KANSER İLACI 5-FLUOROURASİL İN POLİMERİK NANOKÜRELERDEN KONTROLLÜ SALIMI. Aslı KAHRAMAN YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA

Transkript

1 KANSER İLACI 5-FLUOROURASİL İN POLİMERİK NANOKÜRELERDEN KONTROLLÜ SALIMI Aslı KAHRAMAN YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ OCAK 2014 ANKARA

2 Aslı KAHRAMAN tarafından hazırlanan KANSER İLACI 5-FLUOROURASİL İN POLİMERİK NANOKÜRELERDEN KONTROLLÜ SALIMI adlı bu tezin Yüksek Lisans Tezi olarak uygun olduğunu onaylarım. Prof. Dr. Oya ŞANLI Tez Danışmanı, Kimya Anabilim Dalı. Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile Kimya Anabilim Dalında Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Mehlika PULAT Kimya Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi Prof. Dr. Oya ŞANLI Kimya Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi Prof. Dr. Mehmet SAÇAK Kimya Anabilim Dalı, Ankara Üniversitesi Tez Savunma Tarihi: 20/01/2014 Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans derecesini onamıştır. Prof. Dr. Şeref SAĞIROĞLU Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü

3 TEZ BİLDİRİMİ Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. Aslı KAHRAMAN

4 iv KANSER İLACI 5-FLUOROURASİL İN POLİMERİK NANOKÜRELERDEN KONTROLLÜ SALIMI (Yüksek Lisans Tezi) Aslı KAHRAMAN GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Ocak 2014 ÖZET Bu çalışmada, urasil türevi bir antikanser ilaç olan 5-Fluorourasil i hapsetmek ve adsorplamak üzere magnetit içeren kitosan/metilselüloz (CS/MC) nanoküreler hazırlandı. Nanoküreler emülsiyon çapraz bağlama yöntemi ile çapraz bağlayıcı olarak glutaraldehit kullanılarak hazırlandı. Hazırlanan nanoküreler fourier transform infrared (FTIR) spektroskopi, diferansiyel tarama kalorimetri (DSC), geçirimli elektron mikroskopi (TEM), zeta potansiyel ve zetasizer ile karakterize edildi. Nanoküreler ayrıca denge şişme değerleri ve salım profilleri ile tanımlandı. Salım çalışmaları ph 7,4 ortamında altı saat süre ile 37 o C da gerçekleştirildi. Her iki yöntem içinde çapraz bağlayıcı derişimi, çapraz bağlama süresi, polimer/polimer oranı (p/p) gibi değişkenlerin salım yüzdesi, tutuklama verimi ve şişme kapasitesi üzerine etkileri incelendi. En iyi koşullar olarak belirlenen çapraz bağlayıcı derişimi 0,11 M, çapraz bağlama süresi 5 dakika, magnetit içeriği %100, CS/MC oranı 4/1 de salım; hapsetme yönteminde (i/p: 1/8) %100 ve adsorplama yönteminde %46 olarak bulundu. Bilim Kodu : Anahtar Kelimeler : Kitosan, metil selüloz, magnetit, 5-fluorourasil, kontrollü salım, nanoküre. Sayfa Adedi : 71 Tez Yöneticisi : Prof. Dr. Oya ŞANLI

5 v CONTROLLED RELEASE OF ANTICANCER DRUG 5-FLUOROURACIL FROM POLYMERIC NANOSPHERES (M.Sc. Thesis) Aslı KAHRAMAN GAZI UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES January 2014 ABSTACT In this study, magnetite containing chitosan/methylcellulose (CS/MC) nanospheres were prepared to encapsulate and to adsorb 5-fluorouracil which is a uracil derivative, anticancer drug. Nanospheres were prepared by emulsion crosslinking method using glutaraldehyde as crosslinker. The prepared nanospheres were characterized by fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, differential scanning calorimetry (DSC), transmision electron microscopy (TEM), zeta potential and zetasizer. Nanospheres were also characterized by equilibrium swelling values and release profiles. The release studies were performed in ph 7.4 media for six hours at 37 o C. Effect of variables as crosslinker concentration, time of crosslinking, polymer/polymer ratio (p/p) on the release percentage, entrapment efficiency and swelling capacity were examined for both methods. 5-FU release percentages were 100% for encapsulation technique (d/p: 1/8) and 46% for adsorption technique for the optimized conditions of the crosslinker concentration of 0.11 M, crosslinking time of 5 minutes, magnetite content of 100%, CS/MC ratio of 4/1. Science Code : Key Words :Chıtosan, methyl cellulose, magnetite, 5-fluorouracil, controlled release, nanospheres. Page Numbers : 71 Supervisor : Prof. Dr. Oya ŞANLI

6 vi TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim boyunca engin bilgi ve tecrübesi ile beni yönlendiren ve desteğini hep hissettiğim değerli hocam Sayın Prof. Dr. Oya ŞANLI ya çok teşekkür ederim. Deneylerim süresince laboratuarında sağlamış olduğu cihaz desteğinden dolayı Sayın Prof. Dr. Belma ASLIM a teşekkür ederim. Tez çalısmam süresince tecrübelerinden faydalandığım, manevi desteğini eksik etmeyen sevgili hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Ebru KONDOLOT SOLAK a göstermiş olduğu tüm ilgi ve yardımlarından dolayı teşekkür ederim. Deneylerim süresince ve tez yazım aşamasında tüm sıkıntılarıma ortak olan ayrıca yaşamış olduğum tüm zorluklarda yanımda olarak benden desteklerini esirgemeyen, mutluluğu, sevinci, hüznü, kederi beraber paylaştığımız ve her daim dostlukları benim için kıymetli olan canlarım Seda KAYHAN, Merve OLUKMAN ve Nurbanu ÖZDEM e çok teşekkür ederim. Hayatımın her döneminde olduğu gibi yüksek lisans eğitimim boyunca tüm kararlarımın arkasında durarak beni destekleyen, fedakarlıklarından ve özverilerinden dolayı haklarını hiçbir zaman ödeyemeyeceğim babam İsmail KAHRAMAN, annem Şahide KAHRAMAN ve kardeşim Tuncer KAHRAMAN a sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

7 vii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... iv ABSTRACT.v TEŞEKKÜR vi İÇİNDEKİLER... vii ÇİZELGELERİN LİSTESİ......x ŞEKİLLERİN LİSTESİ...xi SİMGELER VE KISALTMALAR...xiii 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Kontrollü Salım Sağlayan Sistemleri Tanım ve terminoloji Kontrollü salım sistemlerinin klasik ilaç salım sistemlerine göre avantajları ve dezavantajları Kontrollü salım sistemlerinin sınıflandırılması İlaç salım kinetiği Kullanılan etken madde ve destek materyalleri Fluorourasil Kitosan Metil selüloz MATERYAL VE METOT Materyal Kimyasal maddeler... 30

8 viii Sayfa Kullanılan cihazlar Yöntem Magnetitin hazırlanması Fluorourasil yüklü nanokürelerin hazırlanması Adsorpsiyon yöntemiyle 5-FU yüklü nanokürelerin hazırlanması Nanokürelerden 5-FU salım çalışması Nanokürelerin denge su içeriklerinin tayini Tutuklanma verimi SONUÇLAR VE TARTIŞMA Magnetit İçeren CS ve MC Kullanılarak Hazırlanan Nanokürelerin DSC Termogramları Magnetit, CS, MC ve A 1b Formülasyonlu Boş Nanokürenin FTIR Spektrumları Hazırlanan Nanokürelerin Zeta Potansiyeli ve Tanecik Boyutu Dağılımları Magnetit İçeren CS ve MC Kullanılarak Hazırlanan Nanokürelerin XRD spektrumları Hazırlanan Nanokürelerin Geçirimli Elektron Mikrograf Görüntüleri Magnetit İçeren CS/MC Nanokürelerden 5-Fluorourasilin Kontrollü Salımı Çapraz bağlayıcı derişiminin 5-FU salımı üzerine etkisi Çapraz bağlama süresinin 5-FU salımı üzerine etkisi CS/MC nanokürelerde magnetit miktarındaki değişimin 5-FU salımı üzerine etkisi Magnetit içeren CS/MC nanokürelerde CS/MC oranının 5-FU salımı üzerine etkisi...50

9 ix Sayfa Magnetit içeren CS/MC nanokürelerde ilaç/polimer oranının 5-FU salımı üzerine etkisi Adsopsiyon Yöntemi Kullanılarak 5-FU Tutuklanan Nanokürelerden 5-FU Salımı Çapraz bağlayıcı derişiminin adsorpsiyon yönteminde 5-FU salımı üzerine etkisi Çapraz bağlama süresinin adsorpsiyon yönteminde 5-FU salımı üzerine etkisi Magnetit miktarındaki değişimin adsorpsiyon yönteminde 5-FU salımı üzerine etkisi CS/MC oranının adsorpsiyon yönteminde 5-FU salımı üzerine etkisi Magnetit içeren CS/MC nanokürelerin denge şişme değerleri Magnetit içeren CS/MC nanokürelerinin % tutuklama verimi değerleri Kinetik sonuçlar SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR EKLER EK-1 Kalibrasyon grafiği ÖZGEÇMİŞ 70

10 x ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Kontrollü salım yapan polimerik sistemlerin sınıflandırılması..10 Çizelge Farklı geometrik şekiller için n parametresinin değerleri ve salım mekanizmaları Çizelge 2.3. Kitosanın teknik üretim koşulları Çizelge 2.4. Kitin, kitosan ve türevlerinin uygulama alanları 26 Çizelge Fluorourasil yüklü magnetit içeren CS/MC nanokürelerin hazırlama koşulları.. 33 Çizelge 3.2. Magnetit içeren CS/MC boş nanokürelerin hazırlama koşulları. 34 Çizelge 4.1. Tutuklama veriminin glutaraldehit derişimi ile değişimi Çizelge 4.2. Denge su içeriğinincs/mc oranı ile değişimi 51 Çizelge 4.3. Değişik formülasyonlarda hazırlanan boş CS/MC nanokürelerin % denge şişme değerleri..57 Çizelge 4.4. Magnetit içeren CS/MC değişik formülasyonlardaki nanokürelerin % tutuklama verimleri Çizelge 4.5. Adsorpsiyon yönteminde kullanılan nanokürelerin % tutuklama verimleri..59 Çizelge 4.6. Magnetit içeren CS/MC yapılı nanokürelere ait kinetik sonuçlar..60 Çizelge 4.7. Adsorpsiyon yönteminde kullanılan nanokürelere ait kinetik sonuçlar.60

