THE QUALITATIVE DETERMINATION OF Bacillus anthracis SPORES USING QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE (QCM) PROJE NO: HPD. Yrd. Doç. Dr.

Transkript

1 Bacillus anthracis SPORLARININ KALİTATİF TAYİNİNDE KUARTZ KRİSTAL MİKROBALANS (QCM) YÖNTEMİNİN UYGULANMASI THE QUALITATIVE DETERMINATION OF Bacillus anthracis SPORES USING QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE (QCM) PROJE NO: HPD Yrd. Doç. Dr. Hasan Nazır ARALIK 2009 ANKARA

2 ÖZET Bu proje kapsamında aşağıda belirtilen çalışmalar yapılmıştır; a) B. anhtracis antikoruyla QCM-immunosensörü hazırlanmasında fiksatif olarak kullanılacak olan aminlenmiş-polivinil klörür (PVC-NH2) sentezi, b) Kuartz kristal yüzeyine immobilizasyonu ve taramalı elektron mikroskobuyla (SEM) yüzey karakterizasyonu, c) B. anhtracis sporlarının hazırlanması ve virülansının gösterilmesi, d) PVC-NH2 ile kaplanmış transdüser yüzeylerine B. anthracis antikorunun immobilizasyonu ve SEM ile yüzey karakterizasyonu, e) Hazırlanan QCM-immunosensörünün B. anthracis sproruna karşı static addition yöntemiyle deteksiyon çalışmaları, f) QCM-immunosensörünün deteksiyon sonrası yüzey görüntülerinin SEM ile incelenmesi çalışmaları yapılmıştır. Anahtar Kelimeler: Kuartz Kristal Mikrobalans, QCM-immunosensörü, B. anthracis ii

3 ABSTRACT Within this project, the studies given below have been done; g) Synthesizing aminated-pvc (PVC-NH2) which was used as an adhesive layer in order to prepare Bacillus anthracis (B. anthracis) QCM-immunosensor, h) Immobilization of PVC-NH2 onto the quartz crystal surface and surface characterization with scanning electron microscope (SEM), i) Preparing B. anthracis spores and showing the virulence of the employed strain, j) Immobilization of the B. anthracis monoclonal antibodies onto PVC-NH2 coated transducer surfaces and surface characterization with SEM, k) Testing the prepared QCM-immunosensor against to B. anthracis spores in static addition procedure, l) Examining the QCM-immunosensor surface images after detection with SEM. Key words: Quartz crystal microbalance, QCM-immunosensor, B. anthracis iii

