KROMATOGRAFIK AYIRMA İŞLEMLERI
Kromatografinin Temeli Analizlenecek bir örnek karışımında bulunan bileşenlerin birbirinden ayrılması esasına dayanır. Kalitatif (nitel) ve kantitatif (nicel) analizler yapılabilir. Çalışma düzeneği temel olarak iki bileşenden oluşur: 1. Sabit Faz (stationary phase) 2. Hereketli faz ya da mobil faz (mobile phase) Bu hareketli faz sonra, bir kolonda veya bir katı yüzeyde sabitleştirilmiş kendisi ile karışmayan bir durgun faz (sabit faz) içinden geçmeye zorlanır. Durgun faz tarafından farklı kuvvetlerde tutulan numune bileşenleri birbirlerinden nitel veya nicel olarak analizlenebilen farklı bantlar veya bölgeler şeklinde ayrılırlar.
Kromatografinin uygulama biçimine göre sınıflandırılması: Kolon kromatografisi: Durgun faz ince bir kolonda tutulur ve hareketli faz basınç veya yerçekimi etkisiyle bu durgun faz arasından geçmeye zorlanır. Düzlemsel kromatografi: Durgun faz düz bir plaka üzerine veya bir kağıdın gözenekleri arasına tutturulur ve bu durumda hareketli faz durgun faz arasından kapiler (kılcallık) veya yerçekimi etkisiyle hareket eder.
İnce Tabaka Kromatografisi s o l v e n t f r o n t c o m p o n e n t B Less polar! s o l v e n t f r o n t c o m p o n e n t B c o m p o n e n t A c o m p o n e n t A More polar! o r i g i n mixture s o l v e n t f r o n t o r i g i n o r i g i n Rf değeri aynı şartlarda bir madde için aynıdır. Rf ayırt edici bir özelliktir.
Kolon Kromatografisi
Kolon kromatografik yöntemlerin faz tiplerine göre sınıflandırılması:
Kolon kromatografik yöntemlerin hareketli faz tiplerine göre sınıflandırılması:
Kolon kromatografik yöntemlerin ayrılma mekanizmasına göre sınıflandırılması: Adsorpsiyon Kromatografisi Partisyon (Dağılma) Kromatografisi İyon Değiştirme Kromatografisi Jel Filtrasyon Kromatografisi Afinite Kromatografisi
Adsorpsiyon Kromatografisi Örnek bileşenlerinin dolgu maddesi yüzeyinde farklı olarak tutunmaları sonucu meydana gelen ayırma işlemidir. Maddeler sabit olan katı faz ve sıvı ya da gaz olan hareketli faz arasında etkileşirler. Sabit Faz Özellikleri Ayrılması gereken maddeleri parçalamamalı Ayrılması beklenen maddeler ile kimyasal reaksiyon vermemeli Adsorpsiyon kapasitesi yüksek olmalı Adsorpladıkları maddeleri kolaylıkla geri bırakmalı
Partisyon (Dağılma) Kromatografisi Maddeler sabit olan sıvı faz ve sıvı ya da gaz olan hareketli faz arasında dağılır. Birbiri ile karışmayan iki sıvıdan oluşan bir faz sistemi içine konulan madde, bu sıvılardaki çözünürlüğüne bağlı olarak iki faz arasında dağılır ve dengeye ulaşır. Maddelerin dağılması, dağılma katsayısı (Kd) ile gösterilir. Kd= C1/C2 C1:Maddenin 1. fazdaki derişimi C2:Maddenin 2. fazdaki derişimi
Dağılma kromatografisinin uygulamaları Alan Farmasötikler Biyokimya Gıda Ürünleri Endüstriyel Kimyasallar Kirleticiler Adli Tıp Klinik Tıp Tipik karışımlar Antibiyotikler, Sedatifler, Steroidler, Analjezikler Aminoasitler, Proteinler, Karbonhidratlar, Lipidler Suni Tatlandırıcılar, Antioksidantlar, Aflatoksinler, Katkı Maddeleri Kondanse Aromatikler, Yüzey Aktif Maddeler, Boyalar Pestisitler, Herbisitler, Fenoller İlaçlar, Zehirler, Kan Alkolü, Narkotikler Safra Asitleri, İlaç Metabolitleri, İdrar Ekstraktları, Östrojenler
İyon Değişim Kromatografisi K o l o n d a k i s a b i t f a z çalışılan ph da + ya da bir yüke sahip<r. Sabit fazla zıt yükle yüklü olan maddeler kolonda alıkonurken aynı yükte olanlar alıkonmazlar.
İyon Değiştirmeyi Etkileyen Faktörler: 1. Hareketli faz derişimi 2. Hareketli faz ph sı İyon Değiştirme Kromatografisinin Uygulama Alanları Ayrılması güç olan bazı iyonların ve asitlerin ayrılması Amino asitlerin saflaştırılması Seyreltik iyon çözeltilerinin derişikleştirilmesi
Jel Filtrasyon (Moleküler Eleme) Kromatografisi Karışımdaki moleküllerin, molekül büyüklüklerine göre ayrılması esasına dayanır. Daha büyük moleküller daha hızlı ilerlerler.
Sabit faza sadece ilgilenilen molekül ile e t k i l e ş e c e k b i r molekül tutturulur. Seçiciliği fazla olan bu yöntem kromatografi t e k n i k l e r i n i n e n yenisidir. Antijen-antikor Enzim-substrat Reseptör-ilaç gibi o l d u k ç a s p e s i fi k etkileşimlere dayanır. Afinite Kromatografisi
Kromatografinin Uygulamaları 1. Kalitatif analiz İçeriği tam olarak bilinen daha önce çalışılmış numunelerle aynı şartlarda çalışılarak karşılaştırma ile kalitatif analiz yapılabilir. Kromatografi kolonlarının UV, IR veya kütle spektrometrelerine doğrudan bağlanmasıyla kalitatif analiz yapılabilir.
