10. VALİDASYON VE KALİTE KONTROL ÇALIŞMALARINA DAYANAN YAKLAŞIM (TEK_LAB VALİDASYON YAKLAŞIMI) 2:00 /4:55:00 10.1 Temel Bilgiler, Ana Denklem, Mutlak ve Bağıl Miktarlar, Pratik Uygulamaya Genel Bakış VALİDASYON VE KALİTE KONTROL ÇALIŞMALARINA DAYANAN YAKLAŞIM (NORDTEST YAKLAŞIMI) Tek Laboratuvar Validasyon yaklaşımı Rastgele Belirsizliğe neden olan etkiler Sistematik İki grup belirsizlik katkıları aytı olarak sayısallaştırılır ve birleştirilir Rastgele etkilerden kaynaklanan belirsizlik Olası BİASdan kaynaklanan belirsizlik Uzun dönem seviyesinde (birkaç ay, mümkünse yıl) Tek-Lab Validasyon yaklaşımı: pratik uyg.1 Temel Denklem Laboratuvar içi tekrar üretilebilirlik Rastgele etkileri temsil eder Laboratuvar ve metot BİASının belirsizlik tahmini Sistematik etkileri temsil eder Çok önemlidir ki bu yaklaşım ile bulunacak belirsizlik değeri herhangi bir ölçüm sonucuna özel değil, geneldir. İstenen herhangi bir ölçüm sonucu için belirsizlik değeri bu genel değer ile ilişkilendirierek belirlenir. Bu denklem dahil verilecek tüm denklemlerde, mutlak ve bağıl değerler kullanılır. Tek-Lab Validasyon yaklaşımı: pratik uyg. Uygulanacak adımlar; 1. Ölçüleni tanımla 2. R w bileşenini sayısallaştır u(r w ) 3. BİAS bileşenini sayısallaştır u(bias) 4. Bileşenleri standart belirsizliğe çevir u(x) 5. Birleştirilmiş belirsizliği hesapla u c 6. Genişletilmiş belirsizliği hesapla U
10.2 Rastgele Etkilerden Kaynaklı Belirsizlik Bileşeni u(rw) laboratuvar içerisinde uzun dönemde elde edilen değişimlerinden kaynaklanan belirsizlik u(r w ) bileşenidir laboratuvar içi tekrar üretilebilirlik (s Rw ). İdeal olarak Numune almayı da - Aynı numune ile içerecek şekilde o Numune, test numunesi ile matriks, konsantrasyon ve homojenite açısından benzerdir. - Aynı laboratuvar - Aynı prosedür - Farklı günler (mümkünse 1 yıl içerisinde) - Farklı personeller - Farklı reaktifler İdeal olarak: farklı matrisler ve farklı konsantrasyonar için farklıdır. Kontrol numunes tüm analiz prosedürünğ kapsayacak şekilde analiz edilmelidir. Tekrarlanabilirlik < lab içi tekrar üretilebilirlik < birleştirilmiş belirsizlik s r < s Rw < u c QUİZ 1) Bir laboratuvar farklı gıdalarda protein tayininin ölçüm belirsizliği için laboratuvar içi tekrar üretebilirlik bileşenini (rastgele belirsizlik bileşeni olarak) hesaplamak istiyor. Bunun için kontrol numunesi olarak seçilen sucuk üzerinde 1 yıl boyunca tekrar ölçümleri yapılıyor. Her gün 1 adet paralel ölçüm gerçekleştirilerek aşağıdaki sonuçlar elde ediliyor. Laboratuvar içi tekrarüretilebilirlik bileşeni belirsizliğini (2 veya üç desimal hane ile) belirleyiniz. Bu durumda mutlak belirsizlik kullanılabilir. =STDSAPMA(18,1;20,5;18,3;19,1;19,3;20,2;19,7;19,5;18,6;20,1) = 0.819 g/100g veya 0.82 g/100g 2) Aşağıdakiklerden hangileri doğrudur. - U(Rw) yi doğru tahmin etmek için kontrol numunesinin