4 1. AMAÇ ve KAPSAM Biyolojik savaş insan, hayvan ve yararlı bitkilerde ölüm veya hasar meydana getirmek için kullanılan mikroorganizmalar veya mikroorganizma toksinleriyle yapılan savaş olarak tanımlanmaktadır. Biyolojik savaş maksadıyla kullanılan mikroorganizma veya bunların ürettiği toksinlere de Biyolojik Savaş Ajanı (BSA) denir. Geniş bir spektruma sahip olan BSA lar solunum ve sindirim yoluyla bulaşırlar. Kimyasal silahlardan farklı olarak BSA ların en önemli özellikleri (Bacillus Anthracis sporlarında olduğu gibi): - Etkileri kullanıldıkları anda ortaya çıkmayıp yıllarca ciddi çevre kirliliğine yol açabilirler; - Kimyasal silahlarda olduğu gibi çabuk etki edebilir ve çevreden hızla kaybolabilirler; - Açık alanda belirlenmeleri oldukça zor ve zaman alıcıdır; - Duyularla varlıkları anlaşılamaz; - Doğal bir epidemi olasılığı nedeniyle bu silahların kullanılıp kullanılmadıklarına karar vermek de her zaman mümkün olamayabilir; - Şiddet ve terör etkisiyle kitleleri paniğe uğratma özellikleri de vardır. BSA lar bu aykırı davranışları nedeniyle, sarin VX, hardal, hidrojen siyanür, fosgen gazları (vd.) gibi sıradan kimyasal silahlardan ayrılır. BSA lar yayılımının ve üretiminin kolaylığı, halk sağlığı üzerine etkisi ve halkta panik ve kargaşa yaratma özelliklerine göre Hastalıkları Kontrol ve Önleme Merkezi (CDC; Centers for Disease Control and Prevention) tarafından A, B ve C olmak üzere 3 kategoriye ayrılmıştır. CDC tarafından hazırlanan biyoterörizm ajanları listesinin A kategorisininen başında Bacillus anthracis yer almaktadır (diğerleri: Botulizm, Veba, Çiçek, Tularemi, Viral Hemorajik Ateşler). Bu bakteri spor üretme yeteneğine sahip bir mikroorganizmadır. Halk arasında Şarbon olarak da bilinen Bacillus anthracis (B.anthracis), sporları kuruluğa, ısıya, UV ışığına ve çoğu dezenfektanlara karşı dirençlidirler. Bu sporlar toprakta yıllarca canlı kalabilir, kolay ve çabuk üreyebilirler. BSA ların tanımlanmasında çeşitli sistem ve yöntemler kullanılabilmektedir. Bu yöntemler arasında biyolojik ajanın kültür ile izolasyonu, toksinlerin spektrometrik olarak tayini (HPLC, GC-MS), antikor saptanması, ELISA ile antijen saptanması, DNA probları kullanılarak genom saptanması vd. sayılabilir. Bu ajanların tayininde kullanılan spektroskopik teknikler beraberinde pahalı donanım da gerektirmekte ve ancak gelişmiş laboratuvarlarda kullanılabilmektedir. Konvansiyonel kültür yöntemleri ise zaman alıcı 1

5 olup en erken 48 saatte etken tanısı konulabilmektedir. Klasik ve Real-Time Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi de biyolojik savaş ajanlarının tanısında kullanılmakla beraber, PCR için analiz öncesi dikkatli örnek hazırlanması gereksinimi vardır. Bu yöntemlerle sırasıyla saat ve dakikada etken tanısı yapılabilmektedir. Bir tür kitle imha silahı olan B.anthracis in kullanılması durumunda olay yerinde yada laboratuvarda ilk belirleme işleminin kısa sürede ve yüksek doğrulukta yapılabilmesi, uygulanacak tedavi ve buna bağlı olarak alınacak koruyucu tedbirlerin alınmasında önemli olacaktır. Son yıllarda immüno testlerden yararlanan cihazların geliştirilmesi ile biyolojik ajanların tayininde önemli başarılar elde edilmiştir. Literatürde silika kapiller, optik fiber, magnetik mikroküreler, entegre devre çipleri gibi çeşitli substratlar üzerinde yapılan immüno temelli sensörler geliştirilmiştir. Çalışılmış olan bu projenin amacı Bacillus anthracis sporlarının hızlı deteksiyonu için Kuartz Kristal Mikrobalans yönteminin uygulanması, antikor-antijen spesifik etkileşmesinin aynı adla anılan sistemin parçası olan elektrot yüzeyinde gerçekleştirilmesi ve laboratuvar tipi bir biyosensör geliştirilmesidir. 2

