Protein Analiz ve Saflaştırma Yöntemleri Dr. Ayhan ÜNLÜ

Transkript

1 Protein Analiz ve Saflaştırma Yöntemleri Dr. Ayhan ÜNLÜ

2 PROTEİNİN SAFLAŞTIRILMASI hücre ekstraktından, proteinin izolasyonu İzolasyon öncesi işlemler - Hücre fraksiyonunun seçimi: sitoplazma, mitokondri, lizozomal, mikrozomal? - Organ tespiti: mitokondri kalp lizozomal /mikrozomal fraksiyonlar KC

3 Saflaştırma Şeması Biyolojik materyal (ör: doku) ekstraksiyon Hücre ekstraktı Hücre enzimatik bütünlüğünün kimyasal (membran yapısının) Fiziksel bozulması mekanik Total hücre içeriği hücre lizatı

4 Saflaştırma Şeması Çözünmeyen hücre debrisi (uzaklaştırılır) diğer protein, iyon,su vb, ortamdan uzaklaştırılması Hücre lizatı süpernatan Saf Protein Primer yapı tayini Santrifüj Filtrasyon hücresiz lizat (nükleik asit, proteinler küçük moleküller) Ardışık Saflaştırma işlemleri

5 Saflaştırma Basamakları Ekstraksiyon Proteinin saflaştırılması Suyun uzaklaştırılması Tuz ve küçük iyonların uzaklaştırılması Diğer proteinlerden ayrılması Primer yapı tayini Amino asitlerin cins, sayı ve sırası

6 Ekstraksiyon Hücre organellerinin elde edilme safhası İstenilen proteinin yapısını ve biyolojik aktivitesini değiştirmemek için: C ortam sıcaklığı(tüm işlemler için) - Blenderde parçalama(kıyılmış doku örneği) - Uygun tampon (ph, iyonik güç) seçimi ör: 0.05 M fosfat tamponu, PH 7.4 Kıyılmış doku örneği, 1 /10 oranında tamponla karıştırılır

7 Kimyasal Yöntemler Deterjanlar: Triton X-100, vb Membran yapısını bozarak hüce içeriğinin ortama geçmesini sağlarlar - Pahalı - Proteinleri denatüre edebilir - Ortamdan hemen uzaklaştırılmalıdır

8 Mekanik yöntemler Fransız Presi Çelik bir kaba yerleştirilen hücre süspansiyonu üzerine uygulanan yüksek basınçla, hücreler küçük bir delikten geçirilir

9 Mekanik yöntemler Sonikasyon Hücre süspansiyonuna daldırılan sonikatör, titreşim yaparak ve yüksek ses dalgalarıyla hücre bütünlüğünü bozar

10 ULTRASONİKATÖR

11 Mekanik yöntemler Homojenizasyon Cam homojenizatör kabında pistonun düzenli dönüşü ya da vuruşu ile sağlanan mekanik güçle, hücreler piston ve cam çeper arasında sıkıştırılır hücre zarı parçalanır,hücre içeriği tampona geçer, elde edilen süspansiyon, bütünlüğü bozulmamış bir çok organeli içerir: HOMOJENAT olarak adlandırılır

12

13 Saflaştırmada Kullanılan Prensipler Proteinler fiziksel özellikler büyüklük/kütle şekil çözünürlük polarite affinite, vb saflaştırma

14 Saflaştırmada Kullanılan Prensip Büyüklük kütle Yöntem santrifüj diyaliz ultrafiltrasyon jel filtrasyonu kromatografisi jel elektroforezi (SDS-PAGE) çözünürlük Fraksiyonel presipitasyon

15 Saflaştırmada Kullanılan yük polarite Prensip Yöntem iyon exchange kromatografisi Elektroforez? izoelektrik fokusing adsorbsiyon kromatografi revers faz kromatografi (HPLC) hidrofobik etkileşim kromatografi Biyolojik aktivite Bağlanma affinite kromatografisi

