MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II PROTEİNLERİN İZOLASYONU VE ANALİZİ

Transkript

1 MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II PROTEİNLERİN İZOLASYONU VE ANALİZİ

2 more of an art than a science

3 MOLEKÜLER BİYOLOJİDE ANA KURAL ve TEMEL ÇALIŞMA ALANLARI Gen dizisi 8 8 transkriptler 8 8 primer protein ürünleri 8 8 fonksiyonel proteinler (DNA) Transkripsiyonel kontrol (mrna) Translasyonel kontrol Translasyon sonrası Kontrol (post-translasyonel modifikasyonlar) Nasıl? Nasıl? Neden? Neden? DNA RNA PROTEİN Nasıl? Neden? Nükleik asitlerle ilgili teknikler Proteinlerle ilgili teknikler MOLEKÜLLER ARASI ETKİLEŞİM GENOMİK PROTEOMİK YAPISAL İŞLEVSEL (TRANSKRİPTOMİK) YAPISAL İŞLEVSEL (METABOLOMİK) Nükleotid dizisinin belirlenmesi mrna analizleri Protein yapı analizleri Protein fonksiyon analizleri

4 ÖZETLE: transkripsiyon translasyon modifikasyon-organizasyon DNA RNA PROTEİN HÜCRESEL İŞLEVLER ANA HEDEF : Hücrenin moleküler organizasyonunu, dolayısıyla canlılığın moleküler temellerini anlamak!!!

5 TEORİK YAKLAŞIM: Nükleotid Amino asit dizisi dizisi Genlerle proteinler arasında birebir ilişki yoktur! Çünkü: DNA P 1 UYGUN 3 BOYUTLU YAPIDA UYGUN ZAMANDA P3 P 2 DOĞRU İŞ GÖREN BİR PROTEİN P5 P4

6 AKTİF BİR PROTEİN OLUŞURKEN 400 DEN FAZLA KİMYASAL MODİFİKASYONUN GERÇEKLEŞEBİLECEĞİ ÖNGÖRÜLMEKTEDİR. İNSANDA: GEN PROTEİN

7 SORULAR: Nerede ve/ya hangi proteinler var? Ne kadar var? Yapısı nedir? Ne gibi özellikleri var? Nasıl iş görür? Hangi moleküllerle etkileşir?

8 Bir proteinin nasıl izole edileceğine, hangi yöntemle ve ne derece saflaştırılacağına karar verirken göz önünde bulundurulan kriterler: AMAÇ; MATERYALİN VE ÇALIŞILACAK PROTEİNİN TİPİ VE MİKTARI; İŞLEMLERİN SÜRESİ VE MALİYETİ; ELDEKİ OLANAKLAR

9 LABORATUVAR ORTAMI

10 LABORATUVARDA KULLANDIĞIMIZ KİMYASALLAR Dünyada en az 65 milyon çeşit kimyasal bileşik üretiliyor ve değişik saflık derecelerinde piyasaya sürülüyor... Kalitesine vemiktarına göre farklı fiyatlara satılıyor.

11 Kimyasalların bazıları (özellikle ENZİMLER) soğutucularda (+4 o C ve - 20 veya - 80 o C derin dondurucularda) saklanmalıdır.

12 LABORATUVAR ARAÇ- GEREÇLERİ

13 balonjoje ölçü kabı pipet

14 Mikropipetler

15 Hamilton şırıngalar

16 TERAZİ ph- metre

17 HAVAN

18 KARIŞTIRICILI HOMOJENİZATÖR ( Waring Blender )

19 MİLLİ HOMOJENİZATÖR ( ultra turrax )

20 PİSTONLU HOMOJENİZATÖR

21 BASINÇ HÜCRESİ

22 BALİSTİK HOMOJENİZATÖR

23 ULTRASONİKATÖR

24 FİLTRASYON DÜZENEKLERİ

25 MEMBRANLI FİLTRASYON

26 SANTRİFÜJLER

27 Protein denatürasyonundan ve inaktivasyondan korunmak için çalışmanın her aşamasında ph ve SICAKLIK kontrol altında tutulmalıdır! Sıcaklığın olumsuz etkisi, işlemlerin SOĞUKTA (genelde 4 o C da) gerçekleştirilmesiyle önlenir. ph ise bu moleküllerin fizikokimyasal gereksinimleri doğrultusunda hazırlanmış tampon çözeltilerin kullanımı ile istenen değerdetutulur.

28 Ortam ph sının 7 ve 7 ye yakın değerlerde olduğu koşulda en geniş çapta kullanılan tamponlar tris ve fosfat tamponlarıdır.

