larvaların üzerindeki fazla su kurutma kâğıdı ile alınmıştır. Kontrol olarak içinde spor bulunmayan steril %0.05 Tween 80 içerisine böcekler 15 erli gruplar halinde daldırılmıştır. Spor süspansiyonu ile muamele edilen larvalar ve kontrol denemesindeki larvalar 15 erli gruplar halinde kültür kutularında 25±2 C de inkübasyona bırakılmıştır. Her bir izolat için bu olay 3 tekerrürlü olarak yapılmıştır. Kültür kutuları hergün kontrol edilmiş ve kontroller sonucunda ölen böcekler nem çemberlerine alınarak 25±2 C de tekrar inkübasyona bırakılmıştır. Takip eden günlerde yapılan kontrollerde üzerinde fungal gelişim olan böcekler (Şekil 3.4) günlük olarak kaydedilmiştir. 48 adet 8x6x5 cm lik boyutlarda steril plastik kutular denemede kültür kutuları olarak kullanılmıştır. Her birisinin içine 5 ml steril saf su ile nemlendirilmiş ve steril kurutma kâğıtları konulmuştur. Her bir kutu içerisine böceklerin beslenebilmeleri için çam ibreleri bırakılmıştır ( Şekil 3.5). Denemede kullanılmış olan her bir süspansiyondaki sporların canlılığının belirlenmesi için su agar (20 gr/lt agar Merck Lot no: VM ) hazırlanmış ve steril petrilere laminar hava kabininde dökülmüştür. Seçilen herbir izolattan 50µl spor süspansiyonu hazırlanan su agar üzerine homojen biçimde yayılmıştır. Petriler 25±2 ºC de 24 saat süre inkübasyona alınmıştır. Daha sonra ortamdan bir kesit alınmış ve faz kontrast mikroskobunda 200x büyütme ile çimlenen sporlar sayılmıştır (Şekil 3.6). Çim tüpü en az spor boyu kadar olanlar çimlenmiş kabul edilmiştir. Bu işlem 3 tekerrürlü olarak yapılmıştır Verilerin Değerlendirilmesi Veriler Arcsin transformasyonuna tabi tutulduktan sonra Anova varyans analizine tabi tutulmuş, ortalamalar arasındaki farklılıklar Tukey testine göre P<0,05 önem seviyesinde ortaya konulmuştur. Veri analizleri Minitab istatistik yazılımı kullanılarak yapılmıştır (Minitab, 1993). 15

19 MATERYAL ve METOT Şekil 3.2. Paecilomyces sp. kültürü. (PDA ortamında 26±2 ºC sıcaklıkta ve 16/8 saat aydınlık karanlık ışıklanma ortamında inokulasyondan 3 hafta sonra). Sekil 3.3. Beauveria sp. kültürü. (PDA ortamında 26±2 ºC sıcaklıkta ve 16/8 saat aydınlık karanlık ışıklanma ortamında inokulasyondan 3 hafta sonra). 16

20 MATERYAL ve METOT Şekil 3.4. Beauveria sp. infeksiyonu sonucunda ölen Thaumetopoea pityocampa larvaları. 17

21 MATERYAL ve METOT Şekil 3.5. Entomopatojen fungus süspansiyonu uygulanan Thaumetopoea pityocampa larvaları ve çam ibreleri bulunan kültür kutusu. Şekil 3.6 İnokulasyondan 24 saat sonra su agar ortamında Beauveria sp. konidilerinin çimlenmesi (27±2 ºC, 16/8 ışıklanma). 18

