Amaç Bu pratiğin amacı öğrencilerin elektroforez yöntemi ve kullanım alanları hakkında bilgi sahibi olmalarını sağlamak

Transkript

1 Biyofizik 2015

2 Amaç Bu pratiğin amacı öğrencilerin elektroforez yöntemi ve kullanım alanları hakkında bilgi sahibi olmalarını sağlamak

3 Hedefler Bu pratiğin sonunda öğrenciler, Elektroforez yönteminin önemi, bileşenleri, kullanım alanları ve çeşitleri hakkında bilgi sahibi olabilmeli

4

5 Elektroforez nedir? İlk kez 1937 yılında Arne tiselius tarafından geliştirilmiş olan elektroforezden, özellikle tıpta ve biyokimyada, kandaki çeşitli protein ve lipidlerin ayrılması, tanınması ve miktarının ölçülmesinde yararlanılır. Ayrıca elektroforezden sanayide yaygın biçimde yararlanılmaktadır.

6 Ortam ph sına göre, (+) ya da (-) olarak yüklenen taneciklerin, bir elektrik alanda, kendi net yüklerine zıt yük taşıyan anot veya katoda doğru farklı hızlarda sürüklenmeleridir. Bu teknik, proteinlerin ve DNA parçalarının analizinde ve ayrışmasında geniş çapta kullanılmaktadır.

7 Temelde: DNA analizi, Protein tanımlama, Molekül ağırlığı, Miktar analizi, Saflık, Saflaştırma amacıyla kullanılmaktadır.

8 ÇALIŞMA PRENSİBİ

9 Elektroforezde Göç Hızı Molekülün net elektriksel yüküne, Molekülün yapısı ve büyüklüğüne, Elektriksel alanın gücüne, Destek ortamın özelliğine, Uygulama ısısına bağlıdır.

10 Elektroforez için 3 temel bileşene ihtiyaç vardır: 1. İyonların hareket edebileceği uygun bir destek ortamı (kağıt,selüloz asetat,nişasta,agaroz jeli ya da poliakrilamit) 2. Elektriksel alanı oluşturmak için doğru akım sağlayacak güç kaynağı 3. Uygun ph da bir tampon çözelti

11 Uygulanış şekillerine göre Yatay Elektroforez (Agaroz Jel) Dikey Elektroforez (Poliakrilamit Jel)

12 KULLANILAN JELLER: Nişasta Agaroz Selüloz Asetat Poliakrilamit (En Geniş Çapta)

13 Katı jel desteği ile ayırımı yapılacak moleküllerin hareketi : Moleküllerin; Yüküne Boyutuna Kimyasal içeriğine Uygulanan elektrik alana bağlı olarak değişir.

14 GÜÇ KAYNAĞI Elektrotlar arasında elektrik akımı sağlar. V= I.R (ohm yasası) P=I 2 R (Üretilen güç ısı şeklinde açığa çıkar ve elektroforez aygıtı, jelin sıcaklığını arttırmaksızın ancak belli miktarda yükü dağıtabilir.)

15 Tamponlar - Elektrik akımını taşımak - Elektroforezin yürütüldüğu ph yı belirlemek - Yürütülen molekülun elektriksel yükünü belirlemek Tamponun iyonik gücü ise ; - İyonik bulutun kalınlaşması - Migrasyon oranı - Elektroforetik zonların daha keskin ayrılması moleküllerin hareket etmesinde önemlidir. - Barbital tamponlar & Tris-borik asid- EDTA tamponları en iyi bilinen tamponlardır.

16 Boyama - Elektroforez tamamlandıktan sonra destek ortamı bir boya ile muamele edilerek ayrılmış fraksiyonların identifikasyonu sağlanır. -Numune tarafından alınan boyanın miktarı ; - proteinin tipine - sabitleyici ajanların oluşturduğu denatürasyon derecesine bağlıdır. En iyi bilinen boyalar ;

17 Agaroz jel elektroforezi Destek maddesi olarak bir karbonhidrat polimeri olan agaroz veya agaropektin kullanılır. Bu maddelerin proteinlere affinitesi az olduğundan protein bantları birbirinden daha iyi ayrılır. Ayrıca çok iyi şeffaflaştıkları için dansitometrik değerlendirmeleri daha güvenilirdir.

