Aktivitesi Kontrol Edilebilen Fotodinamik Terapi Duyarlaştırıcılarına Doğru

Transkript

1 Aktivitesi Kontrol Edilebilen Fotodinamik Terapi Duyarlaştırıcılarına Doğru Engin U. Akkaya Kimya Bölümü, Bilkent Üniversitesi, Ankara De Silva nın 1993 yılındaki ufuk açan makalesi yayımlandığından beri, kimyasal mantık kapısı araştırması hızlı bir ilerleme ve evrilme halindedir. İkinci on yıllık süreç kapanırken, iki girdili bir çok mantık kapısının kimyasal eşdeğeri, daha da kompleks yüksek düzeyde sanal integrasyon içeren sistemlerle beraber yayımlandı. Bu moleküler yapılar için somut uygulamalar bulma son yıllardaki araştırmalar için öncelikli konuların başında gelmektedir. Bu konudaki ilerleme, moleküler mantık kapılarının, ilhamını dijital elektronikteki silisyum bazlı benzerlerinden alsa da, limitler ve de potansiyel uygulamalar olarak birebir aynı doğrultuda gitmek zorunda olmadıkları öncülüne dayanmaktadır. Genellikle belirtilen limitasyon olan girdi-çıktı heterojenitesi bir avantaja dönüştürülebilir: çıktılar moleküler düzeyde doğada birbirleriyle veya daha kompleks metabolizma gibi moleküler veya supramoleküler olaylarla etkileşebilir, ve de sonuçta terapik ajanlarla bilgi işlemede yeni yollar açabilir. Ayrıca, moleküler mantık kapılarında olan bazı dizayn esnekliklerinin yarıiletken temelli analoglarda örneği yoktur. Mantık kapılarının fonksiyonel/ sanal entegrasyonu ve çakışık mantık kapıları olasılığı sadece iki örnektir. Bu iki özel moleküler özellik moleküler multiplekser (MUX) ve demultiplekser (DEMUX) dizaynında faydalanılmıştır. Dijital sinyal işlemede, multiplekser bir çok girdiden bir çıktı seçen bileşik bir devredir. Demultiplekser ise bir tane girdi içerip, bir çok çıktı arasından bir tanesini seçen bir bütünleyici devredir. Bunların ikisi de kontrol devresi olarak düşünülebilirler. Daha önceden fotodinamik terapi konusunda oldukça değerli seçicilik artışı sağlayan basit bir ve mantık kapısı gösterdik. Fotodinamik terapi çeşitli kanserli ve kanserli olmayan belirtileri tedavide kullanılan yayılmacı olmayan bir metoddur. Bu metodoloji tümörlü dokuda bulunan fotoduyarlaştırıcı maddeyi ışıkla uyararak singlet oksijen ve diğer reaktif oksijen türleri oluşturarak o bölgedeki tümörü yok etmekte kullanılır. Son yıllarda teşhis ve tedaviyi birleştiren fonksiyonlar önemli derecede ilgi çekmektedir, ve bu yükselen ilgiyi karşılamak için önerilen kelime ise teranostiktir (tedavi+teşhis). Teşhis bileşeni kesin olarak içerilmekle beraber, sadece

2 istenen bölgenin görüntülenmesiyle kısıtlı değildir. Diğer bütün tedavi yöntemlerinde olduğu gibi, çok fonksiyonlu ulaştırıcı ajanlar fotodinamik terapi için de kullanışlı olacaktır. Şekil 1 ph a bağlı iki farklı çıktı veren, değiştirilebilen çakışık mantık kapısı genel tasarımı Işık ve singlet oksijen çıktılarından bir tanesini seçebilen moleküler bir DEMUX aygıtının fotodinamik terapi konusunda çok kullanışlı olabileceğini düşündük. Böyle bir moleküler aygıt tümör bölgesine gönderildiğinde ve ışıkla uyarıldığında çevredeki sağlıklı hücrelerde parlak bir şekilde emisyon verirken, tümörlü hücrede karanlık görünüp singlet oksijen oluşturur. Anahtar tümörler ve sağlıklı hücreler arasındaki asitlik farkından yararlanarak çalışmakta ve uyarılan dalga boyunu değiştirmeye hiç bir şekilde gerek bırakmamaktadır. Warburg etkisinin bir sonucu olarak çoğu tümörlerin çevredeki sağlıklı hücrelere oranla önemli miktarda daha asidik olduğu bilinmektedir. Dizayn düzgün bir şekilde yapıldığı takdirde emisyon spektrumun kırmızı ya da yakın kızılötesi bölgesinde gözlenir, böylece görüntüleme daha önemli hale gelmektedir. Bu bilgiler ışığında, ortamın asitliğine bağlı olarak yönünü değiştiren boşlukta enerji transferiyle bileşik, ayrışık kırmızı/yakın kızılötesi floresans emisyon ya da singlet oksijen oluşan bir sistem içeren ve de bu prensibin ispatı olan bir DEMUX tasarladık. Burada, 625 nm deki ışık (LED ışık dizisi tarafından sağlanan) girdi (I), asit (trifloroasetik asit, TFA) ise kontroldür (ya da adres