22 BULGULAR VE TARTIŞMA 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Elde Edilen Funguslar Yapılan tüm izolasyon çalışmaları sonucunda üç ayrı bölgeden alınan toprak örneklerinden izole edilen toplam 16 Paecilomyces cinsi fungus izolatı çizelge 4.1 de verilmiştir. Kürtül yöresinden 4 Paecilomyces izolatı elde edilmiştir. izolasyon yöntemi ile 3 fungus izolatı elde edilirken, tuzak böcek olarak kullanılan G. mellonella larvalarından 1 fungus izolatı elde edilmiştir. Tuzak böcek olarak T. pityocampa larvaları kullanımında bir infeksiyon belirtisi görülmemiştir. yöresinden bu cinse ait 9 izolat elde edilmiştir. izolasyon yöntemi ile 4 fungus izolatı elde edilirken, tuzak böcek olarak kullanılan G. mellonella larvalarından 3, T. pityocampa larvalarından 2 fungus izolatı elde edilmiştir. Karacasu yöresinden ise 3 Paecilomyces izolatı elde edilmiştir. izolasyon yöntemi ile 2 fungus izolatı elde edilirken, tuzak böcek olarak kullanılan G. mellonella larvalarından 1 fungus izolatı elde edilmiştir. Bu yörede T. pityocampa larvalarında herhangi bir infeksiyon belirtisi görülmemiştir. Çizelge 4.1. Elde edilen Paecilomyces cinsi fungus izolatları İzolat No Yer İzolasyon Yöntemi PKT1 PKT2 PKT3 PKG4 PŞT5 PŞT6 PŞT7 PŞT8 PŞÇ9 PŞÇ10 PŞG11 PŞG12 PŞG13 PKT14 PKT15 PKG16 Kürtül Kürtül Kürtül Kürtül Karacasu Karacasu Karacasu Tuzak böcek (G. m.) Tuzak böcek (T. p.) Tuzak böcek (T. p.) Tuzak böcek (G. m.) Tuzak böcek (G. m.) Tuzak böcek (G. m.) Tuzak böcek (G. m.) 19

23 BULGULAR VE TARTIŞMA Yapılan tüm izolasyon çalışmaları sonucunda üç ayrı bölgeden alınan toprak örneklerinden izole edilen Beauveria cinsine ait toplam 19 fungus izolatı çizelge 4.2 de verilmiştir. Kürtül yöresinden 5 Beauveria izolatı elde edilmiştir. izolasyon yöntemi ile 2 fungus izolatı elde edilirken, tuzak böcek olarak kullanılan G. mellonella larvalarından 2, T. pityocampa larvalarından 1 fungus izole edilmiştir. yöresinden 7 Beauveria cinsi fungus izolatı elde edilmiştir. izolasyon yöntemi ile 3 fungus izolatı elde edilirken, tuzak böcek olarak kullanılan G. mellonella larvalarından 3, T. pityocampa larvalarından 1 fungus izolatı elde edilmiştir. Karacasu yöresinden 7 Beauveria izolatı elde edilmiştir. izolasyon yöntemi ile 4 fungus izolatı elde edilirken, tuzak böcek olarak kullanılan G. mellonella larvalarından 2, T. pityocampa larvalarından 1 fungus izolatı elde edilmiştir. Çizelge 4.2. Elde edilen Beauveria cinsi fungus izolatları İzolat No Yer İzolasyon Yöntemi BKT1 BKT2 BKG3 BKG4 BKÇ5 BŞT6 BŞT7 BŞT8 BŞÇ9 BŞG10 BŞG11 BŞG12 BKT13 BKT14 BKT15 BKT16 BKG17 BKG18 BKÇ19 Kürtül Kürtül Kürtül Kürtül Kürtül Karacasu Karacasu Karacasu Karacasu Karacasu Karacasu Karacasu Tuzak böcek (G. m.) Tuzak böcek (G. m.) Tuzak böcek (T. p.) Tuzak böcek (T. p.) Tuzak böcek (G. m.) Tuzak böcek (G. m.) Tuzak böcek (G. m.) Tuzak böcek (G. m.) Tuzak böcek (G. m.) Tuzak böcek (T. p.) Çizelgede 4.1 de görüleceği gibi Kürtül, ve Karacasu yörelerinden topraktan doğrudan yapılan izolasyonda 9, tuzak böcek olarak G. mellonella larvaları kullanılarak yapılan izolasyonda 5, T. pityocampa larvaları kullanılarak yapılan izolasyonda ise 2 Paecilomyces cinsine ait fungus izolatı elde edilmiştir. Beauveria 20

