Deneysel Astım Modelleri

Transkript

1 Deneysel Astım Modelleri Doç. Dr. Meral KARAMAN DEÜ Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD. DEÜ SBE Laboratuar Hayvanları Bilimi AD.

2 Astımda deneysel hayvan modellerinin kullanım amaçları Fonksiyonel ve yapısal değişikliklerin araştırılması Etyopatogenezin aydınlatılması Enflamatuar sürecin belirlenmesi Havayolu davranışlarındaki değişimlerin araştırılması Yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi

3 Russel ve Burch (1959) Deneysel çalışmalarda hayvan kullanımına ait 3R kuralı; Replacement: Alternatif yöntemleri sorgulamak Reduction: Kullanılacak hayvan sayısını azaltmak Refinement: Deneylerin hayvana ağrı ve acı verilmeden yapılması Responsibility :Hayvanlara karşı sorumlulukların bilinmesi

4 Laboratuvar hayvanı modelleri Spontan modeller İndüklenmiş modeller Negatif modeller Olası modeller Transgenetik modeller

5 Astım modeli oluşturmada temel basamaklar Uygun hayvan türünün seçimi (Anatomik, biyolojik, fizyolojik özellikler) İnsandaki hastalığa en uygun model (Patogenezin taklit edilmesi) Çalışmanın amacı, hipotezler Modeli oluşturacak etken madde (Verilme yolu, konsantrasyonu, hacmi, süresi ) Modelin oluşumuna ait kanıtlar (Fiziksel, biyokimyasal, mikrobiyolojik ya da histopatolojik) Hayvan deneyleri yerel etik kurulu onayı Hayvan Refah Birimi denetimi

6 Astım çalışmalarında uygun hayvan türleri Fare (BALB/c, C57BL, A/J ) Sıçan (Wistar albino, Spraque dawley, Brown-Norway ) Kobay Köpek Koyun Kedi Maymun Domuz

7 AVANTAJLARI Astım Fare Modelleri Memeli hayvanlara en iyi örnektir. Genetik yapıları, anatomik ve biyolojik özellikleri iyi bilinmektedir. Genetik olarak bir örnek soylara ulaşmak kolaydır. Gebelik süresi kısa (21 gün), bir batında doğan yavru sayısı fazladır (8-12) Küçük boyutludurlar, çalışmada uygulama basamakları kolaydır. Üretilmeleri, yetiştirilmeleri ve barındırılmaları kolaydır. Ucuz ve kolay ulaşılır.

8 Fare modellerinin avantajları Kolaylıkla sensitize edilebilirler. (OVA, HDM, A. fumigatus ag.) Yüksek düzeyde antijen spesifik IgE, eozinofil hakimiyeti olan enflamasyon ve Th2 sitokin (IL-4, IL-5, IL-13) yanıtı gösterirler. Fare ile ilişkili genetik teknolojiler çok fazladır. Ticari olarak fare spesifik kitlerin sayısı fazladır. Literatür ışığında tartışmak kolaydır.

9 Fare modellerinin dezavantajları Nazal solunum yaparlar. Model için yüksek dozda alerjen /antijene gereksinim duyulur. Sistemik sensitizasyon doğal bir modelleme değildir. Ovalbümin aeroalerjen değildir. Havayolları aşırı duyarlılığı insan ile karşılaştırıldığında küçüktür. Farelerde spontan astım modeli gelişmez. Fare (Rodent) mast hücreleri serotonin salgılar.