18 Bu nedenle rutin uygulamalarda sıkça kullanılmaktadır. Deney süreside oldukça kısadır (30-90 dk.) Serum proteinleri, nükleik asitler, hemoglobin varyantları, laktat dehidrogenaz ve kreatin kinaz izoenzimleri, lipoprotein fraksiyonları ve diğer bazı maddelerin analizlerinde başarı ile kullanılmaktadır.

19 Gerekli Malzemeler Güç Kaynağı Agaroz Tampon Çözeltiler (TBE/TAE) Etidyum bromür Yükleme Tamponu (bromophenol blue)

20 Elektroforez Cihazı

21 Agaroz Agaroz kırmızı bir alg türü olan Agar agar dan izole edilen doğrusal bir polisakkarittir. Agaroz sıcak suda çözünür ve soğutulduğu zaman polimerde karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur. Bu oluşum geri dönüşümlüdür.

22 Agaroz Hazırlanacak olan agaroz jel tamponlarla birlikte kullanılır ve kullanılacak olan tamponun düşük ph sı DNA molekülü içerisindeki asidik fosfat gruplarının tamamen iyonize olmasını sağlar ve DNA molekülünün negatif yük ile yüklenmesini kolaylaştırır.

23 Saf agaroz toz biçimdedir ve oda sıcaklığında suda ya da buffer (tampon) içerisinde çözünmez. Kaynama noktasında çözünür hale geçer 65 C de döküm için hazır hale gelir ve 37 C' nin altına düşünce katılaşmaya başlar.

24 Tampon Çözeltiler (TBE/TAE) Elekroforezde TBE ve TAE sıklıkla kullanılan iki tampondur. Burada; T, Tris tir bu kimyasal solusyon sabit bir ph değerinde kalmasını sağlar. B ve A borik asit ve asetik asittir. Bunlar tampon (buffer) için doğru iyon konsantrasyonu sağlar.

25 Tampon Çözeltiler (TBE/TAE) E, EDTA dır. Kimyasal olarak açılımı Etilen daimin tetra asetik asit olan EDTA magnezyum gibi divalent katyonları bağlar ve bilinmeyen toksik etkiye sahip kirleticilerle kolayca ilişki içerisine girebilir. Bu şu nedenle önemlidir; çoğu nükleazlar aktiviteleri için divalent katyonlara ihtiyaç duyarlar EDTA örnek jelde ilerlerken örneğin nükleazlar tarafında degrede edilmesini engeller.

26 Etidyum bromür DNA nın görünür hale gelebilmesi için etidyum bromürün DNA bağları arasına bağlanarak 300 veya 360nm de ışığı absorblaması sonucu flüoresan etki göstermesi ile olur. Bu etki DNA konsantrasyonuna bağlı olarak kuvvetli veya zayıf olabilir.

27 İzole edilen DNA nın genomik ya da plazmid DNA sı olmasına göre jeldeki görünümleri farklılık gösterir. Genomik DNA keskin bir bant ile bu bandın aşağı ve yukarı kısmına doğru yayılan bir görüntü verir. Plazmid DNA'sının jeldeki görüntüsü genellikle DNA nın üç farklı biçimi gözlenir. 1.Süper sarmal biçim 2.Gevşek sarmal biçim 3.Doğrusal biçim (izolasyon sırasında kırılmalar sonucunda oluşur) Eğer saflaştırma işlemi doğru bir biçimde yapılmışsa jelde sadece süper sarmal biçim gevşek sarmal biçim görünür.

28 DNA / RNA ve Protein Yükleme Boyaları DNA, RNA ve proteinlerin agaroz jele yüklenmesi esnasında kullanılırlar. Bromofenol Blue Elektroforez esnasında 3 fonksiyonları vardır: 1. Örneğe karıştırılan boya, örneğin yüklenmesini kolaylaştırır. 2. Örneğin yoğunluğunu arttırdığı için örneğin yuvacıkta etkin bir dağılımını sağlar. 3. Boyaların kendileri de örnekten bağımsız olarak jelde yürürler. Bu da kullanıcının nükleik asit veya proteinin ne kadar yol aldığını tahmin etmesini sağlar.

29

30 Agaros Jel Elektroforezinde por çapları ortamdaki agaros konsantrasyonu ile ayarlanır. Örnekler jel içinde oluşan porlar üzerinde hareket eder.

31 Poliakrilamid jeli elektroforezi -Poliakrilamid jel elektroforezinde 20 yada daha fazla fraksiyon elde edilir. -Bu nedenle genetik varyantlar ve izoenzim analizleri olmak üzere, protein ve nükleik asit çalışmalarında tercih edilir. -Separasyon; moleküllerin büyüklüğüne ve yüküne bağlıdır.

