ÇOKLU TÜP FERMANTASYON YÖNTEMİ İLE TOPLAM KOLİFORM TAYİNİ Koliform Bakteri Grubunun Tanımı Koliform grubunu oluşturan bakteriler; tamamı aerobik veya fakültatif anaerobik olan, gram negatif, spor oluşturmayan, çomak şeklinde, laktozdan 35 C' de 48 saat içerisinde asit ve gaz oluşturan bakteriler olarak tarif edilir. Koliform Bakterilerin Anlam ve Önemi Bu organizmalar patojen olmayıp, suda mevcut olmaları dışkı ile kirlenmeyi ve buna bağlı olarak potansiyel bir kirlenmeyi işaret eder. Tifo, dizanteri, kolera gibi hastalıklar bir bağırsak enfeksiyonu olduğundan, koliform bakterilerin herhangi bir suda bulunması, yukarıdaki hastalıkların amili olan bakterilerin o suda var olacağı ihtimalini gösterir. Yani koliform bakteriler böylesi bir tehlikenin indikatörüdürler. Bu sebepten bunların suda bulunmamaları, patojen bakterilerin de bulunmamasının bir göstergesidir. Sularda koliform bakterilerinin aranmasının sebebi; bunların patojen olan bakterilere oranla daha kolay, daha ucuz ve daha kısa sürede tespit edilebilmeleridir. Enterobacteriaceae; bağırsak bakterleri familyasından olan bu bakterilerin sınflamadaki yeri aşağıdaki gibidir; A. Normal şartlarda saprofit (zararsız) olanlar 1. Koliform bakteriler a. escherichia lar b. Citrobacter ler c. Klebsiella lar d. Enterobacter ler 2. Proteus lar 3. Pseudomonas lar 4. Alcaligenes ler B. Patojen Bakteriler 1. Salmonella 2. Shigella
Tanımı yukarıda yapılan koliform bakterilerin önemli bir türü olan Eschercia Coli, 2-4 µm boyunda 0.4-0.7 µm eninde, düz, uçları yuvarlak çomak biçiminde bakterilerdir. Hareketleri tifo basiline (salmonella typhi) göre daha yavaştır. Fakültatif anaerob bakterilerdir. Optimal üreme süresi 35 o C dir. Genel besi yerinde kolay ve bol olarak üreyebilirler. Sıvı besiyerinde homojen olarak ürerler ve kültürleri feçes (dışkı) kokusundadır. Koliform kaynakları Koliform bakterilerinin asıl kaynağını insan ve sıcakkanlı hayvanların dışkıları oluşturmaktadır. Dolayısıyla, yerleşim merkezlerindeki kanalizasyon suları ve bunlarla kirletilmiş olan sıvı atıklar ve katı atık sızıntı suları önemli koliform kaynaklarıdır. Toplam Koliform Tayin Yöntemleri Toplam koliform tayininde en çok kullanılan iki metot dan biri; hala halk sağlığı laboratuarlarında kullanılmakta olan çoklu tüp fermantasyon yöntemi, diğeri ise membran filtre yöntemidir. 1. Çoklu Tüp Fermantasyon Yöntemi İstatistiksel verilere göre hazırlanmış, belirli limitleri olan bir tablo veya tablolar yardımıyla sonuca gidilen bir yöntemdir. Deney genellikle 15 tüple yapılmaktadır. Çoklu-tüp yöntemi; 1. aşama "Tahmin (Olasılık) Deneyi" 2. aşama "Doğrulama Deneyi" 3. aşama "Tamamlama Deneyi" olmak üzere üç aşamada yapılır. Pratik uygulamalarda, ilk iki aşama ile sonuca gidilmektedir. Tamamlama testi için bütün şüpheleri ortadan kaldırıp, %95'lik bir doğruluk derecesi elde etmek için yapılmaktadır.