10 Fare modellerinin dezavantajları İNSAN FARE İnhale alerjeni izleyen süreçte bronşlarda LPR gelişip gelişmediği tartışmalıdır. AHR kalıcı değildir. EPR; Early phase responses LPR; Late phase responses AHR; Airway hyperresponsiveness

11 Fare modellerinin dezavantajları Postür farklılığı Akciğerin anatomik yapısı,bronş dallanmaları farklıdır. Zosky GR, Clin Exp Allergy 2007

12 Fare modellerinin dezavantajları Kronik astım modeli? (Tekrarlayan inhale alerjene tolerans) Th2 yanıtı çok güçlüdür. (Modellemede bias?) Alerjik alveoliti de taklit edebilir. Eozinofil degranülasyonu düşük düzeydedir. Etik kaygılar (Merdiven altı üreticiler, ruhsatsız laboratuvarlar )

13 Specific IgE MC degranulation (serotonin) Early bronchoconstriction Late bronchoconstriction +/- (50%) - AHR (vivo) BAL eosinophils (%) 10-20% 20-80% EOs degranulation Th2 driven Goblet/mucus Fibrosis Basement membrane Smooth muscle hyperplasia +++ +/- Airway vascular remodeling ++ +

14 Astım Sıçan Modelleri Farelerden farklı olarak AVANTAJLARI; Daha büyük ve daha geniş hacimli oldukları için serum, BAL, organ ya da doku almak, manuplasyonlar daha kolaydır. Sıçanda LPR gelişimi kullanılan protokole göre değişmektedir. Sıçan türleri arasında en uygun model sıçanı olarak tanımlanan Brown Norway sıçanlarda akut cevap hem EPR hem de LPR ile karekterizedir.

15 Astım Sıçan Modelleri Farelerden farklı olarak DEZAVANTAJLARI; Genetik teknolojilerin çeşitliliği daha azdır. Sıçan spesifik kitlerin çeşitliliği daha azdır.

16 İnhale alerjeni takiben akciğer fonksiyonları İnsan Sıçan, kobay ve köpekte LPR gelişimi kullanılan protokole göre değişmektedir. Sıçan Kobay Köpek Sıçan türleri arasında en uygun model sıçanı olarak tanımlanan Brown Norway sıçanlarda akut cevap hem EPR hem de LPR ile karekterizedir.

17 AVANTAJLARI Astım Kobay Modelleri Mesleksel astım ve atopik astım modellerinde tercih edilir. Artmış hava yolu hiperreaktivitesi ve eozinofili ile karekterize yanıt verir. Özellikle kimyasal irritanlara, proteinlere karşı kontakt hipersensitivite çalışmalarında tercih edilir.

18 Astım Kobay Modelleri DEZAVANTAJLARI İnbred soyları az bulunur. Hassas laboratuvar hayvanlarıdır. Bakım ve barındırma koşulları sorunludur. Kobay spesifik kitlerin çeşitliliği azdır. Metakolin, histamin ve alerjeni izleyen solunum yolu yanıtları insan ile aynı, lökotrien yanıtları ise farklıdır. Diğer rodentlerde olduğu gibi serotonin bronkokonstriksiyona neden olur.

19 Astım Büyük Hayvan Modelleri Kedi, köpek, koyun, domuz, maymun kullanılabilir. Köpekler alerjik solunum yolu hastalıklarından ziyade dermatit ya da konjuktivit de tercih edilir. Geleneksel modellerle alerjen inhalasyonuna yanıtta akut fizyolojik konstruksiyon, eozinofili, artmış IgE düzeyleri ve AHR gibi belirteçler görülebilir. Koyun ve köpeklerin solunum yollarında alerjik cevabı ortaya çıkarmak için Ascaris suum etkilidir.

20 Astım Büyük Hayvan Modelleri Koyunlar insan astım patogenezini taklit etmede en uygun model hayvandır. Tıpkı insandaki gibi alerjen inhalasyonu takiben sırasıyla EPR, LPR ve AHR gözlenir. İNSAN KOYUN