11 xi ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 2.1. Kontrollü salım yapan, uzatılmış etkili ve klasik salım yapan salım sistemleri için etkin madde kan düzeyi-zaman eğrileri arasındaki farklılık...6 Şekil 2.2. Difüzyon kontrollü sistemlerin şematik görünümü Şekil 2.3. Kimyasal kontrollü sistemlerin şematik görünümü Şekil 2.4. Çözücünün harekete geçirdiği sistemlerin şematik görünümü Şekil Fluorourasil in kimyasal yapısı Şekil 2.6. a) Urasilin, b) 5-Fluorourasilin kimyasal yapısı Şekil Fluorourasilin etki mekanizmasının şematik gösterimi Şekil 2.8. Kitin ve kitosanın yapısal formülü Şekil 2.9. Kitinin deasetilasyonu Şekil Metil selülozun yapısı Şekil 4.1. (a) MC, (b) CS, (c) A 1b formülasyonlu boş nanokürelere ait DSC diyagramları Şekil 4.2. (a) A 1 formülasyonlu ilaçlı nanoküre, (b) A 1b formülasyonlu boş nanoküre, (c) 5-FU ait DSC diyagramları Şekil 4.3. (a) Magnetit, (b) CS, (c) MC, (d) A 1b formülasyonlu boş nanokürenin FTIR Spektrumları Şekil 4.4. (a) 5-FU, (b) A 1 formülasyonlu nanoküre, (c) A 1b formülasyonlu nanoküre FTIR Spektrumları Şekil 4.5. Magnetitin zeta potansiyeli Şekil 4.6. D 3b formülasyonlu boş nanokürenin zeta potansiyeli...42 Şekil 4.7. D 3 formülasyonlu ilaçlı nanokürenin zeta potansiyeli..42 Şekil 4.8. Magnetitin tanecik boyutu dağılımı 42

12 xii Şekil Sayfa Şekil 4.9. D 3b formülasyonlu boş nanokürenin tanecik boyutu dağılımı 43 Şekil D 3 formülasyonlu ilaçlı nanokürenin tanecik boyutu dağılımı...43 Şekil a) Magnetit, b) A formülasyonlı nanoküreye ait XRD spektrumları...44 Şekil (a) D 3b formülasyonlu boş nanokürenin (b) D 3 formülasyonlu ilaçlı nanokürenin 50 büyütmeli TEM görüntüsü..45 Şekil Tam IPN oluşumunun şematik gösterimi. 46 Şekil Kitosanın glutaraldehit ile çapraz bağlanma mekanizması..47 Şekil Metil selülozun glutaraldehit ile çapraz bağlanma mekanizması.47 Şekil Magnetit içeren CS/MC nanokürelerde çapraz bağlama derişiminin 5-FU salımı üzerine etkisi.48 Şekil Magnetit içeren CS/MC nanokürelerde çapraz bağlama süresinin 5-FU salımı üzerine etkisi...49 Şekil Magnetit içeren CS/MC nanokürelerde magnetit miktarındaki değişimin 5-FU salımı üzerine etkisi...50 Şekil Magnetit içeren CS/MC nanokürelerde CS/MC oranının 5-FU salımı üzerine etkisi...51 Şekil Magnetit içeren CS/MC nanokürelerde ilaç/polimer oranının 5-FU salımı üzerine etkisi 52 Şekil 4.21 Adsorpsiyon kapasitesinin süre ile değişimi Şekil Adsorpsiyon izoterm eğrisi...53 Şekil Magnetit içeren CS/MC nanokürelerde çapraz bağlama derişiminin 5-FU salımı üzerine etkisi...54 Şekil Magnetit içeren CS/MC nanokürelerde çapraz bağlama süresinin 5-FU salımı üzerine etkisi.55 Şekil Magnetit içeren CS/MC nanokürelerde magnetit miktarındaki değişimin 5-FU salımı üzerine etkisi Şekil Magnetit içeren CS/MC nanokürelerde CS/MC oranının 5-FU salımı üzerine etkisi...57

13 xiii SİMGELER VE KISALTMALAR Bu çalışmada kullanılmış bazı simgeler açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur. Simgeler Açıklama 5-FU CS MC GA FTIR DSC UV CTEM XRD Zetasizer 5-Fluorourasil Chitosan Metil Selüloz Glutaraldehit Fourier transform infrared Diferansiyel taramalı kalorimetre Ultraviole Yüksek konsantrasyonlu taramalı elektron mikroskopu X-ışını kırınımı Nano boyut parçacık ölçümü

14 1 1. GİRİŞ Günümüzde hastalıkların tedavisi; hastanın tedavisi yanında yaşam kalitesini artırmak, kullanılan ilaç dozunu azaltmak, dozlama aralığını uzatmak, hastayı yan ve zararlı etkilerden arındırmak ve ilacı hedef bölgeye göndermek amacına yöneliktir. Bu doğrultuda en iyi yanıt veren sistemler kontrollü salım sistemleridir. Sistematik dolaşıma veya hedef bölgede planlanan terapötik derişime ve etken maddenin farmokinetik özelliklerine göre önceden tasarlanan hızda etken madde salımı yapabilen polimerik sistemlere kontrollü salım sistemleri denir. Kontrollü ilaç salım sistemlerinin geliştirilmesinde kullanılan polimerlerin seçiminin doğru bir şekilde yapılması gerekir. Seçilen materyal belirli bir ilaç veya biyoetken madde için istenen salım hızını sağlayacak özelliğe sahip olmalı, vücutta aşınan türden polimerler kullanılıyorsa parçalanma ürünlerinin biyolojik çevrede olumsuz etkilere neden olmayacak maddeler olması gerekir. Bu sistemlerde hem taşıyıcı olarak hem de salım hızını kontrol etmek amacıyla yaygın kullanılan materyaller doğal ve sentetik polimerlerdir. Bu amaçla selüloz, kitosan, aljinat, dekstran, gelatin gibi doğal polimerlerle hazırlanan biyobozunur mikroküreler, kontrollü ilaç salım sistemlerinde ilaç taşıyıcısı olarak geniş bir kullanım alanına sahiptir [1-5]. 5-Fluorourasil (5-FU veya 5-fluoro-2,4-primidindion); Dr. Charles Heidelberger tarafından tasarlanıp sentezlenmiş urasilin C-5 pozisyonunda hidrojen yerine flor gelmesiyle oluşan ve yaygın olarak kemoterapi ilacı olarak kullanılan antimetabolit bir pirimidin analogudur. Birçok kanser türüne karşı aktif olan ve DNA virüslerinin çoğalmasını etkili olarak engelleyen bir ilaçtır [6]. 5-FU özellikle sindirim, meme, yumurtalık kanserleri ve metastazlarında kullanılır. Etkin aktivitesine rağmen bu anti tümör ajanının plazma yarı ömrü kısadır, oral absorpsiyonu hastadan hastaya önemli farklılıklar gösterir ayrıca aynı anda ve yüksek dozlara ihtiyaç duyulduğunda yüksek doz sınırlayıcıdır ve gastrointestinal, hematolojik, sinirsel ve dermatolojik yan etkilere neden olur. Bu yan etkileri ortadan kaldırmak ve 5-FU kan plazmasındaki derişimini uzun süre terapötik düzeyde tutmak için ilacın kontrollü salım formlarının hazırlaması amaçlanmıştır [7,8].

15 2 Literatürde 5-FU kontrollü salımı ile ilgili çeşitli araştırmalara rastlamak mümkündür. Huang ve arkadaşları [9] emülsiyon çapraz bağlama yöntemi ile kitosan/kondroitin sülfat kompleks mikrokapsüllerini hazırlayarak bu mikrokapsüllerden 5-FU salımını incelemişlerdir. İlaç salım performansının çapraz bağlama derecesine, ilaç yüklenmesine ve ph bağlı olduğunu bulmuşlardır. Zinutti ve arkadaşları [10] yağ/yağ buharlaştırma/ekstraksiyon yöntemiyle değişik ilaç/polimer oranları ve çözücü türlerinde 5-fluorourasil yüklü etilselüloz mikroküreleri hazırlamışlar, ilaç/polimer oranı ve çözücü türünün ilaç salımı üzerine etkisini incelemişlerdir. Çalışma sonucunda, çözücü olarak aseton yerine etanol kullanıldığında ilaç salımının daha hızlı gerçekleştiğini ve en yüksek ilaç salımının %90 la ilaç/polimer oranı 1/3 olan etanol kullanılarak hazırlanmış mikrokürelere ait olduğunu bulmuşlardır. Olukman ve arkadaşları [11] sıvıda olgunlaştırma yöntemini kullanarak 5-FU içeren sodyum aljinat mikroküreleri hazırlamışlar ve çapraz bağlayıcı türünün 5-FU salımı üzerine etkisini incelemişlerdir. En yüksek ilaç salımının Fe 3+ ile çapraz bağlanan mikrokürelere ait olduğunu bulmuşlardır. Kemoterapi ile ilgili sorunlardan biri de vücudun belirli bölgesine ilacın tam olarak hedeflenememesidir. Arzu edilen düzeyde terapötik aralığa ulaşmak için ilaç dozu sadece bir kısmını aslında istenen hastalık yerine ulaşacak halde uygulanmalıdır. Böylelikle ilacın toksik etkisi hedef olmayan organları etkilemeyecektir. Bu problemin çözümlerinden bir tanesi kolloidal ilaç sistemlerinin geliştirilmesidir ki böylelikle ilaç istenilen bölgeye fiziksel olarak yönlendirilebilir. İlacın yönlendirilmesi ile vücutta hedeflenen spesifik bölgelere kolay ulaşılabilir. Terapötik seviyeye ulaşmak için gerekli olan ilaç miktarı azalırken ilacın hedeflenmediği bölgelerde(muhtemel yan etkilerinin azaltılması) ilaç derişimi azalır ve esas olarak hedef bölgede ilaç derişimi artar [12]. Nanoteknolojinin hızlı gelişimiyle manyetik demir oksit (Fe 3 O 4 ) nanopartikülleri birçok biyolojik ve tıbbi alanlarda kullanılmaya başlamıştır. Bu uygulamalar; biyoayırma, tümör hipotermi, manyetik rezonans görüntüleme tanı kontrast ajanları, manyetik yönlendirme ile hedef bölgeye ilaç taşıyan ajanlar, biyomoleküler(proteinler, peptitler, enzimler) olarak sıralanabilir [13]. İlaç ve uygun manyetik malzeme birleştirilerek oluşturulan manyetik nanopartiküller kan damarlarında kontrollü salım yapabilirler. Dışarıdan uygulanan

