GELENEKSEL FERMENTE ÜRÜNLERİMİZDEN OLAN BOZADA BİYOJEN AMİN VARLIĞININ ARAŞTIRILMASI

Transkript

1 EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ) GELENEKSEL FERMENTE ÜRÜNLERİMİZDEN OLAN BOZADA BİYOJEN AMİN VARLIĞININ ARAŞTIRILMASI Sırma YEĞİN Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: Sunuş Tarihi: Tez Danışmanı: Prof. Dr. Ali ÜREN Bornova-İZMİR

2

3 III KABUL VE ONAY Sayın Sırma YEĞİN tarafından YÜKSEK LİSANS tezi olarak sunulan Geleneksel Fermente Ürünlerimizden Olan Bozada Biyojen Amin Varlığının Araştırılması başlıklı bu çalışma E.Ü. Lisansüstü Eğitim ve Öğretim Yönetmeliği ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Eğitim ve Öğretim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan değerlendirilerek savunmaya değer bulunmuş ve tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oy birliği ile başarılı bulunmuştur. Jüri Üyeleri İmza Jüri Başkanı : Prof. Dr. Ali ÜREN Raportör Üye: Prof. Dr. M. Kemal ÜNAL. Üye : Doç. Dr. Neriman BAĞDATLIOĞLU.

4

5 V ÖZET GELENEKSEL FERMENTE ÜRÜNLERİMİZDEN OLAN BOZADA BİYOJEN AMİN VARLIĞININ ARAŞTIRILMASI YEĞİN, Sırma Yüksek Lisans Tezi, Gıda Mühendisliği Bölümü Tez Danışmanı: Prof. Dr. Ali ÜREN Temmuz, 2006, 89 sayfa Bu araştırmada piyasadan temin edilen 10 farklı bozanın biyojen amin içerikleri; benzoil türevleri oluşturularak, C 18 kolon ve absorbans dedektörün (254 nm) kullanıldığı HPLC cihazında belirlenmiştir. Boza örneklerinin biyojen amin içerikleri belirlenirken standart katma tekniği uygulanmıştır. Önceki biyojen amin çalışmalarında olduğu gibi bir tek standart kullanmak yerine tespit edilmesi hedeflenen her bir biyojen amini (metilamin, etilamin, propilamin, putresin, kadaverin, triptamin, izopentilamin, spermidin, spermin, histamin, tiramin ve agmatin) içeren standart karışım eklenmiştir. Çünkü her bir biyojen amine ait pikin, gıda maddesinin matriksi tarafından farklı şekilde etkileneceği düşünülmüş ve bu çalışmada bu düşünce doğrulanmıştır. Boza örneklerinde agmatin ve propilamine rastlanmazken, tiramin miktarının diğer aminlere göre yüksek düzeyde olduğu tespit edilmiştir. Örneklerin tiramin içeriklerinin 12,7 ile 65,0 µg/g arasında olduğu, toplam biyojen amin içeriklerinin ise 24,80 ile 68,90 µg/g arasında olduğu belirlenmiştir. Bu sonuçlara dayanarak bozaların biyojen amin düzeylerinin sağlık açısından risk teşkil etmediği söylenebilir. Anahtar Kelimeler: Biyojen amin, HPLC, boza

6

7 VII ABSTRACT INVESTIGATION OF BİOGENIC AMINE CONTENT OF BOZA WHICH IS ONE OF THE TRADITIONAL TURKISH PRODUCTS YEĞİN, Sırma Master Thesis in Food Engineering Department Supervisor: Prof. Dr. Ali ÜREN July, 2006, 89 pages In this research, 10 samples of boza supplied from markets were analyzed to determine biogenic amine content. Biogenic amines of boza samples were derivatized by benzoyl chloride and the quantification was performed by using C 18 column and absorbance detection at 254 nm at HPLC. In this thesis standard addition technique was used for the determination of exact biogenic amine content in samples. Instead of using internal standard, which was preferred in the biogenic amine researches up to now, a standard solution containing each amine (methylamine, ethylamine, propilamine, putrescine, cadaverine, tryptamine, isopenthylamine, spermidine, spermine, histamine, tyramine and agmatine), was used. It was thought that the decreasing ratio of the peak obtained for each biogenic amine might be affected differently by the matrix of food sample. This idea was proven in this thesis. In all boza samples there weren t both agmatine and propilamine. The tiramin amount was found higher in comparison to the other amines. The tyramine content was between 12,7 and 65,0 µg/g while the total biogenic amine content was between 24,80 and 68,90 µg/g. According to results obtained from this research it can be said that the biogenic amine content of boza samples did not indicate any risk for the point of health. Key words: Biogenic amine, HPLC, boza

8

9 IX TEŞEKKÜR Yüksek lisans tez çalışmam süresince bana değerli görüş ve katkılarıyla yol gösteren, çalışmamın değerlendirilmesinde engin bilgisi ile katkıda bulunan hocam Sayın Prof. Dr. Ali ÜREN e, Laboratuar çalışmam süresince ilgi ve desteklerini esirgemeyen tüm araştırma görevlisi, tekniker ve bölümümüz çalışanlarına, Eğitimim için her türlü fedakârlığı gösteren, hayatım boyunca desteklerini ve sevgilerini hissettiğim değerli aileme, Beni yukarıdan her zaman izlediğini hissettiğim canım dayıma, Teşekkürü bir borç bilirim. Sırma YEĞİN

10

11 XI İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... V ABSTRACT...VII TEŞEKKÜR...IX ŞEKİLLER DİZİNİ...XIV ÇİZELGELER DİZİNİ...XVI KISALTMALAR DİZİNİ...XVII 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gıdalarda Biyojen Amin Oluşumu Gıdalarda Biyojen Amin Üretiminden Sorumlu Mikroorganizmalar Biyojen Amin İçeren Gıdalar Balık ve Balık Ürünleri Et ve Et Ürünleri...16

12 XII İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa Peynir Şarap Bira Lahana Turşusu Meyve ve Sebzeler Biyojen Aminlerin Fonksiyonları ve Önemi Biyojen Aminlerin Toksikolojisi Biyojen Aminlerin Detoksifikasyonu Yasal Düzenlemeler Gıdalarda Biyojen Amin Analiz Yöntemleri Boza Boza Üretimi Boza Üretiminde Rol Oynayan Mikroorganizmalar MATERYAL VE YÖNTEM...43

13 XIII İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 3.1 Materyal Yöntem Kullanılan Cihazlar Standartların Hazırlanması Boza örneklerinden biyojen aminlerin ekstraksiyonu Türevlendirme Kromatografik Koşullar Boza örneklerinde gerçekleştirilen diğer analizler ph tayini Kuru madde tayini Protein tayini BULGULAR SONUÇLAR VE TARTIŞMA KAYNAKLAR DİZİNİ...79 ÖZGEÇMİŞ...89

14 XIV ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa 1.1. Biyojen aminlerin oluşumu Biyojen amin oluşumunun metabolik iz yolu Boza üretim basamakları THF siz mobil fazda standart karışıma ait kromatogram THF siz mobil fazda (1) numaralı bozaya ait kromatogram THF siz mobil fazda (2) numaralı bozaya ait kromatogram THF siz mobil fazda (3) numaralı bozaya ait kromatogram THF siz mobil fazda (4) numaralı bozaya ait kromatogram THF siz mobil fazda (5) numaralı bozaya ait kromatogram THF siz mobil fazda (6) numaralı bozaya ait kromatogram THF siz mobil fazda (7) numaralı bozaya ait kromatogram THF siz mobil fazda (8) numaralı bozaya ait kromatogram THF siz mobil fazda (9) numaralı bozaya ait kromatogram THF siz mobil fazda (10) numaralı bozaya ait kromatogram...70

15 XV ŞEKİLLER DİZİNİ (devam) Sayfa THF siz mobil fazda standart karışıma ait kromatogram THF li mobil fazda standart karışıma ait kromatogram Biyojen aminlerin boza ve standart karışım ile çalışıldığında pik alanları...76

16 XVI ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa 2.1. Çeşitli gıdalarda bulunan biyojen aminler ve bu gıdalardan izole edilen bakteriler Stok çözeltilerin hazırlanmasında kullanılan biyojen amin miktarları Dereceli Elüsyon Programı Bozalarda belirlenen biyojen amin miktarları (µg/g) Bozalarda belirlenen ph, % kuru madde ve % protein değerleri ve toplam biyojen amin miktarları (µg/g)...58

17 XVII KISALTMALAR DİZİNİ Kısaltmalar Açıklama DAO DNA FDA GC HPLC HNMT MAO OPA RNA TCA THF Diaminooksidaz Deoksiribonükleik asit Gıda ve İlaç İdaresi (ABD) Gaz Kromatografisi Yüksek basınç Sıvı Kromatografisi Histamin-N-metil transferaz Monoaminooksidaz Orto-fitalaldehit Ribonükleik asit Trikloroasetikasit Tetrahidrofuran

18 1 1. GİRİŞ Biyojen aminler; insan, hayvan ve mikroorganizmaların metabolik ürünleri olup, amonyakta bulunan bir, iki veya üç hidrojen atomunun alkil ve aril grupları ile yer değiştirmesi sonucu oluşan düşük molekül ağırlıklı bazik karakterli bileşiklerdir (Ten Brink et al., 1990; Shalaby, 1996; Hornero-Mendez ve Garrido-Fernandez, 1997; Arena ve Monca de Nadra, 2001). Canlı organizmaların aktivitesi sonucu oluştuklarından biyojen amin adını almaktadırlar (Shalaby, 1996). Biyojen aminler temel olarak aminoasitlerin dekarboksilasyonu veya aldehit ve ketonların aminasyonu ve transaminasyonu sonucu oluşmaktadırlar (Silla-Santos, 1996). H R - C - COOH NH 2 Aminoasit Dekarboksilasyon R - CH 2 - NH 2 + CO 2 Biyojen amin H / H 2 / Ni R - C + NH 3 R - CH 2 - NH 2 + H 2 O \\ O Aldehit Biyojen amin R / H 2 / Ni O = C + NH 3 R - CH - R + H 2 O \ R NH 2 Keton Biyojen amin Şekil 1.1. Biyojen aminlerin oluşumu

19 2 Aminoasitlerden karbondioksitin ayrılmasıyla söz konusu aminoasidin amini oluşmaktadır. Bu olay organizmaya özgü enzimlerle olabildiği gibi mikrobiyal olarak da gerçekleşmektedir. Aminoasitlerden karbondioksidin ayrılmasına dekarboksilasyon, ilgili enzime dekarboksilaz adı verilir. Dekarboksilasyondan sorumlu dekarboksilazlar, hem hayvansal ve bitkisel dokular hem de mikroorganizmalar tarafından oluşturulabilirler. Genellikle dekarboksilazlar ya özel olarak bir tek aminoaside ya da bir dizi farklı aminoaside etki ederler. Çeşitli bakteri türlerinin aminoasitleri dekarboksile etme kabiliyetleri farklıdır. Bazı türler birçok aminoasidi dekarboksile ederken bazıları ise substrata özel dekarboksilaz aktivitesine sahip olup yalnız bir tek aminoaside etki ederler (Yerlikaya ve Gökoğlu, 2002). Biyojen aminlerden en yaygın söz edileni histamin ve tiramin ise de; triptamin, putresin, kadaverin, serotonin, spermidin, spermin, agmatin ve β-feniletilamin gibi aminler de birçok gıdada dekarboksilaz tepkimeleri sonucu oluşmaktadır (Üçüncü, 2004). Kadaverin, putresin, histamin, tiramin, triptamin gibi biyojen aminler sırasıyla lisin, ornitin, histidin, tirozin ve triptofan aminoasitlerinin dekarboksilasyonu sonucu oluşmaktadırlar (Ten Brink et al., 1990; Moret ve Conte, 1996).

20 3 al., 1994) Şekil 1.2. Biyojen amin oluşumunun metabolik iz yolu (Halasz et

21 4 Kimyasal olarak biyojen aminler; Alifatik : Putresin, kadaverin, spermin, spermidin Aromatik : Tiramin, β-feniletilamin Heterosiklik : Histamin, triptamin olarak sınıflandırılabilirler (Silla-Santos, 1996; Çolak ve Aksu, 2002). Diğer taraftan içerdikleri amin grubu sayısına göre de monoaminler, diaminler, poliaminler olarak gruplandırılabilirler (Erkan, 2004). Poliaminler insan ve hayvanlarda fizyolojik fonksiyonların yerine getirilmesinde çok önemli rol oynamaktadırlar (Ten Brink et al., 1990; Hernandez-Jover et al., 1997). Putresin, spermidin ve spermin; DNA, RNA ve protein sentezinin hemen hemen bütün basamaklarında rol almakta ve bu nedenle hücre büyüme ve çoğalmasında gerekmektedirler (Bardocz, 1995). Bu çalışmada geleneksel fermente ürünlerimizden bozanın biyojen amin içeriğinin tespit edilmesi amaçlanmıştır.

22 5 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Gıdalarda Biyojen Amin Oluşumu Protein ya da serbest aminoasit içeren, mikrobiyal ve biyokimyasal aktiviteye imkan tanıyan hemen hemen bütün gıdalarda biyojen amin oluşumu beklenebilmektedir. Farklı aminlerin oluşumu temel olarak gıda maddesinin bileşimine ve söz konusu gıdada mevcut olan mikroorganizmalara bağlıdır (Ten Brink et al., 1990; Silla-Santos, 1996). Gıdalarda biyojen amin oluşumunu etkileyen faktörler; Serbest aminoasitlerin varlığı, varlığı, Aminoasitleri dekarboksile edebilecek mikroorganizmaların Mikroorganizmaların gelişebileceği ve dekarboksilaz enzimini üretebilecekleri uygun ortam koşulları (Shalaby, 1996). Serbest aminoasitler gıdalarda ya doğal olarak bulunmakta ya da proteoliz sonucu meydana gelmektedirler (Bodmer et al., 1999). Dekarboksilaz pozitif mikroorganizmalar ise gıdanın doğal mikroflorasının bir parçası olabildikleri gibi gıdalara proses sırasında veya proses önce ve sonrasında kontaminasyonla geçmiş olabilirler (Ten Brink et al., 1990). Bu nedenle teknolojinin üstünde durması gereken konu istenmeyen dekarboksilaz aktif mikroorganizmaların ve/veya dekarboksilaz enzimlerini aktif hale getirebilecek istenmeyen proses koşullarının oluşumunun önlenmesidir (Bodmer et al., 1999).