24 BULGULAR VE TARTIŞMA cinsinden ise topraktan doğrudan yapılan izolasyonda 9, tuzak böcek olarak G. mellonella larvaları kullanılarak yapılan izolasyonda 7, T. pityocampa larvaları kullanılarak yapılan izolasyonda 3 fungus izolatı elde edilmiştir (Çizelge 4.2). Tuzak böcek yöntemi ile yapılan izolasyonda izolat sayısı böcek sayısı ile sınırlandırıldığı için izolat sayısı doğrudan topraktan yapılan izolasyona göre daha az olmuş olabilir. Ancak her iki izolasyon yönteminde de aynı cinse ait funguslar bulunmuştur Elde Edilen Fungus İzolatlarının Thaumetopoea pityocampa Larvalarına Etkileri Deneme için seçilmiş olan fungusların uygulaması sonucunda ölen 5. dönem T. pityocampa larva sayıları Çizeldge 4.3 de verilmiştir. Kontrol parselinde T. pityocampa larvalarında ölüm görülmemiştir. yöresindeki topraklardan elde edilen Paecilomyces cinsine ait funguslar (PŞT6 ve PŞG11 izolatları) 6. günde öldürmeye başlamış ve devam eden günlerde ölüm oranları iki fungus için rakamsal olarak benzerlik göstermiştir. yöresindeki topraklardan elde edilen Beauveria cinsine ait funguslar (BŞT7 ve BŞG10 izolatları) 5. günde öldürmeye başlamış ve takip eden günlerde ölüm oranları bu iki fungus arasında rakamsal olarak benzerlik göstermiştir. Karacasu yöresindeki topraklardan elde edilen Beauveria cinsine ait funguslar (BKT15, BKG18 ve BKÇ19 izolatları) 5. günde öldürmeye başlamış ve sonraki günlerde ölüm oranları rakamsal olarak benzerlik göstermiştir. Çizelge 4.3. Fungus uygulaması sonucunda Thaumetopoea pityocampa larvalarında görülen ölü birey sayıları. İzolat No Günler PKT ± ± 0.0 0,3 ± 0,3 1,3 ± 0,8 3.0 ± 1,1 4,3 ± 1,2 PŞT ± 0.0 1,3 ± 0,6 2,6 ± 0,3 4.0 ± 0.0 6,3 ± 0,8 8,6 ± 0,8 PŞG ± 0.0 0,3 ± 0,3 2.0 ± 0.0 3,6 ± 0,3 5,6 ± 0,8 8.0 ± 1.0 BŞT ± 0,5 3,3 ± 0,3 4,6 ± 0,3 6,6 ± 0, ± 0, ± 0,5 BŞG ± 0,5 2,6 ± 0,3 4.0 ± 0.0 6,6 ± 0,3 9,3 ± 0, ± 0,5 BKT 15 3,6 ± 0,3 5.0± 0.0 7,6 ± 0,3 10,6 ± 0, ± 0,5 14,3 ± 0,6 BKG 18 2,3 ± 0,6 4.0 ± 0.0 7,3 ± 0,3 10,3 ± 0,6 12,6 ± 0, ± 1.0 BKÇ 19 1,6 ± 0,3 4,3 ± 0,3 7.0 ± 0,5 10,6 ± 0, ± 0, ± 0.0 Kontrol 0.0 ± ± ± ± ± ± 0.0 T. pityocampa larvalarına karşı test edilmiş olan fungus süspansiyonlarındaki konidi çimlenme oranları Çizelge 4.4 de verilmiştir. Çimlenme oranları arasında ANOVA testine göre istatistiksel olarak önemli fark bulunmuş olup (F=9.2, n=3, S.d. =7.23, P<0.05) veriler Tukey testine tabi tutulmuştur. Fungusların çimlenme oranları arasındaki fark PKT2 ve BKÇ19 hariç diğerleri için istatistiksel olarak önemsiz olduğu için fungusların T. pityocampa larvalarına uygulanması sonucundaki veriler istatistik analizine tabi tutulurken PKT2 ve BKÇ19 uygulaması sonuçları analizlerde yer almamıştır. 21

