Prof. Dr. M. Sait ADAK danışmanlığında, Hüseyin AHMET tarafından hazırlanan Irak ta Yetiştirilen Bazı Ekmeklik Buğday Çeşitlerinde Kallus Oluşumu ve B

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ IRAK TA YETİŞTİRİLEN BAZI EKMEKLİK BUĞDAY ÇEŞİTLERİNDE KALLUS OLUŞUMU VE BİTKİ REJENERASYONU Hüseyin AHMET TARLA BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ANKARA 2007 Her hakkı saklıdır

2 Prof. Dr. M. Sait ADAK danışmanlığında, Hüseyin AHMET tarafından hazırlanan Irak ta Yetiştirilen Bazı Ekmeklik Buğday Çeşitlerinde Kallus Oluşumu ve Bitki Rejenerasyonu adlı tez çalışması 24/ 01/ 2007 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Tarla Bitkileri Anabilim Dalı nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Başkan : Prof. Dr. A. Murat ÖZGEN Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. M. Sait ADAK Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. İbrahim DEMİR Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Ülkü MEHMETOĞLU Enstitü Müdürü

3 ÖZET Yüksek Lisans Tezi IRAK TA YETİŞTİRİLEN BAZI EKMEKLİK BUĞDAY ÇEŞİTLERİNDE KALLUS OLUŞUMU VE BİTKİ REJENERASYONU Hüseyin AHMET Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Tarla Bitkileri Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. M. Sait ADAK Bu çalışmada, Irak florasında genetik materyal olarak ve yetiştiricilik açısından önem taşıyan ekmeklik buğday çeşitleri Temmuz 2, Irak, Eliz 66, İba 99 Musaddak, İba 99 Müseccel kullanılmıştır. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümü biyoteknoloji laboratuarı ve deneme saksılarında gerçekleştirilen bu araştırmada, kullanılan çeşitlerde kallus ve rejenere bitkicik potansiyelin in vitro koşullarında belirlenmeye çalışılmıştır. Kallus oluşumu için 8 ml/l 2,4-D içeren katı MS ortamı ve bitki rejenerasyonu için 20 g/l sucroz ve 7 g/l agar içeren katı MS ortamı kullanılmıştır. Çalışmada, kallus oluşumu, kallus ağırlığı, rejenerasyon kapasitesi, kültür etkisi ve rejeneratif bitki sayısı paremetreleri belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre; kallus oluşumu % (Eliz 66) % (İba 99 Musaddak), kallus ağırlığı g (Temmuz 2) g (Eliz 66), rejenerasyon kapasitesi % (Eliz 66) % (İba 99 Musaddak), kültür etkisi % (Eliz 66) % (İba 99 Musaddak) bitki sayısı ise de (İba 99 Musaddak) (Temmuz 2) arasında olarak belirlenmiştir. Ayrıca, karakterler arasındaki ilişkiler incelendiğinde; kallus ağırlığının yüksek olması bitki sayısını arttırmıştır (r = 0.674**). Artan kallus ağılığı ve oluşan rejenerasyon yeteneğinin yüksek olmasını (r = 0.900**) sağlamıştır. Irak ta geliştirilip tescil edilen ve yaygın olarak yetiştirilen (kuraklık, tuzluluk gibi bazı abiyotik stres faktörlerine dayanıklılık / tolerans) bazı ekmeklik buğday çeşitlerinde kallus oluşumu ve rejenerasyon yetenekleri bir başka deyişle bu çalışmada adı geçen buğday çeşitlerinin doğrudan gen aktarma yöntemlerin de kullanılabilme potansiyelleri belirlenmiş, bunlardan Irak çeşidinin bu tip çalışmalarda en uygun çeşit olduğu belirlenmiştir. 2007, 51 sayfa Anahtar Kelimeler: Buğday, doku kültürü, Irak, kallus oluşumu, bitki rejenerasyonu i

4 ABSTRACT Master Thesis CALLUS INDUCTION AND PLANT REGENERATION IN SOME IRAQI COMMON WHEAT VARIETIES Hüseyin AHMET Ankara University Gradute School of Natural and Applied Sciences Department of Field Crops Supervisor: Prof. Dr. M. Sait ADAK Some common wheat varieties such as Temmuz 2, Iraq, Eliz 66, İba 99 Musaddak, İba 99 Müseccel which are important as genetic materiyal and in agriculture of Iraq were used in this study. Experiment was carried out at the biotechnology laboratories of Department of Field Crops, Agriculture Faculty of Ankara University; the aim of this research was to determine the callus induction and plant regeneration for this varieties under in vitro conditions. For this purpose 8 ml/l 2,4-D was used for callus induction and 20 g/l agar was used for plant regeneration as MS. Parameters such as callus induction, callus weight, regeneration capacity, culture efficiency and number of regenerated plant were measured in this study. According to obtained result; callus induction was % (Eliz 66) % (İba 99 Musaddak), callus weight was g (Temmuz 2) g (Eliz 66), regeneration capacity was rejenerasyon kapasitesi % (Eliz 66) % (İba 99 Musaddak), cluture efficiency was % (Eliz 66) % (İba 99 Musaddak) and number of regenerated plants was (İba 99 Musaddak) (Temmuz 2). In addition, when investigated relationships among traits; there was significant relationship between callus weight and number of regenerated plants (r = 0.674**). And also, regeneration capacity was effected as significantly by callus weight (r = 0.900**) Callus induction and regeneration capacity or their potential of the production process of trans genetic plant were investigated of some Iraqi common wheat varieties (which are resistant / tolarent to the drought, salt and some abiotic stress factors) in this research; and also, it was determined Irak variety is most favorable for this kind of studies. 2007, 51 pages Key Words: Wheat, tissu culture, Iraq, callus induction, plant regeneration. ii

5 TEŞEKKÜR Irak'ta Yetiştirilen Bazı Ekmeklik Buğday Çeşitlerinde Kallus Oluşumu ve Bitki Rejenerasyonu konulu tez çalışmasını veren ve beni her konuda yönlendiren danışman hocam sayın Prof. Dr. M. Sait. ADAK a ve çalışmamın gerçekleşmesi için her konuda yardımcı olan değerli hocam Prof. Dr. Murat ÖZGEN e en içten teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmamın her aşamasında desteğini aldığım değerli hocam sayın Doç. Dr. Melahat AVCI BİRSİN e; yardımlarını benden esirgemeyen değerli hocam sayın Doç. Dr. Mustafa YILDIZ a ve Araştırma Görevlisi değerli hocam sayın Nur KOYUNCU ya ve çalışmamda emeği geçen herkese, hayatım boyunca bana her yönden destek olan annem, babam, ablalarım, kardeşlerim e ve tüm sevdiklerime teşekkürlerimi sunarım. Hüseyin AHMET Ankara, Ocak 2007 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii SİMGELER DİZİNİ...v ŞEKİLLER DİZİNİ...vi ÇİZELGELER DİZİNİ...vii 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Yöntem Eksplant hazırlığı Sterilizasyon Malzemelerin sterilizasyonu Steril saf su hazırlanması Eksplantların yüzey sterilizasyonu Ortam hazırlığı Kallus ortamının hazırlanması Rejenerasyon ortamı hazırlığı Embiryoların çıkarılması ve kallus ortamına yerleştirilmesi Rejenerasyon çalışmaları Alıştırma (Aklimatizasyon) çalışmaları Fotoğraf çekimleri Verilerin elde edilmesi Verilerin değerlendirilmesi BULGULAR VE TARTIŞMA Buğday Çeşitlerinin Kallus Oluşturma Oranı Buğday Çeşitlerinin Kallus Ağılığı Buğday Çeşitlerinin Rejenerasyon Kapasitesi Buğday Çeşitlerinin Kültür Etkisi Toprağa Aktarılan Bitki Sayısı Buğday Çeşitlerinde İncelenen Karakterler Arası İlişkiler SONUÇ...44 KAYNAKLAR...46 ÖZGEÇMİŞ...51 iv

7 SİMGELER DİZİNİ AÖF Asgari Öemli Fark 2,4D 2,4 Diklorophenoksiasetik B.S. Bitki Sayısı C Celcius cm KA KE KO L NAA Santimetre Kallus Ağırlığı Kültür Etkisi Kallus Oluşumu Litre Naftalenastik asit µm Mikromol MS Psi RK Murashige ve Skoog besin ortamı pound per square inch (basınç birimi) Rejenerasyon Kapasitesi v

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 4.1 Buğdayda farklı çeşitlerin olgun embriyolarından kallus gelişimi..30 Şekil 4.2 Farklı buğday çeşitlerinin olgun embriyolarından gelişen kalluslardan Sürgün rejenerasyonu...34 Şekil 4.3 Gelişen sürgünlerin köklendirilmesi 39 Şekil 4.4 Köklenen bitkilerin saksılara yetiştirilmesi..40 Şekil 4.5 Saksılarda başak oluşturan bitkiler...41 vi

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 4.1 Buğday çeşitlerinin kallus oluşturma oranına ilişkin varyans analizi sonuçları...28 Çizelge 4.2 Buğday çeşitlerinin kallus oluşturma oranına ilişkin sonuçlar (%).28 Çizelge 4.3 Buğday çeşitlerinin kallus ağırlığına ilişkin varyans analizi sonuçları 31 Çizelge 4.4 Buğday çeşitlerinin kallus ağırlığına ilişkin sonuçlar (g) 31 Çizelge 4.5 Buğday çeşitlerinin rejenerasyon kapasitesine ilişkin varyans analizi sonuçları..32 Çizelge 4.6 Buğday çeşitlerinin rejenerasyon kapasitesine ilişkin sonuçlar (%)...33 Çizelge 4.7 Buğday çeşitlerinin kültür etkisine ilişkin varyans analizi sonuçları...35 Çizelge 4.8 Buğday çeşitlerinin kültür etkisine ilişkin sonuçlar (%).35 Çizelge 4.9 Toprağa aktarılan bitki sayısına ilişkin varyans analizi sonuçları 37 Çizelge 4.10 Toprağa aktarılan bitki sayısına ilişkin sonuçlar...37 Çizelge 4.11 İncelenen karakterler arası ilişkiler 42 vii