Tahmin Deneyinin Yapılışı Bu aşamada LTB (Lauryl Sülfate Tryptose Broth) kullanıldığı gibi laktozlu sıvı besiyeri de kullanılmaktadır. Besiyerlerinin bulunduğu tüplere konacak olan su miktarı, incelenecek olan su özelliğine bağlıdır. İçme suyu için 5 tüpün her birine 10 ml. konmaktadır. Daha hassas bir ölçüm için bu işlem 10 tüple yapılır, İçme suyu dışındaki sularda genellikle 10, 1, 0,1 ml. lik ekimler yapılmakta olup, bu miktarların her biri 5 adet tüpte yapılmaktadır. Böylece toplam 15 adet tüp kullanılmış olacaktır. Şekil1. Ekim Şeması 1 TAHMİN DENEYİ Fermantasyon Tüplü LB besiyerlerine ekim 24 ± 2 saat, 35 ± 0,5 0 C de inkübasyon (1) Gaz Oluşumu var ise Test + (2) Gaz Oluşumu yok veya şüpheli ise 24 saat daha inkübasyona bırakılır Toplam 48 ± 3 saat (a) Gaz Oluşumu var ise Test + (b) Gaz Oluşumu yok ise Test yok
2 DOĞRULAMA DENEYİ Fermantasyon Tüplü LB besiyerlerine ekim 24 ± 2 saat, 35 ± 0,5 0 C de inkübasyon (1) Gaz oluşumu var ise BGB besiyerine ekim yapılır. 48 ± 3 saat, 35 ± 0,5 0 C de inkübasyon (2) Gaz oluşumu yok veya şüpheli ise 24 saat daha inkübasyona bırakılır Toplam 48 ± 3 saat (a) (b) (a) (b) Gaz oluşumu var ise Test + Gaz oluşumu yok ise Test Gaz oluşumu var ise Test + Gaz oluşumu yok ise Test doğrulanmıştır yoktur doğrulanmıştır yoktur Numune yaklaşık 25 kere iyice çalkalanır ve uygun olan ekimler tüplere yapılır. Ekimi yapılan tüpler hafifçe çalkalanarak, suporlara konulur. Supor 35± 0,5 C'ye ayarlanmış, bir inkubatöre yerleştirilir. Ortamın nemini sağlamak için de, inkubatöre küçük bir beherle su konur. Tüpler 24± 2 saat sonra kontrol edilerek, gaz oluşumu olanlar (+) olarak, diğerleri de (-) olarak kaydedilir. Eksi olan tüpler için 24± 3 saat daha beklenir, sonuçlar aynı şekilde kaydedilerek doğrulama deneyine geçilir. Doğrulama Deneyinin Yapılışı Bu deney için Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGB) besiyeri kullanılmaktadır. Tahmin deneyinde asit ve gaz oluşturan tüpler, yavaşça çalkalanarak, organizma süspanse hale getirilir. Steril bir öze ile alınan bakteri kültürü BGB'li tüpe ilave edilir. Aşılanmış olan BGB'li tüpler 35± 0,5 C'de 48± 3saatlik bir inkubasyona bırakılır. Bu inkubasyon süresi içerisinde durham tüplerinde herhangi bir miktarda gaz oluşumu bu deneyin pozitif olarak sonuçlandığını gösterir.