25 BULGULAR VE TARTIŞMA Fungus uygulaması sonucunda 5. dönem T. pityocampa larvalarındaki ölüm oranları Çizelge 4.5 de verilmiştir. Her gün için ayrı ayrı yapılan ANOVA testlerinin hepsinde de fungusların larvaları öldürme oranları bakımından istatistiksel olarak önemli farklılıklar olduğu anlaşılmıştır. 6, 7, 8, 9, 10, 11 ve 12. günler için F değerleri sırası ile 16.1, 208.8, 102.2, 51.3, 32.2, 92.1, dir (n=3, Sd=6,20, P<0.05). Çizelge 4.4. Seçilen fungus izolatları ve çimlenme oranları İzolat no Örnek Alınan Yer İzolasyon Çimlenme Oranı PKT 2 PŞT 6 PŞG 11 BŞT 7 BŞG 10 BKT 15 BKG 18 BKÇ 19 Kürtün Karacasu Karacasu Karacasu Topraktan Topraktan G.mellenolla larvası Topraktan G.mellenolla larvası Topraktan G.mellenolla larvası T. pityocampa larvası %74.6±1.2 a %77.3±1.4 ab %76±2 ab %82±1.1 ab %82±1.1 ab %83.3±2 abc %83.3±0 bc %89.2±1.8 c *Aynı harfi içeren ortalamalar arasında Tukey testine göre istatistiki olarak önemli bir fark yoktur (n=3, P<0.05). Aynı bölgeden alınan aynı cinse ait funguslar birbiri arasında benzer özellik göstermiştir. yöresindeki topraktan izole edilen Paecilomyces cinsine ait PŞT6 ve PŞG11 izolatları tüm günlerde istatistiki olarak aynı oranda ölüme neden olmuştur. yöresindeki topraktan izole edilen Beauveria cinsine ait BŞT7 ve BŞG10 izolatlarının zararlı larvasına etkileri arasında da istatistiki olarak bir fark bulunmamaktadır. Karacasu yöresindeki topraklardan izole edilen Beauveria cinsine ait BKT15 ve BKG18 izolatlarının etkilerinin tüm günlerde yine istatistiki olarak eşdeğer olduğu bulunmuştur. Ayrıca tüm günler için Karacasu dan izole edilmiş olan Beauveria ların, Paecilomyces lerden istatistiksel olarak devamlı önemli derecede daha etkili olduğu ortaya çıkmıştır. Çizelge 4.5. Fungus uygulaması sonucunda ölen Thaumetopoea pityocampa larvalarında ölü birey oranları. İzolat No Günler PŞT 6 8.8±4.4 ab 17.7±2.2 a 26.6±0.0 a 42.2±5.8 ab 57.7±5.8 a 66.6±3.0 a 82.2±2.2 a PŞG ±2.2 a 13.3±0 a 24.4±2.2 a 37.7±5.8 a 53.3±6.6 a 68.8±5.8 ac 84.4±2.2 a BŞT ±2.2 bc 27.7±2.9 b 44.4±4.4 b 66.6±3.8 bcd 86.6±3.8 ab 97.7±2.2 bd 100.0±0.0 a BŞG ±2.2 bc 26.6±0.0 b 44.4±2.2 b 62.2±5.8 abd 79.9±3.8 ab 88.8±2.2 cd 100.0±0.0 b BKT ±2.2 c 51.1±2.2 c 71.1±4.4 c 86.6±3.8 cd 95.5±4.4 b 100.0±0.0 b 100.0±0.0 b BKG ±0.0 c 46.8±2.2 c 68.8±4.4 c 84.4±5.8 d 93.3±6.6 b 100.0±0.0 bd 100.0±0.0 b Kontrol 0.0±0.0 a 0.0±0.0 d 0.0±0.0 d 0.0±0.0 e 0.0±0.0 c 0.0±0.0 e 0.0±0.0 c 22

26 BULGULAR VE TARTIŞMA *Aynı harfi içeren ortalamalar arasında Tukey testine göre istatistiki olarak önemli bir fark yoktur (n=3, P<0.05). Çizelge 4.6 de PKT2 ve BKÇ19 izolatlarının larvaları öldürme oranlarını göstermektedir. Her ne kadar PKT 2 için veriler diğer funguslardan daha düşük BKÇ19 için daha yüksek görünüyor ise de bu fungusların uygulanan süspansiyonlarındaki konidi çimlenme oranları da aynı şekilde PKT2 için istatistiksel olarak önemli derecede düşük, BKÇ19 için önemli derecede yüksek bulunduğu için bu etkinlikteki farklılıkların sadece fungusların virülensliğindeki farklılıktan kaynaklandığı sonucuna varılamamış, çimlenme oranlarının da etkili olabileceği düşünülmüştür. Çizelge 4.6. PKT2 ve BKÇ19 uygulaması sonucunda ölen Thaumetopoea pityocampa larvalarında ölü birey oranları. İzolat No Günler PKT 2-2.2± ± ± ± ± ±5.8 BKÇ ± ± ± ± ± ±0.0 Kontrol - 0.0± ± ± ± ± ±0.0 Fungus uygulaması sonucunda ölen T. pityocampa larvaları üzerinde fungus gelişen birey oranları Çizelge 4.7 de gösterilmiştir. Kürtül ve yörelerindeki topraklardan izole edilen Paecilomyces cinsine ait PKT2, PŞT7 ve PŞG11 izolatları farklı bölgelerden olmasına rağmen rakamsal olarak tüm günlerde benzerlik göstermiştir. yöresindeki topraktan izole edilen Beauveria cinsine ait BŞT7 ve BŞG10 izolatları tüm günlerde rakamsal olarak benzerlik göstermiştir. Karacasu yöresindeki topraklardan izole edilen BKT15 ve BKG 18 izolatları tüm günlerde benzerlik göstermesine rağmen aynı bölgeden izole edilen BKÇ19 izolatı diğerlerinden rakamsal olarak farklılık gösteriyor. Etki bakımından Paecilomyces cinsi funguslar ile Beauveria cinsi funguslar arasında rakamsal olarak fark görülmektedir. 23