10 1. GİRİŞ Tüm dünyada, Türkiye ve Irak ta gerek ekiliş gerekse üretim bakımından tahıllar başta gelen ürün gurubunu oluşturmaktadır. Türkiye de tarla bitkileri ekim alanı içinde tahıllar %70, Irak ta ise %16 pay almaktadır (Anonim 2006). Tahıl ürünleri içerisinde ise en büyük pay buğdaya ait olup, gerek insan beslenmesinde gerekse hayvan beslenmesinde temel bir gıda maddesidir. Endüstride hammadde olarak da son yıllarda tarım teknolojisindeki gelişmelere ve buğday ürünlerine olan talebin artışına paralel olarak hızla artmaktadır. Buğday iyi bir besin hammaddesi oluşu, adaptasyon sınırının genişliği, üretiminin sadeliği, taşıma, depolama ve işleme kolaylığı gibi nedenlerden dolayı dünya nüfusunun yaklaşık % 35 inin temel besini durumundadır. Buğday tanesi yaklaşık olarak %65 75 nişasta, %8 15 protein, %1 5 yağ, %1.5 3 şeker, %1 2 kül, %11 13 nem içerir. Buğday tanesinde karbonhidrat, yağ ve proteinin yanında insan ve hayvan beslenmesinde önemli derecede rol oynayan vitaminler de bulunmaktadır (Kün 1988). Yüksek verimli ekmeklik buğday çeşitlerinin ekiminin yaygınlaştırılmasıyla, makarnalık buğday üretiminde azalmalar meydana gelmiştir. Türkiye nin hemen her bölgesinde buğday üretimi yapılmakla beraber, 2006 yılı verilerine göre buğday ekim alanı 9.3 milyon ha, üretim 21 milyon ton, verim ise 225 kg/da dır. Irak ta ise buğday ekim alanı yaklaşık 1.7 milyon ha, üretim 1.8 milyon ton verim ise 119 kg/da dır (Anonim 2006). Buğdayın tüketimi gelişmiş ülkelerde az olmasına karşın, Türkiye gibi kişi başına gelir düzeyi yüksek olmayan ülkelerde ekmeğe dolayısı ile buğdaya dayalı beslenme oldukça fazladır, çok ülkelerin insan beslenmesinde buğdaya olan bağlılığı, bulunduğu coğrafi konuma göre değişmektedir. Bazı ülkelerde, günlük kalorinin %30 dan fazlasını buğday karşılarken; bazı ülkelerde bu oran %20 nin altına inebilmektedir. Bu değer Türkiye de %60 oranına ulaşmaktadır (Kün 1988). 1

11 Dünyada ve Türkiye de, üzerinde tarım yapılabilecek alanların son sınırlarına ulaşılmış olması, çalışmaların birim alandan elde edilen ürün verimini yükseltmek üzerine yoğunlaşmasına neden olmuştur. Verimin arttırılması için bölge koşullarına uygun çeşitlerin elde edilmesi, bu çeşitlerin üretime alınması, agronomik uygulamaların zamanında ve yeterli ölçüde yerine getirilmesi kaçınılmazdır. Günümüzde çeşitlerin sağlanan üretim artışı çeşitlerin verimlerinin yüksek olmasından kaynaklandığı gibi uygulanan bazı ıslah yöntemlerinin de önemi büyüktür. Ancak artan nüfusun beslenme ihtiyaçlarının giderilebilmesi için verimin daha da yükseltilmesi gerekmektedir. Bu nedenle verimi yüksek çeşitlerin elde edilmesi isteği bitki ıslahçılarının temel amacı olmuştur. Buğday, Yakın Doğu, Orta Doğu, Orta ve Güney Avrupa da başlıca besin kaynağı ve günlük ekmeğin hammaddesidir. Bu bölgelerden Orta Doğu da yer alan Irak ta geliştirilmiş ve tescil ettirilmiş ekmeklik buğday çeşitlerinin üretimini sınırlandıran kuraklık, sıcak ve tuzluk gibi abiyotik stres faktörlerine dayanıklılık / tolerans bakımından bazı sıkıntıları olduğu bilinmektedir. Buğday verimini artırmakta klasik ıslah yöntemleri ile önemli aşamalar sağlanabilmektedir. Günümüzde klasik ıslah yöntemlerinin yanında ileriye yönelik olarak genetik mühendisliği tekniklerinin geliştirilmesine de çalışılmakta klasik melezleme ıslahında karşılaşılan ıslah süresinin uzunluğu, melezleme güçlüğü kısırlık, uyuşmazlık ve istenmeyen gen geçişleri gibi olumsuzluklardan etkilenmeden gen aktarmasın olanak sağlayan ve özelikle doğrudan gen aktarımı (biyolistik) olarak bilinen teknikler geliştirilmiştir (Sanford 1990). Günümüzde buğday ıslahında birçok yöntemden yararlanılmakta olup, her geçen gün yeni özellikler taşıyan çeşitlerle verim ve kalite artışına katkıda bulunulmaktadır. Uygulanan ıslah yöntemleri klasik ve biyoteknolojik yöntemler olarak 2 ana başlık altında toplanmaktadır. Klasik yöntemler; introdüksiyon, seleksiyon, melezleme, mutasyon ve poliploidi olarak sıralanmaktadır. Ancak her yöntemin kendine özgü sorunları vardır. İntrodüksiyon daki en önemli sorun; yeterli adaptasyon denemeleri yapılmadan çeşitlerin getirilmesi ve sonuçta da istenilen başarının elde edilememesidir. Seleksiyon çalışmalarında ise, çeşit ıslahının uzun yıllar sürmesi başlıca sorun olup, kısırlaşmadaki zorluklar, türler arasındaki izolasyon ve uzun yıllar seçmelerin yapılması 2

12 önemli olanlardır. Mutasyon ıslahında ise, yapılan çalışmaların amaçları ve etkinliği tam olarak ortaya konulamamaktadır. Çünkü uygulanan mutagenlerin genetik materyal üzerinde ne gibi bir değişikliğe neden olacağı kesin olarak önceden bilinmemektedir. Elde edilen bu mutantlarda amaca uygun olarak yeniden seleksiyonların uygulanması gerekmektedir. Ayrıca mutant bitkilerde morfolojik ve fizyolojik birçok aksaklıklar da ortaya çıkabilmekte ve böylece bitkinin gelişmesi yavaşlamaktadır. Poliploidi uygulanmış bitkilerde ozmotik basıncın düşük olması hücre bölünmesinin hızını yavaşlatmaktadır. Bu da dolaylı olarak kardeşlenmenin azalması ve çiçeklenmenin gecikmesi gibi fizyolojik değişikliklere neden olmaktadır. Homolog kromozomların mayoz bölünme sırasındaki eşleşme güçlüğü kısırlık sorunu yaratırken, türler arası genetik izolasyon da tohum bağlama oranını azaltmaktadır (Şehirali ve Özgen 1988). Son yıllarda hızla gelişen yeni ıslah yöntemleriyle bitkilere olumlu özellikleri bozulmadan, verim ve kaliteyi yükseltecek bazı yeni özelliklerin eklenmesine ve çıkarılmasına yönelik ümit verici çalışmalar yapılmaktadır. Bu çalışmalar, doğrudan gen aktarımı, rekombinat DNA, protoplast füzyonu ve benzeri ıslah yöntemleri kullanılarak başarılabilmektedir. Klasik ıslah yöntemlerinin yanısıra ileriye yönelik olarak biyoteknolojik teknikler kullanılarak doku kültürü ve genetik mühendisliği çalışmaları hızla devam etmektedir (Acar 1997). Doku kültürü çalışmalarında bitkilerin eşeysel olarak çoğalabilmelerinin yanısıra gövde, dal, yaprak gibi herhangi bir parçalarından eşeysiz olarak da çoğalabilme (totipotensi) özelliği onların in vitro koşullarda, uygun besin ortamı içeriğiyle tüm bitki şeklinde gelişmelerini olası hale getirmektedir. Mikroorganizmalardan arındırılmış bir ortamda ve dengeli şekilde hazırlanmış besin maddeleri, tek bir anaçtan istenildiği kadar çoğaltım yapılmasını sağlamaktadır. Doku kültürü tekniklerinin, bitkileri genetik potansiyellerinin amaca uygun yönlendirilmesi açısından büyük önem taşıdığı anlaşılmaktadır (Acar 1997). 3

13 Tahıllar klasik ıslahındaki mevcut sorunları aşabilmek için, doku kültürü ve biyoteknolojik yöntemlerden yararlanabilmek, istenen sonuçların elde edilmesi için gereklidir. Genetik mühendisliği çalışmalarından yararlanılarak gen aktarmada önemli bir aşama olan embriyo kültürü ile kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonunda başarının başta genotip olmak üzere birçok faktöre olduğu bilinmektedir. Bitki ıslahı çalışmalarında, başarıyı etkileyen iki önemli konu vardır. Bunlar; varyasyon ve seleksiyondur. Varyasyon, küçük değişmelerle yıllar boyunca kendiliğinden olduğu gibi; melezleme, mutasyon ve poliploidi ile de yapay olarak oluşturulabilir. Seleksiyon amaca uygun bitkilerin seçilmesidir. Seleksiyon yapılırken sürekli kontrolle karşılaştırma yapılır. O yörede, yetişen standart çeşitleri aşabilen materyaller seçerek, daha üstün çeşitlerin geliştirilmesi sağlanır. Son yüzyılda, klasik ıslah yöntemlerinden yararlanılarak; üstün verimli ve kaliteli birçok çeşit geliştirilmesine rağmen başta hastalık ve zararlılar olmak üzere bazı biyotik ve abyotik çevresel baskılara karşı dayanıklıkta istenilen sonuca ulaşılamamıştır (Özgen vd. 2000). Biyoteknolojik yöntemler ile bitkilerin tarımsal niteliklerinin geliştirilmesi amacıyla laboratuvar koşullarında uygulanan doku kültürü teknikleri, zamanla tarla koşullarında yapılan çalışmalarda karşılaşılan sorunların giderilmesinde kullanılmaya başlanmıştır. Sonuçların daha kısa sürelerde alınabildiği, bitkilerin hücre, doku ve çeşitli organlarının kullanıldığı bu çalışmalarda, bitkilere biyoteknolojik sistemler için gelişmiş tüm yöntemler uygulanabilmektedir. Melezlemeyle yetiştirdiği bölgeye iyi uyum göstermiş olan çeşidin özelliklerine ek olarak ikinci bir çeşitte bulunan üstün karakteri yöneten gen ya da genler aktarılarak, yeni bir çeşit elde edilebilmektedir (Şehirali ve Özgen 1988). Klasik ıslahta en çok kullanılan bu yöntemde ise bazı sorunlar ortaya çıkmaktadır. Bu sorunların başında kısırlık gelmektedir. Kısırlık, kromozomlar arası sayı ve yapı farklılığı ya da sitoplazma kromozom uyuşmazlığı gibi bir çok değişik nedenden kaynaklanmaktadır. Klasik ıslahta karşılaşılabilecek bu tür sorunlar köprü melezlemeler, kolkisin uygulamaları, mutasyon, geri melezlemeler gibi yöntemlerle giderilebilmektedir. Ancak klasik ıslah 4