23 6 Gıdalarda biyojen aminlerin oluşumunda, amin üreten mikroorganizmaların dekarboksilaz aktivitesini etkileyen bazı faktörlerin sağlanması gereklidir. Bunlardan ph, sıcaklık, tuz konsantrasyonu, starter kültürlerin varlığı en önemli faktörlerdendir (Çolak ve Aksu, 2002). ph ph dekarboksilaz aktivitesini etkileyen en önemli faktörlerden biridir (Silla-Santos, 1996). Ortam asitliğinin amin oluşumuna etkisi bağlamında gerçekleştirilen çalışmalarda, amin üretimi, bakterilerin asidik koşullara karşı korunma mekanizması olarak açıklanmaktadır (Halasz et al., 1994; Silla-Santos, 1996). Aminoasit dekarboksilaz aktivitesinin asidik ortamda artış gösterdiği ve ph 4,0 ve 5,5 arasında optimum düzeyde olduğu bildirilmektedir (Silla-Santos, 1996). ph 4,0 dan daha asidik ph değerlerinde söz konusu amin pozitif mikroorganizmaların yaşayamamalarından dolayı biyojen amin üretimi mümkün olmamaktadır. Maijala (1993) tarafından yapılan bir çalışmada Lactobacillus bulgaricus un aminoasit ilave edilerek kuvvetlendirilmiş MRS broth da daha fazla histamin, tiramin ve triptamin ürettiği tespit edilmiştir. Benzer şekilde ortamda glikoz gibi fermente olabilen karbonhidratların bulunması da bakterilerde hem gelişmeyi hem de dekarboksilaz aktivitesini arttırmaktadır (Halasz et al., 1994). Çünkü şekerin parçalanması ile laktik asit oluşumundan dolayı, ph düşüşü sağlanmaktadır (Çolak ve Aksu, 2002). % 0,5 2,0 arasındaki glikoz konsantrasyonlarının optimum olduğu, % 3 ten fazla olan konsantrasyonlarda ise enzim oluşumunun inhibe edildiği rapor edilmiştir (Halasz et al., 1994).

24 7 ph değeri ne kadar yüksek olursa bakteriyel mikroflora da o kadar kompleks olmaktadır. ph şaraptaki mikroorganizmalar için seçici bir faktör teşkil etmektedir. Şarapların ph sı 3 ile 4 arasında değişmekte olup bu ph aralığında yüksek ph değerlerinde amin üretimi de her zaman yüksek miktarlarda olmaktadır. Bu bakteriyel çeşitliliğin ve toplam büyümenin kolay olmasının bir sonucudur. Bu nedenledir ki; kırmızı şaraplara göre daha asidik olan beyaz şarapların biyojen amin içerikleri daha düşüktür (Lonvaud-Funel, 2001). Sucukların olgunlaşması sırasında ph nın düşüşü ile birlikte bakteriler arasındaki rekabet sonucu, laktik asit bakterileri ortamda gelişerek baskın duruma geçmektedir. Bu durumda fermente sucuklarda amin pozitif laktik asit bakterileri baskın hale geçtiğinden biyojen amin üretimi gerçekleşmektedir (Çolak ve Uğur, 2002). Sucuklarda hızlı ve ani ph düşüşünün; amin pozitif mikroorganizmaların, genellikle Enterobacteriaceae türlerinin gelişimini azalttığı bilinmektedir. Sucuklarda görülen yüksek oranda histamin üretimi, olgunlaşmanın ilk gününde ph düşüşünün yetersiz olmasıyla ilgilidir (Suzzi ve Gardini, 2003). Sıcaklık Sıcaklık, bakterilerin amin üretimini büyük ölçüde etkilemektedir. Amin oluşumu için optimum sıcaklık değerleri bakteri türlerine göre değişir (Çolak ve Aksu, 2002). Örneğin; Enterobacter cloacae 20 C de 24 saatlik bir inkübasyon sonrasında 2 mg/ml putresin üretirken 10 C de amin üretimini gerçekleştirememektedir. Klebsiella pneumoniae sıcaklığa karşı fazla duyarlı değildir ancak 10 C de 20 C ye göre daha az oranda kadaverin üretimi gerçekleştirmektedir (Halasz et al., 1994).

25 8 Çolak ve Uğur (2002) tarafından yapılan bir çalışmada oda sıcaklığında muhafaza edilen sucuk örneklerinde belirlenen putresin miktarının, buzdolabında depolanan örneklere göre artış gösterdiği tespit edilmiştir. Sıcaklığın, balık ve peynir endüstrisinde biyojen amin oluşumu üzerinde belirgin bir etkisi olduğu çok iyi bilinmektedir (Gardini et al., 2001). Yapılan bir çalışmada Gouda peynirlerinde, histamin miktarının depolama sıcaklığı arttıkça artış gösterdiği tespit edilmiştir (Stratton et al., 1991). Klausen ve Lund (1986) tarafından yapılan bir çalışmada ise uskumru ve ringada 10 C deki biyojen amin içeriğinin 2 C ye göre 20 kat daha yüksek olduğu rapor edilmiştir. Wendakoon et al. (1990) tarafından yapılan başka bir çalışmada uskumrunun buzda depolanması sırasında hiçbir amin üretiminin olmadığı bildirilmiştir. Yoshida ve Nakamura (1982) taze balıkta hiçbir histamin kalıntısına rastlamazken, oda sıcaklığında bekletilen balıklarda histamin oranının 24 saat içinde 28,4 ppm e ve 48 saatten sonra 1540 ppm e ulaştığını tespit etmişlerdir. Düşük sıcaklıkta depolama balıklarda biyojen amin oluşum oranını düşürmektedir (Shalaby, 1996). Tuz Konsantrasyonu Biyojen amin oluşumunda ortamın tuz konsantrasyonu önemli bir faktördür. Tuz konsantrasyonunun % 5 ten fazla olmasının histamin oluşumunu azalttığı bilinmektedir (Çolak ve Aksu, 2002). Tuzlama, histidin dekarboksilaz aktivitesini inhibe etmektedir. Ancak halotolerant bakteriler için tuzlama pek bir önem taşımamaktadır. % 12 NaCl konsantrasyonuna sahip sardalye etinde halotolerant bakterilerin biyojen amin ürettiği tespit edilmiştir (Shalaby, 1996). Uskumru etinde histamin

26 9 üretimi, tuz konsantrasyonu ne olursa olsun, tuzlama ile inhibe edilmiş ve hemen hemen hiç üretilmemiştir (Silla-Santos, 1996). Carnobacterium divergens in tiramin üretiminin araştırıldığı bir çalışmada % 10 NaCl un tiramin oluşumunu inhibe ettiği tespit edilmiştir (Masson et al., 1997). Fermente sucukların depolanması ve fermantasyonu sırasında su miktarındaki ve tuz/su oranındaki değişiklik mikroorganizmaların çoğalması üzerinde önemli bir etkiye sahiptir ( Suzzi ve Gardini, 2003). Chander et al. (1989) tarafından yapılan bir çalışmada; ortamın tuz konsantrasyonunun 0 dan % 6 ya çıkarılmasıyla Lactobacillus bulgaricus un ürettiği amin miktarının büyük ölçüde azaldığı tespit edilmiştir. Bu negatif etki, yüksek NaCl konsantrasyonu nedeniyle, hücre bölünmesinin azalması ve/veya mikrobiyal dekarboksilaz enzimi taşıyan membranlarda meydana gelen hasar olmak üzere iki nedene bağlanabilmektedir (Gardini et al., 2001). Gardini et al. (2001) tarafından yapılan bir çalışmada E. feucelis EF37 suşunun M17 broth ve çiğ sütteki aktivitesi; inkübasyon sıcaklığı, NaCl konsantrasyonu ve ortam ph sı olmak üzere üç farklı değişkene göre belirlenmiştir. Söz konusu çalışmada biyojen amin üretiminin ortam sıcaklığından bağımsız olduğu ancak yüksek tuz konsantrasyonu ve düşük ph da azaldığı belirlenmiştir. Sıcaklık faktörünün biyojen amin üretimi üzerinde artışa sebep olması gerekirken bu çalışmada biyojen amin üretimi üzerinde etkisiz görünmesinin sebebi 72 saat gibi kısa bir inkübasyon süresinde gerçekleştirilmiş olmasına bağlanmıştır.

27 10 Starter Kültürler Fermente gıdaların hazırlanması sırasında pek çok farklı mikroorganizmaya rastlanması mümkün olabilmektedir. Laktik asit bakterilerinin büyüme ve gelişmesine olanak sağlayan pek çok gıda maddesinde önemsenecek düzeyde putresin, kadaverin, histamin ve tiramin bulunmaktadır (Ten Brink et al., 1990; Silla-Santos, 1996). Fermente et ürünlerinde, starter kültür kullanımının, doğal mikroflora kullanılarak elde edilen ürünlere oranla daha az miktarlarda biyojen amin üretimine sebep olduğu tespit edilmiştir (Silla-Santos, 1996). Starter kültür kullanımının biyojen amin üretiminin azaltılması açısından iyi bir çözüm yolu teşkil ettiği belirtilmektedir. Starter olarak kullanılan mikroorganizmalar, Enterobacteriaceae gibi biyojen amin oluşumuna neden olabilecek mikroorganizmaların gelişimini azaltıcı etkiye sahiptirler (Hernandez-Javer et al., 1997). Fermente sucuk üretiminde starter kültür kullanımının biyojen amin oluşumunu azalttığı fakat önlemediği belirtilmiştir. Starter kültürler hammaddede mevcut olan bazı kontamine mikroorganizmaları ve dolayısıyla putresin ve kadaverin gibi biyojen aminlerin oluşumunu inhibe etmektedirler. Fakat histamin ve tiramin oluşumunu, amin üreten mikroorganizmalar çok düşük konsantrasyonlarda bulunsalar bile inhibe edememektedirler (Çolak ve Aksu, 2002). Diğer taraftan Eerola et al. (1996) tarafından yapılan bir çalışmada, sucuklarda amin-negatif starterlerden olan Pediococcus pentosaceus ve Staphylococcus carnosus un amin-pozitif kontamine laktik asit bakterilerinin gelişmesini ve biyojen amin oluşturma kabiliyetlerini önlemediği belirtilmiştir. Ansorena et al. (2002) tarafından yapılan bir çalışmada, Kuzey ve Güney Avrupa sucuklarında starter kültürlerin biyojen amin oluşturma yetenekleri incelenmiştir. Söz konusu çalışmada starter olarak kullanılan

28 11 hiçbir Lactobacillus türünün biyojen amin üretmediği ancak Kocuria varions ve Staphylococcus carnosus un fenilalanini dekarboksile edebildikleri ortaya konmuştur. Doğal mikrofloranın bir parçası olan laktik asit bakterilerinin ve Enterococci türlerinin amin oluşumuna katkıda bulundukları aynı çalışmada belirlenmiştir. Süt endüstrisinde starter kültür olarak kullanılan Streptococcus lactis ve Lactobacillus helveticus gibi bazı bakteriler histamin üreticileri olarak tanımlanmıştır (Shalaby, 1996). Ordonez et al. (1997) tarafından yapılan bir çalışmada peynir üretiminde kullanılan ticari starter kültürlerin yüksek oranda tiramin ve putresin üretimine yol açarken diğer biyojen amin üretimlerinde azalmaya neden oldukları saptanmıştır. Biyojen aminlerin oluşmasında starter ve starter olmayan bakterilerin etkileri bulunmasına rağmen, starter olarak yararlanılan bakterilerin söz konusu etkileri diğerlerine göre daha düşük düzeydedir (Üçüncü, 2004). Özellikle laktik asit bakterileri kullanılarak üretilen fermente gıdalarda, doğal mikrofloranın bir parçası olan (starter olmayan) laktik asit bakterilerini ve diğer mikroorganizmaları baskı altına alabilecek amin-negatif starter kültürler tercih edilmelidir (Ten Brink et al., 1990). Fermente gıdalarda fermantasyon süresinin mümkün olduğunca kısa tutulmasının ve doğal mikroflora yerine dikkatlice seçilmiş starter kültürlerin kullanılmasının toksik biyojen aminlerin oluşumunun önlenmesine yardımcı olacağı bildirilmektedir (Silla-Santos, 1996). Diğer Faktörler Oksijen miktarı amin biyosentezinde önemli bir etkiye sahiptir. Enterobacter cloacae anaerobik ortamda aerobik ortam koşullarına

29 12 oranla hemen hemen yarı seviyelerde putresin üretmektedir (Halasz et al., 1994). Oksijenli ortamda mikroorganizmalar tarafından biyojen amin üretimi daha fazla olmaktadır (Erkan, 2004). Saf kültür denemeleri sonuçlarına göre aerobik koşullar altında depolanan domuz etinde Enterobacteriaceae oldukça fazla miktarda kadaverin üretirken, Pseudomonas türleri başlıca biyojen amin olarak putresin üretmektedirler (Shalaby, 1996). Glisin (% 10 w/v), sorbik acid (% 0,1-0,2 w/v) ve sitrik, malik, süksinik asit (% 10 w/v) gibi katkıların da biyojen amin sentezini azaltıcı etkiye sahip oldukları bildirilmektedir (Silla-Santos, 1996) Gıdalarda Biyojen Amin Üretiminden Sorumlu Mikroorganizmalar Genellikle amin üretimi aminoasitleri dekorboksile etme yeteneğine sahip bakterilerin varlığı sonucu gerçekleşmektedir (Shalaby, 1996). Aminoasit dekarboksilaz enzimleri bakteriler arasında geniş bir dağılım göstermemesine rağmen, Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Escherichia, Klebsiella, Lactobacillus, Pediococcus, Photobacterium, Proteus, Pseudomonos, Salmonella, Shigella, Streptococcus türleri bir ya da daha fazla aminoasidi dekarboksile etme yeteneğine sahiptirler (Ten Brink et al., 1990). Histamin tüm biyojen aminler içinde en yüksek biyolojik aktiviteye sahiptir. Escherichia, Salmonella, Clostridium, Bacillus ve Lactobacillus türleri histidin dekarboksilaz aktivitesine sahiptir (Halasz et al., 1994).