27 BULGULAR VE TARTIŞMA Çizelge 4.7. Fungus uygulaması sonucunda ölen Thaumetopoea pityocampa larvaları üzerinde fungus gelişen birey oranları. İzolat No Günler PKT ± ± ± ±2.2 PŞT ± ± ± ±2.2 PŞG ± ± ± ±2.2 BŞT 7 4.4± ± ± ± ± ± ±2.2 BŞG ± ± ± ± ± ± ±2.2 BKT ± ±0.0 40± ± ± ± ±3.4 BKG ± ± ± ± ± ± ±5.8 BKÇ ± ± ± ± ± ± ±2.2 24

28 SONUÇ VE ÖNERİLER 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Bu çalışmada Kürtül, Karacasu ve yörelerinden alınan topraklardan farklı yöntemler kullanılarak Paecilomyces ve Beauveria cinslerine bağlı izolatlar elde edilmiştir ve T. pityocampa üzerine etkileri araştırılmıştır. izolasyon, G. mellonella ve T. pityocampa larvaları kullanılarak tuzak böcek yöntemi ile izolasyon sonucunda toplam 35 entomopatojen fungus elde edilmiştir; bunların 16 tanesi Paecilomyces cinsine, 19 tanesi Beauveria cinsine aittir. Çalışma sonucunda bu iki entomopatojen fungus türünün çamkesetırtılı larvalarını laboratuvar şartlarında yüksek oranlarda öldürdüğü bulunmuştur. Tuzak böcek kullanılarak yapılan izolasyonda toplam 17 izolat elde edilmiştir. Kürtül yöresinden Beauveria cinsine ait 3 izolat, Paecilomyces cinsine ait 1 izolat; Karacasu yöresinden Beauveria cinsine ait 3 izolat, Paecilomyces cinsine ait 1 izolat; yöresinden ise Beauveria cinsine ait 4 izolat, Paecilomyces cinsine ait 6 izolat elde edilmiştir. Bu izolatlardan PŞG11, BŞG10, BKG18 ve BKÇ19 izolatlar çam kesetırtılına karşı etkilerini araştırmak için seçilmiştir. Doğrudan topraktan yapılan izolasyonda toplam 18 izolat elde edilmiştir. Kürtül yöresinden Beauveria cinsine ait 2 izolat, Paecilomyces cinsine ait 3 izolat; Karacasu yöresinden Beauveria cinsine ait 4 izolat, Paecilomyces cinsine ait 2 izolat; yöresinden ise Beauveria cinsine ait 3 izolat, Paecilomyces cinsine ait 4 izolat elde edilmiştir. Bu izolatlardan PKT2, PŞT6, BŞT7 ve BKT15 izolatları çam kesetırtılına karşı etkilerini araştırmak için seçilmiştir. Test edilen Thaumetopoea pityocampa larvalarında fungusların etkinliği bakımından intraspesifik ve interspesifik farklılıklar bulunmuştur. Kullanılan fungusların zararlıya etkilerindeki farklar fungusun izole edilme yönteminden ziyade fungusun elde edildiği bölgenin farklı olmasından kaynaklanmıştır. Kullanılan tüm izolasyon yöntemlerinde aynı cinslere ait funguslar (Beauveria ve Paecilomyces) izole edilmiştir. Tuzak böcek yönteminde G. mellonella larvaları kullanıldığında T. pityocampa larvaların kullanılmasından daha fazla fungus izolasyonu yapılmıştır. Bu da G. mellonella nın T. pityocampa dan bu yöntem için daha etkili olduğunu göstermektedir. İzole edilen funguslar laboratuar şartlarında T. pityocampa larvalarına karşı uygulandığında yüksek etkinlik göstermiştir. Beauveria cinsine ait izolatlar, Paecilomyces cinsine ait olanlara göre çam kesetırtılını daha kısa sürede öldürmektedir. Daha kapsamlı çalışmalar ile daha etkili entomopatojen fungus türleri veya izolatları elde edilebilir. T. pityocampa larvalarına uygulanan funguslar, böceklerin ölümünden sonra böceklerin bir kısmında fungal gelişim göstererek sporulasyon yapabilmiştir. Kontrollerde larva ölümü olmaması; izole edilen fungusları uygulamak için araziden getirilen T. pityocampa larvalarının başka bir hastalık etmeni ile bulaşık 25

