E. coli O157:H7 Genel Bilgiler (Kaynak 3) 1

Transkript

1 E. coli O157:H7 Genel Bilgiler (Kaynak 3) Giriş 02. Kaynağı ve Yayılması 03. Enfeksiyona Aracı olan Gıdalar 04. Biyokimyasal ve Antijenik Özellikleri 05. Gelişmesi ve Canlı Kalması 06. Kontrolü 07. Yaptığı Hastalıklar 08. Virülens Faktörleri 01. Giriş Escherichia coli hayvanların ve insanların barsak sistemlerinin normal florasıdır. Normal olarak vücutta bulunan zararlı bakteri türlerini baskılaması ve vitamin sentezine katkıda bulunması nedeni ile vücut için yararlı olarak da nitelendirilebilmektedir. Az sayıda E. coli serotipi insan ve hayvanlarda zararlı etki yapar (8). İnsanlarda diyareye neden olan E. coli suşları 2. Dünya Savaşı 'ndan sonra ortaya çıkarılmıştır. Bu tarihe kadar düşük virülense sahip olduğu ve idrar yolları enfeksiyonlarına neden olabildiği kabul edilen E. coli 'nin diyare etmeni olarak tanımlanması ile bu bakteriye bakış değişmiştir. Bugün insanlarda diyareye neden olan E. coli serotipleri patojenik (95, 151), enteropatojenik (161), enterovirulent (8, 89, 160), diyarejenik (80, 115) serotipler olarak adlandırılmaktadır. Bu serotipler virülens özellikleri, patojenite mekanizması, klinik sendromlar ve O:H serotiplerine göre başlıca ; enteropatojenik (EPEC), enterotoksijenik (ETEC), enteroinvaziv (EIEC), enterohemorajik (EHEC), difuz-adhering (DAEC), entero-agregativ (EAggEC) olmak üzere 6 ana grup altında toplanmaktadırlar (58). Bununla birlikte, diyareye neden olan serotiplerin bu şekilde kesin bir ayrımı yoktur. Bu gruplara ilaveten fakültatif enteropatojenik (FEEC), verotoksin oluşturanlar (VTEC), önceleri shiga benzeri toksin oluşturanlar (=shiga like toxin ; SLTEC) olarak adlandırılmış olmakla beraber son zamanlarda doğrudan shiga toksin (Stx ; çoğul formda Stxs) oluşturanlar (STEC) şeklinde tanımlanmış olması (129), diyare oluşturanlar (DEC) (115) gibi grupların başka gruplar ile de tarif edilebilmesi (160), diyareye neden olan E. coli 'lerin enfeksiyon veya intoksikasyon etmeni olarak gruplandırılması (61) bu konudaki terminolojiyi zorlamaktadır. Bunlardan ETEC suşları ısıya dirençli (Heat Stabile Toxin = ST) ve ısıya duyarlı (Heat Labile Toxin = LT) bir ya da daha fazla toksin oluştururlar. Bu suşlar bağırsağa tutunma ve kolonizasyon için özel bir yapışma fimbriası içerirler. Genellikle düşük bir ateşe neden olabilirler ya da ateş görülmez. Sulu bir diyareye neden olurlar ve tipik gastroenteritis etmenidirler. Turist ishali (seyahat diyaresi) olarak tanımlanan hastalıklara ve özellikle sıcak mevsimlerde bebek ishallerine neden olurlar. Bu bakterilerin hastalığa neden olabilmesi için çok sayıda bakterinin vücuda girmesi gerekir. Bir diğer deyiş ile bunlarda enfektif doz yüksektir. Bazı EPEC suşları bir 1 Kaynak : Escherichia coli O157:H7 Serotipi Orkim Ltd Yayınları, Ankara 1

2 ya da daha çok verositotoksin üretirler. Sulu ve kanlı bir dışkı ile görülen ishallere neden olurlar. Hastalık sırasında ateş yüksektir. EIEC suşları ise genellikle laktoz negatif ya da laktoz geç pozitif ile hareketsiz olma gibi atipik özellikler taşırlar ve Shigella türleri ile antijenik olarak yakınlık gösterirler. Diğer enterovirulent tiplerden farklı olarak invaziv özellik taşırlar ve fekal lökositlere rastlanır. Mukoid ve kanlı bir dışkı görülür. Ateş yüksektir. Bu gruba giren bakterilerde enfektif doz düşüktür. EHEC olarak tanımlanan grubu başlıca E. coli O157:H7 serotipi oluşturur. EHEC izolatları çeşitli toksinler oluşturmakla beraber bunlardan sadece bir kaçı tanımlanabilmiştir. İlk kez 1955 yılında tanımlanmış olan hemolitik üremik sendrom (HUS) en fazla ölüme neden olan hastalıktır. Sulu ve çok kanlı bir dışkı görülürken ateş yoktur. Enfektif doz ise kayda değer ölçüde düşüktür. EA-AggEC suşları hayvanlarda epidemiyolojik çalışmalar sonucunda ortaya çıkarılmıştır. Tropik ülkelerde çocuklarda süreklilik gösteren diyareye neden olurlar. Daha önceden EPEC grubunda yer alan ve Hep-2 hücre modeline göre diffuz adhesyon ile karakterize edilen diğer grup DAEC olarak adlandırılmıştır. Bunlar da çocuklarda süreklilik gösteren diyareye neden olurlar (58, 88, 89, 115, 117, 123, 129, 160). Diyareye neden E. coli serotipleri içinde en önemlileri E. coli O157:H7 ve O126:H11 serotipleridir. Her iki bakteri de EHEC grubu içinde yer almakta ve benzer hastalıkları yapmakla beraber O126:H11 serotipine gıdalarda rastlanmamıştır. Ayrıca E. coli O157:H7 serotipinin farklı suşları VT-1 ve/veya VT-2 toksinlerini üretirken E. coli O126:H11 serotipinin bütün suşları sadece VT-1 üretmektedir. O157:H7 serotipi bugün için kabul edilen en tehlikeli gıda kaynaklı patojenler içinde yer alır (80, 88, 125, 145). Bununla beraber O111 gibi O157 olmayan STEC serotiplerine gıdalarda sıklıkla rastlandığı ve bunların da klinik hastalıklara neden olduğu, bu nedenle bu serotiplerin ihmal edilmemesi gerektiği belirtilmektedir (3) E. coli O157:H7 serotipi genel olarak Kuzey Amerika kıtası ülkelerinde daha sıklıkla görülmekle beraber, bugün 6 kıtada en az 16 ülkede giderek artan sayıda vakaya rastlandığı, genel olarak mayıs - ekim aylarında vaka sayısında artış olduğu, hastalığın 5 ve daha altındaki çocuklar ile 65 ve daha yukarı yaşlılarda daha fazla görüldüğü bildirilmektedir. Enfektif dozunun 0,3-15 hücre/g gibi çok düşük düzeyde olması salgınların yayılmasında kişiden kişiye bulaşmaların temel etken olduğunu göstermektedir (58, 129). 02. Kaynağı ve Yayılması E. coli O157:H7 serotipinin kaynağı üzerinde farklı görüşler bulunmaktadır. Çeşitli araştırma sonuçları bu bakterinin başta süt inekleri olmak üzere sıcak kanlı hayvanlar olarak tanımlanan memeli ve kanatlı hayvanların dışkıları ile ete, süte, toprağa, suya ve dolayısı ile tüm çevreye yayıldığını göstermiştir (80). Patojen bakterilerin evrimi üzerinde çalışmalar yoğun şekilde sürmektedir. Escherichia, Salmonella ve Shigella türleri üzerinde yapılan genetik analizler E. coli O157:H7 serotipinin bireysel bir patojen olmadığı, bunun enterik bir bakteriden evrimleştiği şeklindeki teori oldukça benimsenmiştir. 16S rrna ve ve 5S rrna dizilişleri ile yapılan filogenetik araştırmalar Escherichia spp. ve Salmonella spp. nin memeli hayvanların ilk türeyişi olan milyon yıl önce ortak bir atadan ayrıldıkları, Shigella spp. nin erken primatların oluştuğu 80 milyon yıl kadar önce E. coli den türediği, kommensal E. coli lerin memelilerin bağırsağını tercih ederken, patojen E. coli lerin barsak epitelini aşıp dolaşım sistemine ve buradan uygun bulduğu yerlere lokalize oldukları kabul edilmektedir. Patojenik E. coli, Salmonella ve Shigella suşlarının virülens analizleri bunların en az bir virülens determinantlarının plazmid ya da transpozon olarak ekstrakromozomal elementler üzerinde bulunduğunu göstermiştir. Örneğin turist ishalinden izole 2