14 uygulamalarıyla ortaya çıkan bir başka sorun ise gen aktarımında istenilen genlerle birlikte istenmeyen genlerin de geçmesidir. Bu olay sırasında alıcı türe büyük ya da küçük bir kromatinin girmesi ve bunların homolog olmaması, kromozomlar arasındaki parça değişimini (crossing-over) olumsuz etkileyerek, genler arasındaki bağlılığın kırılmasını güçleştirebilmektedir (Özgen ve Akar 1993). Bitki doku işlemlerinde ve genetik iyileştirmelerde kullanılan temel sistem bitki rejenerasyonudur (Purnhauser et al. 1987). In vitro bitki rejenerasyon yöntemlerinin amacı, kallusta meristematik bölgelerin ve meristematik sürgünlerin oluşumu arttırmaktadır (Vnuchkova et al. 1993). Bitki rejenerasyonu, kültürü yapılan hücrelerin özellikleri itibarıyla üç kısımda incelenir: 1) organize olmuş meristematik hücreleri içeren somatik dokulardan rejenerasyon, 2) meristematik olmayan somatik hücrelerden rejenerasyon ve 3) mayoz bölünme geçirmiş gametik hücrelerden rejenerasyon. Birinci tip rejenerasyonda uç ve yon meristemlerden bitkiler çoğaltılır. Buna meristem kültürü yoluyla klonal çoğaltım denir. Elde edilen hücreler tamamen verici bitkiye benzerler. İkinci tip rejenerasyon; doğrudan bir bitki eksplantının kesilmiş yüzeylerindeki belirli somatik hücrelerin bir kısmının, genellikle bitki büyüme düzenleyicilerinin (özellikle oksin ve sitokininler) etkisi sonucu bölünerek ve organize olarak, organları ve daha sonra da bitkiye (doğrudan organogenesis) veya bir somatik hücrenin sürekli bölünerek embriyo ve daha sonra da tam bir bitkiyi oluşturması (doğrudan somatik embriyogenesis) şeklinde olabilir. Ayrıca her iki durum belirli bir kallus, proto-kallus veya hücre süspansiyonu oluşumu devresinden sonra da ortaya çıkabilir (dolaylı rejenerasyon) (Babaoğlu vd 2001). Gramineae familyası içerisinde yer alan tahıl ve buğdaygil yem bitkilerinde uygulanan doku kültürü teknikleri; kallus kültürü, embriyo kültürü, anter kültürü, hücre süspansiyon kültürü ve protoplast kültürü olarak sayılabilir. Kallus kültürü, bitkilerin değişik organ dokularının kallus (farklılaşmamış hücre yığını) oluşturmaya teşvik edilmesidir. Kallus elde etmek için kök, kotiledon, hipokotil, yaprak ayası, damar, çiçek durumu, embriyo (olgun ve olgunlaşmamış), gövde segmentleri vb. Bitki kısımları eksplant olarak kullanılmaktadır. Kallus embriyogenik olabilir veya olmayabilir. Ancak, kallus dokusundan bitki rejenerasyon için embriyogenik kallus önem taşımaktadır. 5

15 Kallus türleri, in vitro çoğaltımda, kültürde ortaya çıkan somaklonal varyasyondan yararlanmada, hücre süspansiyon kültürlerinin oluşturulması ve gen transferlerinin uygulanabilmesi amacıyla kullanılmaktadır (Bürün 1996). Kültüre alınmış hücre ve dokulardan yeni bir bitkinin etkili bir şekilde rejenere olması, ürün ıslahında biyoteknolojik yöntemlerin başarıyla uygulanması için gereklidir (Özgen vd 1998, Redway et al. 1990). Kallus kültürlerinden bitki rejenerasyonu, bitki üretim programları için oldukça kullanışlı bir yöntemdir. Bu nedenle kallustan bitki rejenerasyonu için etkili bir sistem kurulması, hücre ve doku kültür araştırmalarının başarı için gereklidir (Özgen vd. 1998, Özgen vd. 1996). Etkili bir doku kültür tekniğinin kurulması, monokotiledonlarda özellikle de Gramineae familyasında, dikotiledonlara göre daha zordur. In vitro doku kültürlerinde kallus oluşumu ve oluşan kalluslardan bitki rejenerasyonunun düzeyi, temel olarak genotip (Purnhauser et al. 1987, Vnuchkova et al. 1993) coğrafik orijin, donör bitkinin fizyolojik şartları, eksplant olarak kullanılan bitki organları, kültür ortamı ve bulanr arasındaki etkileşimden etkilenmektedir (Özgen vd. 1996). Buğday, en önemli besin maddelerden biri olması nedeniyle, in vitro kültürde rejenerasyon çok çalışılan bir bitkidir (Delporte et al. 2001). Buğdayın doku kültüründe kallus oluşturması ve oluşan kalluslardan bitki rejenerasyonu genellikle eksplant kaynağı, genotip ve kültür ortamına bağlıdır (Özgen vd. 1998). Genotipin etkisi nuklear veya sitoplazmik bileşenlerden kaynaklanmaktadır. Buğdayda doku kültürü yanıtı tek veya birkaç kromozomla kontrol edilir (Özgen vd. 2001). Buğdayda farklı eksplant kaynakları somatik kallus kültürü için kullanılmaktadır. Bu eksplant arasında olgunlaşmış embriyo, olgunlaşmamış yaprak ve çiçek durumu, olgun embriyo, mezokotil, tohum, apikal meristem (Özgen vd. 1996), anter ve izole dilmiş mikrosporlar (Delporte et al. 2001) bulunmaktadır. Bu dokuların bütün bir bitkiye rejenere olabilme kabiliyeti birbirinden farklıdır (Delporte et al. 2001). Kültüre alınan eksplantlarda hücre bölünmeleri ve DNA sentezi kültürün üç gün içerisinde başlamakta ve proliferasyonu bir hafta içerisinde fark edilmektedir. Hücre bölünmeleri prokambiyal 6

16 / vasküler dokulardan meydana gelmektedir (Bürün 1996). Olgunlaşmamış embriyo, in vitro koşullarda rejenere olabilen en etkili doku olarak bulunmuştur (Delporte et al. 2001, Özgen vd.1998). Olgunlaşmamış embriyolar buğday doku kültüründe en sık kullanılan eksplant kaynağı olmasına rağmen, sadece yılın belli bir dönemi kullanıma uygun durumdadır (Özgen 1996). Genellikle olgunlaşmamış embriyoların rejenerasyon ve transformasyon yeteneği, alındığı bitkinin büyüme şartlarından etkilenmektedir. Bu bitkinin kültürasyonu da çok zor olabilmektedir (Delporte et al. 2001). Bu nedenle in vitro kültürü oluşumu için oldukça sınırlıdır. Olgun embriyoların kullanılması için böyle bir zaman kısıtlaması yoktur (Özgen vd. 1998). Olgun embriyoların fizyolojik durumu olgunlaşmamış embriyonun aksine pek farklılık göstermez. Üstelik embriyonun alındığı bitkinin sera, iklim dolabı gibi bazı ek gereksinimleri bulunan ortamlarda yetiştirilmesine de gerek yoktur. Tohumlar tarladan toplanıp gelecekte kullanılmak üzere depo edilmektedir, böylece yeterli miktarda materyal elde edilmekte ve çalışma kolaylaşmaktadır (Delporte et al. 2001). Yılın her dönemi kullanıma hazır olmasına rağmen olgun embriyolar oluşum sıklığının daha az olması nedeniyle eksplant kaynağı olarak pek tercih edilmemektedir (Özgen vd. 1998). Ancak geliştirilen bazı yeni tekniklerle, olgun embriyolar da kallus oluşumu için başlangıç materyali olarak başarılı bir şekilde kullanılmaya başlanmıştır (Özgen vd. 1996). Yapılan çalışmalarda embriyonun tercih edilmesinin nedeni, embriyogenik kallus üretim oranının embriyogenik olmayan dokulara göre daha fazla olmasıdır (Delporte et al. 2001). Kültüre alınan embriyo, kallus oluşturmaya teşvik edilir ve kallustan rejenerasyonla bitkiler elde edilir. Buğdaygillerde hem somatik embriyogenesis hem de organogenesis beraber veya sırasıyla meydana gelebilirken bazen de organogenesis esas rejenerasyon yöntemi olmaktadır (Bürün 1996). Doku kültürü çalışmalarında bitkilerin kendilenme ya da karşı döllenme ile eşeysel olarak çoğalabilmelerinin yanı sıra gövde, dal, yaprak gibi herhangi bir parçalarından eşeysiz olarak da çoğalabilme (totipotensi) özelliği, onların in vitro koşullarda uygun 7

17 besin ortamı içeriğiyle tüm bitki şeklinde gelişmelerini olası hale getirmektedir. Mikroorganizmalardan arındırılmış bir ortamda ve dengeli şekilde hazırlanmış besin maddeleri tek bir anaçtan istenildiği kadar çoğaltım yapılmasını sağlamaktadır. Doku kültürü tekniklerinin bitkilerin genetik potansiyellerinin amaca uygun yönlendirilmesi açısından büyük önem taşıdığı anlaşılmaktadır. Doku kültürü çalışmaları genetik mühendisliği çalışmalarına bir taban oluşturmanın yanında melezlemede, Dormensinin kırılmasında, tohum üretilmesi mümkün olmayan materyalin üretilmesinde pek çok sorunu da ortadan kaldırmaktadır. Doku kültürüyle ayıca kombinasyon ıslahında gerek ıslah süresini kısaltmak, gerekse daha az materyal ile çalışmak ya da mutasyon ıslahı mutantları daha kültür sırasında seçmek mümkün olmaktadır. Dayanıklılık ıslahında da sağladığı birçok yararın yanı sıra bitki fizyolojisi ve biyoloji çalışmalarında, büyüme ve farklılaşmanın gözlenmesini kolaylaştırmaktadır. Doku kültürü çalışmalarının genetik mühendisliği çalışmalarıyla birlikte kullanılması, ıslah çalışmaları açısından yeni boyutlar kazandırmıştır. Bu bakımdan farklı bir birey ya da türden alınan DNA parçalarının başka bir birey ya da türün DNA molekülüne taşınma ve planlanması anlamına gelen genetik mühendisliği, organizmaların genetik materyalini kontrollü olarak işleyen geniş bir dizi tekniktir. Bitki doku kültürleri, vegetatif bitki üretiminin yanı sıra genetik mühendisliği yöntemleri uygulanmış hücre, doku ya da organların tüm bir bitki haline getirilmesi amacıyla bitki biyoteknolojisine hizmet etmektedir. Doku kültürleri, bu şekilde bitki elde etmenin tek yolu olarak görülmektedir. Gen aktarımı çalışmalarına başlamadan önce bitki türlerinin büyük önem taşımaktadır. Buğdayın klasik ıslahındaki mevcut sorunları aşabilmek için, doku kültürü ve biyoteknolojik yöntemlerden yaralanmak kaçınılmazdır. Genetik mühendisliği tekniklerinden yararlanılarak gen aktarmada önemli bir adım olan kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu çalışmalarında başarının büyük ölçüde genotip ile bağlı olduğu bilinmektedir (Şehirali ve Özgen 1988). 8

18 Bu araştırmanın amacı, Irak ta geliştirilip tescil edilen ve yaygın olarak yetiştirilen (kuraklık, tuzluk gibi bazı abiyotik stres faktörlerine dayanıklılık / tolerans) bazı ekmeklik buğday çeşitlerinde kallus oluşumu ve rejenerasyon yeteneklerinin bir başka deyişle doğrudan gen aktarma yöntemlerinin uygulanabileceği buğday genotiplerin belirlenmesidir. In vitro koşullarında olgunlaşmış embriyo kullanılarak gerçekleştirilen bu araştırmada, Irak taki kurak iklim bölgelerinde yetiştirilen bazı ekmeklik buğday çeşitlerinin kallus oluşturma ve rejenerasyon yetenekleri belirlenmeye çalışılmıştır. 9