6 2. ANALİZ ve BULGULAR 2.1 Aminlemiş-Polivinil Klorür (PVC-NH2) sentezi PVC, alkil diamin bileşikleriyle etkileştirildiğinde polimer zinciri üzerinde primer ve sekonder amin grupları elde edilir (Şekil 1). Cl H H C C C H H Cl + H 2 N C n NH 2 H2 n = 2, 3, 4 Cl H H C C C H H NH ( CH 2 ) n NH 2 Şekil 1 PVC ile diamin reaksiyonunun şematik gösterimi Bu çalışmada kullanılan PVC-NH2 bileşiği Şekil 1 ile verilen genel reaksiyona bağlı kalınarak, literatürlerinde önerilen yöntemlerin modifikasyonu ile sentezlendi. PVC-NH 2 analiz sonucuları: Cl H H Element analizi sonuçları: C, % 39,04; H, % 6,080; N, % 9,97. C H C H C NH Element analizi sonuçları PVC nin % 10 aminlendiğini göstermiştir. Sentezlenen PVC-NH2 bileşiği için kaydedilen ( CH 2 ) 3 FTIR spektrumu Şekil 2 de PVC ile karşılaştırmalı olarak NH 2 verilmiştir. FTIR (ATR, cm -1 ): 3355, 3317 deki pikler -NH 2 gerilme titrşimlerine, 1629 daki pik ise R C=N konjugasyonuna aittir. Şekil 2 PVC ve PVC-NH 2 bileşiklerinin FTIR spektrumları 3

7 2.2 PVC-NH2 nin Kuartz Kristali Yüzeyine İmmobilizasyonu ve Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) İle Yüzey Karakterizasyonu PVC-NH2 B. antracis antikorunun yüzeye immobilizasyonunda fiksatif olarak kullanılabilirliğinin araştırılması bu proje çalışmasının hedefleri arasındadır. Dolayısıyla QCM-sensörünün hazırlanmasında kullanılacak en uygun miktarın bilinmesine yönelik çalışmalar da apılmıştır. Deney sisteminde kullanılan altın kristallerin alanı (0.204 cm 2 ) dikkate alınarak yapılan çalışmalarda, PVC-NH 2 / DMF çözeltisinden 2 µl alınarak ve bir defada yapılan dropdown kaplamanın da en uygun kaplama olduğu bulunmuştur. Yapılan çalışmalarda kaydedilen SEM görüntüleri Şekil-3 de verilmiştir. (a) (b) Şekil 3 2 µl PVC-NH 2 çözeltisi ile kaplanmış yüzey, (a) x1000 (b) x15000 Hazırlanan sensör yüzeyinde antikor bağlayıcı serbest -NH 2 gruplarının olduğununun gösterilmesi için elektrot yüzeyinin infrared (FTIR-ATR) spektrumu kaydedilmiştir (Şekil 4). 4

8 Şekil 4 - PVC-NH 2 kaplı Au kuartz kristalinin FTIR-ATR spektrumu Spektrumda 3673 cm -1 deki pik hidrojen bağı yapmayan NH 2 gruplarının N-H asimetrik gerilmesine, 3283 cm -1 deki pik ise molekül içi (ya da moleküller arası) hidrojen bağı yapan NH 2 gruplarının N-H gerilmesine aittir ve 2929 cm -1 deki pikler alifatik CH ve CH 2 gerilme titreşimlerine, 1646 cm -1 deki pik ise konjuge R- C=N- gruplarının CN gerilme titreşimlerine aittir. 2.3 QCM ile Static addition yönteminin kullanılacağı deney düzeneğinin hazırlanması Deney sistemi temel olarak 3 ana kısımdan oluşmaktadır; 1- Frekansmetre 2-Osilatör 3- Kuartz kristali. Static addition yöntemde, hazırlanan sensör (modifiye edilmiş kuartz kristali) teflon statik deteksiyon hücresine yerleştirilir. Kristalin bir yüzü tampon solüsyonuna maruz bırakılır ve sistemin dengeye gelmesi beklenir. Daha sonra istenen konsantrasyonda B. anthracis sporu içeren süspansiyon tampon çözelti içerisine enjekte edilir. Sistem tekrar kararlı hale ulaşana kadar frekanstaki değişim zamana karşı kaydedilir. Kurulan deney düzeneğinin çizimi Şekil 5 de verilmiştir. 5