3 edilmiş ETEC suşlarında en az 2 adet plazmid bulunmuştur. Bu konudaki bir başka örnek Sh. sonnei 'nin O antijenini kodlayan bir plazmide sahip olmasıdır. Önceleri bu genin kromozom üzerinde bulunduğu, zamanla bunun inaktive olduğu ve plazmid üzerinde yer aldığı, bunun nedeninin de plazmidde kodlanan genlerin yeni bir ortama adaptasyonda avantaj sağladı düşünülmektedir. Bu teori, patojen olmayan E. coli gibi kommensal bir bakterinin Sh. sonnei gibi bir patojene dönüşmesi için çok sayıda faktöre gerek olmaksızın sadece tek bir plazmidin aktarılmasının yeterli olacağı hakkındaki görüşü kuvvetlendirmektedir. Enterik patojenlerde yapılan kromozomal incelemeler ayrı DNA segmentlerinin fonksiyonel virülens özellikleri kodladığı bulunmuş ve bunlara Pathojenity Island ; Pais adı verilmiştir. Daha ilginç olarak bu genler çoğunlukla başka mikroorganizmalardan kazanılmış olarak ortaya çıkmaktadır. Pais, bakteriye kompleks bir virülens özellik kazandırmakta ve genetik transfer ve rekombinasyonları önlemektedir. Pais genellikle hemolisin ve fimbria gibi hücre yüzeyi proteinlerinden sorumlu genler içerir. E. coli O157:H7 de 35 kb olan Locus of Enterocyte Effacement ; LEE olan bir Pais bulunmuştur. Pais in ortaya konulması ile E. coli O157:H7 nin evrim teorileri yeni bir yön kazanmış, bu evrime en azından belirli patojen E. coli klonlarının farklı aşamalarda dahil olduğu şeklinde teoriler geliştirilmiştir. Kommensal bakteri kromozomuna LEE nin yerleşmesi EPEC benzeri bir klon oluşması için temel bir aşamadır. E. coli O157:H7 EPEC benzeri bir atadan önce LEE yi elde etmesi, sonra transdüksiyon ile SLT 2 yi alması, sonra hemolisini kodlayan EHEC plazmidini kazanması, daha sonra SLT 1 i kazanması ve en son olarak sorbitol fermantasyonu ve β-gur aktivitesini yitirmesi ile evrimini tamamladığı kabul edilmektedir (129). E. coli O157:H7 serotipinin genetik çalışmalar sırasında elde edildiği ve bir kaza sonucu doğaya salındığı şeklinde görüşler de bulunmaktadır. Griffin ve Tauxe 'ye göre bu serotip muhtemelen enteropatojenik bir atadan genetik çalışmalar sonucu oldukça yakın bir dönemde ortaya çıkmıştır (76). E. coli O157:H7 serotipi köpek, kuş, koyun, geyik ve insanda görülmekle beraber, sığır temel kaynak olarak ele alınmaktadır. Bunun nedeni, insanlarda bu serotipin neden olduğu kanıtlanmış pek çok vakada yeterince pişirilmemiş sığır etlerinin ve daha az sıklıkta olmak üzere çiğ sütlerin hastalıktan sorumlu olduğunun kanıtlanmasıdır. Bununla beraber, hayvan dışkısı ile bulaşmış toprak ve suyun dolaylı olarak hastalığın taşınmasında ve yayılmasında önemli bir rol oynadığı da bilinmektedir (58, 80). Genç ve sağlıklı sığırlar E. coli O157:H7 enfeksiyonlarına oldukça dirençlidir. Deneysel olarak yemlerine 10 7 düzeyinde E. coli O157:H7 katılan hayvanlarda her hangi bir klinik bulguya rastlanılmaması, 6-8 haftalık danalar için bu bakterinin patojen etki göstermemesi, buna karşın rumen ve barsaktan geçerken dışkılarındaki bakteri sayısında ciddi bir azalma olmakla beraber halen yoğun ölçüde bu patojene rastlanılması sığırların bu bakterinin kaynağı ve çevreye bu bakterinin yayılmasında önemli olduğunu kanıtlamıştır. Benzer şekilde ahırlarda hayvanların su içtiği kanallardaki segmentlerde bu serotip 4 ay süre ile canlılığını koruyup gelişebilmektedir (129). Bu bakteri süt ineklerinin dışkılarında diğer sığırlara göre daha fazla bulunmaktadır (110, 168). Süt sığırlarının dışkısına 10 3 ve 10 5 kob/g düzeyinde E. coli O157:H7 'nin aşılanıp, dışkının 5; 22 ve 37 o C 'larda depolandığı bir çalışmada E. coli O157:H7 'nin 5 o C 'da 70 gün canlılığını koruduğu (164), sığır dışkısında 50 günden daha fazla süre içinde halen belirlenebilecek düzeyde kaldığı, buna karşın 10 6 /ml düzeyinde inokülasyonlar sonucunda sayının sığır idrarında 10 günde, nehir suyunda 7 günde belirlenemeyecek sayıya düştüğü (111), sığır dışkısında 5, 15 ve 25 o C 'lardaki depolanmasında sırasıyla 14, 18 ve 12 hafta canlılığını sürdürdüğü (72) gösterilmiş ve bu bulgulara göre sığır dışkısının bu patojenin yayılmasında önemli bir taşıyıcı olarak dışkının 3

4 sığırlara, gıdalara ve çevreye E. coli O157:H7 'nin yayılmasında potansiyel bir taşıyıcı olduğu, dolayısıyla ahırlarda dışkının iyi bir şekilde kontrol edilmesi gerektiği belirtilmiştir. Süt hayvanlarının beslenmesinde kullanılan pamuk tohumu ve mısır silajı gibi yemlerin az sayıda da olsa E. coli O157:H7 serotipi içerdiğinin belirlenmesi süt ineklerinin dışkılarında bu bakteriye daha fazla rastlandığı hakkındaki görüşü pekiştirmekle beraber, modern çiftliklerde beslenen süt ineklerinin dışkılarında bu serotipe çok daha az rastlanmaktadır (58). Buna bağlı olarak, önceleri bu bakterinin ana kaynağının süt inekleri olduğu ve insanlara asıl geçişin süt ürünleri ile olduğu düşünülmüş ise de süt ve peynirlere ilişkin olarak yapılan tarama çalışmalarından bu varsayımı doğru kılacak bulgular elde edilmemiştir (10, 168). Deneysel olarak 25 adet E. coli O157:H7 verilen civcivlerin inokülasyondan 8 ay sonrasına kadar dışkıları ile bu bakteriyi attıklarının belirlenmesi üzerine önce E. coli O157:H7 'nin ana kaynağının kanatlılar olduğu düşünülmüş (57), ancak 50 çiftlikte 500 hayvanın dışkısında bu bakteriye rastlanmaması üzerine kanatlıların bu açıdan potansiyel kaynak olmadığını göstermiştir (58). Ruminantlarda özel beslenme ile sağlanan gastrointestinal epitel hücre gelişmesinin E. coli O157:H7 serotipi üzerinde olumsuz etki yaptığı (107), buna karşın silaj yapımı sırasında yetersiz fermantasyonun tüm fekal koliformlarda olduğu gibi E. coli O157:H7 sayısında da artışa neden olduğu ve dolayısı ile dışkı ile bulaşmış otların silajında yetersiz fermantasyonun bu bakterinin ruminantlar arasında taşınmasında etkili olabileceği kanıtlanmıştır (67). Salgınlarda en önemli taşıyıcının insandan insana olduğu, özellikle ana okulu ve düşkünler evi gibi kişisel hijyenin yeterli olmadığı yerlerde salgının hızla yayıldığı bilinmektedir (58, 80). 03. Enfeksiyona Aracı Olan Gıdalar Başta sığır dışkısı olmak üzere doğrudan ve/veya dolaylı olarak hayvanların dışkısının bulaştığı her türlü gıda maddesi E. coli O157:H7 enfeksiyonu bakımından potansiyel tehlike taşımaktadır. Nitekim pek çok gıda maddesinde ve ayrıca içme ve kullanma suları ile yüzülen göllerde E. coli O157:H7 varlığı gösterilmiş iken başka gıdalarda da bu tehlikenin boyutları deneysel olarak kanıtlanmıştır. Dünya çapındaki infeksiyonların çok büyük bir bölümü başta yetersiz pişirilmiş et ve pastörize edilmemiş süt olmak üzere sığır kaynaklı gıdalar ile olmuştur. Diğer hayvanlar ve özellikle ruminantlar da E. coli O157:H7 kaynağı ya da vektörüdür (35). Başta sığır olmak üzere domuz, koyun, piliç etleri ve yine başta hamburger ve köfte olmak üzere kıyma ile hazırlanan et ürünlerinden sıklıkla izole edilmektedir. Farklı hayvanların dışkılarının eti farklı düzeylerde kontamine edebileceği gösterilmiştir. İngiltere 'de yapılan bir seri çalışmada sığır dışkılarında %15,7 ; koyun dışkılarında %2,2 düzeyinde pozitif sonuç bulunmuş iken, sığır eti ürünlerinde %1,5 buna karşın kuzu eti ürünlerinde %5,9 pozitif sonuç alınmış olması oldukça ilginç bulunmuştur. Et ürünleri dışında da bulunan ve salgınlara yol açan bu patojen en yaygın olarak çeşitli peynirler, çiğ süt ve genel olarak patojenler açısından güvenilir bir gıda olarak tanımlanmasına karşın yoğurt gibi süt ürünleri ; çeşitli su kaynakları, salatalar ve salata sosları, evde yapılan sandviç, turp filizi, pastörize edilmemiş elma şarabı ve taze sıkılmış elma suyu çeşitli enfeksiyonlara neden olmuştur. Suyun potansiyel kontaminasyonuna karşı su kaynaklı infeksiyonun diğerlerine göre daha az olduğu ve bunun nedeni olarak E. coli O157:H7 serotipinin suyun işlenmesi sırasında kolaylıkla öldürülebilmesi belirtilirken, Afrika ülkelerinde 4

