Genetikten Genombilime Geçişte Transkriptom Analizleri

Transkript

1 Genetikten Genombilime Geçişte Transkriptom Analizleri Doç.Dr. Hilâl Özdağ AÜ iyoteknoloji Enstitüsü Mammals Other chordates Other eukaryotes Homo sapiens [NCI 35] Vega Gallus gallus [WASHUC1] Drosophila melanogaster [GDP 4] Pan troglodytes [CHIMP1] Xenopus tropicalis [JGI 3] Anopheles gambiae [MOZ 2] Macaca mulatta [Mmul 0.1] browse pre! site Danio rerio [WTSI Zv5] Vega Apis mellifera [Amel 2.0] Mus musculus [NCI m34] Vega Takifugu rubripes [Fugu 2.0] Caenorhabditis elegans [WS140] Rattus norvegicus [RGSC 3.4] Canis familiaris [CanFam1.0] Vega os taurus [tau 1.0] pre! [tau 2.0] Monodelphis domestica [MonDom2] browse pre! site Tetraodon nigroviridis [TETRAODON 7] Ciona intestinalis [JGI 1.95] Saccharomyces cerevisiae [SGcurrent Ensembl 1

2 D N A nın sabit ortama aktarımı Southern lot (Edward M. Southern, 1975) RNA Nitelik ve Nicelik Tayini Fluorescence S 28S Time (seconds) 2

3 mrna Analiz Yöntemleri Northern lot (Tek gen analizi) RT-PCR (Tek gen analizi) Mikroarray (Genom boyunca analiz) NORTHERN LOT mrna lar boylarına göre jelde yürürler. mrna lar naylon membrana transfer edilir ve radyoaktif işaretli DNA probları ile hibridize edilir. İşlem hacmi düşük olan bu teknikte miktar tayini hassas değildir. 3

4 RT-PCR Total veya polya RNA üzerinden reverse transcriptase enzimi ile cdna sentezlenir. Gen spesifik (ekzon) primerler ile PCR yapılır. Özellikle eş zamanlı PCR (Real Time PCR) cihazları ile yüksek hassasiyette miktar tayini yapılabilmektedir. İşlem hacmi northern blot tan yüksek mikroarraylerden düşüktür. DNA Mikroarray DNA Mikrodizin cdna array: bç uzunluğunda probların cam yüzeylere basılması ile üretilir. Oligo array: bç uzunluğundaki oligonükleotidlerin önce sentezlenip sonra çip yüzeyine immobilize edilmesi veya doğrudan çip üzerinde sentezlenmesi (fotolitografi) ile üretilir. 4

5 DNA Mikroarray DNA Mikrodizin 1) Prob (cdna/oligo) 2) Çip üretimi (Probların çipe yerleştirilmesi) 3) Hedef (floresan işaretli örnek) 4) Deney 5) Sonuç 6) ilişim oligonükleotid, cdna Fotolitografi, pipet, dokundurma, püskürtme (inkjet), RNA, (mrna==>) cdna Hibridizasyon, yıkama, tarama Floresans İmaj işleme, WWW, biyobilişim, veri arama/tarama ve görüntüleme DNA Mikroarray DNA Mikrodizin 5

6 Affymetrix GeneChip Oligo Array Hibridize olmuş prob hücresi Tek zincirli, işaretlenmiş RNA hedef molekülü Oligonük ükleotit prob * * * * * 24µm 1.28cm Özgül oligonükleotit probun milyonlarca kopyası >200,000 farklı eşlenik prob Hibridize olmuş oligo array in görüntüsü polya kontrolleri Affymetrix platformunda ifade analizi Total RNA veya Poly (A) + mrna AAAA RT cdna Hedef örneğin hazırlanışı IVT (bio-ntp) İşaretli crna transkriptleri bio bio bio Fragment 2+ ) (Isı,, Mg 2+ bio Tarama Yıkama & oyama Hibridize Hibridizasyon kontrolleri bio bio bio bio İşaretli fragmentler 6

7 Affymetrix platformunda hibridizasyon, boyama ve yıkama GeneChip + iotin İşaretli crna Hibridize Array + SAPE Streptavidinfikoeritrin Affymetrix Prob başına yaklaşık 100 piksel u sinyaller herbir prob hücresi için tek bir rakama indirgenir. Her bir gen oligo tarafından temsil edilir. 7

8 Affymetrix 8

9 Affymetrix platformunda tarama Kanserde Transkriptom Analizleri Klasik Moleküler elirteçler 9

10 Kanserde Transkriptom Analizleri Klasik moleküler belirteçler kanser türlerinin doğru sınıflandırılmasında yetersiz kalmaktadır. ER varlığı tamoxifen tedavisine olumlu cevap için en güvenilir verilerden biri kabul edilmesine rağmen ER+ vakaların %30-40 ında tamoxifen etkisizdir veya tamoxifene karşı direnç gelişmektedir. Kanserde Transkriptom Analizleri Lazer Mikrodisseksiyon ütün Tümör Kesiti RNA 10

11 Kanserde Transkriptom Analizleri ütün Tümör Kesiti Lazer Mikrodisseksiyon Kanserde Transkriptom Analizleri Kötü prognoz ile korele genler İyi prognoz ile korele genler İyi prognoz ile korele hastalar Kötü prognoz ile korele hastalar Van t veer et al, Nature 2002, 415:

12 Mikroarray kullanım amaçları Hücre metabolizmasına global bakış Mikroarrayler vasıtasıyla bir hücreye yapılan bir uygulamanın hücreyi nasıl etkilediği hangi metabolik yolakların uyarıldığı hangilerinin sustuğu uygulama öncesine göre kıyasla ortaya konabilir. enzer yaklaşımla hastalıkların metabolizme üzerine etkilerinin belirlenmesi ve tedavi için hedef moleküllerin saptanması amacı ile hasta ve kontrol gruplarında mikroarrayler ile global ifade analizleri yapılabilmektedir. Tıbbi teşhis SNP mikroarraylerin de yardımı ile hastalığa veya hastalığa yatkınlığa neden olan genler saptanmaktadır insan geni içeren bir mikroarray ile myeloid lösemi ile limfoblastik lösemi 50 adet ifade farklılığı gösteren gen yardımı ile birbirinden ayrıldı Meme kanseri altgruplarını saptayabilen 70 adet gen saptandı yapılan global transkriptom analizi ile. Fonksiyonel Analiz Genlerin Nakavt Edilmesi/Gene Knockout 12

13 Fonksiyonel Analiz sirna A.Ü iyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı Fonksiyonel Genombilim irimleri 13

14 A.Ü iyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı Genombilim irimi A.Ü iyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı Proteombilim irimi 14

15 A.Ü iyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı Fonksiyonel Genomik irimleri