9 Şekil 5 Deney düzeneği, Static addition 2.4 B. anthracis sporlarının hazırlanması Bu çalışmada kullanılan B. anthracis suşu Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkez Başkanlığı bakteri kültür koleksiyonundan alınmıştır. Yapılan çalışmalarda, sahada kullanılabilirliği modellemesi bakımından gerçek B. anthracis sporları kullanılmıştır. Kullanılan B. anthracis bir hasta izolatıdır ve ayrıca DNA analizi de yaptırılmış ve filojenisi belirlenmiştir. Nükleotit dizisi National Center for Biotechnology Information (NCBI) gen bankasına GQ no. ile kaydettirilmiştir. B. anthracis sporları, Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkez Başkanlığı Bakterial Zoonos Araştırma Laboratuvarında, Class 2 Biyogüvenlik kabininde ve kişisel koruyucu güvenlik önlemleri alınarak çalışılmıştır. Çalışma aşamaları: Tryptose agarda B. anthracis 37 C de 48 saat inkübe edildikten sonra 23 C de iki hafta süre ile takip edildi. Schaeffer-Fulton yöntemi ile sporlanma periyodik olarak izlendi (Şekil 6). Sporlanma %95 e ulaştıktan sonra vejetatif hücrelerin eliminasyonu için % 50 metanol-% 50 salin (veya PBS) süspansiyonunda 37 C de 1 saat inkübe edildi. Metanol eliminasyonu için sporlar üç kez salin (veya PBS) ile yıkandı. PBS-tween 20 içerisinde 10 kat dilüsyonları hazırlanarak plate count agar da 37 C de 48 saat inkübe edilerek spore-forming unit sayıları değerlendiridi. C.F.U/mL original sample = C.F.U./plate x (1/mL aliquot plated) x dilution factor formülüyle hesaplamalar yapıldı. Hazırlanan stok solüsyondan istenen konsantrasyonda spor solüsyonları hazırlandı. 6

10 Şekil 6 Schaeffer-Fulton yöntemiyle boyama sonrasında kaydedilen optik mikroskopi görüntüsü, x1000. Sporlar yeşil, basiller kırmızı renkte gözükmektedir 2.5 Kullanılan B.anthracis suşunun virülansının gösterilmesi ve suptiplendirilmesi Kullanılan B. anthracis suşunun virülansını göstermek amacıyla in-house PCR işlemi gerçekleştirildi: B. anthracis in en iyi bilinen virülans faktörleri poly-γ-d-glutamik asitten oluşan kapsülü ve A-B tipi toksininin komponentleri olan protektif antijen (PA), ödem faktör (EF) ve Letal faktör (LF) dür. Tüm bu virülans faktörleri plazmidlerce kodlanır. Üç toksin bileşenleri pxo1 plazmidi üzerindeki paga, cya ve lef genleri tarafından kodlanmaktadır. Organizmanın kapsülü, kapsül sentetik operonu (capbcad) içeren pxo2 (95 kbp ve 60kDa molekül ağırlığı) plazmidince kodlanır. B. anthracis de yeterli kapsül sentezi için 4 açık okuma çerçevesinin (open reading frame); capa, capb, capc ve cape, gerekli olduğu gösterilmiştir. Dolayısıyla bu çalışmada kullanılan B. anthracis suşunun virülan olduğunu yani pxo1 ve pxo2 plazmidlerinin varlığını göstermek amacıyla pxo1 plazmidi üzerindeki paga gen bölgesine ve pxo2 plazmidindeki capa gen bölgesine spesifik primerler kullanılarak PCR işlemi gerçekleştirilmiştir. 7