5 yüzey suyunun içilmesine bağlı olarak binlerce hastalanmanın görüldüğü salgınlar da göz ardı edilememektedir (8, 32, 33, 35, 36,37, 38, 47, 52, 55, 57, 58, 78, 114, 168). Bu bakterinin iceberg salatalarında canlı kalması ve yapraklara penetrasyonu ve klorun etkisi üzerinde de araştırma yapılmış, hücrelerin kesik dokuların 73,5 µm altına penetre olduğu, 200 ppm klorun 5 dakika içinde 0,7-1,0 log birimi indirgeme sağlamakla beraber doku içine nüfuz etmiş E. coli O157:H7 hücrelerinin klor etkisinden daha fazla korunduğu bulunmuştur (153). Böylece çiğ yenilen salata türü sebzelerin ne denli tehlikeli olabileceği ortaya konulmuştur. Taze sıkılmış elma suyu ABD 'de ve Batı Avrupa ülkelerinde oldukça yaygın bir tüketim alanına sahiptir. Ağaçtan yere dökülmüş ve dışkı ile bulaşmış elmaların yeterince yıkanmadan ayaküstü büfelerde sıkılarak tüketime sunulması sonunda kayıtlara geçen pek çok enfeksiyon görülmüştür. Yine ABD 'de pastörize edilmemiş elma suyundan yapılan elma şarabı (cider) pek çok enfeksiyona neden olmuştur. Elma şarabına işlenecek elmaya diğer meyve şaraplarında olduğu gibi ısıl işlem uygulanmaması ve elma şarabında alkolün %4-5 düzeyinde olması enfeksiyon riskini artırmaktadır (58, 129). Her ne kadar E. coli O157:H7 salgınlarında çoğu kez yeterince pişirilmemiş sığır kıyması ve buna bağlı olarak hamburger gösteriliyor ise de oldukça seyrek olan vakalarda risk faktörü hakkında yeterli bilgi yoktur. İlginç olarak ayaküstü (fast food) restoranlarda çalışanların daha büyük bir risk taşımadıkları ve et ürünlerinin tüketimine bağlı olarak riskin artmadığı gösterilmiştir (57). Buna tümüyle karşı bir görüş ise bu serotipin hayvan varlığı ve/veya et tüketimi yüksek olan gelişmiş ülkelerde daha yaygın görüldüğü, genel hijyenik kurallara daha az uyulan gelişmemiş ülkelerde görülmeme nedeninin ise aynı şekilde hayvan varlığı ve et tüketimindeki yetersizlik olduğu şeklindedir (129). 04. Biyokimyasal ve Antijenik Özellikleri E. coli O157:H7 serotipi diğer E. coli 'lerden ; 44,5 o C ve üzerinde gelişememesi, sorbitolü fermente edememesi, β - glucuronidase enzimine sahip olmaması, buna karşı eae genine sahip olması, 60 mda plazmid taşıması ve yaygın olarak görülmeyen Dalton moleküler ağırlıkta OMP ekspresyonu ve enterohemolisin üretimi ile ayrılır (58, 129, 160). E. coli 'lerin %95 'i sorbitolü 24 saat içinde fermente ederken E. coli O157:H7 sorbitolü 48 saat içinde fermente edememektedir. Bununla beraber Birleşmiş Milletler Dünya Sağlık Örgütü (WHO) 'ne göre (6), SLTEC O157 suşları arasında sorbitol pozitif olanlara da rastlanılmaktadır. E. coli O157:H - suşları sorbitol pozitiftir (58). Yine E. coli 'lerin %97 'si ß-glucuronidase enzimi içerirken E. coli O157:H7 serotipi ß-glucuronidase negatiftir. Yeni bir tip hemolisin olarak kabul edilen enterohemolisin, verotoksin pozitif E. coli O157:H7 ve E. coli O157:H - serotipleri tarafından üretilirken, bu özellik diğer E. coli 'lerde yoktur. Enterohemolisin sadece eritrositleri yıkanmış kanlı agar petrilerinde belirlenebilir. Bu şekilde 33 adet verotoksik E. coli O157:H7 ya da E. coli O157:H - izolatının 32 adedinin enterohemolisin ürettiği gösterilmiştir. Bunların dışında E. coli O157:H7 serotipi diğer E. coli 'lere göre safra tuzlarına daha az dayanıklıdır. Antijenik yapısı diğer E. coli 'ler ile kesin bir ayırım sağlar (57, 118, 120, 125, 126). E. coli 'nin florojenik MUG belirteci uida geni tarafından kodlanan β-glucuronidase enziminin aktivitesine bağlıdır. EHEC E. coli O157:H7 'de de bu genin varlığı gösterilmiş olmakla beraber, yapılan sekans analizleri bu serotipte uida geninde bir kaç baz mutasyonu olduğunu göstermiştir. Bu nedenle E. coli O157:H7 serotipinde diğer E. coli 'lerde tipik olan MUG reaksiyonu negatiftir (88). 5

6 E. coli O157:H7 'nin O157 antijenik determinantı bakterinin selüler lipopolisakkaritinin polisakkarit kısmında bulunur. Yapısal analizler sonucunda bu determinant D-glukoz, L-fukoz (6-deoksi-L-galaktoz), 2-asetamido-2-deoksi-D-galaktoz, 4-acetamido-4,6-dideoksi-D mannoz (1:1:1:1) 'dan oluşan ve tekrarlanan tetrasakkarid ünitelerinin doğrusal polimeri olarak tanımlanmıştır (129, 134). MUG negatif E. coli O157 izolatlarının verositotoksin pozitif olduğu söylenebilir. Bir çalışmada 188 E. coli O157 serotipinin MUG ve verositotoksin testleri yapılmış, bunlardan 155 E. coli O157:H7, 10 E. coli O157:H - ve 1 E. coli O157:H (rough) olmak üzere 166 adedi MUG negatif ve verositotoksin pozitif iken, diğer 22 izolat (2 O157:H -, 1 O157:H, 19 diğer H tipleri ; H6, H16, H19, H25, H42, H45) MUG pozitif ve verositotoksin negatif olarak bulunmuştur (156). E. coli suşları arasında serolojik bir bağlantı olduğu ilk kez 1921 'de Dodgeon ve arkadaşları tarafından belirtilmiş, sonra 1937 'de Lowel E. coli 'nin kapsül ve somatik olmak üzere 2 çeşit antijeni olduğunu ileri sürmüş, 1943 'de ise Kaufmann flagella antijenini de göstermiştir. Buna göre E. coli 'de O1-O171 arasında gösterilen 165 somatik O antijeni, K1-K90 arasında gösterilen 90 kapsül K antijeni ve H1-H56 arasında gösterilen 56 flagella H antijeni saptanmıştır. Çeşitli araştırmalar ile 171 O antijeni belirlenmiş ise de bunlardan 31, 47, 67, 72, 94 ve 122 numaralılar listeden çıkarılmış ve 165 O antijeni kalmıştır. En son çalışmalara göre bugün 174 O, 56 H ve 80 K antijeni olduğu saptanmıştır (58). E. coli 'nin somatik O antijenleri ile Salmonella, Shigella, Citrobacter ve Providencia cinsi bakteriler arasında önemli ölçüde çapraz reaksiyonlar bulunmaktadır. Termostabil özellik gösteren O antijenlerinden en çok rastlanan 25 kadar antijendir. Hücre zarında, kılıfında ya da kapsülde bulunan kapsül K antijenleri L, B ve A grubundadır. Bunlardan L ve B grubu yüzeysel somatik antijenler, A grubu ise kapsül antijenleridir. K antijenleri de termostabil özellik gösterir. Kapsül antijenleri içinde ayrıca Vi, a, ß, F antijenleri de vardır. Monofazik olan H antijenleri ise sadece hareketli türlerde bulunur ve ısıya duyarlıdır. Flagellar H antijenleri birbirleri ve diğer bakterilerin H antijenleri ile çapraz reaksiyon vermezler (58, 116). E. coli O157 ile Escherichia cinsi içindeki diğer 4 sorbitol negatif türün antijenik ilişkisinin araştırıldığı bir çalışmada 24 E. hermannii, 12 E. fergusonii, 12 E. vulneris ve 1 E. blattae izolatı poliklonal antiserum ile tüpte aglütinasyon ve lateks lam aglütinasyon testine alınmışlardır. Bunlardan sadece 4 E. hermannii izolatı serolojik olarak çapraz reaksiyon vermiştir (141). Bunlara ilaveten Citr. freundii suşlarının da E. coli O157 antiserumu ile agglutinasyon verdiği bildirilmektedir (89). 05. Gelişmesi ve Canlı Kalması E. coli O157:H7 serotipi de diğer E. coli 'ler gibi optimum olarak 37 o C 'da ve ph 7,2 'da gelişir (55). E. coli O157:H7 serotipinin gelişmesi üzerine yapılan çalışmaların çoğu bu serotipin izolasyon çalışmalarına yöneliktir. Çeşitli araştırmalar gıda kaynaklı hemorajik kolit vakalarında anahtar rol oynayan E. coli O157:H7 'nin aside dirençli olduğunu ve bu toleransının midenin kuvvetli asit ortamından rahatlıkla geçmesini sağladığını göstermiştir. Bu bakterinin aside direnci insanlarda enfeksiyon dozunun çok düşük olmasını etkileyen bir faktör olarak kabul edilmektedir. Salmonella nın tersine olarak 1-2 ph olan insan midesinde yaklaşık 3 saat süren sindirim sırasında canlı kalabilmesi ve buradan bağırsağa geçmesi bu ilişkiyi açıklamaktadır (129). Benzer şekilde mayonez, fermente etler, cottage peyniri gibi asitli gıdalarda diğer patojenler inhibe olurken, bunun E. coli O157:H7 'nin rahatlıkla gelişebilmesi için bir avantaj olduğu gösterilmiştir. Bu özelliği ile elma suyu ve geleneksel olarak güvenli kabul edilen fermente et ürünlerinde 6