30 13 Çizelge 2.1. Çeşitli gıdalarda bulunan biyojen aminler ve bu gıdalardan izole edilen bakteriler (Shalaby, 1996). GIDA İZOLE EDİLEN BAKTERİ BİYOJEN AMİN Balık Peynir Et ve Et Ürünleri Fermente Sebzeler Fermente Soya Ürünleri Mornogella morgoni Klebsiella pneumonia Hoilfnia alvei Proteus mirabilis Clostridium perfingens Enterobacter aerogenes Vibrio alginolytiens Bacillus spp. Staphylococcus xylosus Lactobacillus buchneri Lactobacillus 30a L. bulgaricus L. plantorum L. casei L. acidophilus Streptecoccus faecium S. mitis Bacillus macerans Propioni bacterria Pediococcus Enterobacteriaceae Lactobacillus Pseudomonas Streptococcus Micrococcus Lactobacillus plantarum Pediococci sp. Leuconostoc mesenteroides Rhizopus oligosporus Trichosporon beiglli Lactobacillus plantarum Histamin Tiramin Kadaverin Putresin Agmatin Spermin Spermidin Histamin Kadaverin Putresin Tiramin β-feniletilamin Triptamin Histamin Kadaverin Putresin Tiramin β-feniletilamin Triptamin Histamin Kadaverin Putresin Tiramin Triptamin Histamin Kadaverin Tiramin Triptamin

31 Biyojen Amin İçeren Gıdalar Biyojen aminler; balık ve balık ürünleri, et ve et ürünleri, süt ürünleri, şarap, bira, sebzeler, meyveler ve çikolata olmak üzere geniş bir gıda grubunda bulunmaktadır Balık ve Balık Ürünleri Balık; nötral ph, yüksek su aktivitesi ve yüksek miktarda serbest aminoasit içermesiyle karakterize edilmektedir. Bu nedenle mikrobiyal bozulmalara açıktır. Mikroorganizmalar serbest aminoasitleri, karşılık gelen biyojen aminlere dekarboksile edebilmektedirler (Leuschner ve Hammes, 1999). Biyojen aminler balıkların bozulmasının tespiti açısından bir kalite kriteri olarak kabul edilmektedirler (Hwang et al., 1997). Histamin, putresin, kadaverin, tiramin, spermin, spermidin gibi pek çok farklı çeşit biyojen amin uskumru, ringa, ton balığı ve sardalye gibi balıklarda tespit edilmiştir (Silla-Santos, 1996). Biyojen aminler balık zehirlenmelerine neden olabilmektedirler. Balık kası (özellikle koyu renkli kaslar) oldukça yüksek oranda tirozin ve histidin içerir. Et rengi koyu olan balıklarda beyaz etli balıklara oranla daha fazla histidin vardır (Erkan, 2004). Bu histidin ilgili mikroorganizmalar tarafından histamine dönüştürülebilmektedir (Halasz et al., 1994). Bu nedenle balık ve balık ürünleri histamin zehirlenmesinden sorumlu tutulan başlıca gıda grubu olarak değerlendirilmektedir (Çolak ve Aksu, 2002). Histamin zehirlenmesinin belirtileri, Scomberesocidae ve Scombridae (ton ve uskumru) familyasına ait balıkların tüketimi sonucu ortaya çıkmaktadır. Bu nedenle histamin

32 15 zehirlenmesi Scombroid zehirlenmesi olarak da adlandırılmaktadır (Leuschner ve Hammes, 1999). Ancak son yıllarda yapılan çalışmalar bu zehirlenmelerin Scomboroidae familyasına ait olmayan balık türlerinin (sardalye, hamsi, ringa, lambuga vb.) tüketimi ile de ilişkili olduğunu göstermiştir (Mater et al., 2001). Histamin biyolojik olarak aktif bir amin olup, insan vücudu içerisinde birçok tepkimelere yol açabilmektedir. Histamin kalp damar sistemi ve çeşitli iç salgı bezlerindeki hücre membran reseptörlerine bağlanarak etkisini göstermektedir. Deriyi etkileyen karakteristik belirtiler kızarıklık, ödem ve iltihap olmaktadır. En yaygın görülen belirtiler; mide bağırsak bölgesi belirtileri (ishal, mide bulantısı, kusma), deride görülen belirtiler (kızarıklık, ödem), gerginlik ve sinirsel belirtiler (kaşıntı, kızarıklık, çınlama, baş ağrısı) olmaktadır. Histamin balık zehirlenmesi sonucu oluşan belirtiler toksik miktarların emiliminden birkaç dakika veya saat sonra görülmektedir. Tipik olarak hastalık birkaç saat sürmekle birlikle bu süre birkaç güne uzayabilmektedir (Özoğul et al, 2004). Balıkların fermantasyonu biyojen amin oluşumu için gerekli koşulları sağlamaktadır. Serbest aminoasitlerin ve dekarboksilaz pozitif mikroorganizmaların varlığı, bakteriyel büyüme ve dekarboksilaz sentezine olanak sağlayan ortam koşulları biyojen aminlerin oluşumuna olanak sağlamaktadır (Petaja et al., 2000). Düşük sıcaklıklarda depolanan balıklarda biyojen amin oluşumunun azaldığı bilinmektedir (Özoğul et al., 2004). Balık endüstrisinde avlanmadan sonra balığın düşük sıcaklıkta depolanması biyojen amin oluşumunu kontrol eden en önemli faktördür. Histamin oluşumuna katkıda bulunan bazı bakteriler balığın solungaçlarında ve

33 16 bağırsaklarında bulunur. Yüksek sıcaklıkta depolama durumunda kas dokusuna bakterilerin geçişi ile histamin üretimi söz konusu olmaktadır (Yerlikaya ve Gökoğlu, 2002) Et ve Et Ürünleri Dondurma işlemi gibi et ürünlerine uygulanan koruma ve saklama işlemleri, çözündürme, etin işlenmesi ve et ürünlerinde bulunan bakteriler; söz konusu ürünlerde biyojen amin oluşumunu etkileyen temel faktörlerdir (Durlu-Özkaya et al., 2001). Taze ve işlenmiş et ürünlerinin yüksek miktarlarda adrenalin, noradrenalin, spermidin, spermin, putresin, kadaverin, histamin, tiramin içerdiği tespit edilmiştir (Erkan, 2004). Biyojen aminler taze et ve pişmiş et ürünlerinde kalite indeksi ve istenmeyen mikrobiyal aktivite indikatörleri olarak kullanılmaktadırlar. Putresin ve kadaverin taze et ürünlerinde kabul edilebilirliğin bir indeksi olarak önerilmiştir. Putresin ve kadaverin konsantrasyonu depolamanın hemen öncesinde artış göstermektedir ve mikrobiyal yükle iyi bir korelasyon sergilemektedir (Ruiz-Capillas ve Jimenez-Calmenero, 2004). Wortberg ve Woller (1982) yüksek kadaverin konsantrasyonunun açıkça bozulmanın bir indikatörü olduğunu tespit etmişlerdir. Genellikle fermente et ürünlerinde benzer kalite kriterlerinin uygulanmasının daha güç olduğu kanıtlanmıştır. Biyojen amin konsantrasyonu fermente et ürünlerinde, taze ve pişirilmiş et ürünlerine oranla çok daha fazla farklılık göstermektedir. Çünkü fermantasyon işlemi biyojen amin oluşumunu etkileyen pek çok farklı faktör içermektedir. Bu faktörler; hammaddenin çeşit ve kontaminasyon derecesi (yapısal bozulmayı tetikler), üretim koşulları, proses basamakları, starter kültürler olmak üzere sıralanabilmektedir (Ruiz-Capillas ve Jimenez-Calmenero, 2004).

34 17 Et ürünlerinde biyojen aminler üzerine çalışmalar bulunmasına rağmen bu çalışmaların çoğunluğu fermente ürünler üzerinde yapılmış olup taze et ve kaynatılmış gıdalar üzerinde yapılan çalışmalar daha azdır (Ruiz-Capillas ve Jimenez-Calmenero, 2004). Taze ve işlem görmüş domuz etlerinde yüksek oranda adrenalin, spermidin ve spermin, buna karşılık düşük oranda noradrenalin, putresin, histamin, kadaverin ve tiramin tespit edilmiştir (Silla-Santos, 1996). Yapılan bir çalışmada pişirilmiş ve pişirilmemiş sığır etlerinin 4-10 C de depolanması durumunda biyojen amin içeriklerindeki değişiklik incelenmiştir. Putresin, 1,3-diaminopropan, spermin, spermidin, kadaverin ve tiraminin depolama sıcaklığı ve depolama süresi ile pozitif bir korelasyon gösterdiği tespit edilirken histamin düzeyinin depolama koşullarından etkilenmediği ortaya konmuştur. Spermin ve spermidin dışındaki biyojen aminlerin konsantrasyonunun pişirme işleminden etkilenmediği ancak spermin ve spermidin düzeyinin ısı muamelesi sonucu azalma gösterdiği aynı çalışmada ifade edilmiştir (Halasz et al., 1994). Vinci ve Antonelli (2002) tarafından yapılan bir çalışmada 4 ± 1 C de 36 gün süreyle depolanan kırmızı ve beyaz etteki biyojen amin içeriğine depolama süresinin etkisi araştırılmıştır. Söz konusu çalışmada biyojen amin içeriğinin beyaz ette, kırmızı ete oranla daha erken arttığı tespit edilirken, bu sonuç tavuk etini oluşturan kas dokunun proteolitik enzimler tarafından kolayca parçalanabilen daha kısa liflerden oluşmasına bağlanmıştır. İki et grubunda da kadaverin en yüksek düzeyde üretilmiştir ki; bu da etteki kadaverinin öncü aminoasidi olan lisinin fazla olmasının bir sonucudur. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda iki et

35 18 türünde de kadaverin miktarındaki büyük artış ve kırmızı etteki tiramin miktarındaki artış etin bozulmasının bir indikatörü olarak gösterilmiştir. Fermente et ürünlerinin olgunlaşması sırasında proteinlerde mikrobiyal aktivite ve endojen proteolitik enzimlerin aktivitesi sonucu parçalanmalar meydana gelmektedir (Erçoşkun et al., 2005). Proteoliz; asitlikteki artış, dehidrasyon ve sodyum klorür ün etkisi sonucu ortaya çıkan protein denaturasyonu nedeniyle artış göstermektedir. Fermente sucuklarda biyojen amin üretimi, ette bulunan mikroorganizmaların fermantasyon ve olgunlaştırma sırasındaki proteolitik aktiviteleri ile ilgilidir. Bu proteolitik aktivite sonucu söz konusu biyojen aminleri oluşturan öncül aminoasitler oluşmaktadır (Suzzi ve Gardini, 2003). Fermente sucuklarla ilgili yapılan birçok çalışmada bu üründe biyojen aminlerin önemli miktarlarda bulunabildiği rapor edilmiştir. Sucuklarda oluşan en önemli biyojen aminler, putresin, histamin, kadaverin, tiramin, triptamin, β-feniletilamin, spermidin ve spermin dir (Çolak ve Aksu, 2002). Sucuklarda tespit edilen biyojen amin seviyeleri için genellikle çok farklı değerler rapor edilmiştir. Bu değişik konsantrasyonlar; olgunlaşma ve proses süresindeki farklılıklar, fermantasyondan sorumlu doğal mikrofloranın sahip olduğu dekarboksilaz aktivitesindeki değişiklikler, bazı aminlerin metabolizması ve biyosentezi, üretim koşulları, kullanılan etin çeşidi ve kalitesi, kullanılan et miktarı gibi faktörlere bağlanabilmektedir (Shalaby, 1996). Ayhan et al. (1999) tarafından yapılan bir çalışmada Türk sucuklarında starter kültürlerin biyojen amin oluşumuna etkisi incelenmiştir. Söz konusu çalışma sonucunda starter kullanılmadan üretilen sucuklarda putresin ve tiramin miktarlarının depolama ile artış gösterdiği ancak starter eklenerek üretilen sucuklarda putresin

36 19 oluşumunun durduğu, tiramin düzeyinde ise bir değişiklik olmadığı tespit edilmiştir. Farklı starter kültürlerin ve/veya proses rejimlerinin biyojen amin oluşumunu kontrol edebileceği aynı çalışmada ifade edilmiştir. Bover-Cid et al. (2001) tarafından yapılan bir çalışmada fermente sucuklarda sodyum sülfit kullanımının biyojen amin oluşumu üzerine etkisi incelenmiştir. Sucukların olgunlaştırılması sırasında mikroorganizma gelişimini azaltmak amacı ile kullanılan sodyum sülfit in şaşırtıcı bir şekilde tiramin oluşumunu teşvik ettiği ancak kadaverin oluşumunu büyük ölçüde durdurduğu ifade edilmiştir. Sodyum sülfit in putresin ve diğer biyojen aminlerin birikimi üzerine etkisi tam olarak açıklanamamıştır. Ancak spermin ve spermidin gibi poliaminlerin miktarında sodyum sülfit kullanılması ve kullanılmaması durumunda herhangi bir değişiklik olmadığı vurgulanmıştır. Bu sonuç diğer araştırmacılar tarafından da ortaya konan, poliaminlerin olgunlaştırma sırasında mikrobiyal aktivite sonucu oluşmadığı, et ve et ürünlerinin fizyolojik mikro-komponentleri olduğu ifadesine de uygunluk göstermektedir Peynir Peynir yüksek amin içeriğine sahip olan gıdalardan biridir (Halasz et al., 1994). Peynirde bulunabilen en önemli biyojen aminler; tiramin, histamin, putresin, kadaverin, triptamin ve β-feniletilamin dir (Shalaby, 1996). Peynir, diğer fermente gıdalar gibi amin üretimi için ideal bir substrattır. Peynir üretim prosesi sadece serbest amino asit oluşumunu mümkün kılmakla kalmamakta, ayrıca dekarboksilaz pozitif mikroorganizmaların varlığı ile onların gelişimine ve dekarboksilaz

37 20 enzim aktivitesine olanak sağlayan ortam koşullarını da mümkün kılmaktadır (Novella-Rodriguez et al., 2000). Kazein proteolizi peynirin olgunlaşması sırasında yer alan en önemli prosestir. Bu proses sırasında kazein, peynirde bulunan proteaz ve peptidazlar tarafından yıkıma uğramakta ve sonuçta aminlerin öncü maddeleri olan serbest aminoasitler oluşmaktadır. Olgunlaştırma süresi arttıkça serbest aminoasit içeriğinin artmasından ötürü biyojen amin oluşma olasılığı da artmaktadır (Ordonez et al., 1997). Peynirlerde biyojen aminlerin bulunuşu büyük ölçüde çiğ sütün mikrobiyal kalitesine bağlıdır (Yerlikaya ve Gökoğlu, 2002). Çiğ ya da yeterince pastörize edilmemiş sütten yapılan peynirlerde oluşun biyojen amin miktarı, pastörize sütten elde edilenlere kıyasla daha yüksektir. Nitekim, bu bağlamda gerçekleştirilen bir araştırmada, pastörize sütten üretilen peynirlerin toplam biyojen amin içeriğinin mg/kg arasında değiştiği, buna karşılık çiğ sütten yapılanlarda bu değerin mg/kg olduğu belirlenmiştir (Üçüncü, 2004). Peynirlerin yüksek sıcaklıkta depolanmaları sırasında mikroorganizma sayısının hızla artması nedeniyle biyojen amin konsantrasyonu da artmaktadır (Yerlikaya ve Gökoğlu, 2002). Pinho et al. (2001) tarafından Azeitão peynirlerinde yapılan bir çalışmada 4 C de depolanan peynirlerdeki biyojen amin miktarının, oda sıcaklığında (25 C) depolanan peynirlere oranla daha az olduğu tespit edilmiştir. Oda sıcaklığında depolama sonucu tiramin ve putresin miktarında meydana gelen artıştan yola çıkarak söz konusu iki aminin olgunlaştırılmış peynirlerde sıcaklık değişikliğinin indikatörü oldukları ifade edilmiştir.