29 İYONİK KUVVET Bir tamponda yer alan iyonların derişimi ve yükü de protein çalışmalarında önem taşır. c i = iyonun molar konsantrasyonu z i = iyonun yükü (işareti dikkate alınmaz)

30 TAMPON SEÇİMİNDE DİKKAT EDİLMESİ GEREKENLER: Çalışma ph sı, Tamponun anyonik veya katyonik karakterde olması, İyonik kuvvet ve sıcaklık etkisiyle ph değişimi, Kimyasal etkinlik, Biyolojik etkinlik, Diğer bileşenlerle etkileşim, Biyolojik membranların geçirgenliği, Toksisite, 280 nm ve altındaki dalga boylarında absorbsiyon, Maliyet, Çözünürlük

31 BİYOLOJİK MATERYALLER: MİKROORGANİZMALAR

32 HAYVANSAL ÖRNEKLER

33 HAYVAN DOKU VE HÜCRE KÜLTÜRLERİ

34 BİTKİLER VE BİTKİ DOKU KÜLTÜRLERİ

35 HOMOJEN VE HETEROJEN KARIŞIMLARI AYIRMA VE SAFLAŞTIRMA YÖNTEMLERİ İKİ (ÇOK) FAZLI AYIRMA YÖNTEMLERİ Yardımcı bir faz oluşturarak ayırma(ekstraksiyon,kromat OGRAFİ, ELEKTROFOREZ) Kimyasal reak. sonucu faz oluşturma (ÇÖKTÜRME) Isıtma veya soğutma ile faz oluşturma (KRİSTALİZASYON, DESTİLASYON, SÜBLİMASYON, EVAPORASYON) TEK FAZLI AYIRMA YÖNTEMLERİ SANTRİFÜJLEME FİLTRASYON DİYALİZ

36 HOMOJENİZASYON Çalışılacak molekül grubunu içeren doku veya hücrelerin çeper ve zar yapılarını parçalama işlemi Fiziksel işlemler Mekanik işlemler Ultrasonikasyon Ozmotik şok Dondurma- çözme Kimyasal işlemler Çözücülerin kullanılması Enzimlerin kullanılması

37 Mekanik İşlemler: ALETLİ HOMOJENİZASYON

38 Mekanik İşlemler: OZMOTİK ŞOK

39 Mekanik İşlemler: DONDURMA- ÇÖZME Soğuk- Sıcak- Soğuk- Sıcak...

40 Kimyasal İşlemler: Çözücülerin Kullanılması Organik çözücüler Deterjanlar, Bazik çözeltilerle...

41 BİYOLOJİK MOLEKÜLLERİN İZOLASYONU (EKSTRAKSİYON) : MASERASYON

42 PERKOLASYON

43 SÜREKLİ EKSTRAKSİYON (SOXHLET EKS.)

44 SIVI- SIVI EKSTRAKSİYONU

45 Kimyasal İşlemler: Enzimlerin Kullanılması Lizozim, Tripsin, Proteinaz K, Zimoliyaz gibi enzimlerle...

46 Teknik Nazik Çeşitli materyallere uygulanabilecek bazı parçalama yöntemleri Ozmotik şok Enzim uygulaması Deterjan uygulaması Havan veya pistonlu homojenizatör Diğer aletlerle parçalama Materyal tipi Eritrositler Bakteriler, mayalar Doku kültürü hücreleri Karaciğer vb yumuşak dokular Kas vb. Dokular Orta şiddette Milli homojenizatörlepar. Kum, alumina vb. ile ezme Sert Fransız basınç hücresi Ultrasonikasyon Balistik parçalama Hayvansal ve bitkisel dokular Bitkisel dokular, bakteriler Bitkisel dokular, bakteriler Hücre süspansiyonları Hücre süspansiyonları

47 Parçalama (homojenizasyon) yöntemleri uygulanarak doku veya hücrelerin çeper ve zar yapıları yok edilir. Ele geçen ve çalışılacak molekül grubunu içeren karışıma HOMOJENAT denir.