19 2. KAYNAK ÖZETLERİ Maddock et al. (1983), farklı buğday genotipleri üzerinde sürdükleri araştırmada; genç başaklardan kallus oluşturma oranlarının genotipe bağlı olarak değiştiğini ve oluşan rejenerantlarda fenotipik varyasyon gözlendiğini bildirmektedirler. Tuberosa et al. (1988), 8 ekmeklik buğdayda yaptıkları araştırmada; olgunlaşmamış embriyo kültüründa, embriyoların besi ortamına konulurken skutellumun yukarı doğru gelmesi; olgun embriyolarda ise skutellumun ortamla temas etmesi halinde kallus oluşabileceğini bildirmişlerdir. Olgunlaşmamış ve olgunlaşmış embriyolar bunun aksi şekilde yerleştirildiğinde çimlendikleri görülmüştür. Araştırıcılar kallus oluşumunun günde başladığını, çimlenme durumunda ise, 3-4 gün içerisinde koleoptilin çıktığını gözlemişlerdir. Lörz (1989), tahıllarda in vitro koşullarda yürütülen bitki rejeneasyon çalışmalarında çok hücreli eksplantlarla başarıya ulaşıldığını ve tahıllara alternatif gen aktarım yöntemlerinin uygulanabileceğini belirtmiştir. Lashermes et al. (1990), Batı Asya ve Kuzey Afrika dan elde edilen bazı buğday genotiplerinde anter kültürü çalışmalarında; genotipler arasında varyasyan gözlendiği elde edilen sonuçların bitki ıslahı çalışmalarında kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Bregitzer et al. (1991), yulafta somatik embriyolardan kallus oluşturarak, çok sayıda bitki rejenerasyonu sağlandığını, yulaftan elde edilen embriogenik kırılıcı kalluslardan oluşan süspansiyon kültüründen iriliklerine bağlı olarak alınan kallusları vortekse tabi tutarak somatik embriyolar oluşturulduğunu, iriliğini Mm olan kalluslardan en iyi somatik embriyolar elde edildiğini, elde edilen bu somatik embriyoların %55 lik kısmından tekrar kallus oluştuğunu; kalanından %22 oranında fertil bitki rejenerasyonunu sağlandığını; araştırmanın sonunda partikül bombardımanıyla yapılacak gen aktarımında kırılcı embriyogenik yulaf kallusundan elde edilen somatik embriyoların diğer eksplantlara göre daha uygun olduğunu saptamışlardır. 10

20 Abd-el Maksoud et al. (1993), buğday da anter kültüründe genotip ve ortamın etkisini inceledikleri çalışmalarında; reaksiyonun genotiplere bağlı olarak ortalama %0,54 ile %7,81 arasında değiştiğini, kullanılan farklı ortamlardaki reaksiyon oranlarının da istatistiksel olarak önemli olduğunu saptamış ve diğer pek çok türde olduğu gibi buğdayda da bu tip çalışmalarda reaksiyonda en önemli faktörlerden birinin genotip; ayrıca donar bitkilerin yetiştikleri koşullar ve bunların birbiriyle olan etkileşimlerinin de önemli olduğunu bildirmişlerdir. Hatipoğlu vd. (1994), 10 buğday genotipi ile yaptıkları çalışmalarında anter kültürü, rejenerasyon oranının genotiplere bağlı olarak %0 ile %13 arasında değiştiğini ve ortalama %2.69 olarak geçekleştirdiğini saptamışlardır. Hatipoğlu und Doğramacı (1995), ekmeklik buğdayda (Triticum aestivum L.) genotip, besi ortamı ve besi ortamı katılaştırma maddesinin haploid bitki üretimine etkisini saptamak amacıyla yaptıkları anter kültürü çalışmalarında; 10 ekmeklik buğday ve hattından alınan anterleri iki farklı besi ortamı (85 D12 ve P2) ve üç farklı besi ortamı katılaştırma maddesinde (agar, buğday nişastası ve mısır nişastası) kültüre alındıklarını, reaksiyon gösteren anter oranı ve rejenerasyon oranının büyük ölçüde genotip, besi ve besi ortamı katılaştırma maddesinin etkisi altında olduğunu bildirmişlerdir. Bommineni and Jauhar (1996), buğday çeşitlerinde olgunlaşmamış embriyolardan bitki rejenerasyonu; kallus oluşumu için %2 ve %3 sukroz ile 3 jelleştirici madde (%0.8 agar, %0.8 agaros ve %4 phytagel) kullanmışlardır. Bütün çeşitlerde 2, mg/l, 2,4-D, %3 sukroz ve %0.8 agar içeren MS ortamında 2-3 gün içinde somatik embriyo oluşumu gözlendiklerini, somatik embriyoların 3-4 hafta içinde küçük ve yoğun somatik topluluk halinde geliştiklerini; bu toplulukların bitki rejenerasyon ortamına aktarıldığında bitki oluşumu gözlendiğini ve bitkiler: saksılara aktarıldığını ve serada olgun fertil bitki elde ettiklerini belirtmişlerdir. Özcan ve Özgen (1996), ıslah edilmiş kültür bitkilerin yabani formlarıyla karşılaştırıldığında birçok mantar, bakteri ve virüs hastalıkları ile zararlılara karşı daha 11

21 duyarlı olduğu, bu durumun genelde uygulanan ıslah yöntemlerinin eksikliğinden kaynaklandığını belirtmişlerdir; ıslah programlarında, seleksiyon çalışmalarında ürün kalitesi ve miktarı gibi özellikler ön planda tutulduğundan, hastalık ve zararlılara karşı dayanıklılığın her zaman ikinci plana atıldığını, bitki genetik mühendisliği tekniklerinin kullanılmasıyla, ıslah süresinin kısaltılmasının yanında; melezlemede karşılaşılan engellerin, genetik bağlılık sorunlarının ve gen havuzlarından yararlanmadaki sınırlamaların kolayca ortadan kalkacağını; ayrıca tahıllar gibi ekonomik önemi büyük olan bitkilerde klasik ıslah yöntemlerinin yetersiz kalındığı durumlarda ve zaman kazanmak açısından biyoteknolojik yöntemlerin önemini vurgulamışlardır. Özgen vd. (1996), 7 kışlık buuğday genotipinin olgun ve olgunlaşmamış embriyolarından kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonun en uygun yöntemini saptamaya çalışmışlardır. Bu çalışmda olgunlaşmamış embriyolardan kallus oluşumunun sağlanmasında, kendilerinin geliştirdiği embriyo gevşetme yöntemi kullanarak başarılı bir sonuca ulaşmışlardır. Embriyoların endospermden tam olarak değilde, hafifçe ayrılarak (gevşetilerek) ortama konulmasının çalışmanın en önemli noktası olduğunu belirtmişlerdir. Çalışmada, kallus oluşum oranı ile kallusların rejenerasyon kapasitesi arasında bir ilişki olmadığı belirtilmiştir. Olgunlaşmış embriyoların düşük kallus oluşum frekansına, fakat yüksek rejenerasyon kapasitesine sahip oldukları belirlenmiştir. Hızlı, güvenilir ve her zaman bulunabilmesi göz önünde tutulduğunda; olgunlaşmış embriyo kültürünün bu şeklinin, olgunlaşmamış embriyo kültürü için alternatif bir yöntem olarak belirtilmiştir. Viertel and Hess (1996), Turbo ve Nandu yazlık buğday (Triticum aestivum L.) çeşitlerinde 4 ve 10 günlük fide kök uçlarının eksplant olarak kullandıkları araştırmada; indüksiyon ortamında 10 µm 2,4-D ve alt kültürde 5µM 2,4-D kullanmak suretiyle modifiye edilmiş L3 ortamında Turbo çeşidinin 4 günlük fidelerden alınan kök uçlarının %90 nında embriyogenik kallus oluştuğunu, en yüksek bitki rejenerasyonunun 2,4-D içermeyen fakat 2.22 µm BAP ve 0.27 µm NAA ilavesi ile modifiye edilmiş MS ortamında sağlandığı, Turbo genotipinde bütün embriyogenik kallusların 4 günlük fidelerden sağlandığı ve bitki rejenerasyonunun sadece embriyogenesis yoluyla geçekleştiğini, Nandu genotipinde benzer sonuçlar alındığını saptamışlardır. 12

22 Moieni et al. (1997), 7 hekzaploid buğday genotipinin anter kültürüne iki farklı sıvı ortam (CHB ve W14) ve androgenik uygulamaların etkisini araştırmışlardır. IBPT 19 genotipi her iki ortamda da embriyo oluşumu, yeşil bitki rejenerasyonu ve toplam bitki rejenerasyonu için diğer genotiplerden daha yüksek sonuçlar vermiştir. IBPT 19 genotipinde, CHB ortamında her 100 anterden 68 i embriyo üretirken, W14 ortamında bu sayının 25.6 ya düşmesi ile buğdayın anter kültüründe genotip ve ortamın önemli olduğunu ortaya koymuştur. Özgen vd. (1997), 12 kışlık buğday genotiplerin olgunlaşmış ve olgunlaşmamış embriyolardan kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu çalışması yapmışlardır. Tozlaşmadan 15 gün sonra olgunlaşmamış embriyolar tohumlardan elde edilmiş ve skutellum yukarı doğru şekilde 2 mg/l 2,4-D içeren MS ortamına yerleştirilmiştir. Olgunlaşmış embriyolar ise 8 mg/l 2,4-D içeren MS ortamına konulmuştur. Oluşan kalluslar ve bitkiler daha sonra 2,4-D siz MS ortamına alınmıştır. Her iki eksplanttan elde edilen bitkiler vernalizasyondan sonra toprağa aktarılmıştır. Kallus oluşum oranı, kallus rejenerasyon kapasitesi ile eksplant başına oluşan bitki sayısı genotipe göre değişmiştir. Olgun embriyodan fazla sayıda bitki elde edilmiş olup, buğday doku kültüründe olgun embriyo ile çalışma tüm günlerde yapılabileceği için önerilmektedir. Xiayi et al. (1997), in vitro kültürde 6 yazlık buğday çeşidine ait bitkilerin olgun tohumlarıyla sürdükleri araştırmada; genotip, ortam ve tohumun depolanma süresinin kallus indüksiyonuna etkilerinin araştırıldığı çalışmada, Huanong 400 variyetesinin en iyi sonuç verdiğini, genotipler arasında kallus indüksiyonu açısından bir farklılık görülmezken, bitki rejenerasyonu, kök büyümesi ve genç bitkilerin büyüme hızları arasında farklılıklar olduğunu bildirmişlerdir. Bered et al. (1998), in vitro ortamda 9 yulaf (A. Sativa L.) çeşidini rejenerasyon yeteneğini belirlemek amacıyla 1-3 mm iriliğindeki olgunlaşmamış embriyoların 4 mg/l 2,4-D MS ortamına alındığını, ileriki aşamada 2,4-D kontrasyonunun azaltıldığını ve bitki rejenerasyon aşamasındayken ortamdan tamamen uzaklaştırıldığını, elde edilen kallusların, somatik embrioit üretiminin, karakterler arası ilişkinin ve rejenerasyonun 13