38 21 Peynir, histamin zehirlenmesi ve tiramin toksisitesinin en yaygın olarak gözlendiği gıdalar arasında yer almaktadır. 100 mg histamin/100 g peynir oranında histamin içeren İsviçre peynirlerinin tüketilmesi sonucu pek çok histamin zehirlenmesi vakası bildirilmiştir (El-Sayed, 1996). Peynir; balık ve balık ürünlerinden sonra histamin zehirlenmelerinden en çok sorumlu tutulan gıda maddesidir (Stratton et al., 1991; Silla-Santos, 1996). Peynirlerde histamin zehirlenmesinde asıl rol alan bakterinin Lactobacillus bunchneri olduğu belirtilmektedir (Yerlikaya ve Gökoğlu, 2002). Histamin üretme yeteneğine sahip olan L. bunchneri, Gouda peynirlerinde pek çok farklı koşullar altında yapılan denemeler sonucunda karakterize edilmiştir (Stratton et al., 1991). Peynirlerin L. bunchneri ile kontaminasyonu sonucu histamin ve tiramin oluşumu artmaktadır (Ekici et al., 2002). Peynir reaksiyonu tiramince zengin gıdaların tüketilmesi sonucu ortaya çıkan tehlikeli bir intoksikasyondur. Hipertansiyon krizine genellikle şiddetli baş ağrısı da eşlik etmektedir (Vale ve Gloria, 1998) Şarap Histamin, tiramin ve putresin şaraplarda bulunabilen temel biyojen aminlerdir. Metilamin, etilamin, β-feniletilamin, izopentilamin ve kadaverin gibi diğer biyojen aminler üzüm suyunda bulunmakta ve şarap üretim prosesi sırasında miktarlarında değişiklikler olmaktadır (Lonvaud- Funel, 2001). Şaraplarda bulunan biyojen aminler; Hammaddede bulunabilmektedirler.

39 22 Alkolik fermantasyon sırasında mayalar tarafından üretilebilmektedirler. Malolaktik fermantasyon sırasında bakteriler tarafından üretilebilmektedirler (Anlı et al., 2004). Bazı aminler üzümlerin normal yapı unsurlarıdır ve üzüm çeşidi, olgunlaşma derecesi, yetiştirilen toprağın yapı ve kompozisyonu gibi faktörlere bağlı olarak miktarları değişebilmektedir. Ancak şarap yapım prosesi sırasında da pek çok amin oluşumu ve birikimi söz konusu olabilmektedir. Genel olarak kırmızı şaraplar beyaz şaraplara oranla daha fazla miktarda amin içermektedirler (Gloria et al., 1998). Hemen hemen bütün kırmızı şaraplarda ve beyaz şarapların çoğunda malolaktik fermantasyona ihtiyaç duyulmaktadır (Lonvaud-Funel, 2001). Malolaktik fermantasyon şaraplarda malolaktik bakteriler tarafından yürütülen ikincil şarap fermantasyonu olarak adlandırılan bir işlevdir. İyi kalite şarapların olumlu özellikleri deasidifikasyon, bakteriyolojik kararlılık, arttırılmış tad ve kompleks bir aromaya sahip olmalarıdır (Yurdagül ve Bozoğlu, 2001). Malik asidin dekarboksilasyonu ile sağlanan deasidifikasyon ve bakterilerin sekonder metabolizmaları sonucu oluşan kompleksleşmiş duyusal kalite malolaktik fermantasyonun en önemli sonucudur (Lonvaud-Funel, 2001). Dünyanın rağbet gören kırmızı şaraplarının birçoğu malolaktik fermantasyona uğramıştır. Özellikle Almanya, Fransa ve Amerika Birleşik Devletleri nin doğusu gibi nispeten ılıman bölgelerde üretilen şaraplar yüksek asit içermekte ve malolaktik fermantasyon sayesinde asidifiye olmaktadırlar (Yurdagül ve Bozoğlu, 2001). Şaraplarda bulunan, malolaktik fermantasyonda rol oynayan bakteriler, aminoasitlerin dekarboksilasyonu için gerekli olan enzimlere

40 23 sahiptirler. Şaraplarda söz konusu bakteriler tarafından kullanılabilecek yeteri kadar aminoasit bulunmaktadır. Şaraplarda biyojen aminlerin bulunuşu büyük ölçüde mikrofloraya bağlı olmakla beraber, alkolik fermantasyon sonrasındaki aminoasit kompozisyonuna da bağlıdır. Alkolik fermantasyonda görev alan mayalar, üzümün başlangıç kompozisyonunu değiştirerek çeşitli maddelerle birlikte serbest aminoasitlerin oluşumuna neden olmaktadırlar. Alkolik fermantasyon sonrasında gerçekleşen malolaktik fermantasyonda rol oynayan bakteriler ise bu aminoasitleri dekarboksile edebilmektedirler. Mayalar tarafından gerçekleşen alkolik fermantasyon ne kadar kısa tutulursa bakterilerin hidrolize edebileceği peptid ve dekarboksile edebileceği aminoasit miktarı o ölçüde fazla olmaktadır (Lonvaud-Funel, 2001). Cilliers ve Van Wyk (1985) tarafından Kuzey Afrika şaraplarında gerçekleştirilen bir çalışmada, malolaktik fermantasyonla üretilen şaraplardaki biyojen aminlerin, malolaktik fermantasyon gerçekleştirilmeden yapılanlara oranla iki kattan daha fazla oranda biyojen amin içerdiği tespit edilmiştir. Malolaktik fermantasyonun histamin düzeyine etkisinin araştırıldığı bir çalışmada histamin miktarında malolaktik fermantasyon sırasında çok büyük bir artış olduğu belirlenmiştir (Lehtonen, 1996) Bira Birada bulunan biyojen aminlerin çeşitleri ve miktarları, hammaddeden, bira yapım tekniklerinden ve bira üretimi sırasında gerçekleşebilen mikrobiyal kontaminasyondan etkilenebilmektedir. Putresin, agmatin, spermidin gibi bazı aminler hammaddenin yapı unsurlarıdır. Maltta genellikle yüksek düzeyde putresin, agmatin,

41 24 spermin, spermidin ve düşük düzeyde histamin, β-feniletilamin, triptamin ve kadaverin bulunmaktadır. Arpada ise tiramin, putresin, spermin, spermidin ve agmatin tespit edilmiştir. Şerbetçi otunda da nispeten yüksek oranda tiramin, β-feniletilamin, putresin, spermin, spermidin ve agmatin tespit edilmiştir. Ancak şerbetçi otunun bira üretimi sırasında kullanılan miktarı oldukça az olduğu için birada bulunan biyojen amin miktarına katkısı önemizdir. Pirinç gibi bazı tahılların kullanımının bira ve şıradaki biyojen amin miktarını azaltmakta yararlı olacağı ifade edilmiştir (Gloria ve Izquierdo-Pulido, 1999). Bira üretim ve depolanması sonucunda pek çok amin oluşumu ve birikimi söz konusu olabilmektedir. Arpanın çeşidi, malt üretim teknikleri, şıra üretimi ve fermantasyon koşulları biranın biyojen amin içeriğini etkileyebilmektedir (Halasz et al., 1994). Mayşeleme ve şıranın kaynatılması sırasında tiramin ve agmatin gibi bazı aminlerin birikimi söz konusu olabilmektedir. Bu işlemler sırasında söz konusu aminlerin oluşumu termal aminoasit dekarboksilasyonu ve diğer bir olasılıkla malttaki enzimatik aktivite nedeniyle gerçekleşmektedir. Ayrıca fermantasyon sırasında şıranın laktik asit bakterileri gibi aminoasit dekarboksilaz aktivitesine sahip bakterilerle kontaminasyonu da biyojen amin oluşumuna sebep olmaktadır (Gloria ve Izquierdo-Pulido, 1999). Maltta histidin dekarboksilaz aktivitesi bulunmadığından birada histamin bulunması her zaman mikrobiyal kontaminasyonun bir göstergesidir (Halasz et al., 1994). Farklı fabrikalardan sağlanan 80 e yakın bira örneğinin incelendiği bir çalışmada, örneklerin büyük bir kısmında toplam biyojen amin konsantrasyonunun 20 mg/l altında olduğu ancak bazı bira örneklerinde 160 mg/l ye kadar çıkabildiğini bildirmişler ve biyojen aminler içinde tiramin ve kadaverinin daha fazla miktarlarda olduğunu ifade etmişlerdir.

42 25 Araştırmada yüksek biyojen amin konsantrasyonun mayşenin mikrobiyal kontaminasyona maruz kalmasına bağlanmıştır (Denli ve Anlı, 1998). Kalac et al. (2002) tarafından yapılan bir çalışmada şişelenmiş biraların biyojen amin içerikleri araştırılmıştır. Söz konusu örneklerde dikkate alınacak düzeyde tiramin ve histamin tespit edilmiş olup bu aminlerin başta Lactobacilli suşları olmak üzere yetersiz pastörizasyon sonucunda yaşamaya devam eden laktik asit bakterileri tarafından üretildikleri ifade edilmiştir. HPLC kullanılarak 16 bira örneğinde 8 biyojen aminin (histamin, tiramin, triptamin, β-feniletilamin, putresin, kadaverin, spermin, spermidin) incelendiği bir çalışmada 6 amin tayin edilebilecek düzeylerde bulunurken histamin ve spermin saptanmamıştır. Belirlenen biyojen amin miktarları 0,1-17,2 ppm arasında değişiklik gösterirken tiramin ve putresin en yüksek düzeylerde bulunmuştur. Alkol içermeyen biralar ve alkollü bira örnekleri arasında biyojen amin miktarı yönünden önemli bir fark görülmemiştir (Denli ve Anlı, 1998) Lahana Turşusu Lahana turşusunun Avrupa ülkelerinde üretilen şekli sauerkraut adı verilen Alman tipi susuz lahana turşusudur. Sauerkraut hazırlanmasında salamuralı fermantasyon uygulanmamakta, kuru tuz kullanılarak hücre öz suyu dışarı çıkarılmaktadır (Özdestan, 2004). Bu ürünün üretiminde doğal fermantasyon söz konusu olup dışardan starter kültür eklenmemektedir. Fermantasyon sırasında önce aerob, daha sonra fakültatif anaeroblar rol oynamakta, daha sonra laktik asit bakterilerinin aktiviteleri izlenmektedir. Mikrofloradaki varyasyonlar nedeniyle değişik biyojen amin içerikleri beklenebilmektedir (Ten Brink et al., 1990).

43 26 Sauerkrautta bulunan başlıca biyojen aminler; histamin, tiramin, putresin ve kadaverin dir. β feniletilamin çok düşük düzeylerde bulunabilmektedir (Shalaby, 1996). Kalac et al. (1999) tarafından incelenen sauerkraut örneklerinde ortalama tiramin, putresin ve kadaverin miktarlarının sırasıyla 174, 146 ve 50 mg/kg olduğu, histaminin ise 7.8 mg/kg olarak tespit edildiği bildirilmiştir. Triptamin, spermidin ve özellikle spermin miktarlarının oldukça düşük olduğu da belirtilmiştir. Yücel ve Üren (2006) tarafından yapılan bir çalışmada salamura kullanılarak hazırlanmış lahana turşularının biyojen amin (putresin, kadaverin, triptamin, spermin, sermidin, histamin, tiramin) miktarlarının Alman tipi susuz lahana turşularına oranla daha düşük düzeyde olduğu tespit edilmiştir. Bu durumun lahana turşularının satışa sunulmadan önce yeni hazırlanan salamura ile muameleleri sonucu oluşan bir seyrelmeden ya da aminolitik bakteri aktivitelerinden kaynaklanabileceği belirtilmiştir Meyve ve Sebzeler Aminler bitkilerin yapısında doğal olarak bulunduklarından meyve ve sebzelerde geniş bir dağılım göstermektedir. Meyve ve sebzelerin amin içerikleri olgunluk dereceleri göre değişiklik göstermektedir (Erkan, 2004). Meyve ve sebzelerde bulunan serbest biyojen aminler gıdaların tipik ve karakteristik olgunluk tadının şekillenmesinde rol oynamaktadırlar. Ayrıca serbest biyojen aminler belirli aroma maddelerinin öncü maddeleridir. Diğer taraftan biyojen aminlerin sebzelerde yüksek konsantrasyonlarda bulunması uzun depolanma süresinin sonucu ortaya çıkan bozulmayla ilgilidir (Moret et al., 2005).