16 SANTRİFÜJ Sulu karışımlar(süspansiyon/homejenat) a santrifüj kuvveti uygulandığında, daha büyük ve yoğun komponentler,daha hızlı çökerler Düşük hızlı santrifüj:tam hücreleri, deney ortamından ayırır Yüksek hızlı santrifüj: Farklı büyüklük ve yoğunluktaki subselüler organelleri ayırır

17

18 SANTRİFÜJLEME Santrifüjler yardımıyla yüksek hızda döndürülerek merkezkaç kuvveti oluşturulan bir alanda partiküllerin davranışına göre ayırım sağlayan teknik

19 Büyüklük kütle differensiyel santrifüj homojenat nükleus hücre debrisi mitokondri peroksizom lizozom mikrozom sitozol Homojenat, gittikçe artan santrifüj kuvvetine maruz bırakılarak fraksiyonlarına ayrılır Kütle büyüdükçe, çökmesini sağlayan santrifüj gücü azalır

20 Zonal Ultrasantrifügasyon Yoğunluk esasına dayanır (daha hassas) Yoğunluk ve büyüklük olarak birbirine çok yakın olan organeller, Differansiyel santrifüjle ayrılamaz Bu amaçla zonal santrifügasyon kullanılır Çeşitli tipleri vardır: Sükroz Histopak

21 Kademeli Gradient Santrifüj numune ultrasantrifüj 100,000 x g 24 h sukroz gradienti (% 5-20) Tüpün dibi delinir fraksiyonlar toplanır en yoğun en hafif

22 TUZ İLE ÇÖKTÜRME Proteinlerin su içerisindeki çözünürlükleri çok azdır. Ortama bir miktar nötral tuz (NaCI ve (NH 4 ) 2 S0 4 gibi) ilave edildiğinde (düşük iyonik kuvvet) proteinlerin yüzeyinde veya iç kısımlarında bulunan hidrofilik grupların su ile etkileşim derecesi artar, bu durumda proteinlerin çözünürlükleri de artar. Bu olaya salting in denir. Protein çözeltisine çok miktarda nötral tuz ilave edildiğinde, proteinlerin genellikle iç kısımlarında yer alan hidrofobik gruplar etrafındaki su molekülleri tuz iyonları tarafından uzaklaştırılır, bu durumda hidrofobik grupların birbirleri ile olan etkileşimleri artar ve proteinler çökerler. Bu olaya ise salting out denir.

23 TUZ İLE ÇÖKTÜRME Protein çözeltisinde hidrofobik alanları büyük ve daha fazla olan proteinler, hidrofobik alanları küçük ve daha az olanlarınkine göre daha çabuk birbirleri ile etkileşerek çökerler. Bu olaya proteinlerin fraksiyonlanması denir. Bu işlem için protein çözeltisine farklı derişimler de amonyum sülfat eklenir, oluşan çökelti santrifüjleme ile geri elde edilir ve uygun bir tamponda tekrar çözülür. Her çökeltide ilgili protein, analiz yöntemleriyle aranır. Bu şekilde ilgili proteinin bulunduğu çökelti fraksiyonu, diğer protein fraksiyonlarından uzaklaştırılmış olur. Böylece çöktürme işlemi ile kısmi bir saflaştırma yapılmış olunur.

24

25 Amonyum sülfat ile Fraksiyonel Presipitasyon % 20 (NH 4 ) 2 SO 4 % 40 (NH 4 ) 2 SO 4 protein çözeltisi hedef protein santrifüj presipitat Amonyum sülfat, Proteinleri - Presipite eder (salting-out) - Stabilitesini artırır(kosmotropik iyon )

26 Büyüklük/kütle diyaliz Protein çözeltilerindeki tuzların uzaklaştırılmasında veya çözelti tamponunun değiştirilmesinde çoğunlukla diyaliz işlemi uygulanılır. Bu işlem için özel imal edilmiş, genellikle selüloz asetattan yapılmış, gözenekli ve küçük molekülleri geçiren ancak büyük molekülleri geçirmeyen yarı geçirgen bir membrandan oluşan diyaliz torbası kullanılır.