48 AYIRMA VE SAFLAŞTIRMA Üzerinde çalışılacak molekül grubunu homojenattaki diğer moleküllerden ayırmak ve saf şekilde elde etmek Preparatif veya Analitik amaçlı yapılabilir. Preparatif; molekül gruplarının çözünme özellikleri yada kitle, yoğunluk, elektriksel yük gibi fiziksel karakterlerine veya da diğer moleküllere afinitesine göre birbirlerinden ayrılmasını sağlayan işlemler; Analitik; üzerinde çalışılan molekülün kalitatif veya kantitatif analizi (örn miktar tayini, alt tiplerinin saptanması, yapısal analiz, aktivite belirlenmesi gibi)

49 1. SÜZME (FİLTRASYON)

50 SÜZME (FİLTRASYON)

51 Moleküler biyolojide en çok kullanılan filtre edici materyaller: Müslin (tülbent veya gazlı bez) Filtre kağıdı (bkz. MBKY kitabı Ek 15, s. 324) Sinterli cam huni Membran filtreler (bkz. MBKY kitabı Ek 16, s. 324)

52 Membran Filtreler Membran filtreler veya membranlar özgül por çaplarına sahip polimer filmlerdenoluşur. Porlardan geçemeyecek büyüklükteki partiküller ve mikroorganizmalar için fiziksel bir bariyer oluşturur ve bunları zarın yüzeyinde tutarlar.

53 ULTRAFİLTRASYON Moleküllerin boyut, biçim ve/veya yüklerine göre ayrılmasını sağlar.

54 Centricon tipi ultrafiltrasyon tüpü (vakumdan yararlanılır) Kapan hücresi (basınçtan yararlanılır)

55 NMWC Nominal Molecular Weight Cut-off Membrana özgü bir değerdir. Membrandan geçemeyen bir molekülün ağırlığına eş değerdir.

56 SANTRİFÜJLEME Santrifüjler yardımıyla yüksek hızda döndürülerek merkezkaç kuvveti oluşturulan bir alanda partiküllerin davranışına göre ayırım sağlayan tekniktir.

57 Santrifüjleme sonunda Üst faz (sıvı faz) süpernatant Alt faz (çökelti) pellet

58 Santrifüj kuvveti F = m x ω 2 x r m = çöken partikülün kütlesi ω = açısal hız r = partikülün dönüm eksenine uzaklığı

59 Relative Centrifugal Force Santrifüj hızı ile ilgili bir ifade (g değeri) RCF = x 10-5 x rpm 2 x r rpm = dönüm sayısı (devir/dakika) r = partikülün dönüm eksenine uzaklığı (cm)

60

61

62

63

64 Kromatografi Elektroforez Spektral yöntemler Radyoizotoplar

65 Homojenattaki zar (membran) parçalarını, parçalanmamış doku ve hücreleri uzaklaştırmak amacıyla uygulanan ÖN AYIRMA işlemlerinden sonra ele geçen sıvıya HAM ÖZÜT adı verilir.

66 Proteinlerin Önemi Proteinler tu m canlı organizmalar için en önemli makromoleku llerden biridir. Tu m organizmalarda kompleks fonksiyonlar ve metabolik reaksiyonların çoğu proteinlerce gerçekleştirilmektedir. Bazıları yapısal komponentleri oluştururken, diğerleri ise iletişim, savunma, transport, depo, strese yanıt, hareket, hu cre du zenlenmesi- regülasyon- ve enzim fonksiyonlarını- kataliz- vb. pekçok fonksiyonu gerçekleştirir. Yaşamla ilgili hiçbir işlem protein olmaksızın gerçekleşemez!!!

67 Protein Fonksiyonu; Yapıya bağımlı Proteinin şekli biyolojik aktivitesini belirler. Tek bir protein değişik yapıda ve birden fazla fonksiyona sahip olabilir. Biyolojik bir kompartımanda bulunan proteinlerin sayısı, fonksiyonların kompleksliği ile orantılıdır. Canlı yaşamını ilgilendiren hemen hemen her konuda proteinlerin önemli olması nedeni ile yapılarının ve biyokimyasal özelliklerinin araştırılması zorunludur.

68

69 Protein Ekstraksiyonu İlgilenilen biyolojik moleku l grubunun izolasyonu amacıyla gerçekleştirilen ekstraksiyon işlemleri parçalama (lizis) ve ayırma (saflaştırma) aşamalarından oluşur. Ekstrakte edilecek protein membrana bağlı veya sitoplazmik bir proteinse önce hu cre çeperi aşılmalıdır. Bu aşamada kullanılabilecek uygun teknik seçilmeli ve protein yapısının zarar görmesi engellenmelidir.