21 Astım Patogenezi Eozinofil Kronik Eozinofilik İnflamasyon IL-3, IL-5 GM-CSF IL-4 IL-5 ECP MBP NO Subepitelyal fibrozis Düz kas hipertrofisi Goblet hücre hiperplazisi Revaskülarizasyon Epitel yıkımı Th2 Lenfosit IL-3 SCF IL-4 IL-13 Mast hücresi IgE Histamin LTC 4 PGD 2 Akut İnflamatuar Ataklar Bronkospazm Vazodilatasyon Permeabilite artışı Ödem Mukus sekresyonu B Lenfosit

22 Astımlı havayolundaki enflamatuar hücreler Mast hücreleri (mukozal, düz kas içi) Eozinofiller (remodeling) Th2 lenfositler (Reg T hüc, NK hüc ) Dendritik hücreler Makrofajlar Nötrofiller ( ağır astım, sigara içimi) GINA 2006

23 Farede Akut Astım Modelleri OVA;Ovalbümin, Blag 2;Blatella germanica(cockroach allergen), Derf 1;Dermatophagoides farinae 1 (House dust mite allergen), EAR;Early asthmatic response, LAR;Late astmatic response Nials AT, Dis Model Mech 2008

24 Farede Kronik Astım Modelleri (Nials AT, Dis Model Mech 2008) *Ev tozu akarları, koagüle yumurta beyazı implantı, hamam böceği antijenleri, Aspergillus fumigatus antijenleri kullanılabilir.

25 FAREDE KRONİK ASTIM MODELİ OLUŞTURMA PROTOKOLÜ Temelkovski ve ark. Fare cinsi Alerjen Sensitizasyon Challenge Son alerjen uygulamasından sonraki yanıtlar BALB/c OVA OVA+AlOH 3 (intraperitoneal) 0 ve 14. günlerde İnhale OVA 6-8 hafta 3 gün/ hafta 30 dk/gün İntraepitelyal eozinofili, Lamina propriada mononüklear hücre infiltrasyonu, Remodeling, TH2 sitokinlerin artışı Temelkovski et al. Thorax,1998

26 FAREDE KRONİK ASTIM MODELİ OLUŞTURMA PROTOKOLÜ Temelkovski ve ark. OVA+AlOH 3 (intraperitoneal) 0 ve 14. günlerde

27

28

29 FAREDE KRONİK ASTIM MODELİ OLUŞTURMA PROTOKOLÜ Henderson ve ark. Fare cinsi Alerjen Sensitizasyon Challenge Son alerjen uygulamasından sonraki yanıtlar BALB/c OVA OVA+AlOH 3 (intraperitoneal) 0 ve 14. günlerde İntranazal OVA 14., 27., 28., 47., 61. ve günlerde Eozinofilik ve mononüklear hücre infiltrasyonu, Goblet hücre hiperplazisi, Subepitelyal kollajen Remodeling,??? TH2 sitokinlerin artışı??? Dis Model Mech. 2008

30 Diğer alerjenler

31 Farelerde mesleksel astım modeli Toluenediisocyanate Trimelliticanhydride(TMA), solunum duyarlaştırıcısı(daha fazla solunum cevabı) 1-chloro-2,4-dinitrobenzene(DNCB), dermal duyarlaştırıcı.

32 Farede Astım Atak Modelleri Kronik astım modeli oluşturulan farelerde nebulize ovalbumin uygulamasının 75. gününde metakolin inhalasyonu ile akut atak oluşturulabilir. İnhale metakolin ve 25 mg/ml yoğunluğunda 1 er saat ara ile 3 dk boyunca verilir. Her metakolin dozundan önce 0.dakikada ve 5 dakika sonra O 2 saturasyonu pulse oksimetre cihazı ile karın cildi traş edilmiş farelerin karın cildinden ölçülür.