7 canlılığını koruyabilmektedir (11, 25, 30, 39, 45, 69, 73, 112, 113, 148, 167). ph 'sı 3,6-4,0 olan elma şarabında 8 o C 'da 31 gün canlı kalabilen E. coli O157:H7 'nin %40 'dan fazla mayonez içeren ve ph 'sı 5,40-6,07 olan et salatasında canlılığını uzun süre koruyabildiği, ph 4,2 'de bir kaç hafta canlı kalabildiği, hatta et salatasının karakteristik ph 'sında gelişebildiği, sırasıyla asetik, laktik ve sitrik asitlerin etkili olduğu belirlenmiştir (2, 12, 58, 137, 174). Sığırların sindirim-boşaltım sistemlerindeki düşük ph ve organik asitler varlığının daha sonra karkasa bulaşma potansiyeli olan E. coli O157:H7 serotipi ve diğer patojenlerin aside dirençliğini artırabileceği düşünülmektedir. Yapılan çeşitli çalışmalar bu bakterinin aside toleransının artırabileceğini (16, 102), asit cinsinin aside olan tolerans artırımında etkili olduğu ve suş farklılıklarının aside dirençlikte önemli olduğunu (27, 51) göstermiştir. E. coli O157:H7 suşlarının ekstrem asit (ph 3) koşullarda canlılıklarını sürdürebilmelerinin araştırıldığı bir çalışmada asitle indüklenmiş oksidatif sistem, asitle indüklenmiş arjinine bağlı sistem ve glutamata bağlı sistem olmak üzere önceden karakterize edilen 3 asit dirençlilik sistemi test edilmiştir. Çeşitli asit direnç sistemlerinin patojen E. coli 'nin mide (ph 1-3) ve barsak (ph 4,5-7) ortamlarındaki asit streslerinde canlılığını korumasında etkili olduğu, bir kez indüklendikten sonra asit direnç sisteminin 4 o C 'daki soğuk depoda aktif halde uzun süre stabil kaldığı ve bu bulgunun özellikle gıda endüstrisi için önemli olduğu belirtilmiştir (103). Benzer şekilde aside direncin gelişme fazı ile doğrudan ilgili olduğu ve en yüksek direncin durma fazında olduğu belirlenmiş, aside bir kez direnç kazanıldıktan sonra bunun soğuk depo ortamlarında da korunduğu, sığırların sindirim ve boşaltım sistemlerinde asidik ortama direnç kazanan bu patojenin karkasa bulaşması halinde soğuk depo ortamında canlığını uzun süre koruyacağı ve etten elde edilecek asitli ürünlerde de ortam sıcaklığı gibi diğer koşulların uygun hale gelmesi ile gelişmesini rahatlıkla sürdürebileceği gösterilmiştir (129). Etlerde bulunan E. coli O157:H7 üzerine organik asitlerin etkisi çeşitli araştırmalara konu olmuştur. Sığır karkasında bulunan E. coli O157:H7 'nin organik asitler ile kontrolü için pilot ölçekli bir karkas yıkayıcısı kullanılmış ve yağlı ya da yağsız et dokuları E. coli O157:H7 'nin 3 suşu ile inoküle edilip 24 o C 'da %1; 3 ; 5 laktik asit, asetik asit ya da sitrik asit ile yıkanmış ve 4 o C 'da 24 saat inkübasyondan sonra yapılan sayımların istatistiksel incelenmesinde asit cinsinin önemli olmadığı, ancak asit konsantrasyonu, bakteri suşu ve sığır karkas dokusunun bakteri sayısının azalmasında önemli olduğu, yağsız et dokusu üzerinde %5 konsantrasyonda asit pülverizasyonun tüm E. coli O157:H7 suşları üzerinde en fazla etkiyi gösterdiği saptanmıştır (47). Benzer şekilde ılık (20 o C) ve sıcak (55 o C) asetik, sitrik ve laktik asidin sığır bifteğine inoküle edilmiş E. coli O157:H7 üzerindeki etkisinin araştırıldığı bir çalışmada elde edilen bulgular yine E. coli O157:H7 'nin aside dirençli olduğunu, asit çeşidinin etkili olmadığını, asit uygulamasının depolama süresi boyunca kayda değer bir canlılık azalması sağlamadığını göstermiştir (24). E. coli O157:H7 serotipi yüksek tuz konsantrasyonlarına da direnç göstermektedir. Glass ve ark. tarafından yapılan araştırmada E. coli O157:H7 'nin %6,5 NaCl 'da gelişebildiği, NaCl 'ün inhibisyon etkisinin %8,5 derişimde başladığı, 200 ppm nitrit ve %4,0 NaCl içeren, ph 'sı 5,6 olan sıvı besiyerinde gelişebildiği, %3,5 NaCl ve 69 ppm sodyum nitritli ve ph 'sı 4,8 olan fermente sucukta indirgendiği ancak 4 o C 'da 2 ay süren depolama sırasında kullanılan starter kültüre bağlı olmaksızın tümüyle inhibe olmadığı bulunmuştur (125). Bir başka çalışmada mtsb broth besiyerine ilave edilen %3,5 ve %6,5 NaCl konsantrasyonlarında saat inkübasyon süresi sonunda E. coli O157:H7 serotipinin 10 8 kob/ml düzeyine eriştiği saptanmıştır (1). Bir başka araştırmada ise gelişme üzerine düşük sıcaklık ve yüksek tuz konsantrasyonunun etkisi piliç ekstrakt broth ve triptik soya (TS) broth besiyerinde incelenmiş, 37 o C 'da piliç ekstrakt 7

8 broth besiyerinde %8; 10 o C 'da piliç ekstrakt brothda %6 ve TS brothda %4 NaCl konsantrasyonunda E. coli O157:H7 'nin inhibe olduğu, bakterinin 4 o C 'da gelişemediği gösterilmiştir (40). Buna karşı bir görüş ise E. coli O157:H7 'nin aside kayda değer ölçüde yüksek bir direnç göstermediği ve %6,5 NaCl içeren TS broth besiyerinde gelişemediği belirtilmektedir (129). Bu patojenin kuru ortamlarda canlılığını önemli ölçüde koruduğu gerek deneysel gerek salgına neden olan gıdalar ile gösterilmiştir. Farklı ph ve su aktivitesindeki işlenmiş salamlara inokülasyondan sonra 4 o C 'da 32 saat süre ile 4,63 ph ve 0,90 A s 'de dahi kob/g düzeyinde canlılık elde edilmiştir yılında işlenmiş kuru salamın ve 1966 yılında Japonya 'da turp filizinin neden olduğu salgınlarda her 2 ürünün de kuru olması yine kuru gıdalarda bu bakterinin canlı kalabileceğini kanıtlamaktadır (129). E. coli O157:H7 serotipinin normal gelişme sıcaklığının bir kaç derece fazlasında inkübasyona bırakıldığı bir çalışmada hücrelerin yeni bir grup protein sentezleyerek daha sonra kendileri için öldürücü olabilecek sıcaklıklara karşı daha iyi direnç gösterdikleri bulunmuştur. Aerobik ve anaerobik koşullarda gelişen E. coli O157:H7 'ye ısı şoku uygulamasının ısıl işlemde canlı kalabilen bakteri sayısını artırdığı, bakteriye uygulanan ılımlı bir ısı şokunun bakterinin inhibisyonu için seçilen proses sıcaklığında canlı kalabilme yeteneğini yükselttiği görülmüştür (125). TS broth ve işlenmiş salama ısıl işlem ile strese sokulmuş E. coli O157:H7 'nin inoküle edildiği bir çalışmada ise TS broth besiyerinde ph ve su aktivitesine bağlı olmaksızın 5 o C 'da depolamanın E. coli O157:H7 'nin canlılığını iyi bir şekilde koruduğu, işlenmiş salamda su aktivitesi ve ph 'nın canlılık azalmasında 1-2 log birimi etkili olduğu gösterilmiştir (42). Farklı ortam koşullarında E. coli O157:H7 nin canlılığını ne kadar süre ile devam ettireceği konusunda araştırmalar yapılmaktadır. Laboratuvar analizleri ile E. coli O157:H7 serotipinin kumlu topraklarda ölüm hızının çok yüksek olduğu, 8 haftalık bir süre içinde 10 5 kob/g olan başlangıç sayısının belirlenemeyecek düzeye indiği, buna karşın killi topraklarda 20 hafta içinde sadece 2 logaritma birimi canlılık azalması olduğu belirlenmiştir (66). Bir başka çalışmada ise toprakta 130 günde 10 8 /g düzeyinden sadece 10 7 'ye azalma olduğu bulunmuştur (111). 06. Kontrolü Asitlik ve tuza olan direncin tersine olarak E. coli O157:H7 serotipi yüksek sıcaklığa Salmonella 'dan daha fazla duyarlıdır ancak donma sıcaklıklarına kayda değer ölçüde dirençlidir ve -20 o C 'da 9 ay süre ile sayıda çok az bir azalma ile canlılığını koruyabilmektedir. (8, 55, 129). Yapılan termal inaktivasyon çalışmalarında sığır etinde E. coli O157:H7 'nin D değerinin 54,4 o C 'da 2390 saniye, 60 o C 'da 50 saniye ve 64,3 o C 'da 9,6 saniye olduğu, D değerinin Salmonella 'dan daha düşük olduğu belirlenmiştir (56). %10 yağlı sığır etinde yapılan termal inaktivasyon çalışmaları ile D 10 değerinin 55 o C da 21,13 dakika, 57,5 o C da 4,95 d, 60 o C da 3,17 d, 62,5 o C da 0,93 d, ve 65 o C da 0,39 d olduğu, etteki yağ oranı arttıkça D 10 değerinin de arttığı ve ısıl işleme direncin durma fazının sonunda iken logaritmik gelişme fazına göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir (129). Bu bakterinin ısıl işleme çok duyarlı olduğu, 70 o C 'da 2 dakikalık ısıl işlem uygulaması ile 6 logaritma birimi canlılık azalması olduğu (12, 133), bir diğer deyiş ile ısıl işlem ile yeterli bir indirgeme sağlanabileceği benzer araştırmalar ile de gösterilmiştir (94, 142, 150). Bir başka çalışmada araştırıcılar hamburgerlerin merkezine E. coli O157:H7 inoküle etmişler, hamburgerleri üretici firmanın önerisine göre pişirmişler ve sonuçta bu pişirme sonunda E. coli 8