27 Büyüklük/kütle diyaliz Semipermiabl membran homojenat tampon Diyaliz başı Diyaliz sonu Diyaliz:molekül büyüklüğüne bağlı diffüzyon Semi-permeabl (ultramikroskobik porları bulunan) selefon membran aracılığla filtrasyon Proteinler, tuz, iyon ve küçük moleküllerden ayrılır

28 DeSALTING COLON Bu yöntem tuzların uzaklaştırılması ve tampon değiştirilmesinde diyalize göre daha hızlı olmasına rağmen, küçük hacimlerde uygulama yapılması ve işlem sona erdiğinde oldukça seyreltik bir protein çözeltisi elde edilmesi nedeniyle dezavantajlıdır. Bu işlem için genellikle Sephadex w G25 veya BioGel P-6 gibi küçük gözenekli gel filtrasyon matriksleri kullanılır.

29 ULTRAFİLTRASYON Ultrafiltrasyon protein saflaştırma adımlarında çok fazla kullanılan bir tekniktir. Ultrafiltrasyon sistemi basınç uygulanacak özel bir üniteden, moleküllerin ayrılmasında kullanılacak farklı gözenekli membranlardan (1.000 Da dan Da kadar) ve basınç sağlayan aletlerden oluşmaktadır. Ayrıca, küçük hacimlerin deriştirilmesinde ise santrifüjleme ile filtrasyon yapan özel filtreli tüplerde kullanılabilir.

30 ULTRAFİLTRASYON homojenat hücreler/ proteinler membran Prensip olarak diyalize benzer (büyüklük/kütle) Ultrafiltrasyon tüpünün alt kısmında yarı geçirgen bir membran bulunur Üstten uygulanan basınçlı azot gazı ile, çözücü ve küçük moleküller membran dışına çıkar

31 Liyofilizasyon (Dondurarak Kurutma) Isıya hassas materyallerin kurutulma veya deriştirilmesinde kullanılan en etkili metotlardan biridir. Ayrıca, biyolojik materyallerin taşınması veya depolanması gibi durumlarda da tercih edilmektedirler. Liyofilizasyon, donmuş bir materyalden bir çözücünün (su) doğrudan vakum altında buharlaştırma ile uzaklaştırılması işlemiyle yapılan bir kurutma tekniğidir.

32 Kromatografik Yöntemler Kromatografi:madde karışımlarının, sabit ile mobil faz arasında, büyüklük, şekil, taşıdıkları yük, çözünürlük, vb. özelliklerine göre,dağılmaları,ayrılmaları Protein karışımı depo (tampon) mobil faz (tampon) sabit faz (katı porlu matriks) elüent Kolon kromatografisi:proteinlerin saflaştırılmasında sıklıkla kullanılır Kolon, proteinleri seçici adsorblayan bir maddeyle (katı porlu matriks) doldurulur SABİT FAZ Protein karışımı kolona tatbik edilir Tampon çözelti (MOBİL FAZ) ile yıkanan kolon tarafından, adsorbe edilmeyenler önce adsorbe edilenler daha geç kolondan çıkarlar

33

34 Kolon Kromatografisi

35 Kolon Kromatografi Tipleri Kolondaki dolgu maddesi ve seçilen elüsyon metoduna göre gruplandırılır: Jel filtrasyonu büyüklük İyon exchange yük Affinite (bağlanma) Adsorbsiyon (HPLC) fazlar arasındaki çözünürlük farkı