16 3 manyetik alan altında hedeflenen bölgede ilacın kontrollü salımı sağlanabilir. Böylece ilaç hedef bölgede lokal olarak deriştirildiğinden hedefleme ve yüksek ilaç kapasitesi nedeniyle ilacın toksik etkisi azalırken tedavi edici etkisi artmış olur [14]. Bu amaçla Li ve arkadaşları [15] Fe 3 O 4 -kitosan nanopartikülleri hazırlamışlar ve nanopartiküllerdeki magnetit miktarındaki değişimin etkisini incelemişlerdir. Nanopartiküllerde magnetit miktarının artması ile partikül boyutunun azaldığını bildirmişlerdir. Yang ve arkadaşları [16] yağ/su emülsiyon yöntemiyle magnetit içeren poli Ɛ-kaprolaktam nanoküreleri hazırlamışlar ve bu nanokürelerden birer antikanser ilaç olan gemsitabin ve sisplatin salımını incelemişlerdir. Sisplatin salımının gemsitabin salımına göre daha kontrollü olduğunu rapor etmişlerdir. Zhu ve arkadaşları [17] kitosan kaplı magnetit nanopartiküller hazırlayarak bu kürelerden 5-FU salımını incelemişlerdir. Nanopartikül boyutunun 100±20 nm olduğunu bulmuşlardır. Ayrıca kürelerdeki ilaç miktarını değiştirerek kümülatif ilaç salımını nasıl etkilediğini araştırmışlardır. Partiküllerdeki ilaç içeriğinin artması ile kümülatif ilaç salımının arttığını gözlemlemişlerdir. Wang ve arkadaşları [14] 5-FU yüklü magnetit içeren kitosan nanopartiküller hazırlamışlardır. Hazırlanan bu nanopartiküllerin boyutunun nm, nanopartiküllerde tutulan ilacın%13,4-25,8 arasında olduğunu ve ph=7,2 de 30 saat sonundaki kümülatif ilaç salımının %68 olduğunu rapor etmişlerdir. Bu çalışmada; magnetit içeren kitosan/metil selüloz blend(alaşım) polimerik nanoküreler hazırlanarak 5-FU için kontrollü salım sistemleri oluşturulması hedeflenmiştir Çalışma iki bölüm halinde gerçekleştirilmiş olup birinci bölümde ilaç nanoküreler hazırlanırken tutuklanmış bu amaçla emülsiyon çapraz bağlama yöntemi kullanılmış ve çapraz bağlayıcı olarak gluteraldehit seçilmiş, çapraz bağlayıcı derişiminin etkisi incelenmiştir. Uygun çapraz bağlayıcı derişimi belirlendikten sonra çapraz bağlama süresi, nanokürelerdeki magnetit miktarı, kitosan/metil selüloz oranı, ilaç/polimer oranı gibi çeşitli parametreler değiştirilerek amaca uygun en iyi nanoküre hazırlama ve salım koşullarının bulunması hedeflenmiştir. İkinci bölümünde ise; hazırlanan magnetit içeren kitosan/metil selüloz polimerik boş nanokürelere 5-FU adsorplatılmıştır İlk olarak adsorpsiyon süresinin ilaç salıma etkisi araştırılmıştır. Birinci bölümde olduğu gibi nanokürelerdeki magnetit miktarı,

17 4 çapraz bağlayıcı derişimi, çapraz bağlama süresi, kitosan/metil selüloz oranı gibi çeşitli parametreler değiştirilerek adsorplama yüzdelerindeki değişim ve ilaç salımına etkileri incelenmiştir. İki yöntem ile alınan salım sonuçları karşılaştırılmıştır.

18 5 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Kontrollü Salım Sağlayan Sistemler Tanım ve terminoloji Kontrollü ilaç salımı; terapötik yönden kan dolaşımındaki aktif bileşenlerin derişimlerinin en az düzeyde dalgalanmalar ile sabit tutulması, uzun zaman dilimleri içerisinde öngörülebilen ve tekrarlanabilen salım sonuçlarının sağlanması, çok kısa yarı ömre sahip olan bileşenlerin korunması, yan etkiler, ilacın boş yere harcanmaması ve ilacın sık dozlama aralığı gibi problemlerin ortadan kaldırılması, ilaç stabilitesi sorununa bir çözüm olarak kullanılabilmektedir [18]. Her ilacın terapötik aralığı olarak adlandırılan minimum ve maksimum kan derişimi aralığını tanımlayan bir aralığı vardır. İlaç; minimum kan derişiminin altında olduğunda etkisi yetersiz olurken, maksimum kan derişiminin üzerinde olduğunda ise toksik etki göstermektedir. Klasik ilaç şekilleri ilaçtaki etken maddeyi aniden salıveren sistemlerdir. Bu ilaç şekilleri kısa zamanda maksimum kan derişimi düzeyine ulaşır ve hızlı bir şeklide plazma düzeyine düşmeye başlar. Dengeli bir dozlama aralığı ile ilacın uygulanması sırasında sürekli bir şekilde terapötik aralıkta kalmasını sağlamak amaçlanır klasik ilaç şeklilerinde her doz uygulandığında kan derişiminde dalgalanmalar oluşur. Bu dalgalanmaların en aza indirilmesi ya da tamamen giderilmesi için etken maddenin hazırlanan ilaç şekillerinden salım hızının yavaşlatılmasına çalışılır [19,20]. Kontrollü salım sistemlerinde; ilaç derişiminin kanda sabit tutularak, klasik yöntemlerle söz konusu olan doz aşımı ya da yetersizliği gibi istenmeyen sonuçların önlenmesi hedeflenmektedir. Şekil 2.1 de kontrollü salım sistemlerinin, uzatılmış etkili ve klasik ilaç şekillerine göre farkı verilmiştir.

19 6 Şekil 2.1. Kontrollü salım yapan (A) Uzatılmış etkili (B) Klasik salım yapan (C) salım sistemleri için etken madde kan düzeyi-zaman eğrileri arasındaki farklılık. Salım karakterlerinin farklılık göstermesi nedeniyle, kontrollü salım sistemlerini tanımlamak için farklı ifadeler kullanılmakta ve farklı kaynaklara göre değişik sınıflandırma şekillerine rastlanmaktadır. Kodeks de bütün bu sistemler değiştirilmiş salım sistemleri (modified release systems) başlığı altında verilmektedir [21]. Değiştirilmiş salım sistemleri, zaman ve ilacın etken maddesinin salım oranını değiştirmek için dizayn edilmiş ilaç ürünleridir. Değiştirilmiş salım sistemleri aşağıdaki gibi sınıflandırılabilir: Geciktirilmiş salım sistemleri: Bir ilacın salımı ani salımdan farklı olarak bir süre zarfında olmaktadır. Enterik kaplı ürünler örnek olarak verilebilir [22]. Geciktirilmiş salım sistemleri örnek tipleri; Tekrarlanan etki: İki doz birbiri ardından salınır. Uzatılmış etki: Bu sistemler içerdikleri etken maddeyi uzun bir süre zarfında yavaş yavaş salıveren sistemlerdir [23].

20 7 Enterik kaplı tabletler: Zaman ayarlı salım, polimer kaplı bir bariyerden gerçekleştirilir [24]. Sürekli salım sistemleri: Bu sistemler etken maddenin plazma veya doku düzeyini alışılmış şekillere göre çok daha uzun süre devam ettirebilirler. Ancak sistem bulunduğu ortam şartlarından etkilenebildiği için salım mekanizmasını önceden belirlemek güçtür [25]. Kontrollü salım sistemleri: Kontrollü salım sistemleri, etken maddenin plazma derişimini istenilen süre boyunca istenilen seviyede tutabilen veya etken maddenin hedeflenen bölgeye uygulanmasını sağlayabilen sistemler olarak tanımlanabilir. Kontrollü salım yapan sistemlerde aşağıdaki özelliklerin en az birinin bulunması gereklidir. Plazmadaki sabit etken madde düzeyi ve ilacın etkisinin sürekli olabilmesi için; önceden belirlenen hızda ve sürede etken madde salımı gerçekleştirebilmelidir. İlacın etkisini lokalize etmek için, kontrollü salım sağlayan hastalıklı dokuya yerleştirilebilir olmalıdır. Uygun taşıyıcıların kullanımı ile etken madde hedef bölgelere ulaştırılabilmelidir Kontrollü salım sistemlerinin klasik ilaç salım sistemlerine göre avantajları ve dezavantajları Günümüzde kontrollü ilaç salım sistemlerinin uygulandığı birçok farklı alan bulunmaktadır. Bu alanlara örnek olarak tıp, besin, temizlik malzemeleri ve tarım verilebilir. Bu sistemlerin tıp uygulamalarında klinik açıdan önemli avantajları vardır. Bunlar şunlardır;

21 8 İlacın plazma düzeyi istenilen süre ve terapötik değerde sabit kalır. Alışılmış dozaj şekillerinde ilacın plazma düzeyini etkili dozda tutabilmek için ilacın sık sık alınması gerekmektedir. Bu şekilde ilacın terapötik alandaki dalgalanmaları minimize edilir. Uzun süre sabit terapötik plazma düzeyi sağlamak mümkün olduğu için farmakolojik cevap da uzun süreli ve tekdüze olabilir. İlacın sistemik yolla verilmesinin neden olacağı zararlı yan etkiler bir polimerilaç sisteminin yerel uygulaması ile azaltılabilir veya ortadan kaldırılabilir. İn vivo yarı ömürleri kısa olan etken maddelerin kontrollü salım sistemi haline getirilerek parçalanmaları geciktirilebilir. Etken madde tedavisi istenilen bölgeye, organa, dokuya veya hücreye gönderilebilir ve hedeflendirme ile tıbbi müdahalenin mümkün olmadığı, ulaşılması güç olan bölgelere etken maddenin ulaşması mümkün olabilir [26, 27]. Büyük dozda ilacın parenteral yolla birçok kerede verilmesi yerine kontrollü ilaç salan sistemler ile sürekli, az miktarlarda verilmesi hastanın uygulamalardan doğacak sıkıntılarını ortadan kaldırılabilir. Tedavi düşük dozlarla sağlanabildiği için etken maddenin yan ve toksik etkileri azaltılabilir veya tamamen ortadan kaldırılabilir. Örneğin yüksek derişimlerde gastrointestinal sistemde irritasyona sebep olabilecek maddelerin bu zararlı etkileri önlenebilir. Dozlama sıklığı azaltılabildiği için gece ilaç alma sorunu ortadan kalkabilir böylece, hastanın tedaviye olan uyumu artabilir [28]. Bu yöntem ile ilaç verilmesi daha ucuz ve ilaç kaybını önleyici olabilir.