11 Gerçekleştirilen PCR reaksiyonu sonrasında elde edilen amplikonlar %2 lik agaroz jel elektroforezinde görüntülenmiştir (Şekil 7). Şekil 7 de görüldüğü üzere çalışmada kullanılan B. anthracis suşu için 211 ve 179 baz çiftine karşılık gelen bölgelerde beklenilen bantlar görülmüş, pxo1 ve pxo2 plazmidlerinin varlığı doğrulanmıştır. Şekil 7 - % 2 agaroz jel elektroforezi. Line 2 ve7, çalışmada kullanılan B. anthracis suşu; 3 ve 8, negatif kontrol DNA; Line 4 ve 9, pozitif kontrol kopya/µl; Line 5 ve 10 pozitif kontrol, kopya/µl; Line 6 ve 11, negatif kontrol 2.6 PVC türevlerine B.anthracis antikorunun immobilizasyonu, QCM sensörünün hazırlanması ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile yüzey karakterizasyonu Belirlenen oranlarda kaplanmış PVC-NH 2 sensor yüzeylerine farklı oranlarda B. anthracis antikor u (MAb) immobilizasyonu çalışmaları yapılmıştır. Optimum olarak belirlenen oranla hazırlanmış QCM-sensörünün SEM görüntüsü Şekil 8 de verilmiştir. 8

12 (a) (b) Şekil 8 PVC-NH 2 -MAb kaplı sensör yüzeyi, (a) x350 (b) x B.anthracis sporunun static addition yöntemiyle deteksiyonu çalışmalarının QCM ile yapılması ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ) ile yüzey karakterizasyonu Hazırlanmış PVC-NH 2 -MAb sensörleriyle derişimi 25000, 50000, spor / 5 µl olan solüsyonlar ile çalışmalar yapılmıştır. Yapılan deneylerden PVC-NH 2 -MAb sensörü, için kaydedilmiş grafik sonuçları örnek olarak Şekil 9 de, yüzeyde tutuklanan B.anthracis sporunun SEM görüntüsü de Şekil 10 da verilmiştir. Şekil 9 PVC-NH 2 -MAb sensörü ile 25000, 50000, spor / 5 µl derişimde yapılmış çalışmalar 9

13 (a) (b) Şekil 10 B. anthracis sporu tutuklanmış sensor yüzeyi, (a) x2200 (b) x

14 3. SONUÇ Bu proje çalışması kapsamında, B. anthracis sporlarının deteksiyonuna yönelik QCMimmünosensörünün geliştirilmesi hedeflenmiştir. Hazırlanan QCM-immünosensörünün, olası gerçek bir durumda kullanılabilirliğinin ön incelenmesini de yapmış olmak amacıyla, simulan veya aşı suşu yerine, patojen bir B. anthracis saha suşuyla çalışılmıştır. Kullanılan suşun patojenitesini göstermek amacıyla, in-house PCR yapılmıştır. Ayrıca, kullanılan suşun subtiplendirilmesi amacıyla 16S rrna gen dizi analizi yapılmış, filegenetiği belirlenmiş ve gen bilgisi NCBI GenBank a GQ erişim numarasıyla kaydettirilmiştir. Sentezlenmiş olan PVC-NH 2, QCM sisteminde yüzey modifikasyonu amacıyla kullanılmış ve antikor immobilizasyonu amacıyla adhezif tabaka olarak kullanılabilirliği gösterilmiştir. Ayrıca kuartz kristali yüzeyinin amaca uygun olarak modifiye edildiği FTIR ile ispatlanmış ve yüzey görüntüleri de SEM ile desteklenmiştir. PVC-NH 2 ile modifiye edilerek hazırlanmış QCM sensörüyle static addition yönteminde 25 bin spor alt deteksiyon limitlerine ulaşılmıştır. Deney sonrası B. anthracis sporlarının sensör yüzeyinde immobilize olduğu SEM görüntüleriyle de kanıtlanmıştır. B. anthracis için primatlar üzerinde yapılan çalışmalardan elde edilen verilere göre tahmin edilen enfektif doz spordur. Bu proje çalışması kapsamında ulaşılan alt deteksiyon limitleri de belirtilen enfektif doz aralığındadır. Sonuç olarak, geliştirilen QCM temelli immünosensörü, B. anthracis sporlarının deteksiyonunda gerçek zamanlı, işaretsiz ve direkt sistemler olarak kullanılabilme yönünde ümit vaat etmektedir. 11