36 Jel Filtrasyon Kromatografi Proteinler, molekül büyüklüğüne göre ayrılırlar Kolon, jel boncuklar [sephadeks (çapraz bağlanmış dekstran)vb polisakkarid veya poliakrilamid polimer] ile doldurulur katı matriks Protein karışımını içeren tampon, kolondan geçirilir akış Küçük proteinler,jel boncuklar arasındaki boşluklara girer, kolondan geç çıkarlar cam kolon jel boncuklar Büyük proteinler, jel boncuklar arasındaki boşluklara takılmaz, kolondan önce çıkarlar

37 Jel Filtrasyon Kromatografi Proteinlerin elüsyonu: en büyük en küçük

38 Jel Filtrasyon Kromatografi jel boncuk Proteinlerin, matriksteki porlara takılma yüzdesi, büyüklüğü ile ters orantılıdır Porlara takılan proteinler daha yavaş sürüklenirler en büyük protein Avantaj: Büyük miktarda protein karışımı saflaştırılabilir Dezavantaj: Yavaş ayırım

39 İyon exchange(değiş-tokuş) Kromatografi Proteinler yapılarındaki asidik veya bazik amino asitlerin yan zincirlerinde bulunan ve yüzeye doğru yer alan pozitif veya negatif yüklü gruplar taşırlar. Pozitif yükleri histidin, lizin, arjinin ve daha az derecede N-terminal aminlerden, negatif yüklü grupları ise aspartik ve glutamik asit, C-terminal karboksil grupları ve daha az derecede sistein amino asitlerinden ileri gelir. Bir proteinin net elektrik yükü üzerindeki negatif ve pozitif yüklü grupların bağıl sayısına bağlı olup, ph ile değişir. Pozitif ve negatif yüklerin eşit sayıda olduğu ph değerine izoelektrik nokta denir (pl). Proteinlerin büyük çoğunluğu ph 5 ile 9 arasında değişen bir pl değerine sahiptir, pl değerinin üzerinde proteinler negatif elektrik yüküne, altında ise pozitif elektrik yüküne sahiptirler.

40 İyon exchange(değiş-tokuş) Kromatografi Proteinleri, üzerlerinde taşıdıkları net yüke göre ayırır ph pi net yük pozitif ph pi net yük negatif Protein karışımındaki iyonlar, sabit fazdaki aynı yüklü iyonlarla[ (+) (+) veya (-) (-) ile] yer değiştirerek, kolona bağlanırlar Bağlanmayan proteinler, kolondan en önce çıkarlar Daha sonra, iyonik gücü/ph sı farklı bir tampon kolondan geçirilir bağlı proteinlerin yükü değiştirilerek elüsyonu sağlanır

41 İyon-Exchange Kromatografi

42 Katı destek olarak Reçine Seçimi. Katı destek selüloz dekstran agaroz exchange grup DEAE CM sülfonat + NaCl içeren elüsyon tamponu Reçine seçimi, saflaştırılacak proteinin yüküne ve ortam ph sına bağlıdır Kolonun dolgu maddesine, exchange yapacak yüklü gruplar bağlanır karışımdaki proteinleri bağlar Anyon değiştirici reçine:dietilaminoetil(deae)-selüloz Katyon değiştirici reçine: Karboksi metil(cm)- Selüloz Sülfoksi-selüloz

43 Affinite Kromatografisi Enzim, hormon,vb spesifik proteinlerin saflaştırılmasında kullanılır.kolonun dolgu maddesine, (dekstran, poliakrilamid, selüloz vb) spesifik protein ile kompleks yapabilen bir ligand bağlanır: ligand-protein kompleksi Serbest proteinler Tampon akışı Ligand bağlı boncuk spesifik protein diğer proteinler

44 Affinite Kromatografisi katı destek selüloz sepharoz dekstran ligand + DNA IgG antibody antijen substrat kosubstrat Konkavalin A reseptor spesifik protein histon protein A antijen antibody enzim enzim glikoprotein hormon

45 boncuk Affinite Kromatografisi Ligand ile kompleks yapan spesifik protein,katı desteğe bağlanarak kolonda tutulurken; serbest proteinler kolonu terkederler Bağlı protein, daha sonra, ph değişikliği / tuz çözeltileri veya ligand ilavesiyle kolondan elüe edilir Örnek: glukoz-protein kompleksi İlave glukoz(g) boncuk serbest protein