23 kontrol edildiğini, tüm çeşitlerde bitki rejenerasyonunun gözlendiğini, embriyogenesis ve rejenerasyon aralarında düşük korelasyon saptandığını, yulafta organogenesis ve çimlenme olaylarının sonucunda bitki rejenerasyonun sağlandığını bildirmişlerdir. Machii et al. (1998), 107 japon buğday genotipi ile yaptıkları çalışmada; anter ve olgunlaşmamış embriyo kullanarak, kallus ve rejenerasyon oluşumu belirlenmeye çalışmışlardır. Anter kültüründe 107 genotipten 83 ünde kallus oluşumu ve bunlardan da 45 inde bitki rejenerasyonu elde edilmiştir. Olgulaşmamış embriyo kültüründe ise, genotiplerin %97 inde, %90 oranında kallus oluşumu elde edilirken, anter kültürüne göre daha çok miktarda albino bitki oluşumu saptanmıştır. Araştırıcılar, doku kültüründe bitki rejenerasyonun genotipe göre değiştiğini belirtmişlerdirler. Sayar vd. (1999), diploid, tetraploid ve hekzaploid buğday çeşitlerinde endosperm destekli olgun embriyo tekniği kullanarak, tane iriliğinin kallus oluşumuna etkisi araştırdıkları çalışmada; buğday çeşitlerine ait tohumları küçük ve büyük olarak ikiye ayırdıklarını, yüzey sterilizasyonu uygulanan bu tohumlarda tamamen steril ortamda embriyo endospermden hafifçe ayırılıp 8 mg/l 2,4-D içeren sıvı ortamda kallus oluşumu sağlandığı; içinde oksin bulunmayan MS ortamına rejenerasyon için aktarıldığını, tüm genotiplerde büyük tanelerin, küçük tanelere göre kallus oluşturma frekansı, kallus net ağırlığı, rejenerasyon kapasitesi ve kültür oluşturabilme yeteneğinin önemli derecede yüksek değerler gösterdiğini; tohum ağırlığı ile kallus ağırlığı (r = 0,86) ve kallus ağırlığı ile rejenerasyon kapasitesi (r = 0,85) arasında önemli ilişki olduğunu, büyük taneli buğdaylarda endosperm destekli embriyo tekniği kullanılarak yüksek düzeyde rejeneratif kallus oluşumu elde edildiğini, bu nedenle bu tekniğin olgunlaşmamış embriyolara alternatif olarak kullanılabileceğini belitmişlerdir. Bahieldin et al. (2000), üç yazlık buğday çeşitinin olgunlaşmamış embriyolarından 0.5, 0.1 ve 0.02 mg/l dikamba içeren MS ortamlarında kallus oluşumu ve sürgün rejenerasyon oranlarını incelemişlerdir. İncelenme sonucunda, 0.02 ve 0.1 mg/l dikamba içeren MS ortamında 1 ve 0.5 mg/l dikamba MS ortamdan daha fazla sürgün 14

24 rejenerasyon ve kallus oluşumu ve sürgün rejenerasyonun genotipe bağlı olarak ortaya çıktığını saptamışlardır. Benkirane et al. (2000), makarnalık buğday çeşitlerin olgunlaşmamış çiçek taslağından ve koleoptilden somatik embryogenesiz elde ettiklerini; bunun için eksplantlar µm 2,4-D içeren MS ortamına yerleştirildiğini; 4-6 hafta sonra eksplantlarda embryogenik veya non embryogenik kallus elde edildiğini belirlemişlerdir. İnflorescence eksplantlardan yüzde yüz kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu saptanırken; koleoptil eksplantlarından inflorescence eksplantına göre bitki rejenerasyonu ve kallus oluşumu az olduğunu, genel olarak 2-4 mm uzunluğu koleoptil eksplantlardan daha fazla rejenerasyonu elde edildiğini bildirmişlerdir. Delporte et al. (2001), buğdayda olgunlaşmış embriyolardan bitki rejenerasyonu elde ettiklerini bildirerek; çalışmaların, olgunlaşmış steril ve ezilmiş parçaların, eksplant olarak kullanıldığı, eksplantlar 10 µm 2,4-D içeren ortamda kültüre alındığı ve kültüre alındıktan 24 saat içerisinde hücrelerde gelişim gözlemişlerdir. Eksplantlardan bir çok embriyo elde edildiğini; kallus oluşum oranının %90 olduğunu saptamışlardır. Özgen vd. (2001), dört kışlık buğday genotipinde embriyo kültürü çalışmalarda sitoplâzma etkisini incelemişlerdir. Elde edilen sonuçlardan, kallus oluşumunda sitoplazmik etki olabileceğini ileri sürdürmüşlerdir. Genel olarak sitoplazim kallus oluşumuna ve bitki rejenerasyonuna olumlu etki yaptığını, sitoplâzmanın etkisini genotipe bağlı olduğunu belirtmişlerdir. Haliloglu (2002), buğdayın olgunlaşmamış embriyoları ile dört değişik büyüme ortamında 2,4-D içeren ortamlarda, kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu gözlemlemek için yaptığı çalışmasında; 2 mg/l 2,4-D içeren ortamlarda en fazla embriyogenosiz elde edildiğini belirtmiştir. 15

25 Konieczny (2003), Polonya nın 10 buğday çeşidinden anter eksplantı kullanarak haploid bitki elde etmek için bir çalışma yapmıştır. En fazla (%9.1) kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu (%0.8) Apollo çeşidinin elde edilmiştir. Buradan hareketle kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu genotipe göre değişebileceği söylenebilir. Pellegrineschi et al. (2004), yaptıkları çalışmada, buğdayda bitki rejenerasyonu ve kallus oluşumu için değişik MS ortamlar NaCl ilave edilmiştir. MPB-Bobwhite 26 (Triticum aestivum L.) ve Mexicalı (Triticum turgidum var. Durum) 2.5 mg/l 2,4-D %2 sukroz ve %0.9 Bacto agar içeren MS ortamda kültüre alınmıştır. Muamele edilmiş embriyolar 2,4-D ve NaCl içeren E3 sıvı ortamlarına aktarılmıştır. 2.5 mg/l 2,4-D içeren ortamda 45 gün sonra MPB. Bobwhite çeşidinde kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu gözlenmiştir. Fakat Mexicalı çeşidinde yeterli miktarda kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu gözlenmemiştir. Buna karşılık 2 mg/l 2,4-D 2 mg/l NaCl içeren ortamda Mexicalı çeşidinde daha fazla kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu gözlenmiştir. Başlangıç aşama dışında ortamlarında NaCl ın bulunması bitki rejenerasyonu için uygun görülmemiştir. Çalışma sonuçları makarnalık buğday çeşitlerin transfarmasyon çalışmalarında kullanılabileceğini ortaya koymuştur. Zale et al. (2003), yaptıkları çalışmada, Tiriticum monococcum, Triticum tausschii ve Aegilops speltoides bitkilerine ait 47 farklı buğday çeşidi ile ıslah hatlarında, olgunlaşmış embriyolardan kallus oluşumu ve rejenerasyon kapasitesini incelemişlerdir. Zak (SWS), Scarlet (HRS), Tara (SWS), Jageer (HRW), UC 1036 (HRS) ve Kyle durum buğday genotiplerinde Fielder ve Bobwhite kültür çeşitlerine göre daha fazla kallus oluşumunu ve bitki rejenerasyonu gözlenmişlerdir. Benzer şekilde Ae.speltoides ten de en fazla rejenerasyon görülmüştür. Kallus oluşumu ile kültür arasında 0.42 ve kallus oluşumu ile rejenerasyon kapasitesi arasında 0.39 gibi ilişkiler saptanmıştır. Belchev et al. (2004), double haploid bitki elde edilerek ıslah süresinin kısaltılması için, anter kültüründe elde edilen sonuçların genotipe bağlı olduğunu bildirmişlerdir. 16

26 Keresa et al. (2004), sekiz Hırvatistan kışlık buğday çeşitinde olgunlaşmış ve olgunlaşmamış embriyo ve bitki rejenerasyon kapasitesi incelemişlerdir. En yüksek oranda (%57) rejenerasyon Zitaraka ve Edita (%54) çeşitlerin elde edilmiştir. Olgunlaşmış embriyolardan en fazla rejenerasyon %26 olarak Magdalen çeşidinde saptanmıştır. Kallus ve bitki rejenerasyonu için 2,4-D içeren pikloram ortam iyi sonuçlar vermiştir. Stayavathi et al. (2004), yaptıkları çalışmada, 4 ticari çeşit (Ben, Maire, Munich ve Lebsock) kullanmışlardır. Bu scutellum eksplanttan kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu kapasitesi incelenmiştir. Kallus oluşumundan 4 hafta sonra, kalluslar hormonsuz MS ortamına bitki rejenerasyonu için aktarılmıştır. Elde edilen fertil bitkilerin ve kromosom sayısı 2n = 4x = 28 bulunmuştur. Herhangi somaklonal varyasyon görülmemiştir. Bitki rejenerasyonda, genotip ve kallus oluşturma ortamın etkisi saptanmıştır. Çalışmada kullanılan 4 çeşitte de en fazla kallus oluşumu ve bitki rejenerasyon % 0.10 dikamba içeren ortamlardan elde edilmiştir. Maier çeşidinde başlanguç aşamada 2 mg/l dikamaba kullanıldığında bitki rejenerasyonu % 0.27 ulaşılmşıtır. Sonuçların genetik transformasyon çalışmalarında yol gösterici olarak kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Şimşek (2004), yulafta yaptığı çalışmada, incelediği karakterlerden kallus oluşumu ve kallus ağırlığı arasında r = 0.121, kallus oluşumu ve rejenerasyon kapasitesi arasında r = , kallus oluşumu ve kültür etkisi arasında r = , kallus oluşumu ve bitki sayısı arasında r = 0.037, kallus ağırlığı ve rejenerasyon kapasitesi arasında r = , kallus ağırlığı ve kültür etkisi arasında r = , rejenerasyon kapasitesi ve bitki sayısı r = 0,285 ile kültür etkisi ve bitki sayısı r = ilişkiler saptamıştır. Tahiliani and Kothari (2004), yaptıkları çalışmada, olgunlaşmamış embriyolarda CuSO4 tin kallus oluşumuna etkisini incelemişlerdir. C 306 ile 3777 çeşitlerin olgunlaşmamış embriyolar; 2,4-D ve 0.5, 1 ve 5 µm CuSO4 içeren MS ortamlarında kültüre alınmıştır. Elde edilen kalluslar 11.3 µm 2,4-D ve 86.8 µm prolin içeren 17