9 O157:H7 'nin hamburgerlerde belirlenemediğini, ancak üretici önerisinin altında pişirme sonucunda E. coli O157:H7 'nin canlı kalabileceğini göstermişlerdir (135). Pişirme için 68,3 o C da 15 saniyenin yeterli olduğu, köftelerin ızgaraya konulmadan önce bir süre oda sıcaklığında bekletilmesi ile ısıl işleme direncin azaldığı gösterilmiştir (129). Çiğ süte aşılanan E. coli O157:H7 serotipi ve diğer bakterilerin HTST yöntemi kullanılarak pastörizasyon ile termal inaktivasyonunun araştırıldığı bir çalışmada 16,2 saniye sürede E. coli O157:H7 'de 60,0 o C 'da en çok 2 log birimi 63,0 o C 'da en çok 4 log birimi canlılık azalması olduğu, 64,5 o C 'da ise başlangıçta 10 5 /ml olan canlılığın tümüyle ortadan kaldırıldığı bulunmuştur (50). Bu bakterinin ışınlama uygulamalarına dirençsiz olduğu ve dolayısı ile başta et ürünleri olmak üzere ışınlamanın gıdalar için kayda değer bir hijyen güvencesi sağlayacağı çeşitli araştırmalar ile gösterilmiştir. 60 Co ya da 137 Cs kaynağından elde edilen ışınlar ile gıdaların korunması oldukça yaygın bir uygulama olup, başta E. coli O157:H7 olmak üzere pek çok patojenin özellikle katı gıdalardaki eliminasyonu için kullanılmaktadır. Genel olarak donma sıcaklığı altında olan gıdaların ışınlanması daha az etkili iken, ABD de E. coli O157:H7 enfeksiyonlarını önlemek için kırmızı etlerin de ışınlanmasına izin verilmiştir (63, 70, 83, 129). E. coli O157:H7 'nin ışınlamada düşük D 10 değerine sahip olması özellikle bu bakteriye yönelik olmak üzere ışınlama uygulamalarını yaygınlaştırmaktadır. Bir çalışmada mekanik olarak kemikleri ayrılmış piliç etine E. coli O157:H7 aşılanmış ve bunlara 0-2,0 kgy arasında, farklı sıcaklıklarda ve vakumlu ve vakumsuz olmak üzere farklı atmosfer koşullarında ışınlama uygulanmış, sonuçta +4 o C 'da D 10 değeri 0,27 kgy olarak bulunmuştur (155). Bir başka çalışmada 60 Co kaynağından elde edilen 0,78 ; 2,6 ve 22 kgy/h dozlardaki ışınlamanın E. coli O157:H7 'nin D 10 değeri üzerine etkisi araştırılmış ve bakterinin duyarlığının doz gücü ile ve logaritmik gelişme ya da durma fazında olması ile değişmediği belirlenmiştir (53). Buna karşın E. coli O157:H7 'nin logaritmik fazında iken durma fazına oranla gamma ışınlamasına daha fazla duyarlık gösterdiği, -18 o C 'daki ışınlamada 20 o C 'a oranla E. coli O157:H7 ' nin daha dirençli olduğu, 1,5 kgy dozundaki ışınlamanın bu patojenin imhası için yeterli olacağı gösterilmiştir (29). Bir araştırmada ise E. coli tip 1 'e göre (D 10 = 0,45) E. coli O157:H7 'nin (D 10 = 0,35) daha düşük D 10 değerine sahip olması nedeni ile kıymaların ışınlanmasında indikatör olarak E. coli tip 1 kullanılması önerilmiş, deneysel olarak E. coli tip 1 ve E. coli O157:H7 ilave edilmiş kıymalar ışınlanmış ve sonuçta E. coli tip 1 'in geri alınabildiği dozlarda E. coli O157:H7 'nin geri alınamadığı belirlenmiştir (81). Benzer şekilde yapılan bir çalışmada sığır kıymasından yapılan köfte E. coli O157:H7 ile aşılanmış ve 60 Co ile 0-2,52 kgy arasında değişen dozlarda radyasyon verilmiş, E. coli O157:H7 suşları için D 10 değeri 0,241-0,307 kgy arasında değiştiği, radyasyonun uygulandığı sıcaklığın -17 o C olmasının 3 o C olmasına göre istatistik açıdan önemli ölçüde (p<0,05) daha yüksek D 10 değeri sağladığı, köftelerin yağ oranının etkili olmadığı, bu patojenin radyasyona çok duyarlı olduğu ve 2,5 kgy radyasyon uygulamasının 10 8 sayıdaki E. coli O157:H7 'yi inaktive edeceği, bu inaktivasyonun ise köftelerde bulunabilecek daha az sayıdaki bakteri için tümüyle inaktivasyon anlamına geleceği belirtilmiştir (40). E. coli O157:H7 suşlarının aside dirençliliği ışınlamaya dirençliliğini etkilemektedir. ph 'ya bağlı durma fazı asit dirençliğinin ışınlama dirençliliği ile kıyaslandığı bir çalışmada suş farklılıklarının önemli olduğu, aside direnç kazanmanın ışınlamaya da direnç kazandırdığı, bu durumun D 10 değerleri hesaplanırken göz önüne alınması gerektiği uyarılmıştır (28). Benzer şekilde elma sularının ışınlanmasında ise E. coli O157:H7 'nin D 10 değerinin aside direnç kazandırılmamış suşlarda 0,12-0,21 kgy arasında değiştiği, buna karşı aside direnç kazandırılmış 9