46 Sefaroz boncuk- GTH (glutathione) GST-Çöktürme

47 Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) HPLC High Pressure Liquid Chromatography High Performance Liquid Chromatography High Price Liquid Chromatography

48 Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)

49 HPLC nin AVANTAJLARI Eş zamanlı analiz Doğruluk Yüksek hassasiyet (ppm - ppb) Küçük enjeksiyon hacmi (1-1000µl) Geniş uygulama sahası Zor olmayan analiz koşulları Çok iyi tekrarlanabilirlik

50 Yüksek performanslı sıvı kromatografisi tekniğinin düzgün bir şekilde uygulanabilmesi için Enjeksiyonun yapılabilmesi için örnekler mutlaka sıvı olmalıdır. Katı örnekler ise durgun ve hareketli faza uyumlu olan bir çözgenle çözüldükten sonra yada ekstraksiyon işlemi yapıldıktan sonra enjekte edilebilmektedir.

51 Kolon Kolon üretiminde yapı materyali olarak paslanmaz çelik Teflon cam Kolonun ayırım gücü ve performansı yapıldığı materyalden çok iç yüzeyine yapılan kaplamada kullanılan malzemenin kimyasal ve fiziksel özelliklerinden etkilenmektedir.

52 Kolon Seçilecek kolonun HPLC uygulamasında kullanılacak akış hızı ve dolayısıyla oluşacak basınça dayanıklı olmalıdır. Kolon iç çapı arttıkça akış hızı ve iç doldurma hacmi artmakta ama oluşacak piklerin çözünürlüğü ve dolayısıyla duyarlılık azalmaktadır. Birçok analitik kolonun iç çapı 2-5 mm, boyları çok çeşitli olup genellikle mm aralığında değişmektedir. Kolon uzunluğu arttıkça örnek bileşenlerinin ayrımı daha iyi olmakta fakat analiz süresi uzadığı için daha fazla mobil faz harcanmaktadır.

53 Dedektörler HPLC donanımında temel bileşenden birisi olan dedektörler, örneğin veya hareketli fazın bazı özellikleri ile doğru orantılı olarak bir elektriksel sinyal üretirler. Dedektörleri genel dedektörler ve seçici dedektörler olmak üzere ikiye ayırmak mümkündür. Kullanılan dedektör hem örneğin hemde hareketli fazın özelliklerini ölçüyorsa (refraktif indeks dedektörü gibi) buna genel dedektör, eğer sadece örneğin özelliklerini ölçüyorsa (UV dedektörleri gibi) buna seçici dedektör denilmektedir. Seçici dedektörler, genel dedektörlerine göre yaklaşık 1000 kat daha duyarlıdır.

54 HPLC Sistemi Akış Diyagramı

55 Dedektörler Ultraviolet / Visible detector (UV/VIS) Photodiode Array detector (PDA) Fluorescence detector (RF) Conductivity detector (CDD) Refractive Index detector (RID) Electrochemical detector (ECD) Mass detector (MS)

56 Ultraviyole-görünür bölge dedektörü Absorbans ölçen dedektörler olup HPLC de kullanılan dedektörlerin yaklaşık % 80 ini oluşturmaktadırlar. Lambert-Beer yasası geçerlidir. Spektrum taraması yapmak, farklı dalga boyunda çalışmak veya dalga boyunu zamana karşı programlamak mümkündür. Bu dedektörler ile sadece Hareketli faz, UV/VIS fotometre alkenler, aromatik yapılar, ya da spektrofotometrenin C-O, C-N, C-S bağı bulunduğu küçük bir akış içeren bileşenlerin tayin hücresinden geçirilir. edilebilmektedir