27 ortamda alt kültüre alınmıştır. Bu kalluslar da, 1.07 µm NAA ve 44.4 µm BAP içeren ortamlarda embriyo oluşumu gözlenmiştir. Gelişen bitkicikler 2.85 µm içeren ortamlarda köklendirilmiştir. Deneme sonucunda 5 µm CuSO4 ve 11.3 µm 2,4-D içeren ortamdan daha fazla bitki oluşumu gözlendiğini belirtmişlerdir. Turhan ve Baser (2004), buğday da en iyi kallus oluşumu elde etmek için değişik konsantrasyonlarda NAA ve 2,4-D ve değişik embriyo kaynaklarından elde edilen eksplantlardan yararlanıldığı, eksplant olarak embriyosuz ve embriyolu tohum kullanıldığı; en fazla kallus oluşumu embriyosuz tohumda 4 mg/l 2,4-D ve 1 mg/l NAA içeren ortamda elde edildiği, bu çalışmada 2,4-D nin NAA dan daha etkili olduğu belirtmişlerdir. 18

28 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Bu çalışma Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümü Biyoteknoloji Laboratuarı nda yılları arasında yürütülmüştür. Denemede Irak tan getirilen 5 buğday çeşidi (Irak, Temmuz 2, Eliz 66, İba 99 Müsseccel, İba 99 Mussaddak) materyal olarak kullanılmıştır. Bu çeşitlerden Irak, Temmuz 2, İba 99 Mussaddak Mabeyin El Nehreyin Kerkük Tohum Kontrol ve Tescil Kurumundan; diğer çeşitler olan İba 99 Müseccel, El iz 66, Musul Üniversitesi İba Ziraat ve Araştırma Merkezi nden sağlanmıştır. Çeşitlerin özellikleri aşağıda verilmiştir. Özellikler Irak koşularında saptanmıştır. Irak: Atom Enerjisi Kurumu, Tohum Teknolojisi tarafından 1999 yılında geliştirilmiş ve tescil edilmiştir. Kobalt 60 doz ve 10 kilo rad gama ışınıyla Meksibaktan saf bir hattın ışınlanmasıyla elde edilmiştir. Çiçeklenme süresi gün (ilk sulama gününden itibaren çiçeklenmenin %50 sine kadar); olgunlaşma süresi gün (ilk sulama gününden itibaren fizyolojik olgunlaşmanın %50 sine kadar); bitki boyu cm, başak uzunluğu 15.5 cm, başakta tane sayısı ortalama 70 90, başak şekli az eğik, tane hacmi büyük, rengi amber, şekli oval, 1000 tane ağırlığı g, protein oranı % arasında, yatmaya karşı dayanıklılığı iyidir, tane dökmeye karşı dayanıklılığı ortadır, hastalıklara karşı dayanıklılığı ise; sarı pas hastalığına karşı dayanıklı, kahverengi pas hastalığına karşı orta dayanıklılıktadır. Bir hektar için önerilen tohum miktarı kg. Verimi kg/ha kadardır. İyi yağış alan ve sulanabilen bölgelere önerilmektedir. Temmuz 2: Atom Enerjisi Kurumu, Tohum Teknolojisi tarafından 2001 yılında geliştirilmiş ve tescil edilmiştir. Çiçeklenme süresi (ilk sulama gününden itibaren); olgunlaşma süresi (ilk sulama gününden itibaren fizyolojik olgunlaşmanın %50 sine kadar), yetiştirme dönemi bahardadır. Bitki boyu cm, başak uzunluğu cm, başakta tane sayısı, ortalama 48 50, başak rengi açık sarı, 19

29 başak şekli az eğik, tane hacmi ortadır, tane rengi amber, tane şekli oval, 1000 tane ağırlığı g, yatmaya karşı dayanıklılığı iyidir, tane dökmeye karşı dayanıklıdır, hastalıklara karşı dayanıklılığı ise sarı ve pas hastalığına karşı dayanıklıdır, protein oranı % 0.4,14 ekmeklik için iyidir, bir hektar için önerilen tohum miktarı kg. Verimi 4750 kg / ha kadardır. İyi yağış alan ve sulanabilen bölgelere önerilmektedir. Eliz 66: Atom Enerjisi Kurumu, Tohum Teknolojisi tarafından 1996 yılında geliştirilmiş ve tescil edilmiştir. Çiçeklenme süresi (ilk sulama gününden çiçeklenmenin %50 sinin oluşumuna kadar); bitki boyu yağış alan yerlerde cm ve sulanabilen yerlerde cm, başak uzunluğu cm, başakta tane sayısı ortalama 50 60, başak rengi sarı, başak şekli konik ve dik, seyrek kılçıklı, tane hacmi büyük, tane rengi amber, tane şekli oval, 1000 tane ağırlığı g, protein oranı %12, yatmaya karşı dayanıklılığı iyidir, tane dökmeye karşı dayanıklılığı iyidir, hastalıklara karşı dayanıklılığı ise yapraktaki kahverengi pas hastalığına karşı orta dayanıklı, yapraktaki sarı pas hastalığına dayanıklıdır, ekmeklik kalitesi iyidir bir hektar için önerilen tohum miktarı sulanan yerlerde kg sulanabilen yerlerde kg, verimi kurak koşullarda kg / ha, sulanabilen yerlerde kg / ha kadardır. İyi yağış alan ve sulanabilen bölgelere önerilmektedir. İba 99 Müseccel: İba Ziraat ve Araştırma Merkezi tarafından 1997 yılında geliştirilmiş ve tescil edilmiştir. Çiçeklenme süresi ekimden itibaren 125 gündür. Olgunlaşma süresi 165 gün, bitki boyu 110 cm, başakta tane sayısı 65, başak rengi sarı, başak şekli burgulu ve eğik, kılçık boyu 6.5 cm, tane hacmi orta, tane rengi amber, tane şekli oval, 1000 tane ağırlığı g, yatmaya karşı dayanıklılığı çok iyidir, tane dökmeye karşı dayanıklılığı yüksektir, protein oranı %14, hastalıklara karşı dayanıklılığı, paslara karşı dayanıklıdır ve bazı böceklere karşı da dayanıklıdır. Bir hektar için önerilen tohum miktarı kg. Verimi 5344 kg / ha kadardır. İyi yağış alan ve sulanabilen bölgelere önerilmektedir. İba 99 Musaddak: İba Ziraat ve Araştırma Merkezi tarafından 1995 yılında geliştirilmiştir. Melezleme yöntemiyle elde edilmiş. Çiçeklenme süresi Mart, 20

30 olgunlaşma süresi mayıs ortasındadır. Bitki boyu 110 cm, başak uzunluğu 11.5 cm, başakta tane sayısı 60, başak rengi sarı, kılçık boyu 5 cm, tane dökmeye karşı dayanıklılığı iyi, yatmaya karşı dayanıklılığı çok iyi, tane rengi amber, tane şekli oval, tane hacmi orta, hastalıklara karşı dayanıklılığı, pas hastalıklarına karşı dayanıklıdır tane ağırlığı 38-42g, protein oranı %12, bir hektar için önerilen tohumluk miktarı kg. İyi yağış alan ve sulanabilen bölgelere önerilmektedir. 3.2 Yöntem Olgunlaşmış embriyolarda kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu kapasitelerinin araştırılması amacıyla yapılan bu çalışmada yöntem; eksplant hazırlılığı, sterilizasyon, ortam hazırlığı, embriyoların çıkarılmaları, saksıya aktarma çalışmaları ve fotoğraf çekimleri başlıkları altında ele alınmıştır Eksplant hazırlığı Laboratuar çalışmasının en önemli aşamalarından birini eksplant hazırlığı oluşturmaktadır. Eksplant hazırlığı, başlangıcı ve en önemli aşamalarından biri olarak in vitro temelini oluşturmaktadır. Bunun için, araştırmada kullanılan Irak, Temuuz 2, Eliz 66, İba 99 Musaddak ve İba 99 Müseccel çeşitlerinin iri tohumları seçilmiştir (Sayar vd. 1999) ve yüzey sterilizasyonu aşamasına alınmıştır. Olgunlaşmış embriyo eksplantlarında farklı şekilde hazırlık yapılmış, yüzey sterilizasyonunun başarılı bir şekilde yürütülebilmesi için zemin hazırlanmıştır. Olgunlaşmış embriyolarda kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu sağlamak için öncelikle tohum ön hazırlığı yapılmıştır. 21

31 3.2.2 Sterilizasyon Tüm çalışmaların yapılacağı steril kabinin, kabinde kullanılacak malzemelerin ve eksplantların sterilizasyonu yapıldı. Steril kabin her çalışma öncesinde etil alkolle silindi ve boş olarak 10 dakika çalıştırıldı. Ayrıca her çalışma öncesinde çalışma sırasında kullanılacak malzemeler, eksplant ve saf su sterilizasyon kuralları doğrultusunda steril edilmiştir Malzemelerin sterilizasyonu Doku kültürü laboratuarında steril kabin içerisinde kullanılan tüm malzemeler steril edilmiş olmalıdır. Bunun için, malzemenin özelliğine göre çalışmaya başlamadan belirli süre önce tümü steril edildi. Malzemelerin sterilizasyonu ısı ya da buhar basıncı kullanılarak yapıldı ve ısıya dayanıklı cam kaplar tercih edilmiştir. Petri ve jarların sterilizasyonu için kaplar, yanmaz kâğıtlara sarılı olarak kuru sterilizatörde 180 C de 2 saat bekletilmiştir. Bunun sonunda kağıtlara sarılı olarak, steril kabin içine konulmuş ve gerektiği zaman kağıtlardan çıkarılarak kullanılmıştır. Steril kabin içerisinde gerçekleştirilen bütün işlemlerde kullanılan malzemelerin steril olmasına özen gösterildi. Bu amaçla cam malzemelerin sterilizasyonundan farklı olarak kabinde kullanılan pens, bisturi ve kaşık v.b. malzemelerin sterilizasyonu için malzemeler steril kabine yerleştirilmeden önce %70 lik etil alkolle yıkanmış ve yine içinde etil alkol bulunan kavanoza konulmuştur. Kullanım sırasında da sterilitenin sağlanması amacıyla, malzemeler sık sık alkolden ve kabinin içindeki sürekli yanan doğalgaz alevinden geçirilerek kullanılmıştır (Özgen vd. 1998). 22

32 Steril saf su hazırlanması Musluk suyunda erimiş minerallerin olması çalışmalarda kullanılan ortam formüllerindeki besin maddelerin hassas dengesini bozucu yönde etki ederken, sudaki klor da toksik etkide bulunarak kültürün gelişmesini engellemektedir. Laboratuar çalışmalarında en çok kullanılan madde saf sudur. Saf su, en çok kullanılan yöntem olan destilasyonla elde edilmiştir. Suyun kaynatılıp buharının soğutulması esasına dayanan bu yöntemle elde edilen saf su, laboratuar çalışmalarının her aşamasında kullanılmıştır. Saf su ağzı kapatılabilen cam kaplara doldurularak otoklavlanma için hazır hale getirilmiştir. Su buharı basıncıyla sterilizasyon prensibine dayanan otoklavda, cam kaplar ağızları gevşek şekilde 121 C de 15 psi basınç altında 25 dakika tutularak sterilizasyonu sağlanmış ve böylece steril saf su elde edildi. 25 dakika sonunda otoklavdan çıkarılırken ağızları kapatılan sular soğuduktan sonra kullanılmıştır Eksplantların yüzey sterilizasyonu Olgunlaşmış tohumlarda yüzey sterilizasyonu, tamamen steril kaplar içinde steril kabinde yapılmıştır. Yüzey sterilizasyonu için steril kabin içerisine manyetik karıştırıcı, steril bir beher, içerisinde steril pens ve bistüri ile %70 lik etil alkol bulunan cam kavanoz ve içerisinde yine %70 lik alkol bulunan pisetlerden yararlanılmıştır. Yüzey sterilizasyonunda ilk aşamada tohumlar manyetik karıştırıcı üzerinde %70 lik etil alkol içerisinde 5 dakika bekletilmiş ve 3 kez steril saf suyla durulanmıştır. Durulama sırasında her çalkalama 30 saniyede tamamlanmıştır. Ardından yine manyetik karıştırıcı üzerinde ticari çamaşır suyu (sodyum hipoklorit, %5) içerisinde 30 dakika bekletildi ve 7 defa steril saf su ile durulanmıştır. 23