22 9 İyi bir tıbbi kontrolün bulunmadığı az gelişmiş bölgelerde ilaç kullanımı düzenlenebilir ve kolaylaştırılabilir. Hastaneler açısından ilaç dağıtımı ve süresi minimuma indirilebilir, reçete hazırlama işlemleri azalabilir ve dolayısıyla ekonomik avantajlar sağlanabilir. Özel klinik uygulamalarda kontrollü salım sistemlerinin avantajlarının yanı sıra doğabilecek zararları da göz önüne alınmalıdır [28]. Kontrollü salım sistemlerinin dezavantajları ise aşağıdaki gibi sıralanabilir. Kullanılan polimer maddenin toksikliği veya biyolojik açıdan uyuşmazlık gösterebilmesi, Sistem vücuda yerleştirildikten sonra istenildiği an ilaç salımının durdurulmasının zor olması, Vücutta aşınan tip polimerlerden zararlı yan ürünlerin oluşması, Polimeri uygun bir bölgeye yerleştirmek için cerrahi işlem gerekmesi, Yerleştirilen sistemin neden olduğu ağrı, Polimer fiyatları veya üretim yöntemi nedeniyle belirli bir polimer-ilaç formülasyonu için gereken harcamaların fazla olması, Kontrolün bozulmasına yol açan çatlaklar veya başka faktörler nedeniyle sistemin güvenilirliğinin garanti edilememesi,

23 10 İlacın hasta tarafından alınmasının unutulması durumunda tedavi sırasında etkide azalma riskinin diğer ilaç şekillerine göre daha fazla olması, Her etken maddenin kontrollü salım sistemi haline getirilememesi Kontrollü salım sistemlerinin sınıflandırılması Polimerik kontrollü serbestleşme sistemleri ilaç serbestleşmesini kontrol eden mekanizma ve uygulama alanları baz alınarak iki grup altında sınıflandırılabilir [1]. Çizelge 2.1. Kontrollü salım yapan polimerik sistemlerin sınıflandırılması Uygulama Yerine Göre 1. Oküler Sistemler 2. Nazal Sistemler 3. Oral Sistemler 4. Bukkal Sistemler 5. İmplant Sistemler 6. Transdermal Sistemler 7. Vajinal, Sevikal, İntruterin Sistemler 8. Rektal Sistemler Serbestleşme Mekanizmasına Göre 1. Difüzyon Kontrollü Sistemler a. Membran Sistemler b. Matriks Sistemler 2. Kimyasal Kontrollü Sistemler a. Vücutta Aşınan sistemler b. Zincire Takılı Sistemler 3. Çözücünün Harekete Geçirdiği Sistemler a. Şisme Kontrollü Sistemler b. Ozmotik Kontrollü Sistemler 4. Ayarlanabilen Salım Sistemleri a. ph Duyarlı Salım Sistemler b. Manyetik Kontrollü Sistemler c. Mekanik Kontrollü Sistemler

24 11 Uygulama Yerine Göre Kontrollü Salım Sistemleri İlacın uygulanma yolu terapötik sonucu doğrudan etkileyen bir etmendir. Kontrollü salım sistemleri için en sık tercih edilen uygulama yolları oral ve parenteral yoldur fakat son yıllarda transdermal yol da gittikçe önem kazanmaktadır [25]. 1. Oküler Sistemler Bu sistemler sistematik tedavi işlemleri ile ilgili değil öncelikle göz hastalıklarının tedavileri ile ilgilenir. Göz hastalıklarının tedavisinde kullanılan çözelti, süspansiyon, emülsiyon, merhem gibi alışılagelmiş göz preparatlarından yeterli biyoyararlanım sağlanamaması bu alanda yeni arayışlara neden olmuştur. Etken maddenin göz içinde ve kenar boşluklarındaki etki süresini uzatmak ve yan etkilerini önleyerek, istenilen biyoyararlanımı sağlamak amacı ile polimer çözeltileri, biyoadhezif hidrojeller, kolloidal oküler sistemler, insertler, implantlar oküler salım amacıyla kullanılmaktadır [25, 29]. Bunların dışında ilaç yüklü polimerik mikro ve nano partiküler sistemlerin oküler ortamda sürekli salım sağlayabilen ve dozaj miktarını artırabilen birer oküler salım yöntemi oldukları görülmüştür [30]. 2. Nazal Sistemler Mukoza tabakasının alt bölümü damar bakımından zengin olduğu için burun boşluğu morfolofik olarak ilaç absorbsiyonuna elverişlidir. Bu sebeple nazal yol uzun yıllar, ilaçların yerel etkisini sağlamak amacıyla kullanılmıştır. Bu yolla etken madde absorpsiyonunun avantajı karaciğerden ilk geçiş etkisinin olmamasıdır. Nazal mukozanın ph değerinin 7,2 civarında olmasından dolayı, yalnızca bu ph da iyonize olmayan ilaçların absorbe edilebilmesi ise bu sistemin dezavantajıdır. Nazal yolla kullanılmak üzere; mukoadhezif sistemler, mikroküreler, inhalerler, nebulizörler ve lipozomlar geliştirilmiştir [31].

25 12 3. Oral sistemler Kontrollü salım sistemleri içerisinde en sık kullanılan uygulama yoludur. İlacın ağızdan alınması anlamına gelir. Tasarımı için farklı modifikasyonlara olanak tanıması, hastaya kullanım kolaylığı sağlayarak uyumu artırması sebebiyle tercih edilmektedir. Oral kontrollü salım sistemlerinin etkisi bazı fizyolojik faktörlere bağlıdır, bunların başında ph, sindirim sistemindeki geçiş süresi, gastrointestinal hastalıklar, etken maddenin absorplanma yeri, metabolizasyon yeri ve oranı gelmektedir [32, 1]. 4. Bukkal Sistemler Etken maddenin direkt yanak içi mukozasından absorbe edildiği sistemlerdir. Etken madde küçük disk veya kürelere yüklenmiştir ve mukus ile temas sonucu salım gerçekleşir. Aft, ağız yaraları ve diş eti hastalıklarının tedavisinde kullanılırlar. Bu sistemlerin çoğu ağız mukozasına yapışabilecek yapıdadır. Orahesive toz ve Orabase bu sistemlere ilk ticari örneklerdir [1]. 5. Transdermal Sistemler Son yıllarda transdermal sistemlerin biyomalzemelere uygulanmasıyla ortaya çıkan insülin bantları, yara iyileştirici ilaçlı flasterler gibi transdermal preparatların piyasaya sürülmesi, bu ilaç dağıtım şeklinin artan bir hızla ilgi görmesine sebep olmuştur. Karaciğerde ilk geçiş mekanizmasına göre uzaklaştırılan, oral yolla emilimi az olan, gastrointestinal irritasyona sebep olan etken maddeler için kullanılabilmesi gibi avantajları mevcuttur. İlaçların deriden emilim hızlarının artırılarak sistemin daha çeşitli ilaçlar için kullanılar hale getirilmesi amacıyla yoğun çalışmalar yapılmaktadır [1, 33].

26 13 6. İmplant Sistemler İmplant ilaç dağıtım sistemleri oral yolla tedaviye uygun olmayan, biyolojik yarı ömrü çok kısa olan veya karaciğerde ilk geçiş mekanizmasına göre hızla elimine edilen ilaçların etkin ve kontrol edilebilir şekilde kullanımına olanak veren ilaç dağıtım sistemlerinin çoğunu içerir [1]. 7. Vajinal, Servikal ve Intrauterin Sistemler Jinekolojik hastalıklarda kullanılan bazı etken maddelerin lokal ve sistemik etkilerini ortadan kaldırmak için direk ilgili bölgeye uygulanması tercih edilir. Uygulama bölgesine göre etken maddenin kontrollü salımını gerçekleştiren sistemler vajinal, servikal ve intrauterin sistemlerdir. Oral yol ile verildiğinde etkinliğini az veya çok kaybeden steroidler, prostaglandinler, penisilinler, kinin vb. ilaçlar vajina, serviks ve uterus mukozasından absorbe olabildikleri için bu sistemler ile hastaya verilirler. [1]. 8. Rektal Sistemler Bu sistemde etken madde, kalınbarsağın bitiminde bulunan rektum bölgesindeki rektal mukozadan absorbe olur. Rektum ph sının oral yola göre daha stabil olması rektal uygulama sonucu plazma düzeylerindeki sapmaların, oral yola nazaran daha az olmasına neden olur. Rektal sistemler için faklı mekanizmalarla tasarlanabilen dozaj şekillerine örnek olarak; biyoadhezif jeller, tablet, suppozituvarlar ve halkalar; matriks, mikrokapsül, jel tipi ve osmotik kontrollü rektal sistemler gösterilebilir [1, 33]. Salım Mekanizmasına Göre Kontrollü Salım Sistemleri Çeşitli ilaç taşıyıcı sistemlerde birçok değişik tipteki polimerik sistem, etken maddenin kontrolünü sağlamak için kullanılmaktadır [34]. Bunlar;

27 14 1. Difüzyon Kontrollü Sistemler Difüzyon, ilaç moleküllerinin derişiminin yüksek olduğu bölgeden, düşük olduğu bölgeye hareketidir. Difüzyon kontrollü ilaç salım sistemlerinde, etken maddenin salımı suda çözünmeyen bir polimerden difüzyonu ile kontrol edilir. Bu salım mekanizması en yaygın görülen salım mekanizmasıdır. Membran ve matriks sistemler olmak üzere iki tip difüzyon kontrollü sistem vardır. a. Membran Sistemler: Depo sistemlerde etken madde inert bir polimer membran ile çevrelenmiş çekirdek içinde dağılmış olarak yer almaktadır (Şekil 2.2). Daha sonra membrandan sistemi çevreleyen ortama difüzlenir [25, 34]. b. Matriks Sistemler: Etken madde bir polimer matriks içerisinde homojen olarak çözündürülmüş veya dağıtılmıştır (Şekil 2.2). Matriksi çevreleyen sıvı, porlardan ve granüller arası boşluklardan geçerek ilacı çözer. Bu mekanizmada hız sınırlayıcı basamak etken maddenin polimer matriks boyunca difüzlenerek açığa çıkmasıdır [34, 35].

28 15 Şekil 2.2. Difüzyon kontrollü sistemlerin şematik görünümü 2. Kimyasal Kontrollü Sistemler a. Vücutta Aşınan Sistemler: Bu sistemlerde, matriks sistemlerde olduğu gibi etken madde polimer içinde dağılmış veya çözündürülmüş haldedir (Şekil 2.3). Polimer biyolojik ortamda bozunmaya uğrayarak kontrollü şekilde etken maddenin salınmasını sağlar. Salım hızı sabit değildir ve polimerin biyolojik ortamda uğradığı aşınmanın hızına bağlıdır. Bu tip sistemlerin en büyük avantajları, polimerin erozyon sonucunda vücut tarafından absorplanmasıdır. Bu olay sonucunda sistemi vücuttan uzaklaştırmak için ikinci bir cerrahi işlem gerekmemektedir. Ancak, erozyona uğradıkça yüzey alanlarının azalması bu sistemlerin başlıca dezavantajı olarak sayılabilmektedir [28, 34].