44 27 Bitkisel kaynaklı gıdalarda daha çok arginin vardır, arginin dekarboksilasyonu sonucu agmatin, agmatinden de putresin oluşur (Erkan, 2004). Bitkilerde potasyum ve magnezyum eksikliğinde ve yüksek amonyum konsantrasyonlarında agmatin birikimi fazla olmaktadır (Halasz et al., 1994). Sebzeler üzerinde yapılan mikrobiyal çalışmalar, sebzelerde baskın mikroorganizma grubunun bakteriler olduğunu göstermiştir. Düşük oranda küf ve mayaların bulunduğu da ifade edilmiştir. Meyvelerin ph değerleri sebzelere oranla düşük olduğundan asit-tolere edebilen fungi ve laktik asit bakterileri gibi mikroorganizmaların gelişimi dahi sınırlandırılabilmektedir. Diğer taraftan taze ve bütün sebze ve meyveler kabukları tarafından mikrobiyal saldırılardan korunmaktadırlar. Kesilmiş ve doğranmış ürünler mikrobiyal bozunmalara karşı daha dayanıksızdır. Taze meyve ve sebzeler nispeten güvenli olmalarına rağmen, gıda kaynaklı hastalıklar ortaya çıkabilmektedir (Halasz et al., 1994). Portakal, ahududu, limon, greyfurt, mandalina, çilek ve üzümden elde edilen meyve suyu ve nektarları değişik konsantrasyonlarda çeşitli biyojen aminler içermektedirler. Bunların başında ise putresin gelmektedir. Ayrıca kakao tanelerinde ve dolayısıyla kakaodan yapılan çikolata, çikolata ürünleri ve şekerlemelerde β-feniletilamin bulunabilmektedir. Bazı mantar türlerinde yüksek oranlarda β- feniletilamin; karabiber ve soya sosunda ise pirolidin tespit edilmiştir (Silla-Santos, 1996). Çin lahanası ve bazı marul türlerinde de µg/g arasındaki konsantrasyonlarda değişen amin tespit edilmiş olup, spermidinin bu sebzelerdeki başlıca poliamin olduğu ifade edilmiştir (Shalaby, 1996).

45 28 Kalac et al. (2002) tarafından yapılan bir çalışmada dondurulmuş ıspanak püresi, ketçap, konsantre salça ve yeşil bezelyede bulunan biyojen amin düzeyleri elektrokinetik kapiler kromatografi tekniği kullanılarak tespit edilmiştir. Söz konusu çalışmada putresin ve spermidin tüm örneklerde tespit edilebilir düzeyde bulunurken, histamin, spermin ve kadaverin konsantrasyonları tespit edilebilir limitlerin altında bulunmuştur. Moret et al. (2005) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada taze ve konserve sebzelerin biyojen amin içerikleri HPLC tekniği kullanılarak belirlenmeye çalışılmıştır. o-fitalaldehit (OPA) ve dansil türevleri olmak üzere iki farklı türevlendirme tekniği kullanılmış ve iki teknik sonuçları karşılaştırılmıştır. Sauerkraut dışında tüm örneklerde putresin ve spermidin bulunmuştur. Bu iki amini takiben sperminin geldiği belirtilmiştir. Ispanağın en çok histamin içeriğine sahip (2,0 mg/100g) sebze olduğu ifade edilmiştir. Spermidin ve spermin OPA ile reaksiyon veren başlıca aminler olmasına rağmen, söz konusu çalışmada kullanılan koşullarda bu iki aminin OPA türevlerinin kararlı olmaması nedeniyle bu türevlendirme tekniği ile belirlenemedikleri ifade edilmiştir. Dansil türevlerinin kısa elüsyon süreleri kullanıldığında tercih edilmesinin uygun olacağı da aynı çalışmada vurgulanmıştır Biyojen Aminlerin Fonksiyonları ve Önemi Biyojen aminler canlı organizma bünyesinde pek çok önemli fonksiyona sahip olan bileşiklerdir. Canlı organizmalarındaki fonksiyonları şu şekilde sıralanabilir. Diğer büyüme faktörleri gibi putresin, spermidin ve spermin DNA, RNA ve protein sentezinin neredeyse bütün basamaklarında yer

46 29 almaktadırlar. Bu nedenle hücre çoğalma ve büyümesi için gerekli olmaktadırlar (Bardocz, 1995). Kateşolamin, indolamin, histamin gibi bazı aminler çeşitli metabolik fonksiyonlarda özellikle sinir sistemi ve kan basıncının kontrolünde önemli görevler almaktadırlar. β-feniletilamin ve tiramin kan basıncının yükselmesinde etkili olurken histamin tersine düşürülmesinde etkili olmaktadır (Silla-Santos, 1996). Poliaminler bağırsakların ve bağışıklık sisteminin normal fonksiyonu için gereklidir. Spermin ve spermidin bağırsak dokusunun gelişiminde rol oynamaktadır (Erkan, 2004). Aminler aroma ve tat maddelerinin öncü basamağı rolündedirler. Karakteristik amin kokusu böceklerde vardır. Trimetilamin ve izopentilamin burada asıl rolü oynamaktadır. Bu koku bozulmuş balık ve diğer et ürünlerinde daha belirgindir. β-feniletilamin feniletilen yağının öncüsüdür. Çayda çaya özgü tadı veren tanenin ana unsuru etilamindir (Erkan, 2004). Alkoloid sentezinde aminler ara ürün olarak rol oynamaktadırlar. Örneğin feniletilamin türevlerinden tiramin, morfin vb. alkoloidlerin öncü maddesidir (Erkan, 2004). Spermin, spermidin, putresin gibi poliaminlerin çoklu doymamış yağ asitlerinin oksidasyonunu önlediği ve bu antioksidan etkinin amin grubu sayısıyla korelasyon gösterdiği ifade edilmektedir (Silla-Santos, 1996). Biyojen aminler enzimatik olmayan esmerleşme reaksiyonlarında etkilidirler. Burada gerçekleşen esmerleşme reaksiyonları serbest amino grubu içeren biyojen aminlerin şeker, aldehit ve hidroksi keton gruplarıyla bir seri kompleks bileşik oluşturmasından ileri gelmektedir.

47 30 Özellikle muzların kahverengi renk almasında serotonin etkilidir (Erkan, 2004). Diamin putresin ve poliaminlerden spermin ve spermidin bitkilerde hücre bölünmesi, çiçek açma, meyve gelişimi ve çevresel streslere karşı koyma gibi pek çok fizyolojik prosesle ilişkilidir (Halasz et al., 1994) Biyojen Aminlerin Toksikolojisi Histamin, tiramin ve putresin gibi biyojen aminlere insan ve hayvan vücudunda pek çok kritik fonksiyonun yerine getirilmesinde ihtiyaç duyulmasına rağmen, yüksek miktarlarda biyojen amin içeren gıdaların tüketimi sonucu toksik etkiler görülebilmektedir (Silla-Santos, 1996). Histamin, triptamin, β-feniletilamin ve tiramin biyolojik olarak aktif aminler olup insan vücudunda genellikle vazoaktif ya da psikoaktif etkilere sahiptirler. Psikoaktif aminler sinirsel transmiterler üzerinde rol oynayarak sinir sisteminde etkili olmaktadırlar. Vazoaktif aminler ise vasküler sistemde bir role sahiptirler. Yüksek oranda biyojen amin içeren gıdaların tüketimi sonucu pek çok farmakolojik etki ortaya çıkmaktadır (Shalaby, 1996). Yüksek miktarda histaminin vücuda alınması bulantı, solunum sistemi bozuklukları, ateşlenme, terleme, kalp çarpıntısı, baş ağrısı, kızarıklar, oral yanma ve yüksek ya da düşük tansiyon gibi rahatsızlıkların görülmesine neden olurken diğer biyojen aminler de bu etkileri arttırmaktadırlar (Bardocz, 1995). Putresin ve kadaverin toksik biyojen aminler olarak kabul edilmemelerine rağmen histaminin toksisitesini arttırmalarından dolayı önem taşımaktadırlar. Aminoksidazlarla tepkimeye girmeleri ve detoksifikasyon mekanizmasında yarattıkları karışıklıklar nedeniyle histaminin

48 31 toksisitesinin artmasında rol oynamaktadırlar (Ruiz-Capillas ve Jimene- Colmenero, 2004). Biyojen aminlerin sebep olduğu çok sık görülen gıda kaynaklı intoksikasyonların çoğunda histamin yer almaktadır. Histamin zehirlenmesi çoğunlukla scomboridae familyasına dahil balıkların tüketimi sonucu ortaya çıktığından scomborid balık zehirlenmesi olarak adlandırılmaktadır. Biyojen amin toksisitesiyle ilişkili diğer bir olgu da yüksek oranda tiraminin peynirle vücuda alınması sonucu ortaya çıkan peynir zehirlenmesi olarak bilinen intoksikasyondur (Halasz et al., 1994). Spermidin, spermin, tiramin, putresin ve kadaverin gibi pek çok biyojen amin ısı müdahalesi sonucu sekonder aminlerin oluşumuna sebep olmaktadır. Bu tip aminler ortamda nitrit varlığında nitrit ile reaksiyona girerek kanserojen nitrozaminleri oluşturmaktadırlar (Ruiz-Capillas ve Jimene-Colmenero, 2004). Poliaminler tümör oluşumunda etkili olmaktadırlar. Poliaminlerin tümör oluşumunu tetiklemedeki etkisi, sadece büyüme ve farklılaşmayı teşvik edici etkilerinden ileri gelmemekte ayrıca tümörlerin ortadan kaldırılmasında rol oynayan non-spesifik bağışıklık sistemi üzerindeki etkilerinden de ileri gelmektedir (Eliassen et al., 2002) Biyojen Aminlerin Detoksifikasyonu Memeli organizmaların bağırsak sisteminde normal diyetle vücuda alınan biyojen aminleri detoksifiye edici oldukça iyi çalışan bir detoksifikasyon sistemi mevcuttur (Ten Brink et al., 1990). Bu detoksifikasyon sistemi monoaminoksidaz (MAO), diaminoksidaz

49 32 (DAO) ve histamin N-metil transferaz (HNMT) dan oluşmaktadır. Normal şartlar altında gıdalarla alınan biyojen aminler, bu enzimler ile toksik olmayan ürünlere çevrilmektedir (Çolak ve Aksu, 2002). Ancak bazı alerjik bireylerde yüksek miktarda biyojen amin alınması veya detoksifikasyon enzimi inhibitörlerinin kullanılması durumunda detoksifikasyon işlemi gerçekleştirilememekte ve biyojen aminlerin vücutta birikimi söz konusu olmaktadır (Silla-Santos, 1996). Özellikle solunum ve kroner sistem problemleri, gastrointestinal rahatsızlıklar, yüksek tansiyon, B 12 vitamini eksikliği gibi sorunları olan bireyler risk gruplarını teşkil etmektedir. Çünkü bu bireyler düşük dozlarda biyojen amin alımına bile hassasiyet göstermektedirler. Diğer taraftan stres, depresyon, alzheimer ve parkinson tedavilerinde kullanılan bazı farmakolojik ajanlar da detoksifikasyon sistemi inhibitörleri olarak bildirilmişlerdir (Bardocz, 1995). Yüksek miktarlarda biyojen amin alınması, detoksifikasyon metabolizmasının çeşitli farmakolojik ajanlarla inhibe edilmesi, genetik olarak detoksifikasyon enzimlerinin eksikliği, gastrointestinal rahatsızlıklar, alkol alımı gibi nedenlerden dolayı detoksifikasyon yapılamaması sonucu, gıda zehirlenmeleri ortaya çıkabilmektedir (Çolak ve Aksu, 2002). Gıdalarda biyojen aminlerin bir arada bulunuşunun da toksik etkilerin ortaya çıkmasında önemi büyüktür (Çolak ve Aksu, 2002). Örneğin putresin ve kadaverin histamini detoksifiye eden enzimleri inhibe etmektedir. Tiramin MAO, triptamin DAO, β-feniletilamin ise DAO ve HNMT enzimlerini inhibe etmektedir (Silla-Santos, 1996; Stratton et al., 1991). Spermin ve spermidin ise gastrointestinal duvardan histamin geçişini arttırmaktadır (Shalaby, 1996).

50 Yasal Düzenlemeler Biyojen aminler için toksik düzeylerin belirlenmesi oldukça güçtür. Çünkü toksik etkilerin ortaya çıkması bireysel farklılıklara ve diğer biyojen aminlerin ortamda bulunup bulunmamasına göre değişiklik göstermektedir (Silla-Santos, 1996). Biyojen aminlerin toksikolojik etkileri göz önüne alınırken; gıdanın miktarı, toplam biyojen amin konsantrasyonu, vücuda alınan ilaçlar ve alkol de hesaba katılmalıdır (Lonvaud-Funel, 2001) mg/kg (amin/gıda) oranında toplam aminin vücuda alınmasının insan sağlığı için tehlike taşıdığı düşünülmektedir. Söz konusu bu değer gıda kaynaklı histamin intoksikasyonları temel alınarak hesaplanmıştır (Silla-Santos, 1996). 100 mg histamin/kg gıda ve 2 mg histamin/l alkollü içecek, histamin için üst limit olarak önerilmiştir. Histamin dışında diğer aminlerin toksik dozlarının belirlenmesi için çok az veri olmasına rağmen mg/kg tiramin için, 30 mg/kg ise β-feniletilamin için eşik doz olarak rapor edilmiştir (Ten Brink et al., 1990). Avrupa Birliği balıklarda histamin oranının mg/100 g ı aşmamasını önermektedir (Silla-Santos, 1996). FDA (Food and Drug Administration) da scomborid balık ve/veya balık ürünlerinde histamin için 50 ppm değeri izin verilebilir üst limit olarak ifade edilmiştir (USFDA, 2001, chap. 7). Şaraplarda histamin için tavsiye edilen üst limit Almanya da 2 mg/l, Belçika da 5-6 mg/l, Fransa da 8 mg/l, İsviçre de 10 mg/l dir (Lehtonen, 1996). Yüksek miktarda şarap tüketimi sonucu 8 mg/l

51 34 konsantrasyonunda histaminin vücuda alınmasının baş ağrısına neden olduğu ifade edilmiştir (Gloria et al., 1998). Türk Gıda Kodeksi ne göre histamin miktarının balıklarda 200 mg/kg ı, şaraplarda 10 mg/kg ı aşmaması gerekmektedir (Çolak ve Aksu, 2002). Süt ve süt ürünlerinde biyojen amin içeriği açısından herhangi bir yasal limit bulunmamaktadır. Fermente sucuklarda yüksek seviyelerde biyojen amin oluşumu rapor edilmesine rağmen bu ürün için yasal bir limit önerilmemiştir (Çolak ve Aksu, 2002). Süt ve süt ürünleri, et ve et ürünleri ve diğer fermente ürünlerde de eşik toksik dozların belirlenmesi ve yasal düzenlemelerin yapılabilmesi için daha fazla sayıda bilimsel araştırma yapılmasına ihtiyaç vardır Gıdalarda Biyojen Amin Analiz Yöntemleri Gıdalarda biyojen amin analizleri, gıda tüketiminden önce potansiyel sağlık tehlikesi taşıyan maddelerin tayin edilmesi açısından bir gerekliliktir (Lange et al., 2002). Ancak biyojen amin analizlerinde gıda maddelerinin kompleks matrikse sahip olmaları, interferans (girişim) yapan çok sayıda maddenin ortamda bulunması aynı zamanda pek çok biyojen aminin aynı sıvı ekstrakta bulunması gibi problemlerle karşı karşıya kalınmaktadır (Shalaby, 1999). Tüm zorluklara rağmen gıdalarda biyojen amin analizleri için farklı yöntemler geliştirilmiş olup bu yöntemlerin hepsi temel olarak iki aşamadan oluşmaktadır.