33 Yüzey sterilizasyonu sonunda, tohumlar embriyo çıkarma işlemenin kolay olması amacıyla yine steril kabin içerisinde ağzı alüminyum kağıt ya da streç filmle kapatılarak steril saf su içerisinde 33 C yaklaşık 2 saat süreyle bekletildiler (Özgen vd. 1998) Ortam hazırlılığı Ortam, belirli organik, inorganik ve diğer maddelerden oluşan bitki üretimi ya da kallus oluşumu gibi doku kültürü koşullarında kullanılan karışımdır. Ortam hazırlamada kimyasal maddeler çok küçük miktarlarda hazırlandığından, her seferinde bunları hazırlamak sorun yaratmaktadır. Bunun için kullanımı daha kolay olan belli yoğunluklardaki stok çözeltiler hazırlanmakta ya da hazır ortamlar kullanılmaktadır. Bu çalışmada MS ortamı kullanılmıştır Kallus ortamının hazırlanması Kallus oluşumu, manyetik karıştırıcı üzerinde yerleştiren beher içerisinde hazırlanmıştır. Olgunlaşmış embriyolarda kallus oluşumu için 2 mg/l 2,4-D, 20 g/l sukroz, 7 g/l agar, 4.43g/l MS ortamı kullanılmıştır ve ortamın ph sı 5.8 e ayarlanmıştır. Hazırlanan karışımlar otoklavda 121 C de, 15 psi basınç altında 45 dakika tutularak steril edilmiştir. Otoklavdan çıkarılan ortamlar steril kabinde daha önceden steril edilmiş, 10 cm lik petri kaplarına dökülerek, katılaşması beklenmiş, böylece ortamlar kullanıma hazır hale getirilmiştir Rejenerasyon ortamı hazırlığı Olgunlaşmış embriyolardan elde edilen kalluslardan sürgün ve kök oluşumunu ve gelişimini sağlamak için rejenerasyon ortamı hazırlanmıştır. Manyetik karıştırıcıda hazırlanarak ortama 20 g/l sukroz, 7 g/l agar ile 4.43 g/l MS ilave edilerek ph sı 5.8 e ayarlanmıştır. Otoklavlanan ortam 10 cm lik petri kaplarına dökülmüş ve katılaşması beklenmiştir. 24

34 3.2.5 Embiryoların çıkarılması ve kallus ortamına yerleştirilmesi Sterilizasyonu tamamlanmış embriyoların, canlılıkları bozulmadan tohumlarından ayrılması ve daha önceden hazırlanmış ortamlarına aktarılması büyük önem taşımaktadır. İki saat süreyle suda bekletilen olgunlaşmış steril tohumlardan pens ve bistüri yardımıyla embriyolar çıkarılarak kalkancık tarafi ortama değmeyecek şekilde kallus ortamı içeren petri kaplarına yerleştirilmiştir. Petri kaplarının kapakları kapatılarak etrafı streç filmle sıkıca sarılmıştır. Bu şekilde hazırlanan olgunlaşmış embriyolar ışığı ve ısısı ayarlanabilen inkübatörde karanlık koşullarda 26 C de 14 gün süreyle tutulmuştur Rejenerasyon çalışmaları Kallus oluşumunu tamamlamış olan 14 günlük olgunlaşmış embriyolar rejenerasyon sağlanması amacıyla hazırlanan ortamlara aktarılmıştır. Kalluslar rejenere hale gelebilmeleri için kültür odasına yerleştirilmiş. Kalluslar, burada 30 gün süreyle, 16 saatlik fotoperiyodda (1500 lux) ve 25 ±1 C sıcaklıkta tutularak, sürgün gelişimi saptanmıştır. 30 gün sonunda mm yüksekliğe ulaşan rejenere bitkicikler kültür odasında magenta kapları içinde aynı ortamlarda 25 C sıcaklıkta, 16 saatlik fotoperiyodda (1500 Lux) 30 gün süreyle yetiştirilmiştir. İkinci bir 30 günün sonunda bitkicikler cm yüksekliğine ulaşmış ve rejenerasyonu tamamlamışlardır. 25

35 3.2.7 Alıştırma (Aklimatizasyon) çalışmaları Kültürdeki bitkilerin toprağa aktarılması ve yaşamını sürdürmesi oldukça güç olduğunda kültürlerin alıştırılması (aklimatizasyonu) gerekmektedir. In vitro koşullarda yetiştirilen bitkiler normal koşullara alındığında aşırı derece su kaybetmektedir. Bunu önlemek amacıyla bitki normal ortama alındığında aşırı nemli bir geçiş döneminde alıştırılması yapılmaktadır. Kültür odasında magenta kapları içerisinde cm yüksekliğe ulaşan bitkicikler, iklim odasına alınmıştır. Bitkicikler 1;1;3 oranında kum, perlit ve turba toprağı karışımından oluşan saksılara aktarılarak 25 ±1 C de 16 saatlik fotoperyatta 30 gün süreyle büyütülmüştür. %90 la başlayan ortam nemi periyodik olarak azaltılarak normal koşullara indirilmiş ve 30 gün sonunda yaşayan bitkiler seraya alınmıştır. Bu aşamada bazı bitkilerin başak oluşturduğu saptanmıştır Fotoğraf çekimleri Çalışmaların her Aşamasında elde edilen sonuçların fotoğrafları çekilmiştir. Çekimler, sırasında özel alet ve ekipmana gereksinim duyulduğundan Tarla Bitkileri Bölümü Fotoğraf Odası olanaklarından yararlanılmıştır. Fotoğrafların çekiminde SRL (Single Lens Reflex) fotoğraf makinesi, 125 siyah beyaz ve 100 asalık renkli film kullanılmıştır Verilerin elde edilmesi Kallus oluşumu, kültürün ondördüncü gününde her petride kallus oluşturan embriyoların sayısının toplam embriyo sayısına oranlanmasıyla, Kallus ağırlığı, kültürün ondördüncü gününde embroyolarda oluşan kallusların tartılmasıyla, Rejenerasyon kapasitesi, rejenere olan kallus sayısının kallus oluşturan embriyo sayısına oranlanmasıyla, 26

36 Kültür etkisi, rejenere olan kallus sayısının ortama alınan toplam embriyo sayısına oranlanmasıyla, Bitki sayısı, sürgün ve kökü olan ve toprağa aktarılan bitkilerin sayılması ile elde edilmiştir Verilerin değerlendirilmesi Olgun embriyoların eksplant olarak kullanıldığı denemede her petriye 20 tohum 4 tekrarlı olarak konulmuştur. Elde edilen verilerle istatistik analizleri, MSTAT programı kullanılarak yapılmıştır. Deneme faktöriyel deneme desenine göre 4 tekrarlamalı olarak kurulmuştur. Çeşitler arasındaki farklılığın belirlenmesinde varyans analizi ve AÖF testinden yararlanılmıştır (Düzgüneş vd. 1983). 27

37 4 BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1 Buğday Çeşitlerinin Kallus Oluşturma Oranı Kallus oluşumu, beş farklı ekmeklik buğday çeşitlerinin embriyolarını 8 mg/l 2,4-D ortamına yerleştirerek 26 C de kültüre alınması ve 14 gün sonra kallus oluşturan embriyolar (Şekil 4.1) sayılıp toplam embriyo sayısına oranlamasıyla bulunmuştur. Elde edilen verilerle yapılan varyans analizi sonuçları Çizelge 4.1 de verilmiştir. Çizelge 4.1 Buğday çeşitlerinin kallus oluşturma oranına ilişkin varyans analizi sonuçları. V. K. S.D. K.T. K.O. F Tekerrür Çeşitler ** Hata Genel toplam ** : %1 düzeyinde önemli Çizelge 4.1 de görüldüğü gibi kallus oranı bakımından çeşitler arasında farklılığın %1 düzeyinde önemli çıktığı görülmektedir. Çeşitler arasında farklılığı belirlemek için yapılan AÖF sonuçları da Çizelge 4.2 de verilmiştir Çizelge 4.2 Buğday çeşitlerinin kallus oluşturma oranına ilişkin sonuçlar (%). Çeşitler Ortalama % 5 % 1 Temmuz ± 2.86 AB A Irak ± 2.50 B AB Eliz ± 2.50 C B İba 99 Müseccel ± 2.50 B AB İba 99 Musaddak ± 2.50 A A %5 AÖF: %1 AÖF:

38 Çizelge 4.2 incelendiğinde çeşitlerin kallus oranlarının % (Eliz 66) (İba 99 musaddak) arasında değiştiği görülmektedir. Çeşitler % 5 e göre 3 farklı grup, % 1 e göre de 2 grup oluşturmuştur. Kallus oluşturma oranının genotiplere bağlı değişiklikler gösterdiği bu çalışmanın sonucundan da saptanmıştır. Benzer sonuçlar, 8 ekmeklik buğdayda yaptıkları araştırmada Tuberosa et al. (1988), 7 kışlık buğday genotipi ile çalışan Özgen vd. (1996), 12 kışlık buğday genotipi ile çalışan Özgen vd. (1997), diploid, tetraploid ve hekzaploid buğdaylarda çalışan Sayar vd. (1999), sekiz kışlık buğday çeşidi ile çalışan Keresa et al. (2004) tarafından da belirlenmiştir. Sonuçlarımız adı geçen araştırıcıların sonuçları ile uyum içindedir. 29

39 a b c d e Şekil 4.1 Buğdayda farklı çeşitlerin olgun embriyolarından kallus gelişimi a.temmuz2, b. Irak, c. Eliz 66, d. İba 99 Müseccel, e. İba 99 Musaddak 30