29 16 b. Zincire Takılı Sistemler: Bu tip sistemlerde, polimere kimyasal bir tepkime sonucu bağlanmış olan etken madde, biyolojik ortamda meydana gelecek olan hidrolitik veya enzimatik bir tepkime sonucu polimer yapıdan ayrılmaktadır.(şekil 2.3). Etken madde salım hızında etkili olan basamak kimyasal tepkimedir. Bu sistemlerde kullanılan polimerler, çözünen veya çözünmeyen tipte olabilir [35]. Şekil 2.3. Kimyasal kontrollü sistemlerin şematik görünümü 3. Çözücünün Harekete Geçirdiği Sistemler a. Şişme Kontrollü Sistemler: Şişme kontrollü sistemlerde, etken madde şişebilen hidrofilik polimer matriks maddesi içinde homojen olarak çözünmüş veya dağılmıştır. İn-vivo ortamda, sıvının matriks içine girmesiyle birlikte polimer şişmekte ve etken madde açığa çıkmaktadır (Şekil 2.4). Şişen polimer, kauçuk

30 17 benzeri yapısı nedeniyle etken maddenin dışarıya difüzyonuna imkân sağlamaktadır. Hidrofilik matriks maddesi biyolojik sıvıyı çekerek kenardan merkeze doğru bir jel tabakası oluşturur. Bu jel tabakası tarafından etken madde salımı kontrol edilir yani etken madde salımı, polimer matriksin şişme hızına bağlıdır [25, 34]. b. Osmotik Kontrollü Sistemler: Osmotik kontrollü sistemlere ilk örnek Alzet firması tarafından geliştirilen Acutrim Tablet dir. Bu sistemlerde, etken maddenin salımı osmotik basınç ile aktive edilmektedir. Sıvı veya katı olarak seçilen etken maddenin bulunduğu çekirdek kısmı yarı geçirgen bir zarla çevrelenmiştir (Şekil 2.4). Sistem su veya biyolojik ortamda sıvı ile temas sonucu aktif hale gelmekte, su veya sıvı yarı geçirgen membranın gözeneklerinden içeriye girerek, etken maddeyi çözmektedir. Çözünen etken madde, sistemde lazerle açılmış ve çapı etken maddenin salım hızına göre ayarlanmış olan delikten açığa çıkmaktadır [36, 37]. Şekil 2.4. Çözücünün harekete geçirdiği sistemlerin şematik görünümü

31 18 4. Ayarlanabilen-Salım Sistemleri Bu sistemlerde ilaç salımı; sıcaklık, ph, iyonik şiddet, elektrik alan, elektromanyetik radyasyon ve UV ışığı v.b. bir dış uyaran ile kontrol edilebilmektedir. Böyle dış uyaranlardan etkilenen hidrojeller kontrollü salım sistemlerinde kullanılabilirler. Aşağıda dış sinyallere duyarlı ilaç iletim sistemlerinden birkaçı ele alınmıştır [38]. a. ph Duyarlı Salım Sistemleri: Zayıf elektrolitin iyonlaşma miktarı ph ve sulu ortamın iyonik bileşimi tarafından kontrol edildiği için; akıllı polimerler sulu ortamdaki en ufak ph değişimlerinde bile önemli ölçüde konformasyon değişimine maruz kalırlar. Bütün ph duyarlı polimerler, ortamın ph değerine göre proton alan ya da veren asidik ya da bazik gruplar içerirler [39]. b. Mekanik Kontrollü Sistemler: Mekanik kontrollü pompalarla salım oluşturulabilmektedir. Bu sistemlerle etken maddenin çıkışı çok iyi bir şekilde kontrol edilebildiği gibi, gerektiğinde doğrudan kan dolaşımına etken madde salımı da gerçekleşmektedir. Ayrıca bazı tiplerinin boşaldığında yine doldurulabilmesi de mümkündür ki bu önemli bir avantajdır. Vücut dışına veya içine implant olarak uygulanan tipleri vardır. Her iki tipte de etken madde salımını ayarlayan itici güç sistemin içi ile dışı arsındaki basınç farkıdır. Basınç, etken maddenin bulunduğu depo üzerine uygulanan ozmotik veya doğrudan mekanik bir etki ile de oluşturulabilmektedir [40, 41]. c. Manyetik Kontrollü Sistemler: Bu sistemlerde, etken madde ve manyetik tanecikler bir katı polimer matris içine homojen olarak dağıtılmıştır. Ortam sıvısı ile temasta iken etken madde çıkışı meydana gelmektedir. Ancak değişken bir manyetik alan varlığında salım hızı belirgin bir ölçüde artmaktadır. Bu manyetik alan etken maddenin içinde bulunduğu matrisin porlarına peristaltik bir baskı uygulayarak salımı artırmaktadır. Bu sistemlerin en büyük avantajı, manyetik alan uygulaması ile

32 19 istenildiğinde daha fazla çıkışın sağlanabilmesi ve istenilen salımın sağlanabilmesidir [42] İlaç salım kinetiği Çözünme hızının kontrol edilebilmesi, etken madde salım mekanizmalarının yorumlanması ve farklı formülasyonlar arasında karşılaştırma parametrelerinin elde edilmesi için çözünme hızı verilerine çeşitli matematiksel modeller uygulanmaktadır. Bu modellerin birçoğuna Fick in difüzyon yasasına ait eşitliklerin çözümlenmesiyle ulaşılır. İlaç salım kinetiği, polimerin şişmesi, polimer erozyonu, ilaç çözünme/difüzyon karakteristikleri, matris içinde ilacın dağılımı, ilaç/polimer oranı ve sistem geometrisi (silindir, küre vb.) gibi birçok faktörden etkilenir [43,44]. Sıfırıncı Derece Kinetik: Kontrollü etken madde salımının sağlanması için biyobozunur polimerlerin kullanılmasıyla hazırlanmış mikropartiküler sistemlerde amaç sıfırıncı derece kinetik ile etken madde salımının sağlanmasıdır. [45]. Matematiksel olarak sıfırıncı derece salıma ait hız ifadesi aşağıdaki eşitlikle verilmektedir. Eş. 2.1 in 0 a giderken integrali alındığında, Eş. 2.2 elde edilmektedir. C C k t 0 0 (2.2) C : t anında çözünmeden kalan etken madde miktarı, C 0 : Başlangıçtaki etken madde miktarı, k 0 : Sıfırıncı derece salım hız sabitidir. t : Süre

33 20 Tedavi amacıyla etken madde vücuda verilirken, değişmeyen bir kan seviyesi oluşturmak isteniyorsa sıfırıncı derece kinetik ile verilmelidir [25]. Birinci Derece Kinetik: Matematiksel olarak birinci derece salıma ait hız ifadesi aşağıdaki eşitlikle verilmektedir. (2.3) Eşitliğin 0 a giderken integrali alındığında, aşağıdaki eşitlik 2.4 elde edilmektedir. ln C ln C kt C t 0 : t anında çözünmeden kalan etken madde miktarı, C 0 : Başlangıçtaki etken madde miktarı, k : Birinci derece salım hız sabitidir. t : Süre (2.4) Birinci derece kinetikte, kan düzeyleri değişmez kalmayıp, birinci derece kinetikle azalır. Peppas Eşitliği: Etken maddenin açığa çıkışının difüzyonla ve/veya polimerde meydana gelen gevşeme ile meydana geldiğini açıklamak üzere Peppas ve ark. tarafından geliştirilen denklem eşitlik 2.5 ile verilmiştir [46]. M t kt M n (2.5) Eş. 2.6 in logaritmik formu eşitlik 2.6 ile verilmiştir. M log t log k nlog t M (2.6)

34 21 Burada; M t : t zamanında salınan etken madde miktarı, M : zamanda salınacak etken madde miktarı, k : Salım yapan sistemin yapısal ve geometrik özelliklerini birleştiren bir sabit, n : Salım mekanizmasını tanımlayan deneysel bir parametre, t : Süredir. Bu eşitlik salım mekanizması göz önüne alınmaksızın tabaka, silindir, küre ve disk gibi farklı geometrik şekillere sahip sistemlerden etken madde salımını tanımlamaktadır. Şişen ve şişmeyen polimerik kontrollü salım yapan sistemlerde n değerine karşılık gelen salım mekanizmaları belirlenmiştir. n=0,5 ise polimer matriksten ilaç difüzyonu ve ilaç salımı Fick difüzyonunu takip eder. n>0,5 ise bir anormal ya da Fick e uymayan tipte ilaç difüzyonu gerçekleşir. n=1 ise Fick e uymayan difüzyon ya da durum II salım kinetiği geçerlidir. Eşitlikteki n değeri, etken maddenin polimerden salım davranışını açıklayan önemli bir parametredir. Değişik geometrik şekiller için n parametresinin değerleri ve bu değerlerin hangi salım mekanizmalarına uyduğu çizelge 2.2 de gösterilmektedir [7]. Çizelge 2.2. Farklı geometrik şekiller için n parametresinin değerleri ve salım mekanizmaları [47] İnce film Silindir Küre İlacın salım mekanizması 0,5 0,45 0,43 0,5<n<1,0 0,45<n<0,89 0,43<n<0,85 Fick e uygun difüzyon (Durum I) Fick e uymayan difüzyon (Durum II) 1,0 0,89 0,85 Durum II n>1,0 Süper Geçiş

35 Kullanılan Etken Madde ve Destek Materyalleri Fluorourasil Şekil Fluorourasil in kimyasal yapısı. Kapalı Förmülü: C 4 H 3 FN 2 O 2 IUPAC İsmi: 5-floro-1H-pirimidin-2,4-dion Molekül Ağırlığı: 130,077 gmol-1 5-FU bir primidin analoğudur. Bazı tümor hücrelerinin primidin bazlı olan urasili normal vücut hücrelerine göre daha fazla kullandığının gözlenmesi üzerine ilk kez 1950 lerde Dr. Charles Heidelberger tarafından urasilin C-5 pozisyonundaki hidrojenin yerine flor gelmesiyle sentezlenmiştir. (Şekil 2.6) Şekil 2.6. a) Urasilin, b) 5-Fluorourasilin kimyasal yapısı. 5-FU yaygın olarak kullanılan bir ajandır ve primidin metabolik yolunda metabolize olan bir primidindir. Tümor hücrelerinde sitotoksik etkisini metabolitler aracılığıyla gösterir [48]. 5-FU ve aktif metaboliti floksuridinin etki mekanizmasını açıklayan iki ayrı biyokimyasal yol vardır.

36 23 a. Desoksinükleotidlerin şekillenmesi: 5-FU önce timidinfosforilaz enzimi aracılığı ile 5-floksuridine (5-fluoro-desoksiuridin = 5-FUdR) sonra da timidin kinaz enzimi aracılığı ile 5-fluorodezosiuridin monofosfata (5-FdUMP) dönüşür. 5-FdUMP, pirimidinlerin endojen yolunun anahtar enzimi olan timidilat sentetazı inhibe eder.5-fdump nin kendisi de doğrudan DNA ile integre olabilmekte ve sonuçta hücre metabolizmasını ve işlevini bozabilmektedir. b. Nükleotidlerin oluşumu: 5-FU doğrudan orotikofosforibosil-transferaz (OPRT) ya da dolaylı olarak uridin-fosforilaz enzimi aracılığı ile, ribonükleosid 5-fluorouridine (5-FUR) metabolize edilebilmektedir. Daha sonra üridinkinaz etkisiyle, 5-FUR önce 5-fluorourasil monofosfat (5-FUMP), sonra da 5-fluorourasil trifosfata (5-FUTP) dönüşmektedir. 5-FUMP, ribonükleik asitlerle (RNA) birleşerek hücrenin olgunlaşmasını bozabilmekte ve stotoksik etki oluşturabilmektedir (Şekil 2.7). 5-FU antitümör etkisini RNA sentezi ve fonksiyonunun inhibisyonu, timidilat sentaz aktivitesinin inhibisyonu ve DNA içine yerleşmek ve DNA kol kırıklarına yol açmak şeklinde gösterir [7]. Şekil Fluorourasilin etki mekanizmasının şematik gösterimi [7]