52 35 1. Amin ekstraksiyonu ve saflaştırma 2. Aminlerin analitik bir yöntemle tespiti (Moret ve Conte, 1996). Ekstraksiyon aşaması, söz konusu aminlerin gıda matriksinden izole edilmesi için gerekli ve kritik bir basamaktır (Busto et al., 1994). Hidroklorik asit, trikloraasetik asit, perklorik asit, metanol gibi çok sayıda farklı çözgen biyojen aminlerin gıda matriksinden ekstrakte edilmesi amacıyla kullanılmıştır (Vinci ve Antonelli, 2002). Ekstraksiyonun hemen ardından saflaştırma işlemi uygulanmaktadır. Saflaştırmanın derecesi, tespit için uygulanacak analitik tekniğe bağlı olarak değişmektedir. Saflaştırma işlemi kolon kromatografisi ya da organik çözgenlerle sıvı-sıvı ekstraksiyonu şeklinde yapılabilmektedir (Moret ve Conte, 1996). Aminlerin tespitinde kullanılan yöntemler; - İnce tabaka kromatografisi - Gaz kromatografisi (GC) - Yüksek basınç sıvı kromatografisi (HPLC) şeklinde sıralanabilmektedir (Moret ve Conte, 1996). Bu teknikler içinde sağladığı hassasiyet ve tekrarlanabilirlik nedeniyle en yaygın tercih edilen teknik HPLC dir. Ancak bu teknik fluorojenik veya asit klorürü gibi ajanlarla kolon öncesi türevlendirme gerektirmektedir. Avrupa ülkelerinde pek çok laboratuarda türevlendirmede flurojenik ajanlardan o-ftalaldehit (OPA) yaygın bir şekilde kullanılarak rutin biyojen amin analizleri

53 36 yapılmaktadır (Özoğul et al., 2002). Türevlendirme ajanları içinde fluorojenik ajanların kullanımı spesifik ve hassas sonuçlar vermektedir. Ancak reaksiyon ürünlerinin ömürleri kısadır (Hwang et al., 1997). Ayrıca OPA nın sadece primer aminlerle reaksiyona girmesi ve oluşan türevlerin kararlı olmaması da diğer dezavantajları oluşturmaktadır (Busto et al., 1994). Bu nedenle tosil, dansil, dabsil ya da benzoil klorür gibi asit klorürü ajanların türevlendirmede kullanımı tercih edilmektedir. Asit klorürü ajanlar içinde ise en çok tercih edilen benzoil klorürdür. Türevlendirme ve elüsyon süresinin diğer asit klorürü ajanlara göre kısa olması, kimyasal basitliği, nispeten daha ucuz olması benzoil klorürün sağladığı avantajlardır (Özoğul et al., 2002). Tosil klorür uzun bir türevlendirme işlemi gerektirirken, dansil klorür ise uzun bir elüsyon süresi gerektirmektedir (Hwang et al., 1997) Boza Fermente gıdalar; değişik hammaddelerin, kimi ön işlemlerden geçirilmesinden sonra belirli sıcaklık seviyelerinde, belirli mikroorganizmaların yardımıyla daha dayanıklı yeni ürünlere dönüşmesi sonucu meydana gelmektedirler. Bunlardan birisi de eski bir Türk içeceği olan bozadır. Boza Asya, Mezopotamya, Afrika ve Anadolu da yıldır yapılmakta olan bir içecektir (Topal ve Yazıcıoğlu, 1986). Bozanın çok eski bir geçmişi vardır. M.Ö. 401 yılında Xenophan, Doğu Anadolu da boza yapıldığını ve hazırlandıktan sonra çömlekçi çamurundan yapılmış ve yere gömülü kaplara konulduğunu bildirmektedir. Kaşgarlı Mahmut, Divan-ü Lügat-i Türk te Karahanlıların bozaya buhoun dediklerini ve bunu

54 37 darıdan ürettiklerini belirtmiştir. Orta Asya da Türkler bozayı çok eski zamanlarda beri bilip içmişlerdir. Türkler zamanla Orta Asya dan çeşitli yerlere göç etmiş ve daha sonra Selçuklu ve Osmanlı İmparatorluklarının genişlemeleri sırasında gittikleri yerlerin halkına boza yapımını öğreterek bugünkü coğrafi yayılışını sağlamışlardır. Selçuklular zamanında boza bekni adıyla anılmıştır. Bozacılık Osmanlı İmparatorluğu nun kurulduğu yıllarda büyük kentlerin temel zanaatlarından biri haline gelmiştir. 16. yüzyıl Osmanlı kayıtlarında bozanın en çok Edirne, Bursa, Amasya ve Mardin gibi illerimizde üretildiği belirtilmektedir. Bozanın besleyici ve enerji verici özelliği nedeniyle orduda da tüketildiği bilinmektedir (Tamer ve Çopur, 2004). Boza kelimesinin esası Farsça da darı anlamına gelen buze dir. Fakat Asım Efendi nin Burhan-ı Katı tercümesinde Farsça buze kelimesinin darı değil, pirinç ve darı unundan yapılan içki anlamına geldiği belirtilmiştir. Boza dünya dillerinden Rumence ye bozan, yeni Yunanca ya bozas, İngilizce ye buza veya bosa, Rus, Leh, Çek dillerine buza, Fransızca ya bousa veya bosan (biere blanche), Almanca ya busa, İspanyol ve Portekiz dillerine de boza şeklinde geçmiştir (Birer, 1987; Yücel ve Ötleş, 1998) Boza Üretimi Boza, yabancı maddelerden temizlenmiş darı, pirinç, buğday, mısır vb. hububatların kırma veya unlarından biri veya birkaçına içme suyu katılarak pişirilmesi ve beyaz şeker ilave edilerek tekniğine uygun olarak alkol ve laktik asit fermantasyonlarına tabi tutularak hazırlanan bir mamuldür (Anon., 1992). Ülkemizde boza üretiminde hammadde olarak, yapıldığı yerin başlıca ürününe göre

55 38 arpa, yulaf, buğday, Arnavut darısı, gernik gibi hububat unları, bazen de pirinç, ekmek ve çok nadir olarak da kenevir unu ve karamuk kullanılmaktadır (Yücel ve Köse, 2002). 2002) Şekil 2.2. Boza üretim basamakları (Arıcı ve Dağlıoğlu, Hammaddeler Kaynatma (1-2 saat) Soğutma ve süzme Şeker İlavesi Fermantasyon 15 C ın altına soğutma

56 39 Boza üretiminde başlıca işlem basamakları: - Hammaddenin Hazırlanması Boza üretiminde kullanılan hammaddeler taş, toprak gibi yabancı maddelerden ayrıldıktan sonra kırma değirmenlerinden geçirilerek ince ve kaba un haline getirilmektedirler. Genel olarak boza yapımında kullanılan hammadde ince ve kaba kepek kısımlarından ayrılmış irmik veya buğday iriliğinde öğütülmüş olan darı, mısır veya pirinçtir (Yücel ve Ötleş, 1998). - Kaynatma Yapımda kullanılan hububat ürünü veya hububat ürünleri ağırlıklarının 4-6 kat fazlası suyla (w/v) karıştırılarak kaynatma işlemine tabi tutulmaktadırlar (Arıcı ve Dağlıoğlu, 2002). Kaynatma sırasında topaklanmayı önlemek için sürekli karıştırma gerekmektedir (Birer, 1987). Kaynatma işlemi homojen bir karışım elde edilinceye kadar devam ettirilmelidir. Kaynatma süresi; kaynama sıcaklığı ve kullanılan hammaddeye bağlı olarak değişmekle birlikte yaklaşık 1-2 saat sürmektedir (Arıcı ve Dağlıoğlu, 2002). - Soğutma ve süzme Kaynatma işlem sonrasında elde edilen karışım soğumaya bırakılmaktadır. Soğutma süresi 2-12 saat arasında değişmektedir. Soğutmanın ardından soğumuş ve dinlenmiş olan karışım yeteri kadar su ilave edilerek inceltilmekte ve sulandırılmaktadır. Su ilavesi esnasında homojenliği sağlamak adına sürekli karıştırma

57 40 uygulanmaktadır. Süzme işlemi ise küçük delikli pirinç eleklerde yapılmaktadır (Yücel ve Ötleş, 1998). - Şeker ilavesi Soğutma ve süzme işlemlerinin ardından laktik asit bakterilerinin ve mayaların fermantasyon yapabilmeleri için yeteri kadar şeker ilavesi yapılmaktadır (Yücel ve Ötleş, 1998). - Fermantasyon Fermantasyonda maya olarak daha önce üretilen boza kullanılabilmektedir. Maya olarak eklenen bozanın miktarı tüketileceği zaman ve sıcaklığa göre değişmektedir. En fazla % 2-3 oranında katılan maya C de 24 saat sonra bozanın içilecek kıvama gelmesini sağlamaktadır. Özellikle mevsim başında boza bulunmadığında starter olarak ekşi hamur ve yoğurt da kullanılmaktadır (Arıcı ve Dağlıoğlu, 2002; Tamer ve Çopur, 2004). Bozada iki çeşit fermantasyon gerçekleşmektedir. Birincisi mayaların rol aldığı alkol fermantasyonu olup bozanın kabarması ve CO 2 gazı kabarcıklarının görülmesiyle kendini göstermektedir. Diğeri ise laktik asit bakterilerinin gerçekleştirdiği laktik asit fermantasyonudur. Üretimde yer alan bu iki fermantasyon ayrı ayrı değil, aynı zamanda gerçekleşmektedir (Şahin, 1982; Tamer ve Çopur, 2004).

58 Boza Üretiminde Rol Oynayan Mikroorganizmalar Boza fermantasyonunda mayalar ve laktik asit bakterileri rol oynamaktadır. Ancak bozaya üretim sırasında, havadan, üretimde kullanılan alet ekipmandan ve hammaddelerden diğer mikroorganizmalar bulaşabilmektedir. Bunlardan bazıları fermantasyonda istenilen mikroorganizmalar olabilseler de, istenmeyen etkilere sahip olanlar da bulunabilmektedir (Tamer ve Çopur, 2004). Topal ve Yazıcıoğlu (1986), boza örneklerinde mayalarda Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Candida scottii, Trichosporon capitatum türlerini, bakterilerden ise Pediococcus cerevisiae, Leuconostoc paramesenteroides, Lactabacillus plantarum türlerini tanımlamışlardır. Hancıoğlu ve Karapınar (1997) tarafından yapılan bir çalışmada bozadan izole edilen bakteriler arasında Leuconostoc paramesenteroides, Lactobacillus sanfrancisco, Leuconostoc mesenteroides spp. mesenteroides, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus confusus, Leuconostoc mesenteroides spp. dextranicum, Lactobacillus fermentum, Leuconostoc oenos; mayalar arasında ise Saccharomyces uvarum ve Saccharomyces cerevisiae nin baskın olduğu gözlenmiştir.

59 42 Üretimleri sırasında fermantasyon ve olgunlaştırma işlemlerini gerektiren gıda maddelerinde biyojen amin bulunma olasılığı yüksektir. Çünkü fermantasyon ve olgunlaştırma işlemleri sırasında biyojen amin üretimi için gerekli olan serbest aminoasitlerin oluşumu söz konusudur. Ayrıca fermantasyon işleminde çok sayıda farklı mikroorganizma rol almaktadır. Önceki biyojen amin çalışmalarında sucuk, peynir, lahana turşusu gibi fermente gıdalarda dikkate alınacak düzeylerde biyojen amin tespit edilmiştir. Bu çalışmada, önceki bilgiler doğrultusunda geleneksel fermente ürünlerimizden olan bozada biyojen amin oluşumunun söz konusu olabileceği düşünülerek; İzmir, İstanbul, Ankara, Balıkesir, Aydın, Edirne, Eskişehir piyasalarından toplanan 10 farklı boza örneğinin biyojen amin içeriği benzoil türevleri kullanılarak HPLC cihazında belirlenmiştir. Gerçekleştirilen çalışmalarda C 18 kolon ve absorbans dedektör kullanılmış ve dereceli elüsyon programı uygulanmıştır.

60 43 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal Kullanılan Kimyasallar: Sodyum hidroksit, benzoil klorür, sodyum klorür, tetrahidrofuran, borik asit, brom krezol yeşili ve metil kırmızısı, Merck firmasından; susuz sodyum sülfat, metanol (HPLC saflıkta), dietileter (HPLC saflıkta), Lab-Scan firmasından; sodyum asetat. 3hidrat ve hidroklorik asit, J.T. Baker firmasından; selenyum Riedel firmasından temin edilmiştir. Ayrıca teknik saflıkta sodyum sülfat, sodyum hidroksit ve bakır sülfat. 5hidrat kullanılmıştır. Kullanılan standart biyojen aminler Metilamin hidroklorür: Merck Etilaminhidroklorür: Acros Organics Propilamin: Merck Putresin dihidroklorür: Fluka Kadaverin dihidroklorür: Sigma Triptamin: Sigma İzopentilamin: Merck

61 44 Spermidin trihidroklorür: Sigma Spermin: Sigma Histamin dihidroklorür: Sigma Tiramin: Sigma Agmatin sülfat: Sigma Kullanılan boza örnekleri: İzmir, İstanbul, Ankara, Balıkesir, Aydın, Edirne ve Eskişehir piyasalarından toplanan 10 farklı boza örneğinin biyojen amin içerikleri tespit edilmiştir Yöntem Kullanılan Cihazlar HPLC Cihazı: Biyojen aminlerin belirlenmesi amacıyla Hewlett-Packard (HP) 1050 HPLC cihazı kullanılmıştır. Ultrasyoik su banyosu: HPLC cihazında kullanılan hareketli fazların degas edilmesi amacıyla kullanılmıştır. Destilasyon Düzeneği: Hamilton marka destilasyon düzeneği saf su eldesinde kullanılmıştır.