10 suşlarda bu değerin 0,26-0,35 kgy arasında olduğu, ayrıca elma sularındaki kuru madde miktarı arttıkça ışınlamaya direncin arttığı belirtilmiştir (26). Yukarıda da belirtildiği gibi aroma kayıplarına neden olduğu için hammaddeye ısıl işlem uygulanamayan elma şaraplarında UV 'nin etkisinin incelendiği bir çalışmada 254 nm dalga boyunda UV lambası ile sağlanan 9,402-61,005 µw-s/cm 2 dozundaki ışınlama ile E. coli O157:H7 'de 3,81 log azalma sağlandığını ve UV lambanın bu amaçla kullanılabileceği gösterilmiştir (171). Laktik asit bakterilerinin fermentasyon boyunca E. coli O157:H7 üzerindeki antagonistik etkisi pek çok çalışma ile araştırılmaktadır. Laktik asit bakterileri psikrotrof ve patojenleri buzdolabı sıcaklığında dahi inhibe edebilen metabolitleri salgılama özellikleri ile tanınmaktadır. Örneğin Lactobacillus lactis 'in ürettiği H 2 O 2 'in pek çok patojen üzerinde inhibisyon etkisinin olduğu kanıtlanmıştır (129). Yapılan bir araştırmada pastörize edilmiş ve çiğ yağlı ve yağsız süte 2 farklı konsantrasyonda E. coli O157:H7 aşılanmış, bu sütler farklı sıcaklıklarda 28 güne kadar inkübasyona bırakılmıştır. Deneme sonuçlarında E. coli O157:H7 'nin 5 o C 'da gelişmediği hatta 28 gün sonunda 2 log kob azalması olduğu, 8 o C 'da ilk 4 günde yaklaşık 1-2 log kob artma olduğu 22 o C 'da ise 4 gün içinde ph 'nın 4 'ün altına düşmesi sonunda E. coli O157:H7 'nin sayısında hızla azalma olduğu, pastörize edilmemiş sütte ise refakatçı floranın varlığına ve bunların antagonistik etkisine bağlı olarak pastörize süttekine göre daha yavaş geliştiği belirlenmiştir (164). Benzer bir çalışma labneh peynirleri ile yapılmış, E. coli O157:H7 popülasyonunun fermantasyon sırasında arttığı ve 1 gecelik soğuk depoda bekletme sırasında aynı kaldığı, sonra giderek azaldığı ve 2 gün sonra 2-4 logaritma birimi azaldığı ve 4 gün sonra belirlenemeyecek sayıya indiği ve dolayısı ile geleneksel labneh peynirinin bu patojen açısından güvenilir olduğu gösterilmiştir (91). Bu bulgulara karşı ticari laktik asit starter kültürü ile inoküle edilmiş sütte 4 ve 7 o C 'larda 5 gün süre sonunda starter kültürün bu patojenin canlılığını etkilemediği gösterilmiştir (164). Bir diğer çalışmada starter katılmış ve katılmamış sucuklara farklı düzeylerde E. coli O157:H7 aşılanmış ve fermentasyon boyunca sayı incelenmiş, bulgular bu serotipin sucuk olgunlaştırma süresi içinde tümüyle ortadan kalktığını göstermiştir (97). Buna karşın bu bakterinin aside dirençli olduğu için geleneksel olarak güvenli olduğu kabul edilen fermente etlerde canlılığını koruduğuna ilişkin bulgular olduğuna yukarıda da deyinilmiştir (35). Nitekim sucuklarla yapılan bir çalışmada sucuk hamuruna 10 5 kob/g düzeyinde E. coli O157:H7 ilave edilmiş, olgunlaştırma aşamasında sadece 3 log indirgeme olduğu saptanmış, vakumla korunan ambalajlarda 2 ay, vakumsuz olanlarda ise 1 ay süre ile bakteri geri alınabilmiştir (46). Bu konu üzerindeki farklı bulgular laktik asit bakterilerinin farklı düzeylerde inhibitör etki gösteren metabolitler üretmeleri ile açıklanabilir. Nitekim E. coli O157:H7 ilave edilmiş kıymalarda refakatçı floranın etkisinin araştırıldığı bir çalışmada yüksek sayıdaki refakatçı floranın hem aerobik hem de anaerobik koşullar altında E. coli O157:H7 'nin gelişmesini inhibe ettiğini, refakatçı floranın yaklaşık %80 Lactobacillus sakei olmak üzere laktik asit bakterilerinden oluştuğu, kıymaların doğal refakatçı florasının E. coli O157:H7 gelişmesi üzerinde etkili olduğu gösterilmiştir (163). Benzer şekilde E. coli O157:H7 'nin yoğurt, ekşi krema ve tereyağında aynı düzeyde asitlendirilmiş skim milk ortamına göre daha fazla inhibe olduğu (75), Pediococcus acidilactici kullanılarak yapılan laboratuvar ölçekli sosis fermantasyonunda E. coli O157 gelişmesinin nitrit varlığı ile engellenebildiği (31) bulunmuştur. Enterohemorajik E. coli 'nin süt ve kıymada gelişmesi üzerine düşük sıcaklık ve refakatçı floranın etkilerinin incelendiği bir çalışmada düşük sayıda refakatçı flora varlığında 8 o C 'da gelişme olduğu, ancak bu sıcaklıkta yüksek sayıda refakatçı flora varlığında gelişmenin olmadığı, yüksek sayıdaki refakatçı floranın E. coli 'nin gelişmesini 10

11 engellediği, yüksek refakatçı flora varlığı veya 5 o C düşük sıcaklıkta gelişme olmasa dahi canlılığın korunduğu, sonuçta 5 o C 'da korumanın gıdalarda riski koruduğu, 8 o C ve üzerindeki sıcaklıkların ise riski artıracağı gösterilmiştir (127). E. coli O157:H7 inhibisyonu için çeşitli kimyasallar denenmektedir. Bunlar arasında klor özellikle içme ve kullanma suları için başarılı olarak tanımlanırken, çeşitli dezenfektanların organik asitlere göre daha etkili olduğu belirtilmektedir. Yağlı ve yağsız sığır etleri için klor heksidin, bağ doku için hidrojen peroksit, elma şaraplarında %0,1 sodyum benzoat çözeltisi etkili dezenfektanlar olarak değerlendirilmiş ayrıca et endüstrisinde kullanılan gıda katkılarından emülsifer olarak kullanılan monolaurin ve baharat ekstraktı olan eugenol de yine etkili bileşikler olarak belirlenmiştir (129). Çeşitli bitkilerin E. coli O157:H7 üzerindeki etkileri araştırılmaktadır. Ticari ürün olan "protecta one" ve "protecta two" adlı bitki ekstraktları ete aşılanmış E. coli O157:H7 üzerine % 2,5 konsantrasyonda püskürtülmüş ve ilk gün etki görülmemekle beraber 4 o C 'da 7 günlük depolama sonunda bu bakteride 1,3 log/cm 2 düzeyinde indirgeme sağlanmış ve bitki ekstraktlarının bir miktar indirgeme yapabileceği belirtilmiştir (48). Buna karşı %1 konsantrasyondaki sarımsak tozu çözeltisinin 6 saat gibi bir süre içinde 10 7 kob/ml düzeyindeki E. coli O157:H7 'yi tümüyle öldürdüğü, dolayısı ile sarımsağın gıda korumada etkili olduğu gösterilmiştir (146). Turpgiller (Crucifera) familyası üyelerinde bulunan ve gerek sıvı ortamlarda gerek buhar formunda kuvvetli bir antimikrobiyal etkisi olduğu bilinen allyl isothicyate 'ın E. coli O157:H7 üzerindeki etkisinin buhar formunda ve bakteri gelişme fazında iken yüksek düzeyde olduğu bulunmuştur (104). Benzer bir araştırmada ise %0,1 asetik asit içeren sirkenin E. coli O157:H7 'nin gelişmesini engellediği gösterilmiştir (62) E. coli O157:H7 'ye özgü bakteriyofajlar ile yapılan çalışmalarda bakteriyofajın sadece E. coli O157:H7 serotiplerine özgü olduğu, bakteriyofajın E. coli O157 olmayan bakterileri lize etmediği ve dolayısı ile bakteriyofaj uygulaması ile bu bakterinin hayvanlarda ve gıdalarda diğer mikrofloraya zarar vermeden kontrol altına alınabileceği gösterilmiştir (101). Bdellovibrio spp. 'nin Gram negatif bakterilerin periplazmasında gelişmektedir. Bu özellikleri nedeni ile kontaminasyonda etkili olan paslanmaz çelik tank yüzeylerinden E. coli O157:H7 'nin arındırılabileceği düşünülmüş, Bdellovibrio : E. coli O157:H7 oranı 10:1 olarak yapılan denemede E. coli O157:H7 'nin 24 saat süre içinde 3,61 log birimi, indirgendiği gösterilmiştir (129). Portakal suyuna ilave edilen E. coli O157:H7 'nin çeşitli ph 'larda ve yüksek basınç altında canlılığı araştırılmış ve 550 MPa basınçta 4,5 ve altındaki ph 'larda canlılıkta 6 logaritma birimi azalma olduğu, portakal sularının yüksek basınç altında işlenmeleri sırasında sıcaklık ve sürenin de ürün güvenliği açısından dikkate alınması gereken faktörler olduğu saptanmıştır (105). 07. Yaptığı Hastalıklar Yapılan çeşitli araştırmalar ve klinik bulgular hastalıkların giderek arttığını, HIV/AIDS, Ebola hemorajik ateş, Hepatit B ve E. coli O157:H7 enfeksiyonları gibi yeni hastalıkların ortaya çıkarken, halk sağlığı uygulamasındaki ihmaller sonucunda tüberkülozun yeniden yayılmaya başlaması gibi olumsuzlukları da ortaya koymaktadır. Bu hastalıkların ortaya çıkışında ve yayılmasında ekolojik değişmeler, demografik hareketler, insanların ve ticari malların dünya 11