37 Kitosan Kitin, poli-n-asetilglikozamin yapısında olan, yapısı selüloza benzeyen ve selülozdan sonra dünyada en yaygın olarak bulunan ikinci yenilebilir biyopolimerdir [49]. Genel olarak yengeç, karides, midye gibi bazı deniz kabuklularının ana bileseni olup, sinek, çekirge, örümcek gibi bazı böceklerin iskeletinde ve mantarların hücre duvarlarının yapısında da bulunmaktadır. Dünyada yıllık kitin üretiminin yaklaşık 150x10 3 ton civarında olduğu belirtilmektedir. Bunun 56x10 3 tonu karidesten, 39x10 3 tonu çesitli deniz kabuklularından, 32x10 3 tonu mantarlardan ve 23x10 3 tonu istiridyelerden elde edilmektedir [50, 51]. Kitinin ticari olarak kullanımı, beraberinde bulunan proteinlerin uzaklaştırılmasındaki güçlükler nedeniyle sınırlı kalmaktadır. Kitinin birçok türevi bulunmakla beraber, bunlar arasında en önemlisi kitosandır. Kitosan, kitinin alkalin deasetilasyonu ile elde edilen amorf yapıda bir poliaminosakkarit ve doğal olarak meydana gelebilen birkaç katyonik polielektrolitten biridir [50, 52]. Kitosanın kimyasal yapısı, poli-[β-(1,4)-2-amino-2-deoksi-b-d-glukopiranoz] şeklindedir. Kitinde asetamid (-NHCOCH 3 ), kitosanda ise amin (-NH 2 ) grubu bulunmaktadır. Kitin ve kitosanın yapısal formülü Şekil 2.8 de gösterilmiştir. Şekil 2.8. Kitin ve kitosanın yapısal formülü

38 25 Kitosan, ilk kez 1811 yılında Henri Bracannot tarafından keşfedilmiştir. Bracannot, mantarlarda bulunan kitini sülfürik asitte çözmeye çalışmış ancak başarılı olamamıştır de Hoppe-Seyler, kitini potasyum hidroksit içerisinde 180ºC de işleme sokmuş (deasetilasyon) ve asetil içeriği azaltılmış bir ürün olan kitosan ı elde etmiştir [53]. Kitinin deasetilasyon tepkimesi Şekil 2.9 da verilmiştir. Şekil 2.9. Kitinin deasetilasyonu İyi biyouyumluluk, düşük toksisite ve biyobozunurluk gibi olumlu özellikleri nedeniyle son yıllarda biyomedikal ve ilaç alanında kitosan kullanımı artmıştır [54]. Çizelge 2.3. Kitosanın teknik üretim koşulları [1] Adım Kimyasal Madde Sıcaklık ( C) Süre Deprotenizasyon % 0,5-15 NaOH ,5-72 saat Demineralizasyon % 2-8 HCl ,5-48 saat Dekolorizasyon Çeşitli organik Yıkama, 60 dk çözücüler(naocl,h 2 O 2 ) Deasetilasyon % NaOH ,5-144 saat Kitosan, her tekrarlayan birimdeki primer (C-6), ve sekonder (C-3) hidroksil grupları ile amin (C-2) grubu olmak üzere toplam üç tane reaktif gruba sahiptir. Bu reaktif gruplar kolayca kimyasal modifikasyona uğrayabilmekte ve kitosanın mekaniksel ve fiziksel özellikleri ile çözünürlüğünü değiştirmektedir [55].

39 26 Kitosanın kullanım alanları Kitosan kolay kullanım, ucuzluk, antifungal ve bakteriostatik özelliklere sahip olduğu için tıptan gıdaya, ziraatten kozmetiğe, eczacılıktan atık su arıtımına ve tekstil sektörüne kadar sayısız alanda kullanılabilmektedir. Biyouyumluğu ve biyolojik olarak kolay parçalanma özelliği kimyasal modifikasyonlarda kullanımda kolaylık sağlamaktadır. Kitosan, canlı hücrelerin immobilizasyonu/salımı ve protein/peptit ilaçların oral salımı için uygun polimer maddesi ile kaplanması konularında da kullanılmaktadır [56]. Kitosanın uygulama alanları Çizelge 2.4 de verilmiştir. Çizelge 2.4. Kitin, kitosan ve türevlerinin uygulama alanları [52, 55] Uygulama Alanı Medikal Alan Kozmetik Biyoteknoloji Gıda Özel Kullanım Alanları Yapay deri ve yara iyileştirme elbiseleri Kanı pıhtılaştırıcı madde Hidrojel yapımı Antikoagülant ve antitrombojenik materyaller (sülfatlanmıs-kitin türevleri olarak) Kan diyaliz membranları Kontakt lens yapımı İlaç salım teknolojileri Saç şekillendirici yapımı Nemlendirici kremlerde Antikolestrol ve yağ bağlayıcı olarak zayıflama maddesi Traş losyonu, deodorantlarda koku giderici madde Kromatografik yöntemlerde Enzim immobilizasyonunda Sentetik fiber üretimi Doğal kıvam arttırıcı Yiyecek işlemede (örneğin şeker işleme) Filtreleme ve temizleme Zayıflama ürünleri

40 27 Çizelge 2.4. (Devam) Kitin, kitosan ve türevlerinin uygulama alanları [52, 55]. Atık yiyeceklerin tekrar işlenmesi Ziraat Su arıtımı Bitki katkı maddesi Antimikrobiyal madde Bitki tohumu kaplanması Gübre yapımı İnsektisid ve nematositlerde Kirlenmiş atık sular için koagülasyon ve flokülasyon Atık sudaki metal iyonlarının uzaklaştırılması ve geri kazanımı Biyouyumluluk özelliğine sahip kitosan, çesitli ilaç formülasyonlarında uygun bir matris maddesi olarak sıklıkla kullanılmaktadır. Çesitli ilaçlar, kitosan matris içerisine (film, mikroküre, kaplanmış tablet vb.) yerleştirilmektedir. Kitosanın serbest amin grubu katyonik özellik kazandırması nedeniyle negatif yüklü ilaçlar, polimerler ve biyoaktif moleküllerle etkileşimini sağlamaktadır. Midede tahrişi engelleyen antiasit ve antiülser aktivitelere sahip olması da kitosanı ideal materyal haline getirmektedir [57]. Birçok araştırmacı, kitosan ve kitosan kaplı sodyum aljinat mikrokürelerden etken madde salımı konusunda farklı çalışmalar yapmışlardır. Kitosan kaplı sodyum aljinat mikroküreleri elde etmek için nispeten hafif çapraz bağlama koşulları ve bu iki doğal polimerin toksik olmaması ve biyobozunurlukları onları çok çeşitli aktif ajanlar dahil, proteinlerin, enzimlerin, antikorların, hücrelerin, DNA nın ve ilaçların kapsülasyonunda etken olarak kullanılmasına sebep olmuştur [58]. Etken maddenin kitosan mikrokürelerinden salım karakteristiklerini etkileyen birçok faktör vardır. Bu faktörler arasında; kitosan derişimi ve molekül kütlesi, etken madde / kitosan oranı karıştırma hızı, kullanılan çapraz bağlama işlemi, çapraz bağlama ajanının türü ve konsantrasyonu, yağ tipi, katkılar sayılabilir [55].

41 28 Xing ve arkadaşları [59] 5-FU yüklü kitosan/aljinat (CS/Alg) nanopartiküllerini (NPS) bir yüzey olarak Poloksamer ile hazırlamışlar ve salım çalışmalarını ph=7,4 te gerçekleştirmişlerdir. Tutuklama veriminin ve 5-FU salımının Alg derişimi, poloksamer derişimi, kitosan derişimi ve 5-FU derişimiyle değiştiğini bulmuşlardır. Karaca [60], salisilik asiti kapsüllemek üzere PVA/Na-Alg, PVA/CS kullanarak ve sıvıda olgunlaştırma yöntemiyle mikrokürelerini hazırlamıştır. Salisilik asit salımının ilaç/polimer oranı azaldıkça hem PVA/Na-Alg ve PVA/CS mikrokürelerde arttığı, bununla birlikte tutuklama veriminin her iki tip mikrokürede ilaç/polimer oranının artmasıyla azaldığı gözlemlemiştir. Kürelerdeki PVA ve CS miktarının artışının salımı azalttığı belirlemiştir. Mikrokürelerin hazırlanması ve ilaç salımı için en iyi koşullar; PVA/Na-Alg mikroküreler için: PVA/Na-Alg: 3/1(w/w), çapraz bağlayıcı derişimi: %2,5(v/v) GA + %3(v/v) HCI, ilaç/polimer (i/p) oranı: 1/1,25 (w/w) ve ph=7,4 olarak belirlemiş bu koşullarda 6. saat sonunda toplam salisilik asit salımı %91,40 olarak bulmuştur. PVA/CS mikroküreler için: PVA/CS: 2/1(w/w), çapraz bağlayıcı derişimi: 1M NaOH + %2,5(v/v) GA, ilaç/polimer (i/p) oranı: 1/2 (w/w) ve ph=7,4 olarak belirlemiş bu koşullarda 6. saat sonunda toplam salisilik asit salımı % 85,90 olarak bulmuştur Metil Selüloz Metil selüloz (MC), biyolojik olarak parçalanabilen ve doğada en çok bulunan biyopolimer olan selülozun değiştirilmesi ile elde edilen kimyasal bir bileşiktir. Kimyasal olarak, selülozun bazı hidroksil gruplarındaki hidrojen atomlarının metil grupları ile yer değiştirilmesi (-OCH 3 ) sonucu oluşan selülozun metil eterlerindendir. Yapısında metil grubunun bulunması, hidrofilik bir yapı kazandırarak şişme davranışı göstermesine neden olur. Saf halde metil selüloz beyaz toz halde bulunur. Selüloz gibi, sindirilemez, toksik ve alerjik değildir [61,62].

42 29 Şekil Metil selülozun yapısı R= H veya CH 3 Suda çözünürlük limitleri metil sübstitüentlerin selülozik omurga boyunca C-2, C-3 ve C-6 pozisyonlarındaki dağılımına bağlıdır [63]. Sıcaklık ve selülozik omurga boyunca metil grublarının dağılımı değiştiğinde tamamen farklı özellikler gösterir. Soğuk suda yoğun bir çözelti ya da jel oluşturarak çözünebilirken, etanol, eter ve kloroform gibi organik çözücülerde çözünmez. Çözücü olarak genellikle glacial asetik asit kullanılır [64]. Toksik olmaması, düşük maliyeti ve kolay işlenebilirliği yüzünden çevre dostu ürünlerin yapımında, kaplama ve toprak özelliklerinin iyileştirilmesinde (malçlama); gıda alanında, E 461 kapsamında gıda katkı maddesi, kıvam artırıcı, emülsifiye edici ve dayanıklaştırıcı madde olarak kulanılır. Metil selülozun diğer kullanım alanlarına ilaç endüstrisi, kök hücre ayrıştırılması, kabızlık tedavisi, yağlama malzemesi, suni gözyaşı ve salya gibi biyomalzemelerin üretimi, antibakteriyel laboratuar malzemelerinin üretimi, kağıt ve tekstil sektöründe boyutlandırma işlemi, şampuan, diş macunu sıvı sabun gibi ürünlerde kıvam ayarlayıcı, tutkal ya da sargı malzemesi, inşaat malzemesi gibi birçok yer örnek olarak gösterilebilir [65,66]. Metilselüloz 1976 yılından beri, göz içi lens implantasyonunda, kornea endoteli zarar görmesini önlemek için ameliyatlarda kullanılmaktadır [67]. Barış [1], piridostigmin bromür yüklü kitosan/metilselüloz mikrokürelerini emülsiyon çapraz bağlama yöntemi ile hazırlamış, mikrokürelerden polimer oranı, ilaç/polimer oranı, çapraz bağlayıcı derişimi ve çapraz bağlama süresi koşullarını değiştirerek en iyi ilaç salım koşullarını belirlemiştir. Bu koşullar; CS/MC(w/w): 4/1, çapraz bağlayıcı derişimi: 3,25 M, ilaç/polimer oranı (w/w):1/6, çapraz bağlama süresi: 10 dakika ve ph:7,4 olarak belirlemiştir. Bu koşullarda kümülatif ilaç salımı 6 saat sonunda CS/MC mikrokürelerde ise kütlece %100,00 olarak bulmuştur.