62 45 ph metre: Mod 821 NEL marka ph metre, asetat tamponu-metanol (%60 asetat tamponu, %40 metanol) den oluşan hareketli fazın ph sını ayarlanmasında ve boza örneklerinin ph sının tespitinde kullanılmıştır. Santrifüj: Boza örneklerinden biyojen aminlerin ekstraksiyonu ve türevlendirme işlemleri sırasında faz ayırımının sağlanması amacıyla NF 815 Nüve marka santrifüj kullanılmıştır. Vorteks karıştırıcı: Türevlendirme işlemi sırasında homojen bir karışım elde etmek amacıyla Elektro- Mag M-16 marka vorteks karıştırıcı kullanılmıştır. Vakumlu Etüv: Gallenkamp marka vakumlu etüv boza örneklerinin kuru madde düzeylerinin belirlenmesinde kullanılmıştır. Kjeldahl Cihazı: Gerhardt Kjeldatherm marka ön yakma ünitesi ve Gerhardt Vapodest 20 marka destilasyon ünitesinden oluşan kjeldahl cihazı boza örneklerinin protein içeriklerinin belirlenmesi amacıyla kullanılmıştır.

63 Standartların Hazırlanması Etilamin, kadaverin, putresin, metilamin, triptamin, propilamin, spermin ve spermidin Çizelge 3.1 de verilen miktarlarda tartılarak, söz konusu biyojen aminlerin hepsi, 50 ml destile su içinde çözülerek aynı balon jojede bir karışım oluşturulmuştur. Bu karışıma mikroorganizmaların gelişiminin önlenmesi amacıyla 15 µl kloroform eklenmiştir. Histamin, agmatin, tiramin ve izopentilamin ayrı ayrı stoklar şeklinde hazırlanmış karışıma dahil edilmemiştir. Histamin, agmatin ve izopentilamin stokları hazırlanırken her bir amin için Çizelge 3.1 de belirtilen miktar kadar tartılmış ve her biri 25 er ml destile su içersinde çözülüp üzerine 7,5 µl kloroform ilave edilerek ayrı balon jojelerde hazırlanmıştır. Tiramin hazırlanırken ise benzer şeklide Çizelge 3.1 de verilen miktar kadar tartılıp 25 ml 0,2 M HCl çözeltisi içinde çözülmüştür. Tiramin stoğu hazırlanırken 0,2 M HCl kullanılmasının sebebi tiraminin saf sudaki çözünürlüğünün az olmasıdır.

64 47 Çizelge 3.1. Stok çözeltilerin hazırlanmasında kullanılan biyojen amin miktarları Biyojen amin Miktar (mg) Etilamin 41,6 Kadaverin 29,6 Putresin 22,6 Karışım Metilamin 18,9 Triptamin 44,8 Propilamin 25,3 Spermin 30,2 Spermidin 28,5 Histamin 75,7 Tek Başına Hazırlanan Stoklar Agmatin 14,3 İzopentilamin 55,4 Tiramin 110.6

65 48 Standart biyojen amin çözeltilerinden, Karışım (etilamin, kadaverin, putresin, metilamin, triptamin, propilamin, spermin, spermidin): 4ml Histamin: 5 ml Agmatin: 1,6 ml İzopentilamin : 2 ml Tiramin: 2 ml belirtilen hacimlerde alınıp 25 ml ye saf su ile tamamlanıp üzerine 7,5 µl kloroform eklenerek, boza örneklerindeki biyojen amin miktarının tespitinde kullanılacak olan standart stok çözelti hazırlanmıştır Boza örneklerinden biyojen aminlerin ekstraksiyonu Bozada bulunan biyojen aminlerin ekstraksiyonu için TCA (% 5 lik) ve HCl ile yapılan ekstraksiyon denemeleri sonrasında, elde edilen kromatogramlar değerlendirildiğinde, TCA nın ekstra bir avantaj sağlamadığı belirlenmiş ve ekonomikliği nedeniyle HCl tercih edilmiştir. Diğer taraftan TCA kullanımının yüksek konsantrasyonlar gerektirmesi nedeniyle ortama dışardan yabancı madde girişinin fazla olması da HCI seçimde etkili olmuştur. Biyojen aminlerin bozadan ekstraksiyonu için; 15 g boza örneği üzerine 15 ml 0,2 M HCl çözeltisinden eklenerek homojen bir

66 49 karışım elde edilinceye kadar yaklaşık 5 dakika süreyle karıştırılmıştır. Elde edilen karışım 30 dakika süreyle santrifüj edilmiş ve santrifüj sonrasında üst faz ayrı bir tüpte toplanmıştır. Bu işlemler sonrasında biyojen aminler asit faza geçmiş durumdadır Türevlendirme Biyojen aminlerin HPLC kullanılarak tespit edilebilmeleri için belirli dalga boyunda absorbans yapan ya da fluoresans özelliğe sahip olan türevlerine dönüştürülmeleri gerekmektedir. Bu çalışmada biyojen aminlerin UV dedektör kullanılarak tespiti gerçekleştirilmiştir. Her bir boza örneğinden ekstrakte edilip asit faza çekilen biyojen aminler, benzoil klorür ile türevlendirilerek söz konusu aminlere 254 nm dalga boyunda absorbans yapma özelliği kazandırılmıştır. Biyojen aminlerle benzoil klorür arasında gerçekleşen reaksiyon Schotten-Baumann açillendirme reaksiyonu olarak adlandırılmaktadır (Hornero- Mendez ve Garrido-Fernandez, 1997). Türevlendirme işleminde Hornero-Mendez ve Garrido- Fernandez (1997) tarafından kullanılan yöntem, çeşitli modifikasyonlar yapılarak uygulanmıştır. Her bir boza örneği için standart stok biyojen amin çözeltisinden eklenmiş bir ve standart stok biyojen amin çözeltisinden eklenmemiş iki tane olmak üzere üç paralel çalışılmıştır. Ekstraksiyon sonrasında asit fazda bulunan biyojen aminlerin tespiti için söz konusu ekstraktan şilifli bir tüpe 5 ml

67 50 alınıp üzerine 0,5 ml standart stok biyojen amin çözeltisinden eklenmiştir. Biyojen aminlerin türevlendirilmesi en iyi bazik ph da gerçekleştiğinden ortamın bazikleştirilmesi amacıyla 3 ml 5 M NaOH eklendikten sonra 100 µl benzoil klorür ilavesi yapılmıştır. Bu işlemlerin ardından tüpün ağzı kapatılarak vorteks karıştırıcıda 1 dakika süreyle çalkalandıktan sonra 1 saat türevlendirme işleminin gerçekleşmesi amacıyla 25 C de bekletilmiştir. Bu sürenin sonunda 5 ml doymuş NaCl çözeltisi ilave edilip vorteks karıştırıcıda 2 dakika süreyle çalkalama işlemi gerçekleştirilmiştir. NaCl ilavesindeki amaç türevlendirme işlemini sonlandırmaktır. Bu işlemin ardından oluşan biyojen amin türevleri 3 kez 5 er ml dietileter ile ayırma hunisinde 2 dakika süreyle çalkalanmıştır. Eter içeren fazlar (üst faz) alınıp ayrı bir tüpte toplanarak birleştirilmiş ve üzerine içinde kalması muhtemel sulu fazı tutması amacıyla susuz sodyum sülfat ilavesi yapılarak 5 dakika süreyle bekletilmiştir. Daha sonra üstteki sıvı kısım başka bir test tüpüne aktarılmış ve eter azot gazı altında uzaklaştırılmıştır. Bu aşama sonrasında biyojen aminler tüpün çeperlerine yapışmış kalıntı durumundadır. Tüpteki kalıntı üzerine 1 ml metanol ve 5 µl benzoil klorür çözeltisi (0,0652 g benzoil klorür 5 ml metanolde çözülerek hazırlanmıştır) eklenerek kalıntı çözülüp 1 µ gözenek çaplı Whatman mavi bant süzgeç kağıdının yerleştirildiği filtreden süzülerek karışımın 20 µl si HPLC cihazına enjekte edilmiştir. Türevlendirme işlemi daha önce belirtildiği gibi her bir boza için üç paralel şeklinde gerçekleştirilmiştir. Yukarıda anlatılan işlemler standart ilavesi yapılmış paralel için izlenmiş prosedürdür. Standart ilavesi yapılmadan gerçekleştirilen diğer iki paralelde 0,5 ml standart ilavesi yerine, hacim farklılığının yaratacağı hataları

68 51 önlemek amacıyla 0,5 ml destile su ilavesi yapılıp diğer işlemler bu iki paralel için de aynı şekilde gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında standart karışımında bulunan biyojen aminlerin alıkonma zamanlarının tespiti için yapılan denemelerde, türevlendirme basamağında standart stok biyojen amin çözeltisinden 5 ml alınarak boza için uygulanan türevlendirme basamakları bir farkla aynen uygulanmıştır. Söz konusu fark benzoil klorür miktarının 100 µl yerine 60 µl alınmasıdır. Bu şekilde hazırlanan standart karışım için: enjeksiyon miktarı = 10 µl ve AUFS=1 alınmıştır, diğer kromatografik koşullar aynı tutulmuştur Kromatografik Koşullar Akış hızı:1,0 ml/ dk Pompa: Dereceli elüsyon pompası Enjeksiyon Miktarı: 20 µl Kolon: Hichchrom, C 18, 10 µm; 3,9 300 mm Kolon sıcaklığı: 25 C Ara yüzey: HP Dedektör: Waters 486 UV dedektör, λ = 254 nm Hassasiyet: 0,2 AUFS

69 52 Mobil Faz: (A) Asetat tamponu (%60) Metanol (%40) (B) Metanol HPLC cihazının (A) hattına bağlanan asetat tamponu metanol çözeltisinin hazırlanması için; 4,0824 g sodyum asetat. 3hidrat az suda çözülüp hacim destile su ile 600 ml ye tamamlanmış ve üzerine 400 ml HPLC saflıkta metanol ilavesi yapılmıştır. Elde edilen karışımın ph sı HCl ve NaOH çözeltisi kullanılarak 8 e ayarlanmış ve Whatman mavi bant süzgeç kağıdından süzülmüştür. Daha sonra 40 C de 10 dakika süreyle gerçekleştirilen degas işleminin ardından oda sıcaklığına soğutularak HPLC cihazına bağlanmıştır. (B) hattında kullanılan metanol ise yine HPLC saflıkta olup 25 C de 10 dakika süreyle gerçekleştirilen degas işleminin sonrasında sisteme bağlanmıştır. Bozada bulunan biyojen aminlerden histamin için yapılan denemelerde (A) hattına bağlanan mobil fazda bir takım modifikasyonlar yapılarak çeşitli denemeler gerçekleştirilmiştir. (A) hattına bağlanan diğer mobil faz; [asetat tamponu: THF (96:4)] (%60)-metanol (%40) çözeltisinin hazırlanması için; 4,0824 g sodyum asetat. 3hidrat az suda çözülüp hacim destile su ile 600 ml ye tamamlanmış, oluşan karışımdan 576 ml alınıp üzerine 24 ml THF ve 400 ml HPLC saflıkta metanol ilave edilmiştir. Elde edilen karışımın ph sı 8 e ayarlanmış ve Whatman mavi bant süzgeç kağıdından süzülmüştür. Daha sonra 40 C de 10 dakika süreyle gerçekleştirilen degas işleminin ardından oda sıcaklığına soğutularak HPLC cihazına bağlanmıştır.

70 53 Biyojen aminlerin benzoil türevlerinin en uygun ayırımını sağlamak amacıyla bu çalışmaya özgü çeşitli programlar denenmiş ve bu denemeler sonucunda en uygun ayırımın gerçekleştiği dereceli elüsyon programı belirlenmiş ve Çizelge 3.2 de gösterilmiştir. Çizelge 3.2. Dereceli Elüsyon Programı Zaman (dk) % A (v/v) % B (v/v) Toplam süre = 35 dakika

71 Boza örneklerinde gerçekleştirilen diğer analizler ph tayini Her bir boza örneği için şişelerin kapakları açılır açılmaz, 20 g boza örneği tartılıp üzerine 80 ml destile su ilave edildikten sonra homojen bir karışım elde edilinceye kadar karıştırılmıştır. Daha sonra ph metre kullanılarak her bir örneğin ph sı saptanmıştır Kuru madde tayini Boza örneklerinde kuru madde tayini Türk Standartları Enstitüsü tarafından yayınlanan TS 9778 (Ocak 1992) boza standardına göre yapılmıştır. Buna göre; temiz ve kuru, metal nem kapları içersine tüm yüzeyi kaplayacak şekilde ve 2 kat olmak üzere beyaz bant süzgeç kağıdından dairesel şekilde parçalar kesilip yerleştirildikten sonra etüvde 70 C de sabit tartıma gelinceye kadar bekletilmiştir. Daha sonra her bir boza için üç paralel olmak üzere 5 er g boza tartılmış ve vakumlu etüvde 70 C de ve 600 mbar vakum altında sabit tartıma gelinceye kadar bekletilmiştir Protein tayini Yapısındaki suyun tamamen uçurulduğu kuru madde tayininde kullanılan boza örnekleri protein tayininde de aynen kullanılmıştır. Söz konusu örneklerin her biri asitle yakma destilasyon ve titrasyon aşamalarından geçirilerek protein miktarları tespit edilmiştir.