homojen olması gereklidir. EVET (eğer numune homojen değilse, metot tekrarşlanabilirliğine farklı günlerdeki numune konsantrasyonundan kaynaklı katkı olacağından, u(rw) yapay olarak yüksek çıkacaktır.) - U(Rw) yi doğru tahmin etmek için kontrol numunesinin zaman içerisinde stabil olması gereklidir. EVET (Eğer numune ayrııyorsa, metot tekrarşlanabilirliğine farklı günlerdeki numune konsantrasyonundan kaynaklı katkı olacağından, u(rw) yapay olarak yüksek çıkacaktır.) -Kontrol numunesi üzerinde bir yıl içerisinde gerçekleştirilen 10 ölçüm sonucuna göre protein değeri %95 olasılık ile ±2 u(rw) olarak belirlenmiştir. 1o adet daha fazla ölçüm yapılarak bu hesaplamanın yapılması daha uygun olurdu. EVET (u(rw) belirlenmesi için yıl içerisinde 20-30 ölçüm yapılması daha uygundur)
10.3 Sistematik Etkilerden Kaynaklı Belirsizlik Bileşeni u(bias) Laboratuvar sonuçlarının tahmin edilen en iyi gerçek değerden olası BİASı dikkate alınır. u(bias) aşağıdaki şekillerde bulunabilir. -Referans bir prosedür ile aynı numune üzerinde yapılan tekrar analizleri -Sertifikalı Referans Malzeme ile yapılan tekrar analizleri -Tekrarlanabilir laboratuvarlararası karşılaştırma testlerinden -Tekrarlanan spike deneylerinden İdeal olarak: Farklı referans malzemeler, Farklı PT ler, çünkü bias çoğunlukla matrix ile kanasantrasyon ile değişir. Eğer yeteri kadar tekrar yapılmazsa önemli oranda rastgele hata içerir. 1- Olası ifadesi. BİAS ın belirlenmesi herzaman çok kolay değildir ve çok sayıda deney yapılması gereklidir. Eğer yeterince deney yapılmaz ise bias önemli oranda rastgele hata içerecektir. 2- BIAS ın çalışılabilmesi için mutlaka değeri bilinen bir referansa ihtiyaç vardır. Aslında en iyi oldur, ancak belirsizliği düşük ve güvenilirliği yüksek bir referans prosedür olmadığından uygulaması çok mümkün değildir. Satın alınan CRM ler kullanmak (iyi bir yoldur). CRM gerçek numuneye benzer ve analit içeriği yüksek güvenilirlik ile bilinen (yüksek analitik teknik uzmanlığa sahip laboratuvarlarca) malzemelerdir. Karşılaştırma testlerine/pt katılarak. Çoğunlukla referans değer, test sonuları kullanılarak elde edilir (konsensus değer). Latılımcılar farklı seviyede laboratuvarlar olduklarından konsensus değer çok güvenilir olmayabilir. Genellikle belirsizlik tahmini yüksektir. Elinizde bir numune var üzerin değeri bilinen bir analit ekliyorsunuz ve geri kazanmaya çalıyorsunuz. Eklediğini ile kazandğınız arasındaki fark BİAS dır. BIAS ı çok yüksek veta çok düşük tahmin etmemek için ortalama BIAS elde etmek için ORTLAMA BIAS dır Ortalama değerdir. Bir sonraki salyatta açıklanacak. Referans değerin ortama belirsizliğidir. Referans değer gerçek değer demek değildir ve bu yüzden belirsizliği vardır. Bu bileşen laboratuvar sonuçlarının, Cref değerinden ortalama biasıdır. Bu bileşen, Cref değerinden ortalama belirsizliğidir.