Sonucun değerlendirmesi: Deney 10, 1, 0,1 ml hacimler kullanılarak yapılmışsa Tablo 1 ve 2 den pozitif tüp sayısını gösteren üçlü sayıya bakarak bunun karşısındaki sayı değeri, numunenin 100 ml deki toplam koli miktarını EMS olarak. Eğer bir seyreltme yapılmışsa ortalama seyreltme miktarı ile bu sayı çarpılarak gerçek değer bulunmuş olur. 20 tüpe seyreltilerek yapılan bir ekim ve bunlara ait sonuçlar Tablo 3 te verilmiştir. Tamamlama Deneyinin Yapılışı Koliform bakterilerinin varlığını kesin olarak belirleyip, kalite kontrol verilerini sağlamak için doğrulama safhasında pozitif sonuç veren bütün tüplere tamamlama testi uygulanmaktadır. BGB'de gaz oluşturan tüplerden LES Endo agarlı petri kutularına aseptik şartlar altında ekim yapılır. Yapılan ekimde esas amaç, kolonilerin ayrı ayrı oluşmasını temin etmektir. Petri kutuları ters olarak 35± 0,5 C' de 24± 2 saat inkube edilir. Besiyerinde oluşan tipik kolonilerden (yüzeyi yeşil metalik parlaklıkta koyu kırmızı koloniler) aseptik koşullarda bir öze yardımı ile hem yatık agarlı besi yerini, hem de laktozlu buyyon'a ekim yapılır. Ekim yapılan laktozlu buyyon besiyerleri 35+ 0,5 C'de 24+ 2 saat inkube edilir. Gaz oluşumu yoksa 24± 3 saat daha beklenir, eğik agarlı besiyerinde üreyen bakteri kolonilerinden (24 saat sonra) alınarak gram boyaması yapılır. Laktozlu sıvı besiyerinde gaz oluşumu, gram boyaması sonucunda da gram (-), sporsuz, çubuk şeklinde bakterilerin çıkmış olması, bu deneyin pozitif olarak sonuçlandığını gösterirken gaz oluşmaması ve gram (+) olarak elde edilen sonuçlar ise deneyin negatifliğini işaret etmektedir. Tablo 1 Kuvvetli Olasılık Sayısı için kullanılan EMS çizelgesi Ekilen su miktarı 10 ml 1 ml 0,1 ml 100 ml de koli sayısı Kullanılan tüp sayısı 1 1 1 (EMS/100 ml) Olasılık deneyinde 48 saatin sonunda tüplerde gaz oluşumu + + + 240 dan çok Olasılık deneyinde 48 saatin sonunda tüplerde gaz oluşumu + + - 240 Olasılık deneyinde 48 saatin sonunda tüplerde gaz oluşumu + - + 95 Olasılık deneyinde 48 saatin sonunda tüplerde gaz oluşumu + - - 23 Olasılık deneyinde 48 saatin sonunda tüplerde gaz oluşumu - + + 19 Olasılık deneyinde 48 saatin sonunda tüplerde gaz oluşumu - + - 9,4 Olasılık deneyinde 48 saatin sonunda tüplerde gaz oluşumu - - + 9 Olasılık deneyinde 48 saatin sonunda tüplerde gaz oluşumu - - - 9 dan az
Tablo 2. her seyreltme için (10 ml, 1 ml, 0.1mL) 5 tüpün kullanılması durumunda elde edilen pozitif kombinasyona göre EMS değeri Pozitif kombinasyon EMS Index/100mL Pozitif kombinasyon EMS Index/100 ml 0-0-0- <2 4-2-0 22 0-0-1 2 4-2-1 26 0-1-0 2 4-3-0 27 0-2-0 4 4-3-1 33 4-4-0 34 1-0-0 2 1-0-1 4 5-0-0 23 1-1-0 4 5-0-1 30 1-1-1 6 5-0-2 40 1-2-0 6 5-1-0 30 2-0-0 4 5-1-1 50 2-0-1 7 5-1-2 60 2-1-0 7 2-1-1 9 5-2-0 50 2-2-0 9 5-2-1 70 2-3-0 12 5-2-2 90 5-3-0 80 3-0-0 8 5-3-1 110 3-0-1 11 5-3-2 140 3-1-0 11 5-3-3 170 3-1-1 14 3-2-0 14 5-4-0 130 3-2-1 17 5-4-1 170 5-4-2 220 4-0-0 13 5-4-3 280 4-0-1 17 5-4-4 350 4-1-0 17 4-1-1 21 5-5-0 240 4-1-2 26 5-5-1 300 5-5-2 500 5-5-3 900 5-5-4 1600 5-5-5 >1600 Tablo 3. yirmi tüpe yapılan ekimler sonucu meydana gelen kombinasyonların tespit edilmesi Örnek 1 ml 0.1 ml 0.01 ml 0.001 ml Pozitif kombinasyon EMS Index/100 ml a 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 5000 b 5/5 4/5 2/5 0/5 5-4-2 2200 c 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20 d 5/5 3/5 1/5 1/5 5-3-2 1400 e 5/5 3/5 0/5 0/5 5-3-2 1400