3 girdisi). Hedef madde iki adet distiril-bodipy modüllerinin Huisgen siklokatılması ile klik reaksiyonu yapılmasıyla oluşmuştur. Distiril-Bodipylerle önceki deneyimlerimizden, piridinetenil ve dimetilaminofeniletenil grupları yapısında bulunan bodipylerin asit eklendiğinde (dimetilaminofenilde mavi kayma, piridilde kırmızı kayma) farklı iç yük transferi karakteristiği ile ters spektral kayma oluştuğunu bilmekteyiz. Sabit bir dalgaboyunda uyarıldığında, enerji transferinin yönünde bir değişim görmek olağandır (Şekil 10). Bununla birlikte, Bodipy modüllerinden bir tanesi (2, FL modülü) floresans yapan modül olarak dizayn edildi, hatta asit eklendiğinde daha da çok floresans yapmaktadır. Diğer modül ise (1, PS modülü), yüksek oranda singlet oksijen oluşturması için sistemler arası geçişi kolaylaştıran ağır atomlar (2,6 pozisyonlarında iki iyot atomu) içermektedir. DEMUX operasyonu birbirine klik ile bağlanmış çakışık iki modüle ayrılabilir. 3 no lu molekül geniş bir banda sahiptir ve kontrol girdisi olan TFA eklendiğinde spektral kaymaları analiz etmek zordur. Fakat, iki modül ayrı ve bağımsız çalışıldığında 3 molekülünün çalışma prensibi daha iyi anlaşılır. Asit eklenmeden, izole fotoduyarlaştırıcı (PS) modülünün (1) absorbans maksimumu 637 nmde, florofor (FL) modülünün (2) ise 678 nmdedir. Fakat, TFA eklendiğinde 14 molekülünün absorbsiyon tepe noktası 656 nmye kayarken 2 molekülünün ise 640 nmye kaymaktadır. Fark küçük gibi görünse de, 2 nin protonlonmasının oksokromik doğası düşünüldüğünde, 3 molekülünün dizayn edildiği şekilde çalışacağı görülmektedir. 3 molekülü için asit eklenmediği durumda (c=0), 625 nmden uyarıldığında DEMUX cihazının çalışma prensibine uygun olarak FL modülünden 720 nmde yoğun bir emisyon gözlenmektedir, ve girdi hv 625 =1, c=0 olup, sonuç olarak 1 e yönlenmiştir (hv 720 ). Burada biz nötr phde singlet oksijen oluşumunun sönümlenebilmesi ve bunun yerine kızılötesi emisyonun oluşabilmesi için gerekli olan uyarılma enerji transfer hızının sistemlerarası geçiş hızından daha fazla olmasından (aşağıda belirtildiği üzere) yararlandık. PS modülü tek başına iken hem asidik hem de nötr ortamda singlet oksijen üretirken DEMUX 3 molekülünde singlet oksijen üretme kapasitesinde düşüş gözlemlenmiştir. PS den FL ye uyarılma enerji transferi (UET) burdan doğrulanmıştır. Asit eklendiği durumda ise (c=1), uyarılma dalgaboyu 625 nm de sabit tutulduğunda, PS ve FL da aynı anda oluşan iç-yük transferi sebebiyle, UET nin yönü değişti ve hücrelere zarar veren singlet oksijen üretildi. Bu durumda FL nin emisyonu ise sönümlendi. PS modülüne enerji transferi ayrıca TFA eklenmiş CHCl 3 içindeki verici FL modülünün uyarılmış durum ömrünün 4.05 ns den ( 2 = 1.16) 0.03