43 30 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Kimyasal maddeler Etken madde olarak kullanılan 5-Fluorourasil Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) den temin edilmiştir. Küre hazırlamakta kullanılan polimerlerden kitosan SİGMA-Aldrich den, metil selüloz ise Sigma dan temin edilmiştir. Gluteraldehit (GA) (HOC(CH 2 ) 3 COH) %25 (v/v) sulu çözeltisi, tween-80, hekzan, diğer kimyasallar (Na 2 HPO4, NaH 2 PO4 ) ve magnetit oluşturmak için kullanılan kimyasallar (FeCl 3, FeCl 2.4H 2 O ve NH 4 OH ) Merck ten temin edilmiştir. Ayrıca 2-propanol Sigma-Aldrich, parafin ise Birpa (Türkiye) dan temin edilmiştir Kullanılan cihazlar Homojenizatör: Magnetitin dağıtıcı ortamda homojen olarak dağılmasını sağlamak için WiseTise marka HG-15A model homojenizarör kullanılarak magnetitin dağılması sağlanmıştır. Ultrasonik Banyo: Polimer karışımı ve magnetitin karışmasını sağlamak amacıyla Elma marka X-tra 50H model ultrasonik banyo kullanılmıştır. Ultrasantrifüj: Oluşan nanoküreleri çöktürmek amacıyla Electro-Mag marka M 4812 model ultrasantrifüj kullanılarak küreler çöktürülerek elde edilmiştir. UV spektrofotometresi: Hazırlanan nanokürelerden salınan 5-fluorourasil miktarları, Unicam UV2-100 marka UV/Vısıble spektrofotometresi kullanılarak 266 nm dalga

44 31 boyundaki absorbsiyon pikinin şiddetinden kalibrasyon grafiği çizilerek tayin edilmiştir. FTIR spektrofotometresi: 5-fluorourasil ve CS/MC kullanılarak hazırlanan boş ve 5- fluorourasil yüklü nanokürelerin KBr disklerinin infrared spektrumları, Mattson 1000 model FTIR spektrofotometresi kullanılarak elde edilmiştir. Diferansiyel taramalı kalorimetre (DSC): Nanokürelerin ve polimerlerin DSC sonuçları General V4.1C DuPont2000 marka diferansiyel taramalı kalorimetre kullanılarak elde edilmiştir. Yüksek Kontrastlı Geçirimli Elektron Mikroskobu (CTEM): Nanokürelerin TEM görüntüleri Lantan hekzaborür (LaB 6 ) elektron tabancalı, kv aralığında hızlandırıcı voltaj altında çalışan FEI marka Tecnai G 2 Spirit Biotwin model yüksek kontrastlı geçirimli elektron mikroskobu kullanılarak elde edilmiştir. X-Işını Difraksiyonu (XRD): Magnetit ve magnetit içeren CS/MC kullanılarak hazırlanan boş nanokürenin XRD sonuçları Rigaku Ultima-IV marka X-ışını kırınım cihazı kullanılarak elde edilmiştir. Zetasizer: Magnetit, magnetit içeren CS/MC kullanılarak hazırlanan boş ve ilaçlı nanokürelerin zeta potansiyelleri Malvern Nano-ZS marka zeta-sizer cihazı kullanılarak elde edilmiştir. Ayrıca bu temel cihazların yanında aşağıda verilen cihazlar da kullanılmıştır. Çalkalamalı su banyosu (Medline BS-21) Manyetik karıştırıcı (Chiltren) Etüv (Memmert) ph metre (Hana ph211 Microprocessor ph Meter) Analitik terazi (Precisa XB

45 Yöntem Magnetitin hazırlanması 0,5 M FeCl 3 ve 0,25 M FeCl 2.4H2O çözeltileri hazırlandı. Çözeltiler 1/1 oranında karıştırılarak üzerine %25 lik NH 4 OH ilave edildi. 30 dakika manyetik karıştırıcıda karıştırıldı ve sonra güçlü bir mıknatıs yardımıyla oluşan magnetit ayrıldı, yıkama çözeltisinin ph değeri 7 olana kadar su ile yıkandı etüvde kurutuldu [16] Fluorourasil yüklü nanokürelerin hazırlanması 5-FU yüklü nanoküreler emülsiyon çapraz bağlama yöntemi kullanılarak hazırlandı Bu amaçla destek maddesi olarak kullanılan CS ve MC 4/1, 3/1, 2/1 ve 1/1 oranlarında %2 (m/m) derişimde asetik asit içerisinde çözülerek hazırlandı. Çizelge 3.1 de verilen polimer oranlarındaki karışımların içine farklı ilaç/polimer (w/w) oranlarında 5-fluorourasil ilave edildi ve çözelti 12 saat süre ile karıştırılarak ilaç, polimer çözeltisi içerisinde dağıtıldı. Elde edilen süspansiyondan 15 ml alınarak; içerisine 30 ml parafin, 0,5 ml tween- 80 ve belirli oranlarda magnetit bulunan karışıma ilave edildi. Farklı bileşim ve özelliklerde 5-fluorourasil yüklü nanoküre hazırlama işlemi çalkalama banyosunda yaklaşık 30 dakika sürede tamamlandı ve çapraz bağlama çözeltisi olan glutaraldehit (%25 w/w) eklenerek 5, 10, 30 dakika süre ile tutularak çapraz bağlandı. Elde edilen nanoküreler rpm karıştırma hızındaki ultrasantrifüj yardımıyla çöktürüldü. Ayrılan nanoküreler hekzan ve 2-propanol ile yıkanarak etüvde 40 0 C da sabit tartıma gelinceye kadar kurutuldu [15]. CS/MC oranı, ilaç/polimer oranı, çapraz bağlama süresi, çapraz bağlama derişimi ve nanokürelerde bulunan magnetit miktarı değiştirilerek değişik formülasyonlarda nanoküreler hazırlandı. Nanoküre hazırlama koşulları ve nanoküre bileşimleri Çizelge 3.1 de verildi.

46 33 Ayrıca, Çizelge 3.2 de de polimer karışımında 5-fluorourasil olmaksızın hazırlanan boş nanokürelerin hazırlama koşulları ve nanoküre bileşimleri verildi. Çizelge Fluorourasil yüklü magnetit içeren CS/MC nanokürelerin hazırlama koşulları Çapraz Çapraz Polimer Magnetit Bağlama Bağlayıcı İlaç/Polimer No Oranı Yüzdesi Süresi Derişimi Oranı (m/m) (m/m) (dak) (M) x10 2 (%) A 1 1/1 5 2,3 67 1/8 A 2 1/1 5 4,2 67 1/8 A 3 1/1 5 5,8 67 1/8 A 4 1/1 5 7,1 67 1/8 A 5 1/1 5 11,0 67 1/8 B 1 1/ ,0 67 1/8 B 2 1/ ,0 67 1/8 C 1 1/1 5 11,0 33 1/8 C 2 1/1 5 11, /8 D 1 2/1 5 11, /8 D 2 3/1 5 11, /8 D 3 4/1 5 11, /8 E 1 4/1 5 11, /10 E 2 4/1 5 11, /16

47 34 Çizelge 3.2. Magnetit içeren CS/MC boş nanokürelerin hazırlama koşulları No Çapraz Çapraz Magnetit CS/MC Oranı Bağlama Bağlayıcı Yüzdesi (m/m) Süresi Derişimi (%) (dak) (M) x10 2 A 1b 1/1 5 2,3 67 A 2b 1/1 5 4,2 67 A 3b 1/1 5 5,8 67 A 4b 1/1 5 7,1 67 A 5b 1/1 5 11,0 67 B 1b 1/ ,0 67 B 2b 1/ ,0 67 C 1b 1/1 5 11,0 33 C 2b 1/1 5 11,0 100 D 1b 2/1 5 11,0 100 D 2b 3/1 5 11,0 100 D 3b 4/1 5 11, Adsorpsiyon yöntemiyle 5-FU yüklü nanokürelerin hazırlanması Bölüm de açıklandığı şekilde içerisinde 5-FU olmaksızın nanoküreler hazırlandı. Hazırlanan boş nanokürelerden 50 mg alınarak 0,02 M 15 ml ilaç çözeltisine ilave edildi ve belirli sürelerde ilaç çözeltisi içerisinde bekletildi. Daha sonra rpm karıştırma hızındaki ultrasantrifüjde küreler çöktürülerek ayrıldı ve 40 0 C de kurumaya bırakıldı. Nanokürelerin adsorpsiyon kapasitesi (q) çözeltinin başlangıç ve son ilaç derişimleri belirlenerek aşağıdaki eşitliğe göre hesaplandı [69] : q= [(C 0 -C)V]/m (3.1)

48 35 Eşitlikte; q: Adsorpsiyon kapasitesi C 0 : İlaç çözeltisinin başlangıç derişimi(ppm) C: İlaç çözeltisinin son derişimi(ppm) V: İlaç çözeltisi hacmi(ml) m: Kullanılan nanoküre miktarı(g) Nanokürelerden 5-FU salım çalışması Değişik formülasyonlarda hazırlanan nanokürelerden 5-FU salım hızını belirlemek için 25 mg ilaç içeren nanoküre örnekleri, 100 ml salım ortamı içeren 250 ml hacimli erlene içerisine konularak çalkalamalı su banyosununa yerleştirildi. Salım çalışması 37 o C de altı saat süre ile ph=7,4 tampon çözeltisinde gerçekleştirildi. Nanokürelerden salınan 5-fluororurasil miktarını belirlemek için 30 dakika aralıklarla salım ortamından 5 er ml lik örnekler alındı ve yerine alınan miktar kadar tampon çözeltiden ilave edildi. Salım ortamından alınan 5 ml lik örneklerin UV spektrofotometresi ile 266 nm de absorbans değerleri belirlendi. Daha sonra kalibrasyon grafiği yardımıyla derişimler bulundu Nanokürelerin denge su içeriklerinin tayini Boş nanokürelerin şişme yeteneklerinin belirlenmesi amacıyla sabit tartıma gelmiş 40 mg nanoküre örnekleri 30 ml saf su içerisinde 24 saat süreyle bekletildi. Bu sürenin sonunda nanokürelerin yüzey suyu uzaklaştırılarak tartıldı. Boş nanokürelerin denge su içeriklerinin hesaplanması amacıyla Eş. 3.2 kullanıldı ve % denge su içerik değerleri Çizelge 4.2 de verildi. ( Ws Wk) x100 W % Denge su içeriği (w/w) (3.2) Burada; Ws : Şişmiş nanokürelerin kütlesi, Wk : Kuru nanokürelerin kütlesidir. k

49 Tutuklanma verimi (TV) Tutuklanma verimi, teorik olarak yüklenmesi gereken ilacın gerçekte ne kadar yüklendiğinin bir ölçüsüdür. İlaç yüklü nanoküreler ezilerek 2 saat süre ile çalkalama banyosu altında 50 ml su ile ilaç ekstrakte edildi. Elde edilen ekstrakt süzülerek ilaç içeriği UV spektrofotometresi ile (266 nm) tayin edildi. Nanokürelerin tutuklama verimi aşağıdaki Eş. 3.3 kullanılarak hesaplandı. Sonuçlar Çizelge 4.3 de sunuldu. D % TV = x 100 (3.3) T Burada; D: Gerçekte nanokürelerin içinde bulunan ilaç miktarı (mg), T: Teorik olarak nanokürelerin içinde bulunması gereken ilaç miktarı (mg).