32 SDS-poliakrilamid jel elektroforezi - Bu elektroforez tipinde β-mercaptoethanol kullanılır amaç disulfid köprülerini indirgemektir. - β-mercaptoethanol & SDS, numune ile 5 dakika kaynatılır. - SDS: Kuvvetli deterjan etki ile proteinleri denatüre eder. SDS proteinlerin yüzeyini kaplar ve proteinlerin hidrofobik bölgelerine bağlanır. - Separasyon moleküler büyüklüğe göre gerçekleşir. - Genellikle proteinlerin molekül ağırlığı ve proteinlerin saflık tayininde kullanılır.

33

34 SDS - PAGE SDS-PAGE ile proteinler, net yük ve şekillerine göre değil, sadece molekül büyüklüklerine göre, birbirinden ayrılırlar. SDS in bağlanmasıyla, doğal yapısını kaybeden proteinler, aynı şekil ve yük/kütle oranına sahip olurlar elektriksel alan içinde proteinlerin hareketi sadece molekül ağırlıklarına bağlıdır. Daha küçük olanlar, daha hızlı sürüklenir ve proteinlerin alt üniteleri birbirinden ayrılır.

35 SDS-PAGE ÖRNEKLERİ

36 Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE): PAGE elektroforezinde kesikli ve kesiksiz olmak üzere 2 ayrı tampon sistem kullanılabilir. Kesiksiz sistemde tek bir ayırıcı jel vardır. Kesikli sistemde ise jel farklı tamponlarda hazırlanan 2 kısımdan oluşur. 1- Büyük porlu yükleme jeli 2- Küçük porlu ayırma jeli

37 Molekül Ağırlığı Tayini Standart Örnek Molekül ağ.(log) molekül ağırlığı bilinmeyen protein Sürüklenme hızı

38 Yükleme jeli Ayırma jeli x y A İşaret boyasına ait bant A bantı için Rf = x (cm) Göreceli(rölatif) göç hızı, sürüklenme hızı, mobilite y (cm)

39 Kapiller elektroforez - Sistem ters cevrilmis U seklinde duran ve ucları tampon dolu tuplere batmıs durumda iken yüksek gerilim uygulanan bir borudan oluşur. - Dış yüzeyi; ya bir sıvı kılıfı yada soğuk hava akımı ile soğutularak ısınma sorunu ortadan tamamen kalkar. - Çok kırılgan olan bu kapillerin kırılmasını önlemek icin üzeri poliimid tabakası ile kaplanmıstır. - Poliimid tabakasının detektor önune gelen kısmı ya soyularak yada yakılarak bir pencere açılır. - Bu pencere, spektrofotometre kuveti görevi görür. - Elektroforezle ayrılan moleküller bu pencereden geçerken ısığı absorbe ederler. - Absorbe edilen ışık detektör tarafından saptanır. - Bilgisayar sistemi aracılığı ile absorbsiyon pikleri ekrana verilir.

40

41 İmmünoelektroforez - İlk kez 1953 yılında Grabar ve Williams isimli iki bilim adamı, jel elektroforezi sonrası immün diffüzyon uygulamışlardır. - İmmünelektroforez ile bir çok spesifik protein gösterilebilir: - Prealbumin, albumin, α1- asit glukoprotein, α1-antitripsin, tiroid bağlayan globulin, α1-kimotripsin, α2-hs glukoprotein, α2- makroglobulin, seruloplazmin, haptoglobin, antitrombin III, C1 esteraz inhibitörü, hemopeksin, β lipoprotein, transferrin, C3, C4, C5, properdin faktör B, plazminojen, IgA, IgM, IgG. - Bu yöntem bu gün klinik laboratuarlarda, immünglobulinlerin gösterilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. - İmmunelektroforez için agaroz jel kullanılır. - Bu yöntemin prensibi; serum proteinlerinin elektroforetik ayrımından sonra, aranan proteine karşı antiserum ekleyerek antijen-antikor presipitatlarının gösterilmesidir.

42 Diğer elektroforez yöntemleri - iki yönlü Jel Elektroforez - İzoelektrik Odaklanma - O Farrell Metodu - Pulse Field Jel Elektroforez (PFGE) - Preparative Gel electroforezi - Protein Elektroforezi - Serum Protein Elektroforez - Hemoglobin Elektroforezi - Lipoprotein Elektroforezi