4 ns ye ( 2 = 1.43) düşmesinden de doğrulandı, bu azalma çok yüksek oranda bir enerji transferi olduğunu gösterir (% 99). Yakın kızılötesi floresans emisyonunun ve singlet oksijen oluşumunun ayrışık karakterini desteklemek için üç adet negatif ve iki adet pozitif kontrol deneyi yapıldı. Pozitif kontrollerde, 20 nm 1 molekülünün (PS modülü, Demultiplekser 3 ile aynı konsantrasyonda) singlet oksijen aktivitesi çalışıldı ve trifloroasetik asit varliğında ve yokluğunda duyarlaştırma yönünden aktif olduğu gözlemlendi. Singlet oksijen üretme hızının düşmesi sadece enerjiyi kendine çeken florofor modülünün varlığından dolayı gerçekleşmiştir. Bağıl singlet oksijen üretme verimi, DPBF (difenilizobenzofuran) nin ilk bozunma hızının normalize edilmesiyle elde edilir. Asidik ortamda ve sadece PS nin olduğu durumda (pozitif kontrol-1), verimin 3 no lu moleküle kıyasla 0.9 a düştüğü gözlemlenmiştir. Bu büyük olasılıkla bileşik 3 ün PS nin uyarma enerji transferi ile uyarılmasının protone olmuş FL nin soğurumunun daha geniş olmasından dolayı daha fazla olmasından kaynaklanmıştır. PS nin protone olduğunda kırmızı bölgeye kaymasıyla beraber uyarılan dalgaboyundaki (625 nm) molar soğurmanın azalmasından dolayı, 1 O 2 üretme hızında düşüş olmuştur. Ayrıca, iki negatif kontrol göstermiştir ki tuzak molekülü (difenilizobenzofuran, DPBF), hem asidik hem de nötr ortamda ve de fotoduyarlaştırıcı olmadığı durumda bozunma olmamıştır. Üçüncü negatif kontrol 3 no lu molekülün nötr ortamda, yani asit eklenmeden singlet oksijen üretebilme yetisinin belirlenmesi amacıyla gerçekleştirilmiştir. Bu deneyde etkili bir şekilde PS dan FL ye ters UET olduğundan dolayı beklenildiği üzere singlet oksijen üretimi gerçekleşmemiştir. Bununla beraber, bütün deneylerde ışıkla uyarmanın olmadığı durumlarda singlet oksijen tuzağının bozunmadığı gözlemlenmiştir. Bu herhangi bir beklenmedik reaksiyonun olmadığını göstermektedir. Fakat, asidik ortamlarda molekül 3 in iki modülünün absorbanslarındaki karşılıklı kaymadan dolayı UET nin yönü değişmektedir. FL verici olmakta, uyarılma enerjisi PS ye transfer edilmekte, bu modül aktive olmakta ve hücreye zararlı singlet oksijen 20 nm gibi az konsantrasyonlarda dahi etkili bir şekilde üretilebilmektedir. Burada sunulan moleküler DEMUX un bütün çalışma prensibi şu şekildedir; asit olmadığı durumda 720 nm civarında kuvvetli yakın kızılötesi emisyon vardır. Asit eklendiğinde, 3 molekülünün floresansı, emisyonu olmayan PS modülüne UET den dolayı tamamen kaybolmaktadır. Emisyondaki düşüş etkili bir şekilde singlet oksijen üretimiyle ilgilidir. UET nin yönünün ph ile değişmesiyle PS modülü aktive olmakta ve tedavi edici özelliği olan singlet oksijen üretmektedir. Bu olay UET nin

5 yönünün değişmesine bağlıdır ve sonuç olarak singlet oksijen üretmek için duyarlaştırma sadece asidik ortamlarda (çoğu tümörde olduğu gibi) mümkün olmaktadır ve tümör bölgesinin sınırları Şekil. 2 1:2 DEMUX mantık operasyonunun doğruluk tablosu (a), devresi (b) ve anahtar operasyonunun şematiği (c). floresans yoğunluğunun değişimiyle görülebilir (çevredeki sağlıklı dokulardan kırmızı/yakın kızılötesi floresans gelirken, tümör bölgesi karanlık kalacaktır).çok fonksiyonlu ilaçların ve ulaştırıcı sistemlerin önemi çok iyi bilinmektedir ve bu çalışmada iki kritik fonksiyonun, teşhis ve tedavi olayları gibi, prensipte tek bir moleküler ajan kullanılarak uygulanabileceğini gösterdik. Bu prensibin ispatı olan teranostik ajan çalışmasının interaktif bir şekilde tedavi edici ilacı yerine ulaştırıp aynı zamanda teşhis edici görüntüleme imkanlarını sağlamasının diğer çok fonksiyonlu moleküler sistemlerin yol alması için bir model olmasını beklemekteyiz. Bu erken döneminde bile bilgi işleyebilen moleküller, teşhis ve tedavi arasında kendiliğinden karar verme gibi öngörülemeyen işler yapabilirler. Bu işlem, yarıiletken parçası olmayan, tek moleküllü bir çakışık mantık operasyonuyla mümkün olabilmektedir. Moleküler mantık kapısı araştırmalarının geleceği oldukça parlak görünmektedir.