72 55 Asitle yakma: Boza örneği, reaksiyon tüpüne konularak üzerine 15 ml derişik H 2 SO 4 ve katalizör (250 g susuz Na 2 SO 4, 7,5 g Cu 2 SO 4 ve 3,75 g selenyum iyice karıştırılıp ufalanarak homojen bir hale getirilerek hazırlanmıştır) eklenerek 480 C de elektrikli ısıtıcıda berrak yeşilimsi renk görülünceye kadar yakma işlemine tabi tutulmuştur. Destilasyon: Tüp içerisinde bulunan berrak yeşilimsi renkteki örnek üzerine 50 ml saf su ilave edilip destilasyon düzeneğine yerleştirilmiştir. 50 ml % 40 lık NaOH, alkali pompası ile tüp içine pompalandıktan sonra buhar açılıp 6 dakika süresince oluşan destilat 25 ml borik asit içerisinde toplanmıştır. Titrasyon: Destilat 0,1 N ayarlı HCl ile titre edilmiştir. Sarfiyatlardan boza örneklerinin her biri için % protein değerine geçiş aşağıdaki formül kullanılarak gerçekleştirilmiştir. % Protein = (S-Skör) F HC l 0,14 6,25 g örnek S= Sarfiyat F= Faktör

73 56 4. BULGULAR İzmir, İstanbul, Ankara, Balıkesir, Aydın, Edirne ve Eskişehir piyasalarından toplanan 10 farklı boza örneğinde belirlenen biyojen aminler Çizelge 4.1 de verilmiştir. Boza örneklerinde metilamin, etilamin, propilamin, putresin, kadaverin, triptamin, izopentilamin, spermidin, spermin, histamin, tiramin ve agmatin düzeyleri araştırılmıştır. İncelenen örneklerin hiçbirinde propilamin ve agmatin belirlenememiştir. Söz konusu örneklerde en yüksek düzeyde bulunan biyojen aminin tiramin olduğu tespit edilmiştir. Bozalarda ph, % kuru madde ve % protein değerleri ve toplam biyojen amin miktarları ise Çizelge 4.2 de görülmektedir.

74 57 57 Örnek No Metilamin B 0,32± 0,09 1,70± 0,08 B B 0,24± 0,07 0,45± 0,02 B 0,85± 0,04 0,23± 0,02 Etilamin B 0,76± 0,26 5,01± 2,02 B B B B B 1,67± 0,52 0,62± 0,25 Propilamin B B B B B B B B B B Putresin 3,44± 0,23 1,22± 0,16 5,56± 0,65 0,63± 0,10 0,81± 0,01 0,40± 0,10 2,77± 0,43 0,67± 0,18 0,98± 0,66 0,68± 0,19 Kadaverin B 1,07± 0,79 1,47± 0,77 B B B B B B B Triptamin B B 3,26± 1,10 B B B B B B B İzopentilamin B 5,58± 1,65 6,22± 4,83 1,45± 1,00 2,13± 0,12 0,93± 0,37 1,75± 1,20 B B 1,94± 0,51 Spermidin 1,41± 0,16 2,72± 0,03 3,51± 0,27 1,82± 0,04 1,21± 0,61 0,76± 0,17 1,47± 0,35 0,63± 0,08 2,00± 0,96 1,18± 0,21 Spermin B 2,99± 0,54 4,03± 0,12 B B 1,05± 0,40 B B 1,38± 0,86 0,53± 0,29 Histamin B 2,15± 0,11 6,54± 0,42 B 1,85± 0,76 1,63± 0,84 7,89± 0,34 B 2,11± 1,75 1,48± 0,22 Tiramin 45,4± 26,0 18,0± 7,8 23,1± 2,0 65,0± 6,0 18,8± 6,9 55,3± 10,2 12,7± 4,2 51,9± 0,0 33,4± 3,0 41,1± 17,4 Agmatin B B B B B B B B B B Çizelge 4.1. Bozalarda belirlenen biyojen amin miktarları ve standart sapmaları (µg/g) B: Belirlenemedi.

75 58 58 Örnek No ,96 4,02 3,38 3,49 3,51 3,16 3,29 3,81 3,54 3,49 16,12±0,09 23,75±0,02 31,12±0,14 19,96±0,16 26,12±0,20 24,38±0,11 15,32±0,10 24,06±0,03 21,15±0,12 23,00±0,09 ph % Kuru Madde 0,69± 0 0,63± 0 0,51± 0,01 0,59± 0,02 0,50± 0 0,76± 0,03 0,84± 0,05 0,99± 0,02 0,57± 0,09 0,74± 0,03 50,25 54,73 53,69 68,90 24,80 60,31 27,03 53,20 42,39 47,76 % Protein Toplam Biyojen amin Çizelge 4.2. Bozalarda belirlenen ph, % kuru madde ve % protein değerleri ve toplam biyojen amin miktarları (µg/g)

76 59 Yapılan çalışmada izopentilamin, β-feniletilamin ve etanolaminin birbirine çok yakın alıkonma zamanlarına sahip olduğu görülmüştür. Bu üç biyojen aminden hangisinin boza örneklerinde bulunabileceği konusunda standartlarla ve bozalarla yapılan denemelerde, boza örneklerinde, triptamin ve spermidin arasındaki pik için, izopentilamine daha yakın bir alıkonma zamanı tespit edildiğinden, bozalarda söz konusu pikin esas itibariyle izopentilaminden oluştuğu ve az miktarda β-feniletilamin ve etanolamin içermesinin olası olduğu kabul edilmiştir. Bu pikin izopentilamin olarak değerlendirilmesinde etkili olan diğer bir faktör de boza yapımında kullanılan mısır ve darı unlarının aminoasit kompozisyonları olmuştur. Mısır ununda etanolaminin öncül aminoasidi olan serin 5,2 g/100 g protein, β-feniletilaminin öncül aminoasidi olan fenilalanin 5,3 g/100 g protein, izopentilaminin öncül aminoasidi olan löysin 14,3 g/100 g protein oranlarında bulunmaktadır. Darı ununda ise sırasıyla serin, fenilalanin ve löysin 4,2 g/100 g protein, 5,1 g/100 g protein ve 13,2 g/100 g protein oranlarında mevcuttur (Hoseney, 1994). Bu değerlerden anlaşıldığı üzere mısır ve darı ununda, izopentilaminin öncül aminoasidi olan löysin; β-feniletilamin ve etanolaminin öncül aminoasitlerine oranla çok daha yüksek miktarda bulunmaktadır. Bu durum bozada izopentilamin oluşma olasılığının, β-feniletilamin ve etanolamin oluşma olasılığından daha fazla olduğunu ortaya koymaktadır. Bu verilerden yola çıkılarak bozada triptamin ve spermidin arasında çıkan pikin esas itibarıyla izopentilamin olduğu kabul edilmiştir. Standart karışıma ait kromatogram Şekil 4.1 de; boza örneklerine ait kromatogramlar ise Şekil de görülmektedir.

77 60 1 Şekil 4.1. THF siz mobil fazda standart karışıma ait kromatogram

78 Şekil 4.2. THF siz mobil fazda (1) numaralı bozaya ait kromatogram 61

79 62 Şekil 4.3. THF siz mobil fazda (2) numaralı bozaya ait kromatogram

80 Şekil 4.4. THF siz mobil fazda (3) numaralı bozaya ait kromatogram 63

81 64 Şekil 4.5. THF siz mobil fazda (4) numaralı bozaya ait kromatogram

82 Şekil 4.6. THF siz mobil fazda (5) numaralı bozaya ait kromatogram 65

83 66 Şekil 4.7. THF siz mobil fazda (6) numaralı bozaya ait kromatogram

84 Şekil 4.8. THF siz mobil fazda (7) numaralı bozaya ait kromatogram 67

85 68 Şekil 4.9. THF siz mobil fazda (8) numaralı bozaya ait kromatogram

86 Şekil THF siz mobil fazda (9) numaralı bozaya ait kromatogram 69

87 70 Şekil THF siz mobil fazda (10) numaralı bozaya ait kromatogram

88 71 Özdestan (2004) tarafından yapılan çalışmada benzoil türevleri kullanılarak biyojen aminlerin HPLC ile analizi için optimum şartlar belirlenmeye çalışılmıştır. Söz konusu çalışmada histaminin 4 farklı pik verdiği belirtilmiştir. Yaptığımız bu araştırmada çalışılan kromatografik koşullarda, standart karışım ile yapılan denemelerde histamine ait 3 pik belirlenmiştir. Histamine ait piklerin belirlenebilmesi için (A) hattında iki farklı mobil faz kullanılmıştır. İlk olarak (A) hattına Asetat tamponu (%60) Metanol (%40), (B) hattına Metanol mobil fazları bağlanarak bir dereceli elüsyon programı uygulanmıştır. Bu durumda standart karışım ile çalışıldığında, histamine ait 2 pik (2. histamin ve 3. histamin pikleri) tespit edilmiştir. Şekil 4.12 de bu mobil fazlar kullanıldığında standart karışıma ait kromatogram görülmektedir. Diğer histamin piki (1. histamin piki) bu koşullar altında spermin ile çakışmaktadır. Ayrıca histamine ait 3. pik, boza ile çalışıldığında, bozanın yapısındaki maddelerden kaynaklanan piklerle çakıştığından bozada 3. histamin pikinin tespiti mümkün olamamıştır. Bu durumda histamine ait 1. pikin görülebilmesi ve ayrıca histamine ait 3. pikin bozada belirlenebilmesi amacıyla tüm koşullar aynı tutularak (A) hattına bağlanan mobil fazda değişiklik yapılmıştır. (A) hattına [asetat tamponu: THF (96:4)] (%60)-metanol (%40) mobil fazı bağlanmıştır. Bu koşullar altında spermin ile çakışan 1. histamin pikinin ayırımı sağlanmış ve tespit edilebilmiştir (Şekil 4.13). Ayrıca bozalarla çalışıldığında kromatogram sonunda bozanın yapısındaki maddelerden kaynaklanan piklerde de ayırım sağlanmış ve 3. histamin pikinin alıkonma süresine sahip bir pik tespit edilmiştir. Ancak 3 gün bekletilen türevlerin enjeksiyonu sonucu elde edilen kromatogram

89 72 Şekil THF siz mobil fazda standart karışıma ait kromatogram

90 73 incelendiğinde söz konusu pikin alanında bir azalma görülmediğinden bu pikin 3. histamin piki olmadığına karar verilmiştir. Çünkü Özdestan (2004) tarafından standart karışımla yapılan çalışmada söz konusu 3. histamin pikinin büyüklüğünde 3 gün sonunda yüksek oranda azalma tespit edilmiştir. Boza örneklerinde histamin için yapılan mobil faz denemelerinin ardından (A) hattında mobil faz olarak; Asetat tamponu (%60) Metanol (%40) kullanımı uygun bulunmuştur. Çünkü diğer mobil faz ile çalışıldığında spermin ile çakışan 1. histamin pikinin ayırımı sağlanırken diğer biyojen aminlerin piklerinin alıkonma sürelerinin değiştiği ve ayırımın yeterince iyi sağlanamadığı gözlenmiştir. Asetat tamponu (%60) Metanol (%40) ile çalışıldığında, spermin ile çakışan 1. histamin pikinin oldukça küçük olması nedeniyle hatanın ihmal edilebilecek düzeyde olduğu düşünülmüştür.

91 74 Şekil THF li mobil fazda standart karışıma ait kromatogram

92 75 Biyojen aminlerin tayiniyle ilgili araştırmalarda genellikle iç standart tekniği uygulanmıştır. Çünkü aynı miktar biyojen aminin, standartlarla çalışıldığında verdiği pik, gıda maddesiyle çalışıldığında verdiği pikten daha büyük olmaktadır. Bu durum gıda maddelerinin kompleks bir yapıya sahip olmalarından ileri gelmektedir. Bu nedenle iç standart olarak bir biyojen amin tespit edilip bu madde hem standartlara hem de gıda maddesine ilave edilmektedir. İç standart olarak kullanılan maddenin söz konusu gıda maddesinde bulunmayan bir biyojen amin olması gerekmektedir. Analizin çeşitli aşamalarında iç standardın, gıdanın matriksi tarafından hangi oranda etkilendiği tespit edilip bu oran diğer biyojen aminlere uygulanarak bir düzeltme yoluna gidilmektedir. Ancak bugüne kadar yapılan biyojen amin analizlerinde kullanılan bu yöntemin çok doğru sonuçlar verdiği söylemez. Çünkü her biyojen amine ait pikin, gıda maddesi ile çalışıldığında küçülme oranı birbirine eşit değildir. Bu nedenle bu çalışmada bozadaki biyojen aminler tayin edilirken iç standart yöntemiyle çalışılması uygun görülmemiştir. Aranan biyojen aminlerin tamamını içeren bir standart karışım oluşturulmuş ve bu karışım boza örneğine eklenerek her bir biyojen aminin boza içindeki küçülme oranı kendi standardıyla kıyaslanarak tespit edilmiştir. Bu yöntem standart katma yöntemi olarak isimlendirilmektedir. Şekil 4.14 de her bir biyojen aminin boza içersindeki küçülme oranının farklı olduğu görülmektedir. Kıyaslamada pik alanları baz alınmıştır. Kolona enjekte edilen 1 µg biyojen amine karşılık hesaplanan pik alanları ve standart sapmaları, boza ve standart karışım için sırasıyla: metilamin 175,5±7,3 ve 190,4±10,0; etilamin115,3±1,8 ve 141,2±8,2; propilamin 103,4±3,8 ve 137,2±5,9; putresin 163,5±29,8 ve 215,6±22,0; kadaverin 55,0±15,8 ve 122,3±4,7; triptamin 51,3±6,3

93 76 ve 92,2±7,0; izopentilamin 76,8±5,2 ve 91,4±5,6; spermidin 74,2±8,2 ve 140,4±7,3; spermin 45,7±8,0 ve 154,6±27,4; histamin 45,3±7,8 ve 129,4±16,3; tiramin 15,6±3,4 ve 208,5±33,4 şeklindedir. Pik alanları bozalarda 6 paralel, standart karışım için 3 paralel çalışılmıştır. Şekil 4.14 incelendiğinde en yüksek düzeyde azalmanın tiramine ait pikte olduğu, en düşük düzeyde azalmanın ise metilamine ait pikte olduğu görülmektedir. Metilamindeki azalma % 7,8 iken tiramindeki azalma % 92,5 tir. Şekil Biyojen aminlerin boza ve standart karışım ile çalışıldığında pik alanları (pik alanları, kolona enjekte edilen 1 µg biyojen amine karşılıktır)