70 Protein Ekstraksiyonu Membran proteinlerinin ekstraksiyonunda (hu cre membranı veya organellerin membranlarında) farklı yöntemler mevcuttur. Özellikle organel membran proteinleri için önce organel izolasyonu daha temiz ekstre sağlar. Dokuya ve organele uygun izolasyon yapılarak organelin zarar görmemesi ve proteinin membranda kalması önemlidir. Diferansiyel santrifu j kullanımı yaygındır (du şu k hızlarda önce nukleus, sonra artan hızlarda mitokondri ve son olarak da ribozom gibi en ku çük moleku ller çöktu ru lu r).

71 Protein Ekstraksiyonu Aşırı ısınma önlenmelidir. Parçalama sırasında ortaya çıkacak proteazların etkisindenkorunmalıdır. Parçalama sonunda elde edilen homojenattaki çözu nmeyen materyal santrifu jlenerek uzaklaştırılır. Önemli olan istenilen proteinin hemen tamamının sıvı faza (supernatant) geçmesidir.

72 Protein Ekstraksiyonu Sıvının bir kısmı çözu nmeyen hu cresel artıklar ile kaybedilir Karaciğer, kalp veya kas dokusu ile çalışıldığında doku ağırlığının katı kadar ekstraksiyon (lizis) tamponu ile başlanmalıdır.

73 Total hu cre liziti hazırlama (taze doku) SDS lizis buffer %2 SDS 25mM Tris- HCl (ph 6.8) 5mM EDTA 1mM PMSF (proteazinhibitöru - en son ekle) Protein ekstraksiyonu yapılacak doku alınır, buz u zerinde 1gr doku başına yaklaşık 2-3 hacim buffer ile homojenizasyon tu pu nde ezilir.

74 Pistonlu teflon homojenizatör Temiz bir ependorfa aktarılır. Ultrasonikatörde homojenizasyona devam edilir (bu sırada ısı artışı kontrol edilerek işlem durdurularak tu p buz u zerine alınır).

75 Taze dokudan protein izolasyonu rpm da 1-2 saat santrifu j yapılır. Supernatantdikkatlicetemiz bir tu pealınır. Her bir 1 ml örnek için; 2μl bromfenol blue, 50 μl DTT, 50 μl Gliserol eklenir. 100 C dekapaklar açık olarak 3-5 dakika tutulur. Elektroforez için kullanılabilir. Hemen kullanılmayacaksa - 20 C de hızla dondurmak veya - 80 C de saklamak uygundur.

76 Protein Ekstraksiyonu Dondurulmuş örneklerin kullanılacakları zaman hızla çözu nmeleri önemlidir, bu amaçla su banyosunda (40-50 C) sık sık karıştırarak çözu nme uygundur. Proteinler çok sayıda sekonder ve tersiyer yapılar içerirlerveherzaman negatifyu klu olmazlar. Bu yapıların uzaklaştırılması ve proteinlerin negatif yu klu olmaları için SDS (sodyum dodesil su lfat) deterjanı ile muamele edilirler.

77 Protein Ekstraksiyonu PMSF (fenilmetilsu lfonilfluorid) serin proteaz inhibitöru olarak eklenir. Suda çok az çözu ndu ğu nden aseton veya etanol de hazırlanır. Hızla hidrolize olduğundan hazırlandıktan hemen sonra kullanılmalıdır. Son konsantrasyonu 1mM olacak şekilde lizis buffera son anda eklenmelidir.

78 Protein Ekstraksiyonu Metalloproteinazlar aktiviteleri için iki değerlikli metallere ihtiyaç duyar, EDTA metal iyonlarıyla kompleks oluşturarak proteinlerin stabilizasyonunu sağlar. Son konsantrasyonu 2-5mM olacak şekilde lizis buffera eklenmelidir. Gliserol örneğe running bufferdan yu ksek dansite kazandırır, bu da kuyucuğun dibine gömu lmesine izin verir. Bromfenol blue du şu k moleku l ağırlıklı bir boyadır, elektroforezintakibini kolaylaştırır. DTT indirgeyici ajandır, protein örneğindeki disu lfit bağlarını azaltır.

79 Protein Ekstraksiyonu Protein denatu rasyonundan korunmak için her aşamada ph ve ısı kontrol altında tutulur. İşlemler soğukortamda+4 C de buzu stu nde gerçekleştirilir. ph ise uygun tamponların kullanımı ile kontrol edilir. Tris bu amaçla kullanılır.

80

81 Protein boyanması Protein Coomassie Blue (CB) ile boyanır. Protein- CB kompleksi koyu mavidir ve normal ışıkda göru lebilir. Moleku ler Ağırlık Protein: Dalton ya da Da, veya sıklıkla kilodalton (1000Da), ya da kda olarak ifade edilirler.