10.5 Nordtest Yaklaşımı Pratik Uygulama: Gıdalarda LC-MS ile acrlyamide tespiti Tek-lab validasyon yaklaşımı pratik uygulaması: Gıdalarda (gevrek ekmek) LC-MS ile akrilamit tespiti Konsantrasyon seviyesi 998 g/kg Laboratuvar benzer matriksde iki ayrı CRM analiz etmiştir. o Patates jpsi ve gevrek ekmek o Gevrek ekmek aynı zamanda kontrol numunesi olarak kullaılmıştır. Akrilamit ısıl işlem uygulanan gıdalarda ortaya çıkan zehirli bir kirleticidir. Bu yöntemde deney sonucuna belirsizlik bulmaya çalışmayacağız, belirsizliği bulup bulduğumuz değeri ölçüm sonucuna yanıtacağız Laboratuvarın elinde yeterli miktarda var ve uzun dönem boyunca kontrol numunesi olarak kullanılabilmiş. Sertifikalı Referans Malzeme (CRM) Gevrek ekmek CRM inin akrilamit konsantrasyonu: Referans değerler Patates cipsi CRM inin akrilamit konsantrasyonu: Genişletilmiş belirsizlikler
CRM ler ile yapılan ölçümler Gevrek ekmek Patates cipsi Günler Günler Bu veriler 1-Kısa bir zaman aralığını yansıttığından laboratuvar içi tekrar üretilebilirlik u(rw) için de kullanılabilmaz (Rastgele hata) 2- BİAS için kullanılabilir Ortalama: Ortalama: Bu veriler 1-Bir yılı aşkın bir zamana yayılmış olduğundan aynı zamanda laboratuvar içi tekrar üretilebilirlik u(rw) için de kullanılabilirler (Rastgele hata) 2- BİAS için kullanılabilir nordtest_belirislik akrilamit.xls Sonuç Numunedeki akrilamit miktarı
11. Yaklaşımların Karşılaştırılması Modelleme -Çokda kolay olmayan bir çok hesaplama yapılmasını gerektirir. -Yüksek seviyede bilgi gerektirmesi nedeniyle uzman laboratuvarlar tarafından kullanılır -Özel bir takım ölçümler gerektirdiğinden fazladan deneysel çalışma yapılması gerekir. -Bileşenlerinin gözden kaçırılması durumunda belirszilik tamininin düşük olma tehlikesi vardır. -Ölçüm prosedürü ve üzerinde durulması gereken hususlar hakkında önemlli bilgiler verir. Tek-lab validasyon -Zamanı ve yeterli seviyede bilgisi olmayan rutin çalışan laboratuvarlar için oldukça uygundur. -Bir çok veri gerektirir, ancak zaten laboratuvarın elinde mevcuttur (validasyon çalışmaları, PT sonuçları vb.), dolayısıyla daha az fazladan çalışma gerektiri. -Daha gerçekçi bir belirsizlik tahmini verir. Ancak BİAZ bileşeni rastgele hataları da içerdiğinden özellikle CRM lr iyi kalitede değilse belirsizliği yüksek tahmin etme gibi bir durum vardır. -Öğretme seviyei düşüktür.
QUİZ 1) Aşağıdaki hangi durumlarda ISO GUM, hangi durumlarda Nordtest yaklaşımı kullanılır. - Sertifikalı referans malzemeler ile ölçümler de dahil olmak üzere mevcut bir çok ölçüm varsa. -Ölçüm prosedürü prensibi tam olarak bilinmiyor ve olası birçok bilinmeyen belirsizlik kaynağı varsa.n -Referans değeri tahmin etmek için güvenilir sertifikalı referans malzeme yoksa veya referans prosedürü bulunmamaktaysa. G Ölçüm prosedürü prensibi iyi anlaşılmış ve belirsizlik kaynakları kantitatif olarak tahmin etmek kolaysa.g -Laboratuarda güvenilir bir referans numunesi mevccut ve farklı günlerde paralel bir dizi ölçümler yapılmıştır. Rutin bir örnek ile bir yıllık bir zaman süresi boyunca aynı prosedür ile ölçümler yapılmıştır. N