15 4. KAYNAKLAR Biyolojik Savaş Ajanları (BSA) kolay üretilebilen, depolanabilen ve uygulanabilen silahlardır. Üretimleri insani amaçların (aşı, ilaç, tarım ve hayvancılık uygulaması, vb.) arkasına gizlenebileceği gibi, biyoteknolojik araştırma amaçlı olduğu beyan edilerek açıktan da olabilir. Birinci durum, gizli yapıldığı için doğrudan zarar vermeyi hedeflediği varsayıldığı halde ikinci durum, bilimsel amaçlı bir araştırmayı hedeflemekle beraber araştırmayı deklare eden ülkenin BSA sahibi olduğunun da dolaylı olarak bir ifadesidir. Çok geniş bir dağılım gösteren BSA lar çoğu zaman yara ve çatlak olmadıkça sağlam deriye nüfuz edemezler. Bu nedenle solunum veya sindirim yoluyla bulaşırlar. Sekonder geçiş veya bulaşma riski kimyasal silahlara göre çok daha fazladır. BSA nın en önemli özelliği, kimyasal silahlardan farklı olarak şarbon sporlarında olduğu gibi, temel olarak bilinen Mikroorganizmaların inkübasyon sürelerine bağlı olarak etkileri kullanıldıkları anda ortaya çıkmaz davranışına uyması ve yıllarca ciddi çevre kirliliğine yol açabilmesidir. Aynı zamanda, kimyasal silahlarda olduğu gibi çabuk etki edebilir ve çevreden hızla kaybolabilir olmasıdır (stafilokok toksini). Açık alanda belirlenmeleri oldukça zor ve zaman alıcıdır. Ayrıca duyularla varlıkları anlaşılamaz. Doğal bir epidemi olasılığı nedeniyle bu silahların kullanılıp kullanılmadıklarına karar vermek de her zaman mümkün olamayabilir. Şiddet ve terör etkisiyle kitleleri paniğe uğratma özellikleri de vardır. BSA lar bu aykırı davranışları nedeniyle, sarin VX, hardal, hidrojen siyanür, fosgen gazları (vd.) gibi sıradan kimyasal silahlardan ayrılır. BSA lar yayılımının ve üretiminin kolaylığı, halk sağlığı üzerine etkisi ve halkta panik ve kargaşa yaratma özelliklerine göre Hastalıkları Kontrol ve Önleme Merkezi (CDC; Centers for Disease Control and Prevention) tarafından A, B ve C olmak üzere 3 kategoriye ayrılmıştır. (Bioterrorism Agents/Diseases agent/agentlist-category.asp). CDC tarafından hazırlanan biyoterörizm ajanları listesinin A kategorisinin (Anthraks, Botulizm, Veba, Çiçek, Tularemi, Viral Hemorajik Ateşler) en başında Bacillus anthracis yer almaktadır. Bu bakteri spor üretme yeteneğine sahip bir mikroorganizmadır. Şarbon etkeni olarak da bilinen Bacillus anthracis sporları kuruluğa, ısıya, UV ışığına ve çoğu dezenfektanlara karşı dirençlidirler. Bu sporlar toprakta yıllarca canlı kalabilir, kolay ve çabuk üreyebilirler. 12