12 yüzeyinde daha fazla dolaşması, antibiyotiklerde hatalı uygulamalar sonunda mikroorganizmaların direnç kazanması gibi bir çok faktör etkin rol oynamaktadır (129). Diyarejenik E. coli 'lerin (DEC) neden olduğu gıda kaynaklı hastalıkların klinik, halk sağlığı ve ekonomik önemi vardır. Sadece E. coli O157:H7 serotipinin neden olduğu hastalıkların tedavi giderleri ve işgücü kaybı bedelinin yılda milyon US$ olduğu tahmin edilmektedir (115). ABD Hastalık Önleme ve Koruma Merkezi (Centers for Disease Control and Prevention) tahminlerine göre sadece ABD 'de gıda kaynaklı mikrobiyolojik hastalıklar toplamı olarak yılda 76 milyon vaka olmakta, bunlardan i tedavi görürken 5000 ölüm olmakta, E. coli O157:H7 ise vaka ve 250 ölümden sorumlu tutulmaktadır (58). ABD 'de hastalığın sıklığı her kişide 2,1 kişi iken, bu değer Kanada 'da yılları arasında 3-5,3 kişi olarak değişmiştir (129). Avrupa da görülen enfeksiyonların seyri ABD den farklılık göstermektedir. Avrupa da HUS vakalarının %10-30 kadarını O157 olmayan STEC suşları oluşturulmaktadır. İngiltere de laboratuvar tarafından doğrulanmış vaka sayısı 1982 de sadece 1 iken bu sayı 1995 yılında 1000 i geçmiştir. Kıta Avrupa sı ile İngiltere deki enfeksiyonlarda farklılık göstermektedir. Özellikle Almanya da sorbitol pozitif hareketsiz O157 serotipine sıklıkla rastlanmaktadır. Bulaşma kaynaklarında da ABD ile Avrupa ülkeleri arasında farklılık görülmektedir. ABD ve İngiltere de E. coli O157:H7 enfeksiyonlarının asıl kaynağı hamburger ve diğer et ürünleri iken Kıta Avrupa sında keçi sütü, çeşitli peynirler, gölde yüzmek ve kişiden kişiye bulaşmalar daha önemli olarak görülmektedir. Avustralya 'da ise O157 olmayan ve özellikle O111:H - serotipi sıklıkla ciddi hastalıklara neden olmaktadır (129). ABD 'de Philadelphia eyaletinde 1971 yılında 5 erişkin hastada izlenen klinik seyir bilinen barsak hastalıkları ile açıklanamamış ve hiç bir etiyolojik etken saptanamayan benzer hastalıkların ABD 'nin diğer eyaletleri ile Avrupa ve Japonya 'da ihbar edilmesi üzerine ABD Hastalık Denetim ve Önleme Merkezi arasında geriye dönük olarak 300 E. coli suşunu serotiplendirmiş ve kanamalı ağır diyare geçiren California 'lı 50 yaşında bir kadından 1975 yılında izole edilen suş E. coli O157:H7 olarak saptanmıştır (4, 125). Bireysel vakalar dışında E. coli O157:H7 ilk olarak 1982 yılında ABD 'de Oregon 'da 26 ve Michigan 'da 21 olmak üzere 47 vaka ile ve her ikisi de yine daha öncekilere benzemeyen kanlı diyare şeklinde 2 salgın ile görülmüştür. Her iki salgında da köfteli sandviçlerin yenilmesinin hastalığa neden olduğu belirlenirken salgınların birinde aynı partiye ait donmuş köftelerde E. coli O157:H7 'ye rastlanmıştır. Aynı yıl Kanada Ottowa 'da evde yapılan sandviçlerin de salgına neden olduğu bildirilmiştir (8). Bundan hemen sonra benzer vakalar ABD, Kanada ve İngiltere 'de görülmüş, daha sonra Meksika, Çin, Arjantin, Belçika gibi ülkelerde de aynı hastalığa rastlanmış, 1996 yaz aylarında ise Japonya 'da 16 kişinin ölümüne neden olan salgının etmeni E. coli O157:H7 olarak gösterilmiştir. (57, 78, 93, 140, 165). E. coli O157:H7 'nin yapmış olduğu hastalıklar tipik ve oldukça sert geçen hemorajik kolitis, HUS ve trombotik trombositopenik purpura (TTP) olmak üzere 3 şekilde görülür. Kusma nadirdir. Bunlardan hemorajik kolit aniden ortaya çıkan kramplı karın ağrıları ile başlar ve saat içinde sulu diyare ile devam eder. Diyare sırasında görülen kan artar ve dışkı zamanla tümüyle kan olur. Hastalığın ortaya çıkması genellikle 3-9 gün (ortalama 4 gün), hastalık süresi ise 2-9 gündür. Hastalığın ortalama 8 gün sürdüğü şeklinde kaynaklara da rastlanmaktadır. Kramplı karın ağrılarının doğum sonrasına benzer yoğunlukta olduğu ve apandisit ağrısından daha şiddetli olduğu bildirilmektedir. Bu hastalık shigellosiste tanımlanan dizanteri ve invasiv 12

13 E. coli 'nin neden olduğu gastroenteritisden ateş olmaması ve kanlı dışkı ile ayrılmaktadır (8, 57, 58, 125, 149, 160). Bazı hastalarda ve özellikle çok gençlerde böbrek yetersizliği, mikroangiopatik hemolitik anemi ve trombositopeni ile karakterize edilen ve üçlü bir sendrom olarak tanımlanan HUS gelişir. Hemorajik kolitis vakalarında ortalama %0-15 arasında HUS geliştiği tahmin edilmekte, bu oran çocuklarda %10 olarak verilmektedir. HUS, kalıcı böbrek fonksiyon kaybına neden olabilir. Yaşlılarda ise HUS, ateş ve TTP olmak üzere ilave iki semptom ile görülür. Bu durumda yaşlılarda ölüm oranı ortalama %50 'ye çıkmaktadır. Kuzey Amerika ülkelerinde ölüm oranı %5 olarak tahmin edilmektedir (8, 58, 129). Çoğu kez hastalara diyaliz ve kan nakli gerekir, nöbet ve koma ile karakterize edilen merkezi sinir sistemi hastalıkları gelişir ve ölüm görülebilir (57). HUS 'un prodromal kanlı diyare ile başlayan tipik ve diyareli fazı içeren atipik alt grupları vardır. Hastalarda sarılık, sıklıkla yüksek tansiyon ve kalp yetmezliği de görülebilmektedir. Sh. dysenteriae serotip-1 ile oluşan enfeksiyon HUS 'a neden olurken bazı mikroorganizmalar HUS gibi hastalıklar yapmaktadırlar. VTEC ile HUS arasındaki bağlantı ise ilk olarak 1985 yılında Karmali ve ark. tarafından gösterilmiştir (149). TTP 'da ise klinik ve patolojik özellikler HUS 'a benzer ancak merkezi sinir sistemi bozukluğu genellikle temel özelliktir. Hastalıkta beyinde kan pıhtısı oluşur ve ölüm genellikle görülür (57, 118). Bununla beraber E. coli O157:H7 enfeksiyonlarında TTP 'nin nadir olduğu da bildirilmektedir (58). E. coli O157:H7 enfeksiyonları gençlerde daha etkilidir. Japonya 'da yapılan araştırmalarda gençlerin ve çocukların E. coli O157:H7 serotipinin yapmış oldukları hastalıklara duyarlığı açık bir şekilde gösterilmiştir. Dışkılarında bu bakteriye rastlanan 20 yaş altındaki kişilerin %80 'den fazlası tipik semptomları gösterirken, yine dışkılarında E. coli O157:H7 serotipi bulunan yaş arasındaki kişilerin %70 'i tipik semptomları göstermemiştir (162). E. coli O157:H7 'nin neden olduğu hastalıkların yoğunluğunun 'de 10 'dan daha az olduğu kabul edilmektedir. Buna karşı hastalar hastalığın ortaya çıkmasından itibaren 10 gün süre ile E. coli O157:H7 yayarlar, ortalama %5 kadarı HUS 'a yakalanırken, %50 'den daha azında dışkıda kan görülür (131). Bununla birlikte, başka kaynaklar E. coli O157:H7 enfeksiyonlarında dışkıda kan görülme olasılığını %90 olarak vermektedir (58). Bakteri antibiyotiklere dirençlidir ve/veya giderek direnç kazanmaktadır. Bu nedenle hastalıkta antibiyotik ve antikoagulant kullanılması tartışılmaktadır. İskoçya 'da yapılan çalışmalar mide asitliğini düşürücü ilaç ve tesadüfen antibiyotik kullanan hastaların HUS / TPP ' ye yakalanma risklerinin arttığını ortaya koymuş (58, 60), benzer sonuçlar ABD 'de de alınmıştır (170). Japonya da 1996 yılında görülen ve çoğu okul çocuğu olan 6000 kişinin etkilendiği salgında ise özellikle enfeksiyonun 7. gününde alınan antidiyarejenik ilaçların enfeksiyonu daha da şiddetlendirdiği belirlenmiştir (129). Japonya 'da 1996 yılı ile başlayan salgınlarda ve sporadik vakalarda moleküler analizler hastalıktan tek bir suşun değil, tüm Japonya 'ya yayılmış farklı genotiplerdeki suşların sorumlu olduğunu göstermiştir. Yapılan analizler hastalardan izole edilen EHEC suşlarının %80 'den fazlasının O157:H7 serotipi olduğunu, bununla birlikte O26 ve O111 serotiplerinin sayısında giderek bir artış olduğunu göstermiştir (165). Benzer şekilde E. coli O157:H7 olmayan VTEC suşlarının giderek HUS ve diyareli hastalardan daha fazla izole edildiği, çeşitli ülkelerde sığır 13