33 Sensitizasyon ve inhalasyon prosedürü OVA+AlOH 3 (intraperitoneal) 0 ve 14. günlerde Nebulize OVA (%2.5) (21. günden başlayarak 74. güne kadar, 8 hafta boyunca, haftada 3 gün, günde 30 dakika) Astım Atak grupları 75. Gün Astım Atak prosedürü Kontrol grupları O 2 saturasyonu ölç, 6.25mg/ml İnhale Metakolin 3 dk süreyle ver. 5 dk sonra O 2 saturasyonu ölç 1 saat ara ver. O 2 saturasyonu ölç, İnhale serum fizyolojik 3 dk süreyle ver. 5 dk sonra O 2 saturasyonu ölç 1 saat ara ver. O 2 saturasyonu ölç, 12.5 mg/ml İnhale Metakolin 3 dk süreyle ver. 5 dk sonra O 2 saturasyonu ölç 1 saat ara ver. O 2 saturasyonu ölç, İnhale serum fizyolojik 3 dk süreyle ver. 5 dk sonra O 2 saturasyonu ölç 1 saat ara ver. O 2 saturasyonu ölç, 25 mg/ml İnhale Metakolin 3 dk süreyle ver. 5 dk sonra O 2 saturasyonu ölç O 2 saturasyonu ölç, İnhale serum fizyolojik 3 dk süreyle ver. 5 dk sonra O 2 saturasyonu ölç Temelkovski et al. Thorax,1998

34 Astım hayvan modellerinde laboratuvar incelemeleri

35 Sensitizasyon ve inhalasyon prosedürü OVA+AlOH 3 (intraperitoneal) 0 ve 14. günlerde Nebulize OVA (%2.5) (21. günden başlayarak 74. güne kadar, 8 hafta boyunca, haftada 3 gün, günde 30 dakika) Sağaltım prosedürü Günler 75 Yaklaşık 7-10 gün sonra Yaşamı sonlandırma Grup I- Sağlıklı kontrol Grup II- Astım + plasebo Grup III- Astım + Deksametazon Grup IV- Astım + Etken madde BAL örneği alma Hücre sayımı Sitokin yanıtları NO düzeyi Antioksidan yanıtları vb. Kan örneği alma OVA spesifik IgE Sitokin yanıtları NO düzeyi Antioksidan yanıtları vb. Sitokin Doku-organ örneği alma (Akciğer dokusu, trakea vb.) NO düzeyleri vb. Histopatolojik analizler

36 Histopatolojik Yöntemler Işık mikroskobu incelemeleri Elektron mikroskobu incelemeleri * Havayolu epiteli bozulmuş Subepitelyal düz kas tabakası belirgin kalınlaşmış Peribronşial parankimal alanlarda mononükleer infiltrasyon Gc PAS (+) goblet hücreler

37 SAĞLIKLI FARE AKCİĞERİ KRONİK ASTIMLI FARE AKCİĞERİ Av Av Sm Sm Bv Av Alv Ep Küçük çaplı hava yolları ve çevreleyen epitel sağlam ve olağan görünümde. Hava yolunu çevreleyen düz kas tabakası (Sm) ince ve devamlı. Kan damarları ve çevreleyen parankim normal, alveol yapıları düzenli olarak izlenmektedir (H E X 10). Hava yolunu çevreleyen uzun boylu epitel (Ep) Kalınlaşmış olarak gözlenen düz kas (Sm) tabakası Peribronşial mononükleer yangısal infiltrasyon Işık Mikroskobu (H E X 10)

38 BAL Örneği Alma Teknikleri

39 Kan Örneği Alma Teknikleri

40 Hayvan modellerinde SFT? Hava yolu obstrüksiyonu ve reverzibilitesi (FEV 1,PEF) Body Plethysmograph

41

42 Sonuç olarak; Günümüzde mevcut astım modelleri insan astımını tam olarak yansıtamamakla birlikte gerek hastalığın patogenezi gerekse etkili tedavi arayışları konusunda değerli veriler sunmaktadır. Ancak hayvan modellerinde; hayvan türü seçiminin, oluşturulacak modelin protokolünün ve elde edilen sonuçların dikkatli yorumlanmasının önemli olduğu unutulmamalıdır.

43 Teşekkürler.