16 Özellikle viral ajanlarda olduğu gibi şarbonu silah olarak hazırlamak için çok yüksek teknolojiye gereksinim yoktur. Üretimi için 5-10 m 2 alan ve $ lık yatırımın yeterli olacağı belirtilmektedir. Şarbon için infekte edici dozun spor olduğu belirtilmektedir. Şarbon vücutta toksik bir reakiyon oluşturmaktadır. Bu reaksiyon belli bir aşamaya ulaştığında bakteriler etkisiz hale getirilse bile bir geri dönüş yoktur. Belirtilen bu özelliklerden dolayı anthrax biyolojik silahların en önemlilerinden biri olarak değerlendirilmektedir. Ayrıca insandaki etkisine vurgu yapmak bakımından Amerika da 11 Eylül 2001 saldırısından sonra gönderilen şarbonlu mektuplarla 11 i akciğer şarbonu 11 i de cilt şarbonu olmak üzere 22 kişi infekte olmuş ve akciğer şarbonlu olguların 5 i ölmüştür. bilgisi verilmektedir. BSA ların hızlı deteksiyonuna yönelik literatürde yeralan birkaç araştırmayı örnek vermek gerekirse: Erwin Yacoub-George ve arkadaşları, çalışmalarında biyolojik ajan nokta deteksiyonu için otomatik olarak çalışan 10 kanallı otomatik kapiller çip immüno detektörünü (10K- IDWG) prototip olarak geliştirmişlerdir. Yapılan çalışmada Kemilüminesans kapiller immünoassay tekniğini entegre mikro-akışkanlarla kombine kullanılmış ve laboratuvarda sıvı solusyonlar içinde multiple biyolojik ajanların yüksek duyarlılıkta ve hızlı deteksiyon ve ön identifikasyonunu sağlanmıştır. Kemilüminesans kapiller immünoassay tekniğini seçilmiş yakalayıcı antikorlar ile kaplı paralel olarak düzenlenmiş 10 birleşmiş silika kapillerler içerisinde gerçekleştirilmiştir. Her bir kapillerlerdeki kemilüminesans yoğunluğunu detekte etmede multianot ışık çoğaltıcı düzenek kullanmıştır. 10K-IDWG teknolojisini üç farklı biyolojik ajan ile, bakteriyel patojen olarak stafilokokal enterotoksin B ve Escherichia coli (E. coli) O157:H7, virus patojen modeli olarak M13 bakteriyofajı, değerlendirilmiş ve yukarıda bahsedilen üç biyolojik ajanı sıvı örnek içerisinde 29 dakikada tespit edilebilmişlerdir. Sistemin deteksiyon limitini stafilokokal enterotoksin B için 0.1 ng/ml, Escherichia coli (E. coli) O157:H7 için 10 4 cfu ml ve M13 için 5x10 5 pfu/ml olarak vermişlerdir. R. Slavı k, J. Homola, E. Brynda ise çalışmalarında Staphylococcal enterotoxin B (SEB) deteksiyonu için fiber optik yüzey plazmon rezonans (SPR) biyosensörünü rapor etmişlerdir. Sensör ince metal kaplı tek-mod optik fiber temelli küçük algılayıcı element içerisinde yüzeyden yansıyan ışığın spektral değişimlerine dayanmaktadır. SEB nin 13

17 spesifik deteksiyonu için SPR sensörü SEB ye karşı antikorların çift tabakalı kovalent olarak çapraz bağlanmaları ile işlevselleştirilmiştir. Rapor edilen çalışmada SPR sensörünün 10 dakikadan az zamanda ng/ml konsantrasyonlarında SEB yi detekte edebildiği belirtilmiştir. Bakteri ve bunların toksinlerinin tayini için kullanılan diğer yöntemler ise, elektrokimyasal (potansiyometrik, amperometrik ya da kondüktometrik/kapasitatif) metodlar ve piezoelektrik temelli gravimetrik bir yöntem olan Kuartz Kristal Mikrobalans (Quartz Crystal Microbalance, QCM) sistemleridir. Örneğin; Xiao-Li Su ve Yanbin Li yaptıkları çalışmalarında Escherichia coli (E. coli) O157:H7 nin hızlı deteksiyonu için bir piezoelektrik immüno sensör geliştirmişlerdir. Rapor edilen çalışmada biyosensörün hazırlanması sırasıyla, AT-kesim altın elektrotlu kuartz kristalin yüzeyine SAM (Self Assembled Monolayer) yöntemiyle 16- merkaptohekzadekanoik asidin tek tabaka halinde kaplanması, reaktif tabaka olarak N- hidroksisüksinimid (NHS) esterinin yüzeye tatbiki ve affinite ile saflaştırılmış antikorların immobilizasyonunu basamaklarını içermektedir. Hedef bakterinin immobilize edilen antikorlar üzerine bağlanmasının sensör frekansını düşürdüğünü ve frekanstaki kaymanın bakteri konsantrasyonu ile orantılı olduğunu belirtmişlerdir. İmmünosensörün hazırlanmasındaki her aşama hem kuartz kristal mikrobalans (QCM) hem de dönüşümlü voltametri teknikleri ile karakterize edilmiştir. Bu çalışmada sensörün kullanılabilirliğinin test edilmesi 3 analitik yöntem (immersion-daldırma, dip and dry-daldırma ve kurutma, flow through-akışkan metodları) ile yapılmıştır. İmmünosensörün dakika içerisinde cfu/ml aralığında bakteriyi tespit edebildiğini ve sensörün kullanımının tekrarlanabilirlik oranını 10 3 cfu/ml konsantrasyonda %18 ve 10 5 cfu/ml konsantrasyonda ise %13 olarak bildirmişlerdir. Önerilen sensörün immobilize olan antikor miktarı ve deteksiyon hassasiyeti yönünden Protein-A temelli piezoelektrik immünosensör ile kıyaslanabilir olduğunu belirtmişlerdir. İnsanlık tarihinde, özellikle 19. yüzyılda biyolojik savaşın (yada biyoterörizm) da bir savaşma biçimi olabileceğine dair örnekler vardır. Uluslararası platformda ülkeler birbirleriyle, konusu biyolojik savaş olan antlaşmalar imzalamış olsalar bile, biyolojik 14