57 Ultraviyole-görünür bölge dedektörü

58 fotodiyot array dedektör UV/VIS dedektörler içerisinde fotodiyot array dedektör son yıllarda yaygın olarak kullanılmaktadır. UV/VIS dedektörden farkı, her elementin ayrı bir dalga boyundaki absorbansını eş zamanlı olarak ölçebilmesidir. Bu sayede üç boyutlu kromatogramlar almak ve istenilen her pikin çok hızlı spektrum taramasını görebilmek ve farklı dalga boyunda absorbans yapan türleri ayni anda tayin etmek olasıdır. Ayrıca istenilen dalga boyu aralığında çalışılabilmesi bu dedektörün sağladığı bir diğer önemli avantajdır.

59 fotodiyot array dedektör

63 fotodiyot array dedektör PDA nın sağladığı olanaklar İstenilen dalga boyu aralığında çalışabilmek Analiz sonrası istenilen çok sayıda dalga boyunda ölçüm yapabilmek Oran kromatogramı alabilmek istenilen her pikin spektrumunu görebilmek Benzerlik kıyaslaması yapabilmek Pikin saflığını tayin edebilmek D2 ve W lambayı aynı anda kullanabilmek

64 Fluoresans dedektörü Organik maddelerin yaklaşık % 15 i fluoresans oluşturma yeteneğine sahiptir. Oluşan fluoresans ölçülmektedir. Kullanılan ışık kaynağı ksenon lamba olup duyarlılığı UV/VIS dedektöre göre yaklaşık 10 3 kat fazladır.

65 İletkenlik dedektörü İletkenlik ölçülür. Daha çok anyon ve katyon analizlerinde ve iyon kromatografisinde kullanılır. Kullanılan mobil fazın iletkenliği ne kadar düşük olursa oluşan sinyal de o kadar düşük olmaktadır.

66 Refraktif indeks dedektörü Kırılma indisi ölçülür. Sıcaklıktan etkilenir. Örnek bileşenlerinin bulunduğu ortamda yoğunluk artacağından gelen ışık kırılarak hücreyi terkeder. Işığın ölçülen kırılma oranından (kırılma indisi) kantitatif tayin yapılır.

67 Kütle dedektörü Hareketli iyonları kütle/yük oranlarına göre hızlı biçimde ayırabilen bir cihazdır. İyonların çoğu tek yüklü olduklarından, oran basitçe iyonun kütlesine eşittir. Bu dedektörün kullanımı ile örnek bileşenlerine ait çok özgün kromatogramlar elde edilir, dolayısıyla kalitatif tayinlerde teşhis amaçlı kullanımlarda çok önemli bir dedektördür. İyon kaynağı, kütle analizörü ve iyon dedektör sistemi olmak üzere başlıca üç kısımda incelenebilir

68 Kütle dedektörü Ion Max API Kaynağı: Analizi yapılcak numuneye bağlı olarak ESI (Electrospray Ionization) veya APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) iyonizayon teknikleri kullanılabilir. Her iki teknikte atmosferik basınçta gerçekleşir. Genel olarak aminler, peptidler ve proteinler gibi polar bileşikler ESI tekniği, steroidler gibi apolar bileşikler ise APCI tekniği ile analiz edilir. Kütle Analizörü: İyon kaynağından gelen iyolar, kütle analizöründe değişen elektrik alana tabi tutularak m/z (kütle/yük) oranlarına göre ayrılırlar. MS İyon Dedektör Sistemi: MS dedektörü yüksek duyarlılığa sahip, pozitif ve negatif iyon modlarında çalışan bir iyon dedektör sistemidir.

69 HPLC tekniğinde sınırlamalar Karmaşık örneklerde iyi çözünürlük sağlamak zor olabilmektedir. Aynı anda sadece bir örnek analizlenebilmektedir.