29 SONUÇ VE ÖNERİLER olmadığını ve deneme esnasında böceklerin alındığı ortamın böceğe negatif etkisinin bulunmadığını işaret etmektedir. Denemede 5. dönem T. pityocampa larvalarına laboratuar şartlarında uygulanan funguslar kısa sayılabilecek bir sürede (12 gün) %100 lere varan ölüm oranları ile sonuçlanmıştır. Larvaların daha hassas dönemi olan 1. ve 2. dönemlerine (Battisti ve ark., 1998), bu funguslar uygulandığında daha iyi sonuçlar alınabilir. Bu çalışma; entomopatojen fungusların potansiyel olarak çam kesetırtılına karşı kullanılması için bir ön çalışma niteliğindedir. Bu araştırma sonuçları çam kesetırtılının yaşadığı üç farklı bölgede entomopatojen fungusların olduğunu göstermiştir. Entomopatojen fungus izolatlarından Paecilomyces ve Beauveria cinsi fungusların çam kesetırtılına karşı kullanıldığında, tırtılı çeşitli zaman aralıklarında öldürebilmektedir. Fungus izolatları içerisinden istatistik analizlere göre BŞT7, BŞG10, BKT15 ve BKG18 numaralı izolatlar bu türün mikrobiyal mücadelesinde potansiyel biyolojik etmenler olabilir ve umut vaat eden bir biyolojik kontrol etmeni olabilir. Bu izolatların çam kesetırtılının doğal ortamlarında pratikte kullanılabilirliğinin araştırılması gereklidir. Pratikte kullanılabildiği sürece ekosistemimizde oluşabilecek hasarların bir nebze de olsa önüne geçilmiş olabilir. Günümüzde gittikçe önem arz eden çevre koruma çalışmalarının da ön planda olması bağlamında; gelecekte yapılabilecek çalışmalar ile bulunan entomopatojen funguslar zararlıya uygulanan diğer mücadele yöntemleri ile birlikte entegre edilebilir. Kullanılan izolatların farklı dozları çam kesetırtılına uygulandığında nasıl bir sonuç alınacağı merak konusudur, bundan dolayı çam kesetırtılı üzerinde farklı doz denemeleri yapılabilir. İlerleyen günlerde mikrobiyal kontrol etmenlerinden entomopatojen fungusların etki mekanizmasının daha kısa sürelere çekilmesi için yapılacak çalışmalar, fungusların daha spesifikleşmesi için yapılacak çalışmalar, raf ömrünü uzatabilmek için yapılacak çalışmalar ve diğer mücadele etmenleri ile sinerjisini arttırmak için yapılacak genetik çalışmalar ülkemiz ekonomisi ve dünyamızın daha yaşanabilir bir hale gelmesinde önem arz edebilir. 26