14 popülasyonu üzerinde yapılan çalışmalarda temel kaynak konumunda olan sığırlardan 100 'den daha fazla serotip izole edildiği belirtilmektedir (92). Patojenik grupların gıdalarda bulunma sıklığı üzerinde yapılan araştırmalar farklı sonuçları göstermektedir. Eylül 1983 'de ABD Washington D.C. 'de 45 kişinin Fransa 'dan ithal edilen brie peynirinden kaynaklanan benzer semptomlar taşıyan sulu diyare (%91) ve karın krampları (%80) göstermesi üzerine yapılan çalışmalarda hastalık etkeninin ısıya dayanıklı enterotoksin üreten E. coli O27:H20 olduğu saptanmıştır. Benzer hastalıklar kısa bir süre sonra ve yine peynirden kaynaklanmak üzere ABD 'nin 4 eyaletinde daha görülmüştür. Brezilya 'da sığır eti, hamburger ve sosislerden yapılan analizlerde sırasıyla %5; %7,5 ve %10 ETEC suşlarına rastlanmıştır. Buna karşın ABD 'de 78 peynir örneğinde ETEC suşları bulunamamıştır. Domuz etinden 274, sığır etinden 248 ve tavuk etinden 278 E. coli suşu izole edilmiş ancak bunların hiç birinin ısıya duyarlı toksin ya da bunları oluşturan genleri içermediği görülmüştür. EIEC ve EPEC suşlarına nadir olarak gıdalarda rastlanılmıştır. EHEC suşlarına ise sığır kıymasında rastlanılmaktadır. Bir başka çalışmada ise toplam 18 örnekten izole edilen 159 E. coli suşunun 84 adedinin farklı suş olduğu gösterilmiştir (58, 123, 125). 08. Virülens Faktörleri DNA sekans analizleri ile elde edilen bulgulara göre ana toksin Shigella dysenteriae type 1 tarafından oluşturulan "shiga toxin" ile %99 gibi çok büyük bir benzerlik gösterir ve bu nedenle "shiga like toxin 1 ; SLT-1 (yeni terminolojide Stx 1)" olarak adlandırılır. Diğer toksin Stx 1 ile sadece %55-60 homolog olmasına karşın SLT-2 (yeni terminolojide Stx 2) olarak adlandırılır. Her iki toksin de HeLa ve vero doku kültürü hücrelerine toksiktir ve bu nedenle verotoxin 1 ve 2 (VT-1 ; VT-2) olarak da adlandırılırlar. EHEC tarafından oluşturulan bu toksinler doku kültürü analizleri ile belirlenir. Bununla beraber, EHEC suşlarındaki SLT varlığını belirleyebilecek şekilde DNA prob ve PCR analizleri geliştirilmiştir (58, 89, 117, 129, 143, 160). Shiga toksinlerin konu üzerindeki önemleri açıktır. HUS sadece Stxs üreten bakteriler tarafından oluşturulmaktadır. EPEC serotipleri EHEC lere benzemekle beraber bunlarda Stxs olmadığı için HUS a neden olamazlar. Stx 2 nin Stx 2c, Stx 2d ve Stx 2e şeklinde varyantları vardır. Stx, Stx/Stx 1 ve Stx 2 olarak 2 serogruba ayrılır. EHEC serotipleri tarafından oluşturulan Stx 1 ile Sh. dysenteriae nın Stx 1 i sadece A polipeptidindeki tek amino asit ile ayrılır. Stx 2 nin amino asit dizilişi Stx 1 ile %55 homologdur. Stx 2 böbrek endothelial hücrelerine daha fazla toksiktir. HUS gösteren hastalardan daha fazla sadece Stx 2 üreten suşlar izole edilmiş olması bu görüşü kuvvetlendirmektedir. Stxs bir A polipeptidi ve beş B polipeptidinden oluşmaktadır (129). E. coli O157:H7 serotipinin oluşturduğu toksinler ve bunların etki mekanizmaları üzerinde pek çok çalışma yapılmaktadır. Tümü hemorajik kolit vakalarından izole edilen E. coli 'lerin vero hücre kültürlerinde toksisite testi yapılmıştır. Orta veya yüksek düzeyde verotoksin üreten suşlar serotip, biyotip, antimikrobiyellere resistantlık, plazmid profilleri ve HeLa hücrelerine bağlanma açısından analize alınmışlardır. Bunların 200 'den fazlası tipik E. coli O157:H7 suşları iken 6 'sı atipik E. coli O157:H7 olarak bulunmuştur. Bu 6 suşun tipik E. coli O157:H7 'lerden farkı; ikisinin antimikrobiyellere dirençli olması, birinin indol negatif olması, ikisinin sitrat pozitif olması ve birinin üre pozitif olmasıdır. Bir başka 6 E. coli O157:H7 izolatında ise hareket negatiftir. Tüm bu farklı izolatlar tipik E. coli O157:H7 suşları ile benzer plazmid profilleri vermişler ve sorbitol fermantasyonları negatif ya da yavaş olarak bulunmuştur. Diğer 11 verotoksijenik izolat O157 antijeni göstermemiş, değişik plazmid profilleri vermiş ve sorbitolü fermente etmişlerdir. Bu bulgular tarama çalışmaları sırasında dikkatli olunması gerektiğini göstermektedir (23). 14

15 E. coli O157:H7 'nin patojenitesi tam olarak açıklanamamış olmakla beraber önemli virülens faktörleri identifiye edilmiştir. Tüm klinik izolatların 1 ya da 2 verotoksin ürettikleri, bunların doku kültüründe geliştirilen Vero ve HeLa hücrelerine sitotoksik oldukları saptanmıştır. Saflaştırılmış broth toksinleri Verotoksin -1 (VT-1) ve Verotoksin -2 (VT-2) olarak adlandırılmıştır. Bunlardan VT-1 immunolojik ve yapısal olarak Sh. dysenteriae 1 'in oluşturduğu shiga toksinlerinden ayırt edilemediği için bu toksinler shiga 'ya benzer anlamında Shiga-like toksinler (SLT-I = VT-1 ; SLT-II = VT-2) olarak da adlandırılmaktadır. SLT-1 'in nükleotid dizilişi shiga toksine benzemektedir (13, 57, 149, 160). VT-1, E. coli O157:H7 serotipinden saflaştırılmış olmakla beraber VT-1 ve VT-1 'e benzer toksinler E. coli 'nin diğer suşlarından da izole edilmiştir. İmmunolojik olarak VT-1 'e benzer proteinler ise Salmonella, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae ve V. parahaemolyticus gibi diğer bakteriler tarafından da üretilmektedir. Her ne kadar ELISA, immundifüzyon vb. yöntemler kullanılarak bu verotoksinlerin shiga toksine benzerliği gösterilmiş ise de izoelektrik noktası ve molekül ağırlığı gibi özelliklerden yararlanılarak E. coli verotoksinleri shiga toksinlerinden ayırt edilebilmektedir. VT-1, A ve B olarak adlandırılan ve molekül ağırlıkları sırasıyla 5000 ve 7000; izoelektrik noktaları ise 7,1 olan 2 alt gruptan oluşur. VT-1, E. coli O157:H7 'nin bazı suşları tarafından üretilen intraselüler bir toksindir. Son araştırmalarda E. coli 'nin O26:H11 ve H30 serotiplerinin de bu toksini ürettiği belirlenmiştir. 70 g hücreden 268 mg olarak saflaştırılan toksinin A, A1, A2 ve B alt üniteleri SDS-PAGE ile ayrılmış ve bunların molekül ağırlıkları sırasıyla 32,000; 28,000; 3,700; 4,700 olarak bulunmuştur (14, 57, 149). Verotoksin üreten E. coli suşlarından elde edilen VT-2 'ler arasında serolojik farklılıklar gözlenmiştir. Bu bulgular verotoksinler arasında heterojenite olduğunu göstermektedir. HUS gösteren hastadan izole edilen E. coli 'den elde edilip saflaştırılan SLT-IIvh ve Swine Edema hastalığı olan domuzdan izole edilen E. coli 'den saflaştırılan SLT-IIvp gibi SLT-II 'nin varyantları bulunmuştur. Bu 2 toksin HeLa hücrelerine toksik olmayıp her ikisi de E. coli O157:H7 ile ilgili değildirler. Bu bulgular SLT üreten E. coli 'lerin oluşturduğu benzer verotoksinlerde akrabalık olabileceğini düşündürmektedir (57). Verotoksinlerin memeliler üzerindeki etki mekanizması moleküler düzeyde tam olarak anlaşılamamıştır. Bununla beraber, toksinin B alt birimi hücrelerde glikolipid reseptörüne bağlanarak içeri girdikten sonra A alt biriminin enzimatik olarak A 1 fragmentine indirgendiği bu fragmentin daha sonra 60S ribozomlarına bağlanarak protein sentezini inhibe ettiği ve hücre ölümüne yol açtığı tahmin edilmektedir. Araştırmalar, E. coli O157:H7 serotipinin taşıdığı 60 MDa 'luk plazmidin patojenitede önemli rol oynadığını belirlemiştir (14, 57). Enterohemorajik E. coli O157:H7 'nin RTX sitotoksin olarak belirlenen yeni bir hemolitik determinantının 90 kbp plazmidde (po157) kodlandığı gösterilmiştir (99, 129). E. coli O157:H7 'nin gıdalarda verotoksin oluşturup oluşturmadığı ya da gıdalarda önceden oluşmuş verotoksinin sindirilmesi ile insanlarda hastalık meydana gelip gelmediği bilinmemektedir. Bununla beraber VT-1 'in ısıya dayanıklı bir toksin olduğu ve dolayısıyla yetersiz ısıtılan gıdada bu toksinin aktif olarak kalacağı gösterilmiştir. 70 o C 'da 60 dakika ısıl işlem uygulanan VT-1 'in önemli ölçüde stabil kaldığı, 80 o C 'da 15 dakika %90 ve 80 o C 'da 30 dakika %99 azaldığı, buna karşın 80 o C 'da 60 veya 85 o C 'da 5 dakika ısıl işlem uygulamasının başlangıç aktivitesi Vero CD 50 olan VT-1 'in tümüyle inaktive olduğu belirlenmiştir. 4,5 ph 'da 16 saat içinde aktivitesi %90 düşen toksinin ph ve ısıl işleme olan toleransı gıda endüstrisinde önem taşımaktadır (14, 57, 58). 15