70 ELEKTROFOREZ Ortam ph sına göre, (+) ya da (-) olarak yüklenen kolloid taneciklerin, bir elektrik alanında, kendi net yüklerine zıt yük taşıyan anot veya katoda doğru farklı hızlarda sürüklenmeleri ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER Proteinler, elektrik yükü, büyüklük (yük/kütle oranı), şekil gibi özelliklerine göre ayrılırlar Elektroforez, genellikle poliakrilamid jel üzerinde yapılır

71 ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER Proteinlerin saflaştırılmasında kullanılmaz! Elektroforetik Yöntemler Karışım içinde bulunan protein sayısını tespit etmek( kağıt ve jel elektroforezi) Saflaştırılmış proteinin saflık derecesini belirlemek( SDS-PAGE) Saflaştırılmış proteinin molekül ağırlığını tayin etmek (SDS-PAGE) amacıyla kullanılır

72 POLİAKRİLAMİD JEL Poliakrilamid Jel:Çapraz bağlı akrilamid polimeri

73 Poliakrilamid Jel Elektroforezi(PAGE) protein karışımı katot plastik kasa tampon jel anot tampon

74 SDS - PAGE SDS:Sodyum Dodesil Sülfat-anyonik deterjan (-) yüklü SDS, proteinlerin kuarterner, tersiyer ve sekonder yapılarını bozar, katları açılan peptid zincir, SDS ile sarılarak misel görünümü kazanır Zincirde yer alan her 2 AA artığına 1 molekül SDS bağlanır proteinlerin hepsi (-) yüklenir

75 SDS - PAGE SDS-PAGE ile proteinler, net yük ve şekillerine göre değil, sadece molekül büyüklüklerine göre, birbirinden ayrılırlar SDS in bağlanmasıyla, doğal yapısını kaybeden proteinler, aynı şekil ve yük/kütle oranına sahip olurlar elektriksel alan içinde proteinlerin hareketi sadece molekil ağırlıklarına bağlıdır Daha küçük olanlar, daha hızlı sürüklenir ve proteinlerin alt üniteleri birbirinden ayrılır

76 SDS-PAGE ÖRNEKLERİ

77 Molekül Ağırlığı Tayini Standart nümune Molekül ağ.(log) nümune protein Sürüklenme hızı

78 İzoelektrik Fokusing İzozimleri ya da özellikleri çok benzeyen proteinleri ayırmak için kullanılır ph gradienti oluşturulan jel üzerinde elektroforez yapılarak, proteinlerin pi değerleri tayin edilir ph gradienti:küçük molekül ağırlıklı organik asit ve bazları içeren bir amfolit ya da amfolin (katyonik/anyonik polistren elektrolitler) çözeltisi inkorpore edilen jele elektrik alanı uygulanır izoelektrik fokusing jel 10 ph - ph 10 ph 4 + 4

79 İzoelektrik Fokusing Amfolit çözeltisindeki H + ve OH - iyonları, biri diğerini nötralize ederek sürüklenirken, jel üzerinde ph gradienti oluşur protein karışımı İzoelektrik jele uygulanıp elektroforez yapıldığında, karışımdaki her protein kendi izoelektrik noktasına kadar jel üzerinde sürüklenir ve durur ph gradient pi:6.5

80 İzoelektrik Fokusing

81 Kapiler Elektroforez (2D)

82 Western blotlama ya da imminoblotlama denilen yöntem, bir protein karışımı içindeki belirli bir proteini ve de büyüklüğünü saptamak için kullanılan bir yöntemdir. Proteinin in vivo ya da in vitro sentezlenmesinin önemi yoktur. Bununla beraber, bu metot istenilen bir proteine karşı yönlendirilen yüksek kalitede bir antikor kullanımına bağlıdır. Bu antikor prob olarak kullanılarak ilgili protein bir karışımın içinden saptanabilir. Western blot hücrede ne kadar proteinin biriktiğini gösterebilir.

83 Molekül Ağırlığı Tayini Standart nümune Molekül ağ.(log) nümune protein Sürüklenme hızı

84

85

86 Thank you for your attention