18 savaş/biyoterörizm e karşı her zaman hazır olmak için bilimsel ve faydacı bir yaklaşımla çalışmalarını sürdürmektedirler. Halen, biyolojik savaş ajanları listesinde yeralan mikroorganizmaların {Bacillus anthracis (antraks), Yersinia pestis (veba), Brucella spp. (brusellozis), Eschericia coli vb.} doğrudan ve hızlı teşhisi için henüz bir teknik geliştirilememiştir. Dolayısıyla bu alanda yapılan her çalışma anlamlı ve alanına doğrudan bir katkı niteliğindedir. Kaynaklar [1] Sauerbrey, G., The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing, Z. Phys. 155: , [2] Bioterrorism Agents/Diseases agent/agentlistcategory.asp. [3] Erwin Yacoub-George et al. Automated 10-channel capillary chip immunodetector for biological agents detection, Biosensors and Bioelectronics 22, 2007, [4] R. Slavı k, J. Homola, E. Brynda. A miniature fiber optic surface plasmon resonance sensor for fast detection of staphylococcal enterotoxin B, Biosensors and Bioelectronics 17, 2002, [5] Xiao-Li Su, Yanbin Li., A self-assembled monolayer-based piezoelectric immunosensor for rapid detection of Escherichia coli (E. coli) O157:H7, Biosensors and Bioelectronics 19, 2004,

19 EK A MALİ BİLANÇO ve AÇIKLAMALARI Proje Bedeli : TL Gider : TL Kalan : 380 TL Proje kapsamında aşağıdaki sarf malzemeleri alınmıştır. Sıra No Malzemenin Cinsi Miktarı Ölçü Birimi 1 Bacillus Anthracis spore antigen-antibody (MAB SA) 500 µg 2 Schaeffer and fulton spore stain kit 1 Adet 3 Difco tryptose agar 1 Adet 4 Nutrient broth No:3 1 Adet 5 Plate count agar plates 1 Adet 6 Plate count agar biochemika 1 Adet MHz Polished Ti/Au kuartz kristali 30 Adet 16

20 EK B PROJE KAPSAMINDA GERÇEKLEŞTİRİLEN SUNUMLAR Oztuna A., Nazir H., Kilic S., Baysallar M., "Using PVC Derivatives as Adhesive Layer For Bacillus anthracis Spore Detection on QCM", Biomed 2009, 15th International Biomedical Science and Technology Symposium, p. 51, August 2009, Güzelyurt, Northern Cyprus. 17

21 18