30 KAYNAKLAR KAYNAKLAR AVTZIS, N.D, The use of Bacillus thurungiensis against Thaumetopoea pityocampa ( Den & Schiff.) ( Lep., Thaumetopoea) in Greece. Proceding: Population dynamics impacts and integrated management of forest defoliating insects. USDA Forest Service General Tecnical Report, BABUR, H., Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff) nın çam gençliğinde zarar miktarı. Ülkemiz Ormanlarında Çam Kesetırtılı Sorunu ve Çözüm Önerileri Sempozyumu, Kahramanmaraş, Türkiye, BATTISTI, A., LONGO, S., TIBERI, R., TRIGGIANI, O., Result and perspectives in the use of Bacillus thurungiensis Berl. var. kurstaki and other pathogens against Thaumetopoea pityocampa ( Den & Schiff.) in Italy ( Lep., Thaumetopoea). Anzeiger fur Schadlingskunde Pflanzenschutz Umweltschutz, 71: BUTT, T.M., HARRIS, G.J., POWELL, A.K., Microbial piopesticides: The european scene in (Edt. Hall, F.R., Menn, J.J.) Biopesticides Use And Delivery, Humana press, New Jersey, BOUCIAS, D.G., PEDLAND, J.C., Principles of insect pathology. Kluwer Academic Publishers. New York, USA, ER, M.K., TUNAZ, H., GÖKÇE, A., Bazı entomopatojen fungusların laboratuar koşullarında çam kesetırtılı Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff.) (Lepidoptera; Thaumetopoeidae) larvalarına etkileri. Türkiye I. Bitki Koruma Kongresi Bildirileri, Samsun, Türkiye, 43 s. HOZZANK, A., WEGENSTEINER, R., WAITZBAUER, W., BURNELL, A., MRACEK, Z., ZIMMERMANN, G., Investigations on the occurrence of entomopathogenic fungi and entomoparasitic nematodes in soils from Lower Austria. Insect Pathogens and Insect Parasitic Nematodes IOBC WPRS Bulletin, 26: HIZAL, E., AYBERK, H., Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff) ile mücadelede Bacillus thurungiensis var. kurstaki kullanımı. Ülkemiz Ormanlarında Çam Kesetırtılı Sorunu ve Çözüm Önerileri Sempozyumu, Kahramanmaraş, Türkiye, s. ISSI, I.V., On polymorphism of the species Pleistophora schubergi (Zwolfer), possible ways of speciation in the order of Microsporodia. Parazitologiya, 5: 297. ISSI, I.V., LIPA, J.J., Report on identification of Protozoa pathogenic for insects in the Soviet Union, with description of some new species. Acta Protozoal, 6: LACEY, L.A., GOETTEL, M.S., Current developments in microbial control of insect pests and prospects for the early 21st. Century. Entomophaga, 40:

31 KAYNAKLAR MARTIGNONI, M.E., IWAI, P.J., A catalogue of viral diseases of insects, mites and ticks. Appendix 2 in (Edt. Burges, H.D.) Microbial control Pest and Plant Diseases, Academic Press, London, 2: MINITAB, Release 9.2, Minitab Inc Enterprise Drive State College, PA, USA. ÖZKAZANÇ, O., Bacillus thurungiensis preperatının çam kesetırtılı Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff) mücadelesinde kullanılma olanakları ve etkin dozların belirlenmesi üzerine araştırmalar. Ormancılık Araştırma Enstitüsü Yayınları. Teknik Bülten Serisi, Ankara, Türkiye, 14 s. ÖZKAZANÇ, O., Çam kesetırtılı Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff.) mücadelesinde Bacillus thurungiensis var kurstaki kullanımı. Ülkemiz Ormanlarında Çam Kesetırtılı Sorunu ve Çözüm Önerileri Sempozyumu, Kahramanmaraş, Türkiye, s. SPRAGUE, V., Annotaded List of Species of Microsporadia in (Edt. Bulla, L.A., Cheng, T.C.,), Comparative Pathobiology V:2; Systematics of the Microsporadia. Plenium Press, New York, PAPARATTI, B., FABOZZI, R., A new pathogen of the pine processionary caterpillar Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff). Informatore Fitopatologica, 38: TAŞOLAR, F., Kahramanmaraş orman bölge müdürlüğünde çam kesetırtılına karşı mücadele çalışmaları. Ülkemiz Ormanlarında Çam Kesetırtılı Sorunu ve Çözüm Önerileri Sempozyumu, Kahramanmaraş, Türkiye, s. TRIGGIANI, O., TARASCO, E., Preliminary attempts to control overwintering populations of Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff) with Steinernema feltiae (Filipjev) (Nematoda: Steinernematidae). Entomologica, 35: TRIGGIANI, O., TARASCO, E., Efficacy and persistence of entomopathogenic nematodes in controlling larval populations of Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff). with Steinernema feltiae (Filipjev) (Nematoda: Steinernematidae). Biocontrol Secience & Tecghnology, 12: TRIGGIANI, O., TARASCO, E., Application of entomopathogenic nematodes in controlling overwintering larvae of Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff). Bulletin Oilb/Srop, 26: TRIGGIANI, O., SIDOR, C., Microbiological control tests against the pine processionary Thaumetopoea pityocampa (Den&Schiff) in pinewoods in Puglia. Entomologica, 17: