AMİNO ASİTLER, PEPTİTLER VE PROTEİNLER II: Peptitler ve Proteinler

Transkript

1 AMİNO ASİTLER, PEPTİTLER VE PROTEİNLER II: Peptitler ve Proteinler 1

2 Peptitler amino asitlerden oluşmuş zincirlerdir. İki amino asit molekülü bir amit bağı ile kovalent olarak birbirine bağlandıklarında bir dipeptit oluşur. Bu bağın oluşumu için bir amino asidin α-karboksi grubundan ve diğer bir amino asidin α-amino grubundan bir molekül suyun ayrılması gerekir. 2

3 Peptit bağı oluşumu bir kondensasyon reaksiyonudur. Biyokimyasal şartlar altında bu reaksiyonun dengesi amino asit oluşumu yönündedir. Reaksiyonun termodinamik olarak tercih edilir hale gelmesi için karboksil grupları kimyasal olarak aktive edilmelidir. Üç amino asit iki peptit bağı ile birbirlerine bağlandıklarında bir tripeptit ve benzer şekilde dört amino asitten tetrapeptit ve beş amino asitten pentapeptit oluşur. Genellikle 8 ve üzeri amino asitten oluşan peptitler oligopeptit olarak isimlendirilirler. 20 ve üzeri amino asitten oluşan peptitler ise polipeptit olarak adlandırılırlar. Üç boyutlu yapıya katlanarak bir fonksiyon gösteren polipeptitlere protein adı verilir. 3

4 Peptit yapısında yer alan bir amino asit birimi (amino grubundan bir hidrojen atomu ve karboksi grubundan bir hidroksil molekülü kaybetmiş olan kısım) genellikle amino asit kalıntısı olarak adlandırılır. Uçta serbest bir α-amino grubu taşıyan amino asit kalıntısı amino terminali veya N-terminali olarak, serbest bir α-karboksil grubu taşıyan amino asit kalıntısına karboksi terminali veya C-terminali denir. 4

5 Peptitler zincirin her iki ucunda serbest bir amino ve serbest bir karboksil grubu taşırlar. Bu gruplar pk a değerlerinin altında ve üstünde farklı yüklenirler. Ayrıca zincir içindeki iyonlaşabilen yan gruplara sahip amino asit kalıntıları da pk a değerlerinin altında ve üstünde farklı yüklenirler. Peptit bağı oluşumuna katılan amino ve karboksil grupları ise yük alamazlar. 5

6 Küçük peptitler oldukça düşük hücresel konsantrasyonlarda etkilerini gösterirler. Nonapeptit oksitosin ve bradykinin vücutta hormon olarak görev alır. Pek çok antibiyotik peptit yapılıdır, ayrıca amanitin gibi mantar zehirleri de küçük peptitlerdir. Daha fazla amino asit sayısına sahip olan insulin ve glukagon polipeptit hormonlarıdır. Proteinlerin amino asit sayıları son derece farklılık gösterebilir. Bazı proteinler tek polipeptitten oluşurken (çoklu alt üniteli), diğerleri bir veya daha fazla polipeptidin kovalent olmayan bağlarla bir araya gelmesiyle oluşmuştur. Bir çoklu alt üniteli proteini oluşturan polipeptit zincirlerinden her birine alt ünite adı verilir. 6

7 Bazı proteinler birbirlerine kovalent bağlarla (genellikle disülfit) bağlanmış polipeptit zincirlerinden oluşmuştur. Bu durumda proteini oluşturan her bir polipeptit alt ünite olarak değil zincir olarak isimlendirilir. Polipeptitler kuvvetli asitlerle ısıtılmak suretiyle tamamen kendilerini oluşturan amino asitlere hidrolizlenebilirler. Her bir polipeptit için elde edilen amino asitlerin bileşimi karakteristiktir. Ancak hidroliz tek başına yeterli değildir, bazı yan reaksiyonlar nedeniyle bazı amino asitlerin tayini zordur. Asparajin ve glutamin işlem sırasında aspartat ve glutamata dönüşürken, triptofanın yan zinciri tamamen degrade olur. Serin, treonin ve tirozinin küçük bir kısmı ise parçalanır. 7

8 Pek çok protein sadece amino asit kalıntılarından oluşmuştur. Böyle proteinlere basit proteinler denir. Ancak, bazı proteinler kalıcı olarak başka moleküllerle birleşmişlerdir. Bu tür proteinlere konjuge proteinler adı verilir. Konjuge amino asitler ağlanmış olan gruba bağlı olarak lipoproteinler, glikoproteinler ve metaloproteinler gibi gruplara ayrılabilirler. Proteinler görevlerini yerine getirebilmeleri için üç boyutlu yapıya katlanmak zorundadır. Proteinler, üç boyutlu yapılarının incelenebilmesi amacıyla dört temel yapıya ayrılırlar. 8

9 Bir polipeptit zincirinde birbirine kovalent bağı ile bağlanmış amino asit kalıntıları o polipeptidin primer yapısını oluşturur. Primer (birincil) yapı için en önemli öge o polipeptidin amino asit dizilimidir (sekuansıdır). Sekonder (ikincil) yapı amino asitlerin birbirini tekrar eden kararlı düzenlenmelere sahip olmasıyla ortaya çıkar. 9

10 Tersiyer yapı proteinlerin üç boyutlu yapıya nasıl katlandıklarının bilgisini verir. Bir protein birden fazla alt birimden oluşuyorsa bu alt birimlerin boşluktaki yerleşimleri kuaterner yapıyı oluşturur. Protein yapı ve fonksiyonu hakkındaki bilgilerimiz ayrı ayrı proteinler üzerinde yapılan çalışmalardan elde edilmiştir. Bir proteini ayrıntılı olarak çalışabilmek için araştırmacıların bu proteini diğer proteinlerden ayırabilmeleri gereklidir. Proteinleri ayırmak için boyut, yük ve bağlanma spesifikliği gibi proteinlerin farklı özelliklere sahip olmasından yararlanılır. 10

11 Protein kaynağı genellikle bir doku veya hücredir. Protein saflaştırma yöntemlerinin ilk basamağı hücrelerin parçalanarak açılması ve içlerindeki proteinlerin çözeltiye alınmasıdır. Bu çözeltiye ham ekstrakt adı verilir. Fraksiyonlama yapmak veya spesifik organelleri izole etmek amacıyla kademeli (diferansiyel) santrifüj uygulanabilir. Dokular izotonik bir sükroz çözeltisi içinde mekanik olarak homojenize edilir. Küçük ve büyük moleküller farklı hızlarda santrifüj uygulanarak birbirinden ayrılabilir. Farklı yoğunluktaki molekülleri birbirinden ayırmak için farklı yoğunluk gradyenti oluşturularak izopiknik santrifüj uygulanır 11

12 12

13 Ekstrakt veya organel hazır olduğunda içerdiği proteinlerden bir veya daha fazlasını saflaştırmak üzere fraksiyonasyon işelmleri uygulanır. Bu amaçla ph, sıcaklık, tuz konsatrasyonu ve iyonik şiddetin bir fonksiyonu olan protein çözünürlüğünden yararlanılarak tuzla fraksiyonlu çöktürme kullanılır. Genellikle amonyum sülfat kullanılarak proteinler fraksiyonlu olarak çöktürülürler. Bu amaçla protein içeren çözeltiye belli bir yüzde için hesaplanmış olan amonyum sülfat miktarı katı olarak eklenir. Farklı amonyum sülfat doygunluklarında farklı proteinler çöker. 13

14 Eğer amonyum sülfat ile çöktürme ile fraksiyonlama yapılmışsa daha sonraki işlemleri bozacağı için tuzun uzaklaştırılması gerekir. Bu amaçla diyaliz işleminden yararlanılır. Yarı geçirgen bir zar kullanılarak proteinler tuz ve diğer küçük moleküllerden kurtarılabilir. 14

15 Proteinleri fraksiyonlamak için kullanılan en güçlü yöntem kolon kromotografisidir. Uygun kimyasal özelliklere sahip porlu katı bir madde (sabit faz) kolona doldurulur ve tamponlanmış bir çözelti (hareketli faz) sabit fazın içinden geçer. Örneği içeren çözelti kolonun yüzeyinden tatbik edilir ve mobil fazla taşınarak kolonun içine doğru ilerler. Kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre sabit fazla en fazla etkileşen moleküller en yavaş olarak ilerlerken, sabit fazla en az etkileşen moleküller en hızlı olarak ilerler. Benzer şekilde hareketli fazla etkileşimler de ilerlemnin hızını tayin eder. Bu şekilde farklı proteinler bantlar halinde elde edilir 15

16 16

17 17

18 İyon değişim kromatografisinde belirli bir ph da proteinlerin farklı net elektrik yüküne sahip olmaları esasına dayanarak ayırma yapar. Ayırmayı optimize etmek için mobil fazın iyonik gücü kademeli olarak arttırılır. Jel geçirgenlik (moleküler elek) kromatografisinde proteinler boyutlarına göre ayrılırlar. Bu amaçla genellikle Sephadex olarak bilinen belirli büyüklükte porlara sahip boncuklar sabit faz olarak kullanılır. Affinite (ilgi) kromatografisi proteinleri bağlanma özelliklerine göre ayırır. İlgilenilen proteine spesifik olarak bağlanabilecek doğru dolgu maddesinin seçimi son derece önemlidir. 18

19 En gelişmiş kromatografik yöntemlerden birisi de yüksek-perfromans sıvı kromatografisidir (HPLC). HPLC yönteminde yüksek basınçlı pomplar ve çelik kolonlar kullanılarak deneme süresini ve deney sonunda elde edilen çözünürlüğü önemli ölçüde arttırır 19

20 Proteinlerin ayrılmasında kullanılan bir başka önemli teknik, yüklü proteinlerin bir elektrik alanda göç etmesi esasına dayanan elektroforezdir. Elektroforez, daha basit metotlar mevcut olduğundan dolayı genellikle büyük ölçekli protein saflaştırılmasında kullanılmaz. Ancak proteinlerin bir arada görünür hale getirilmesini ve ayrılmasını sağladığından son derece önemli bir analitik metottur. En yaygın olarak kullanılan protein elektroforez metotu Sodyum dodesilsülfat- Poliakrilamit jel elektroforezidir (SDS- PAGE). Bu yöntemde proteinler SDS tarafından eksi yükle kaplandıkları için ayrım sadece proteinin molekül ağırlığına göre olur. 20

21 İki boyutlu SDS-PAGE yönteminde ise proteinler önce izoelektrik noktalarına daha sonra ise molekül ağırlıklarına göre ayrıldıkları için çözünürlük ve hassasiyet çok daha yüksektir. 21

22 Eğer bir enzim saflaştırılıyorsa, her bir saflaştırma basamağından sonra, enzim aktivitesi ve toplam protein miktarı belirlenir. Bu iki miktar arasındaki oran spesifik aktiviteyi belirler. Genellikle her bir saflaştırma adımında aktivite azalırken spesifik aktivite artar. 22

23 Bir proteinin saflaştırılması, yapı ve fonksiyon araştırmaları için ilk basamağı teşkil eder. Bir proteinin primer yapısı o protein hakkında önemli bilgiler taşır. Primer yapı bir proteinin kendisine özgü üç boyutlu yapıya nasıl katlanacağının bilgisini taşır ve bu üç boyutlu yapı proteinin fonksiyonunu belirler. Farklı fonksiyonlara sahip olan proteinler farklı amino asit dizilimlerine sahiptir. İnsanlarda görülen binlerce genetik rahatsızlık hatalı proteinlerin oluşmasıyla etkilerini gösterir. Bu hatalı proteinlerin üçte birinde amino asit diziliminde sadece tek bir değişiklik vardır. Farklı türlerdeki benzer görevli proteinlerin yapıları incelendiğinde bu proteinlerin benzer amino asit dizilimlerine sahip oldukları görülür. 23

24 Bununla birlikte amino asit dizilimi her protein için sabit değildir. İnsanlardaki proteinlerin %20 ila %30 unun polimorfik olduğu tahmin edilmektedir. Polimorfik proteinler insandan insana farklı amino asit dizilimlerine sahip olabilirler. Polimorfik proteinlerde görülen sekuans farklılıkları genellikle proteinin görevini yerine getirmesinde bir sorun teşkil etmezler. Protein yapısında bazı bölgeler o proteinin üç boyutlu yapıya katlanmasında çok önemli görevler aldıklarından korunmuşlardır. 24

25 Bir proteinin amino asit dizilimi kimyasal olarak tayin edilebildiği gibi kendisine karşılık gelen genin nükleotid dizilimi kullanılarak da aydınlatılabilir. Günümüzde pek çok türe ait binlerce proteinin amino asit dizilimi aydınlatılmıştır. Amino terminal amino asidini tanımlanması için 1-floro-2,4- dinitrobenzen (dinitroflorobenzen, DNFB, Sanger Reaktifi), dansil klorür ve dabsil klorür gibi farklı reaktifler geliştirilmiştir. Amino terminali reaktif ile işaretlendikten sonra peptit hidrolizlenir ve işaretli olan amino asit tanımlanır. Ancak bu yöntemlerle sekuans tayini yapılamaz çünkü hidroliz basamağı peptidi parçalar. 25

26 26

27 Tüm bir polipeptidin dizi analizinin yapılması için Edman degradasyonu metodu kullanılır. Edman yöntemimde sadece N-terminal amino asidi koparılır ve analiz edilir. Peptidin geri kalanı ise aynen korunur. Peptit bir polimere tutturularak Edman sekuans analizinin tamamen otomatik bir şekilde yapılması sağlanabilir. Ancak yapısında 50 dan fazla amino asit içeren peptitlerin bu yöntemle tayin edilmesi mümkün değildir. Bu nedenle daha büyük proteinlerin yapısı aydınlatılmak isteniyorsa, Edman degradasyonundan önce protein özel yöntemlerle daha küçük parçalara ayrılır. Bu amaçla öncelikle disülfit bağları kırılır, daha sonra spesifik proteazlarla protein parçalanır. 27

28 28

29 29

30 Proteazlar arasında sindirim sistemi enzimi tripsin polipeptit bağlarını lizin ve arjinin amino asitlerinden keser. Bu sebeple tripsin ile muamele edilmiş olan polipeptitten oluşmuş olan parçalar tahmin edilebilirler. Tripsin veya başka ajanlarca oluşmuş olan peptit parçaları kromatografik veya elektroforetik yöntemlerle tayin edilebilirler. İlk olarak tripsinle parçalama yapıldıysa farklı bir proteaz kullanılarak ayrı bir parçalama denemesi gerçekleştirilerek peptit parçalarının nasıl birleştikleri bulunur. Eğer primer yapıda disülfit bağları içeren bir peptit söz konusu ise bu disülfit bağlarının yerlerinin bulunabilmesi için disülfit bağları kırılmadan tripsin ile muamele edilir. 30

31 31

32 Bir polipeptitin dizilimini bulmak için farklı yöntemler de kullanılabilir. Kütle spektrometreleri kullanılarak amino asitten oluşan peptitler saniye gibi bir sürede analiz edilebilirler. Hızlı DNA sekuans analizörlerinin gelişimi ile söz konusu proteinin sentezlendiği genin analizi ile de protein dizilimi belirlenebilir. Ancak bu yöntemlerin uygulanabilir olması için ilgili proteinin veya genin dizi analizinin daha önceden yapılmış olması gereklidir. Bu sebeple yeni keşfedilmiş bir proteinin analizinde doğrudan analiz metotları kullanılmalıdır. 32

33 Bir organizmanın DNA sının dizilimine o canlının genomu adı verilir. Farlı organizmalara ait genom bilgileri veri tabanlarında mevcuttur. Belirli bir organizmanın belirli bir zamanda sentezlediği proteinlerin tamamına ise proteom adı verilir. Proteom analizi genom analizine göre çok büyük zorluklar taşır ancak bir organizmanın proteomunun aydınlatılması ile çok önemli bilgiler elde edilebilir. 33

34 Pek çok peptit farmakolojik olarak önem taşır ve üretimleri ticari bir öneme sahiptir. Bu amaçla 3 farklı yöntem kullanılabilir. Dokulardan peptitler izole edilebilir, Genetik mühendisliği kullanılarak çeşitli bakterilere ürettirilebilir veya, doğrudan kimyasal sentezleri gerçekleştirilebilir. Her yöntemin kendine göre avantaj ve dezavantajları vardır ancak günümüzde kullanılan güçlü teknikler nedeniyle doğrudan kimyasal sentez yöntemi önem kazanmaktadır. 34

35 35