40 4.2 Buğday Çeşitlerinin Kallus Ağırlığı Uygun ortama yerleştirilen tohumlardan oluşan kalluslar 11 gün sonunda tartılarak ağırlıkları bulunmuştur. Beş farklı ekmeklik buğday çeşidinin olgun embriyolarından elde edilen kallus ağırlığına ilişkin varyans analizi sonuçları çizelge 4.3 te verilmiştir. Çizelge 4.3 Buğday çeşitlerinin kallus ağırlığına ilişkin varyans analizi sonuçları. V. K. S.D. K.T. K.O. F Tekerrür Çeşitler ** Hata Genel Toplam ** : %1 düzeyinde önemli Çizelge 4.3 te de görüldüğü gibi kallus ağırlığı bakımından çeşitler arasında farklılığın %1 düzeyinde önemli çıktığı görülmektedir. Çeşitler arasında farklılığı belirlemek için yapılan AÖF sonuçları da çizelge 4.4 de verilmiştir. Çizelge 4.4 Buğday çeşitlerinin kallus ağırlığına ilişkin sonuçlar (g). Çeşitler Ortalama % 5 % 1 Temmuz ± A A Irak ± B B Eliz ± B B İba 99 Müseccel ± B B İba 99 Musaddak ± B B %5 AÖF: %1 AÖF: Çizelge 4.4 incelendiğinde çeşitlerin kallus ağırlığı g (Temmuz2) ile g (Eliz 66) arasında değiştiği görülmektedir. Çeşitler hem % 5 hem de % 1 e göre iki 31

41 farklı grup oluşturmuşlardır. Temmuz 2 çeşidi her iki gruplandırmada da diğe çeşitlerden farklı olmuştur. Bulgularımız, 8 ekmeklik buğday çeşidinde yaptıkları araştırmada Tuberosa et al. (1988), farklı buğday çeşitlerinde saptadıkları sonuçlarda Bommineni and Jauhar (1996), üç yazlık buğday çeşidinde yaptıkları çalışmada Bahieldin et al. (2000), makarnalık buğday çeşitlerinde olgunlaşmamış çiçek taslağından ve koleoptilden kallus elde ettikleri çalışmalarında Benkirane et al. (2000), ayrıca Delporte et al. (2001), Zale et al. (2003) yaptıkları çalışmada elde ettikleri sonuçlarla benzerlik göstermektedir. 4.3 Buğday Çeşitlerinin Rejenerasyon Kapasitesi Hormonsuz besi yerine alınan kalluslar 26 C de 16 saat karanlık, 8 saat aydınlık fotoperyot ortamına geçirilmişlerdir. Işıklı ortama geçen kalluslardan hızla sürgün ve kök oluşumu başlamıştır (Şekil 4.2). Işıklı ortama alındıktan sonra 4 hafta sonra rejenere olan kallusların ortama konulan toplam kallus sayısına oranlanmasıyla elde edilen rejenerasyon kapasitesine ilişkin varyans analizi sonuçları Çizelge 4.5 te verilmiştir. Çizelge 4.5 Buğday çeşitlerinin rejenerasyon kapasitesine ilişkin varyans analizi sonuçları V. K. S.D. K.T. K.O. F Tekerrür Çeşitler * Hata Genel Toplam *: %5 düzeyinde önemli Çizelge 4.5 de de görüldüğü gibi rejenerasyon kapasitesi bakımından çeşitler arasında farklılığın %5 düzeyinde önemli çıktığı görülmektedir. Çeşitler arasında farklılığı belirlemek için yapılan AÖF sonuçları da çizelge 4.6 da verilmiştir. 32

42 Çizelge 4.6 Buğday çeşitlerinin rejenerasyon kapasitesine ilişkin sonuçlar (%). Çeşitler Ortalama % 5 % 1 Temmuz ± 3.20 A A Irak ± 2.50 AB A Eliz ± 8.61 B AB İba 99 Müseccel ± 0.00 AB AB İba 99 Musaddak ± 2.50 A B %5 AÖF: %1 AÖF: Çizelge 4.6 incelendiğinde çeşitlerin rejenerasyon kapasitesi en düşük % ile Eliz 66 çeşidinde, en yüksek ise % ile İba 99 Musaddak çeşidinde elde edilmiştir. Çeşitler % 5 göre 2 farklı grup, % 1 göre de 2 farklı gruba ayrılmışlardır. Farklı buğday çeşitlerinin olgun embriyolarından gelişen kalluslardan sürgün rejenerasyonun değişiklikler gösterdiği bu çalışmanın sonucundan da elde edilmiştir. Benzer sonuçlar, buğdayda yaptıkları araştırmada Abd-el Maksoud et al. (1993), Bommineni and Jauhar (1996), kışlık buğday çeşitlerinde olgunlaşmamış embriyolarla çalışan Özgen vd. (1996), üç yazlık buğday çeşidi ile yaptıkları çalışmada Bahieldin et al. (2000) tarafından da saptanmıştır. 33

43 a b c d e Şekil 4.2 Farklı buğday çeşitlerinin olgun embriyolarından gelişen kalluslardan sürgün rejenerasyonu a. Temmuz 2, b. Irak, c. Eliz 66, d. İba 99 Müseccel, e. İba 99 Musaddak 34

44 4.4 Buğday Çeşitlerinin Kültür Etkisi Beş farklı ekmeklik buğday çeşidinde; rejenere kallus sayısının kültürün başında ortama konulan toplam embriyo sayısına oranlamasıyla elde edilen kültür etkisine ilişkin varyans analizi sonuçları Çizelge 4.7 de verilmiştir. Çizelge 4.7 Buğday çeşitlerinin kültür etkisine ilişkin varyans analizi sonuçları V. K. S.D. K.T. K.O. F Tekerrür Çeşitler ** Hata Genel Toplam ** : %1 düzeyinde önemli Çizelge 4.7 de de görüldüğü gibi kültür etkisi bakımından çeşitler arasında farklılığın %1 düzeyinde önemli çıktığı görülmektedir. Çeşitler arasında farklılığı belirlemek için yapılan AÖF sonuçları da çizelge 4.8 de verilmiştir. Çizelge 4.8 Buğday çeşitlerinin kültür etkisine ilişkin sonuçlar (%). Çeşitler Ortalama % 5 % 1 Temmuz ± 8.66 AB A Irak ± 0.00 BC AB Eliz ± 8.66 C B İba 99 Müseccel ± 2.50 AB AB İba 99 Musaddak ± 2.88 A A %5 AÖF: %1 AÖF: Çizelge 4.8. incelendiğinde çeşitlerin kültür etkisi bakımından çeşitler % ile % arasında değişim göstermişlerdir. En yüksek değer (97.50) İba 99 Musaddak çeşidinde belirlenirken buna en yakın değeri %92.50 ile Temmuz 2 çeşidi göstermiştir, 35

45 en düşük değer (%77.50) ise Eliz 66 çeşidinde elde edilmiştir. Yapılan AÖF gruplandırmasında çeşitler %5 göre 3 grup, %1 göre de 2 gruba ayrılmışlardır. Kültür etkisinin genotiplere bağlı olarak değiştiğini gösteren sonuçlarımız; bu konuda daha önce farklı buğday genotipleri üzerinde sürdükleri araştırmada Makddock et al. (1983), Batı Asya ve Kuzey Afrika dan elde edilen bazı buğday genotiplerinde anter kültürü çalışmalarında, genotipler arasında varyasyan gözlendiğini belirten Lashermes et al. (1990), buğdayda yaptıkları çalışmada anter kültüründe genotip ve ortamın etkisini inceleyen Abd-el Maksoud et al. (1993), 10 buğday genotipi ile yaptıkları çalışmalarında anter kültürü, rejenerasyon oranının genotiplere bağlı olarak %0 ile %13 arasında değiştiğini saptayan Hatipoğlu vd. (1994), Turbo and Nandu yazlık buğday çeşitlerinde yaptıkları araştırmada, bitki rejenerasyonunun sadece embriyogenesis yoluyla gerçekleştiğini belirten Viertel and Hess (1996), in vitro kültürde 6 yazlık buğday çeşidine ait bitkilerin olgun tohumlarıyla sürdükleri araştırmada kök büyümesi ve genç bitkilerin büyüme hızları arasında farklılıkları gözleyen Xiayi et al. (1997), buğdayda yaptıkları araştırmada olgunlaşmamış embriyolardan kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu elde eden Haliloğlu nun (2002), bulgularıyla uyum göstermektedir. 4.5 Toprağa Aktarılan Bitki Sayısı Rejenerasyon ortamında mm gelişen sürgünler kök oluşumu için cam kavanozlara (Şekil 4.3) ve bir ay sonra toprağa aktarılmıştır. Toprağa aktarılan bitkiler iklim odasına belli bir süre alıştırma aşamasında saksılarda tutularak vernalizasyon gereksinimi karşılanan bitkiler başak oluşturabilmişlerdir (Şekil ). Toprağa aktarılan sürgün ve kökü bulunan bitkiler sayılarak elde edilen verilerle yapılan varyans analizi sonuçları Çizelge 4.9 da verilmiştir. 36

46 Çizelge 4.9 Toprağa aktarılan bitki sayısına ilişkin varyans analizi sonuçları V. K. S.D. K.T. K.O. F Tekerrür Çeşitler ** Hata Genel Toplam ** : %1 düzeyinde önemli Çizelge 4.9 da da görüldüğü gibi bitki sayısı bakımından çeşitler arasında farklılığın %1 düzeyinde önemli çıktığı görülmektedir. Çeşitler arasında farklılığı belirlemek için yapılan AÖF sonuçları da çizelge 4.10 da verilmiştir. Çizelge 4.10 Toprağa aktarılan bitki sayısına ilişkin sonuçlar. Çeşitler Ortalama % 5 % 1 Temmuz ± A A Irak ± B B Eliz ± B BC İba 99 Müseccel ± C CD İba 99 Musaddak ± C D %5 AÖF: 2.52 %1 AÖF: Çizelge 4.10 incelendiğinde buğday çeşitlerinde toprağa aktarılan bitki sayısı en düşük ile İba 99 Musaddak çeşidinde, en yüksek ile Temmuz 2 çeşidinde elde edilmiştir. Diğer çeşitler bu değerler arasında yer almıştır. Çeşitler AÖF gruplandırmasında % 5 e göre 3, % 1 e göre de 4 grupta toplanmışlardır. Rejenere bitki sayısının genotipe göre değiştiğini gösteren bulgularımız, Bregitzer et al. (1991), 6 yazlık buğday çeşidi ile in vitro kültürde bitkilerin olgun tohumlarıyla yaptıkları araştırmada, kök büyümesi ve genç bitkilerin büyüme hızları arasında 37

47 farklılıklar olduğunu belirleyen Xiayi et al. (1997), Bered et al. (1998), olgunlaşmamış embriyolarda yaptıkları çalışmada, değişik ortamlara göre farklı bitki oluşumu gözleyen Tahiliani and Kothari (2004) un sonuçlarıyla uyumludur. 38

48 a b c d e Şekil 4.3 Farklı buğday çeşitlerinde gelişen sürgünlerin köklendirilmesi a. Temmuz 2, b. Irak, c. Eliz 66, d. İba 99 Müseccel, e. İba 99 Musaddak 39

49 a b c Şekil 4.4 Köklenen bitkilerin saksılarda yetiştirilmesi a. Irak, b. İba 99 Müseccel, c. İba 99 Musaddak 40

50 A B Şekil 4.5. Saksılarda başak oluşturan bitkiler a. Irak, b. İba 99 Müseccel 41