50 37 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA Bu çalışmada destek malzemesi olarak magnetit içeren kitosan/metil selüloz karışımı kullanıldı. Hazırlama koşulları ve bileşimleri değiştirilerek hazırlanan nanokürelerin etken madde salım değerleri, denge su içerikleri, içerdikleri 5-FU miktarları incelendi. Elde edilen nanoküreler FTIR, DSC, TEM, XRD ile karakterize edildi. Magnetit içeren CS/MC nanokürelerinin salım özelliklerini iyileştirmek amacıyla çeşitli parametreler denendi ayrıca adsorpsiyon yöntemiyle de nanokürelere ilaç adsorbe ettirilerek salım çalışması yapıldı ve hapsetme yöntemi ile karşılaştırıldı Elde edilen sonuçlardan yola çıkılarak ideal salım profili araştırıldı Magnetit İçeren CS/MC Kullanılarak Hazırlanan Nanokürelerin DSC Termogramları Şekil 4.1 de A 1b boş formülasyonlu nanoküre (çbd: 0,11 M, çbs:5 dak, magnetit yüzdesi: %100, CS/MC: 1/1), MC ve CS nin DSC diyagramları görülmektedir. DSC diyagramlarından, metilselülozun Tg değeri 108 o C, kitosanın Tg değeri 150 o C ve A 1b formülasyonlu nanokürenin Tg değeri 117 o C olarak belirlendi. Boş nanokürenin Tg değeri nanoküreyi oluşturan bileşenlerin Tg değerlerinin arasında bulundu. A 1b formülasyonlu magnetit içeren CS/MC nanokürelerde Tg değerinin MC dan yüksek, CS dan düşük olarak bulunması bu polimerlerin karışabilirliğinin kanıtı olarak düşünüldü [1]. Şekil 4.2 de A 1 formülasyonlu nanoküre, A 1b formülasyonlu boş nanoküre ve 5- Fluorourasil in DSC diyagramı verilmektedir. DSC diyagramından A 1 formülasyonlu nanokürenin Tg değeri 138 o C, A 1b formülasyonlu nanokürenin Tg değeri 117 o C ve 5-FU nun erime noktası 282 o C olarak bulundu. Diyagram incelendiğinde ilaç yüklü nanokürenin Tg değerinin boş nanoküreye ait Tg değerinden daha yüksek olduğu görüldü. Bu durum ilacın yapısındaki F - iyonunun CS ın pozitif yüklü amin grubu ile etkileşmesine atfedilebilir. Ayrıca ilaç yüklü nanokürenin DSC diyagramında 5-

51 38 FU ya ait erimenin piki görülmemesi, 5-FU nun nanokürelerde bozunmadan bulunduğunun kanıtı olarak alınabilir. Şekil 4.1. (a) MC, (b) CS, (c) A 1b formülasyonlu boş nanokürelere ait DSC diyagramları

52 39 Şekil 4.2. (a) A 1 formülasyonlu ilaçlı nanoküre, (b) A 1b formülasyonlu boş nanoküre, (c) 5-FU ait DSC diyagramları Magnetit, CS, MC ve A 1b Formülasyonlu Boş Nanokürenin FTIR Spektrumları Şekil 4.3 de Magnetit, CS, MC ve CS/MC oranı 1/1 olan boş nanokürenin FTIR spektrumu görülmektedir. Magnetitin spektrumunda gözlemlenen 598 cm -1 deki bandın Fe-O bağına ait olduğu düşünüldü [15]. CS nin spektrumunda 3 472cm -1 deki geniş bandın birbirini kapatmış olan N-H ve O-H gerilmelerinden kaynaklandığı [15], ve cm -1 deki iki bandın amid gruplarına ait olduğu [1], ve cm -1 deki iki bandın alifatik C-H gerilmelerinden kaynaklandığı [1] ve cm - 1 deki bandın ise C-O grubuna ait olduğu düşünüldü. MC nin spektrumunda cm -1 deki geniş bandın O-H gerilmesine [1], ve cm -1 deki bandların

53 40 alifatik C-H gerilmelerine ait olduğu [1], cm -1 deki bandın C-O grubundan kaynaklandığı düşünüldü. Boş nanokürenin spektrumunda magnetit, CS ve MC ait bandlar hafif kaymalarla gözlendi. Şekil 4.4 de 5-FU, CS/MC oranı 1/1 olan boş ve ilaçlı nanokürelerin FTIR spektrumu görülmektedir. 5-FU spektrumunda cm - 1 de görülen pik C-F gerilme bandına ait olduğu düşünüldü [7]. Bu pik ilaç yüklü nanokürelere ait spektrumda cm -1 de görülürken boş nanokürenin spektrumunda görülmedi. Bu sonuç 5-FU nun hazırlanan nanokürelerin yapısında bozunmadan bulunduğunu göstermektedir. Şekil4.3. (a) Magnetit, (b) CS, (c) MC, (d) A 1b formülasyonlu boş nanokürenin FTIR Spektrumları

54 41 Şekil 4.4. (a) 5-FU, (b) A 1 formülasyonlu nanoküre, (c) A 1b formülasyonlu nanoküre FTIR Spektrumları 4.3. Hazırlanan Nanokürelerin Zeta Potansiyeli ve Tanecik Boyutu Dağılımları Şekil 4.5. Magnetitin zeta potansiyeli

55 42 Şekil 4.6. D 3b formülasyonlu boş nanokürenin zeta potansiyeli Şekil 4.7. D 3 formülasyonlu ilaçlı nanokürenin zeta potansiyeli Şekil 4.8. Magnetitin tanecik boyutu dağılımı

56 43 Şekil 4.9. D 3b formülasyonlu boş nanokürenin tanecik boyutu dağılımı Şekil D 3 formülasyonlu ilaçlı nanokürenin tanecik boyutu dağılımı Şekil 4.5 incelendiğinde magnetitin zeta potansiyeli değerinin sıfıra yakın olması yapının aglomere halde ve kararsız olduğunu göstermektedir. Şekil 4.6 da boş nanoküreye, Şekil 4.7 de ise ilaçlı nanoküreye ait zeta potansiyeli değerleri görülmektedir. Kitosanın yapısında bulunan OH - grupları nedeniyle zeta potansiyeli değeri eksi bir değere kaymıştır. İlacın yapısında bulunan NH grupları nedeniyle de pozitif yüklü iyon sayısı artmış ve potansiyel değeri ilaç içermeyen nanoküreye göre daha küçük bir değere kaymıştır. Şekil 4.8 magnetitin tanecik boyutu dağılımını vermektedir. Şekil 4.8 de görüldüğü gibi magnetit nanopartikülleri aglomere halde bulunduğundan geniş bir dağılım

57 44 göstermiştir. Şekil 4.9 da boş nanoküreye ait tanecik boyutu dağılımı verilmiştir. Şekil 4.9 görüldüğü gibi tanecik boyutunun magnetite nazaran daha küçük olması nedeninin, kürenin hazırlanışı sırasında ultrasonik banyonun kullanılmasından kaynaklandığı düşünülmektedir Şekil 4.10 da görülen tanecik boyutu dağılımında ilacın yapıya girmesiyle boş nanoküreye oranla tanecik boyutunda artma gözlenmiştir. Magnetitin ortalama partikül büyüklüğü 839,6797 nm, boş nanokürenin ortalama partikül büyüklüğü 282,5376 nm, ilaç yüklü nanokürenin ise 306,8044 nm dir. Şekillerden görüldüğü gibi zeta potansiyeli ve tanecik boyutu dağılımı değerleri birbirini desteklemektedir Magnetit ve CS/MC Kullanılarak Hazırlanan Nanokürelerin XRD Spektrumları Şekil a) Magnetit, b) A 1b formülasyonlı nanoküreye ait XRD spektrumları Şekil incelendiğinde magnetititin XRD spektrumunda 2Θ= 35,62-56,82 ve 62,78 değerlerinde görülen pikler magnetit içeren CS/MC nanokürelerde 35,80-57,42 ve 62,88 değerlerinde gözlenmiştir. Bu nedenle magnetitin nanoküre yapısına girmiş olduğu düşünülmüştür.

58 Hazırlanan Nanokürelerin Geçirimli Elektron Mikrograf Görüntüleri Şekil 4.12 de sırasıyla D 3b ve D 3 formülasyonundaki (CS/MC) boş ve ilaçlı nanokürelerin 50 büyütmeli TEM fotoğrafları verilmiştir. Görüntüler magnetit partiküllerin CS/MC nanokürelerin çekirdeğini oluşturduğunu göstermektedir. Benzer sonuçlar literatürde de gözlenmiştir. Yang J. ve arkadaşları [16] yağ/su emülsiyon yöntemini kullanarak magnetit poli ε-kaprolaktam (PCL) nanopartikülleri hazırlamışlar ve nanokürelerin TEM görüntülerini incelediklerinde manyetik partiküllerin PCL nanopartiküllerin çekirdeğini oluşturduğunu ifade etmişlerdir. Şekil (a) D 3b formülasyonlu boş nanokürenin (b) D 3 formülasyonlu ilaçlı nanokürenin 50 büyütmeli TEM görüntüsü 4.6. Magnetit İçeren CS/MC Nanokürelerden 5-Fluorourasilin Kontrollü Salımı Çapraz bağlayıcı derişiminin 5-FU salımı üzerine etkisi Kitosan ve metil selüloz polimerleri GA ile çarpaz bağlanarak Şekil 4.13 de şematize edildiği gibi IPN ağ yapısı oluştururlar. Gluteraldehit ile çapraz bağlanma tepkimeleri Şekil 4.14 ve Şekil 4.15 de, salım sonuçları ise Şekil 4.16 da gösterildi. Çapraz bağlayıcı derişiminin 5-FU salımı üzerine etkisini incelemek amacıyla beş farklı GA A 1 (0,023M); A 2 (0,042M); A 3 (0,058M); A 4 (0,071M); A 5 (0,11M)