RNAi Teknolojisinin Deneysel Aşamaları ve Tedavideki Geleceği

Transkript

1 RNAi Teknolojisinin Deneysel Aşamaları ve Tedavideki Geleceği sirna Doç.Dr. Metiner Tosun EÜ Eczacılık Fakültesi Farmakoloji AD Trabzon Ekim 07 Geleneksel ilaç geliştirme fazları: Doğrusal süreç 1-5 yıl 2-10 yıl 2 ay-7 yıl 1

2 MOLEKÜLER TEMELLER GENOMİK ANATOMİ (DNA dizi analizi) Bireyler arası ve etnografik farklılıklar EKSPRESYON ŞEKİLLERİ (RNA-proteinmetabolitler) Fizyolojik, patolojik, gelişimsel farklılıklar Farmakogenetik PRENSİP ve TEKNİKLER İLAÇ DUYARLIK PROFİLLERİ GENOTİP-FENOTİP KARŞILAŞTIRMALARI (Proteinler) Hücresel lokasyon Mekanizmalar Yolaklar HEDEFLER KİŞİYE-ÖZEL İLAÇ VE TEDAVİ YENİ İLAÇ KEŞFİ ve KLİNİK DENEMELER İlaç geliştirme fazları (yeni yaklaşım) ADMET, ADME + Toxicity; IND, investigational new drug; NDA, new drug application; PGx, pharmacogenomics. 2

3 Petunyadan öğrenilen: Reversible co-suppression of homologous genes Napoli et al., The Plant Cell,

4 4

5 Fire, A. et al. Nature 391, (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Elbashir, S.M. et al. Nature 411, (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. 5

6 RNA interferans (Metaforik animasyon), NOVA ScienceNow 2006 Hücre çekirdeği, NOVA ScienceNOW 6

7 Transkripsiyon (mrna oluşumu), NOVA ScienceNOW Translasyon (protein sentezi), NOVA ScienceNOW 7

8 Viral genomun girişi, NOVA ScienceNOW Küçük müdahale-edici RNA (small interfering RNA, sirna) oluşumu, NOVA ScienceNOW 8

9 Post-transkripsiyonel gen susturma Viral şifre taşıyan elçinin imhası, NOVA ScienceNOW NATURE CHEM. BIOL. DECEMBER

10 NATURE Rev Drug Disc sirna tasarımı: Genel yönergeler I Hedeflenecek dizi genellikle 21 nt olmalı Başlangıç ve bitiş kodonlarından bp dizileri arasında olmamalı İntron bölgelerini içermemeli AAAA, CCCC gibi 4 veya daha uzun baz tekrarları içermemeli GC içeriği %30 dan az %60 tan fazla olmamalı Dizi tekrarları olmamalı SNP bölgeleri içermemeli 10

11 sirna tasarımı: Genel yönergeler II Diğer genler ve diziler üzerindeki off-target etkilerden sakınmak için BLAST homoloji araştırması yapılmalı Her zaman sirna içeriğindeki dizileri karıştırarak en azından 4-5 eşleşmeyen mismatched baz dizisi içerecek negatif kontrol sirna tasarlanmalı. Çırpma işleminin yeni dizilere homoloji göstermemesine dikkat edilmeli. TRPC1 sirna BLAST analizi /seq/blastgen/blastgen.cgi?taxid=10116; BLASTN (Aug ) Reference: Altschul SF, TL Madden, AA Schäffer, J Zhang, Z Zhang, W Miller, and DJ Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: RID: HGVD1E6M012 Database: Rattus norvegicus RefSeq RNA 35,902 sequences; 72,405,186 total letters >ref NM_ Rattus norvegicus transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 1 (Trpc1), mrna Length=4015 Score = 38.2 bits (19), Expect = Identities = 19/19 (100%), Gaps = 0/19 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 GAACATAAATTGCGTAGAT 19 Sbjct 246 GAACATAAATTGCGTAGAT

12 Hedef mrna sına spesifik sirna 2. Pozitif kontrol (siklofilin B, CyPB sirna) 3. Negatif kontrol (non-targeting NT, hiçbir genomik diziyi hedeflemeyen sirna) 4. Yalancı transfeksiyon (sadece transfeksiyon ajanı) (mock, M) 5. Hiçbir uygulama yapılmamış (untreated, UT) hücreler NATURE Rev Drug Disc

13 NATURE Rev Drug Disc Geleneksel ilaçlar (küçük moleküller, proteinler) ve RNAi NATURE CHEM. BIOL. DEC Agonist Antagonist Ekstraselüler hedef İntraselüler hedef Seçicilik Potentlik Optimizasyon Sentez kolaylığı 13

14 Klinikte RNAi-terapötikler Tedavi Hedef Hastalık Faz Bevasiranib (Acuity) Sirna-027 (Sirna) VEGF VEGF reseptör-1 Yaşa-bağlı maküler dejenerasyon Diyabetik maküler ödem Yaşa-bağlı maküler dejenerasyon II I ALN RSV01 (Alnylam) Respiratuvar sinsitial virüs RSV enfeksiyonu I PTC-299 (PTC Therapeutics) VEGF Kanser (Katı tümörler) I Nature Rev., Temmuz

15 RNAi uygulanabilirliğinin kanıtlandığı organlar NATURE CHEM. BIOL. DECEMBER 2006 NOVA ScienceNOW 15