2. Kantitatif analiz Kromatogramda analit pikinin yüksekliği veya alanı, konsantrasyonla doğru orantılıdır. Kantitatif kolon kromatografisi genel olarak, analit pikinin yüksekliği ya da alanının bir ya da daha fazla standardınki ile kıyaslanmasına dayanır. 1. Pik yüksekliğine dayalı analizler (geniş piklerde) hatalara sebep olabilir. 2. Pik alanına dayalı analizlerde ise pik genişlemesinden etkilenme olmaz. 3. Standartlarla kalibrasyon: Bilinmeyenin bileşimine yakın bir dizi standart çözelti hazırlanıp, konsantrasyona bağlı standart grafikler çizilip bilinmeyenin bu grafik ile karşılaştırılması ile uygulanır. 4. Standart ilave yöntemi: Hem standart hem de numuneye dikkatle ölçülmüş miktarda iç-standart ilave edilerek uygulanır.
Karışımı oluşturan komponentlerden durgun faza kuvvetlice tutunanlar, zayıf tutunanlara göre daha yavaş ilerler. B bileşeni durgun fazda daha kuvvetli tutunduğu için bu bileşen göç sırasında geride kalmaktadır. Komponentler görünür bantlar ya da bölgeler oluştururlar. Bantların ilerleme hızları hareketli fazda geçirdikleri zamana bağlıdır. Elüsyon zamanı (alıkonma süresi) veya hacmine karşı dedektör cevabından elde edilen grafiğe kromatogram denir. Bu grafikler hem nitel hem de nicel analizler için kullanılabilir. Bir kromatogramdaki pik sayısı, numunedeki bileşen sayısı kadardır. Kromatogramdaki zaman ekseni üzerindeki pikin yeri, onun hangi maddeye ait olduğunu, numune miktarı ile orantılı pikin alanı da, o bileşenin kantitatif ölçüsünü vermektedir.
Kromatografi birçok analiz cihazının kullandığı bir saflaştırma tekniğidir. Bunlardan en yaygın kullanılanları: Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Gaz Kromatografisi (GC)
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC) HPLC, bütün analitik ayırma teknikleri arasında en yaygın kullanılanıdır. Yöntemin bu kadar yaygın olmasının başlıca sebepleri, duyarlı doğru nicel tayinlere kolaylıkla uyarlanabilir olması otomasyon kolaylığı uçucu olmayan veya sıcaklıkla kolayca bozunabilen türlerin ayrımasına uygun olması endüstriyi, birçok bilim dalını ve halkı yakından ilgilendiren maddelere geniş bir şekilde uygulanabilirliğidir. HPLC de, hareketli faz bir sıvı ve durgun faz ise çok küçük katı parçacıklardan oluşmuştur. Uygun akış hızları elde edebilmek için sıvıya birkaç yüz psi lik veya daha yüksek basınçlar uygulanır.
HPLC Cihazının Şematik Olarak Görünüşü Çözücü HPLC kolonu Enjektör Yüksek basınç pompası Detektör Atık
Kromatogram Sıvı ve gaz kromatografi için genel cihaz şeması
HPLC cihazı:
Pompalama sistemleri HPLC pompalama sistemlerinde şu özellikler bulunmalıdır: 1. 400 atm e kadar basınç üretimi 2. Puls içermeyen basınç çıkışı 3. 0,1-10 ml/dakika aralığında akış hızları 4. % 0,5 veya daha iyi tekrarlanabilirlikte akış kontrolü 5. Korozyona dayanıklı parçalar
Numune enjeksiyon sistemleri Pek çok modern kromatografi cihazında otoenjektörler bulunur. Bunlar numune kaplarından sıra ile numune alarak LC kolonuna enjekte edebilir. Uygulama iki şekilde yapılabilir: 1. Akış durdurma enjeksiyonu: Çözücü akışı bir an durdurulup numune enjekte edilir ve tekrar basınç uygulanır. Kolaydır fakat enjeksiyonun tekrarlanabilirliği çok düşüktür. 2. Çözücü akışının durdurulmadığı numune sarımı sistemi: 5-500 µl arasında numune enjeksiyonu yapılabilmektedir. Yüksek numune enjeksiyon tekrarlanabilirliğine sahiptir.
Kolonlar Düzgün iç çaplı paslanmaz çelikten oluşan kolonlar kullanılır. Kolonların çoğu 10-30 cm uzunluğundadır ve düzdür. İç çapları homojen olup, 4-10 mm kalınlığındadır. Gözenekli kolon dolgu malzemelerinin (silis, alumina, sentetik reçine gibi) mikrotanecik boyutu 3-10 µm arasındadır.
Dedeksiyon sistemleri Sıvı kromatografi için ideal bir dedektörde aranan özellikler: 1. Yeterli duyarlılık 2. İyi bir kararlılık ve tekrarlanabilirlik 3. 400 o C a kadar varan sıcaklık aralığı 4. Akış hızından bağımsız kısa cevap zamanı 5. Yüksek güvenilirlik ve kullanım kolaylığı 6. Her türden analite tahmini kolay ve seçici cevap verebilme 7. Numuneyi parçalamamalı 8. Bant genişlemesini azaltmak için minimum iç hacime sahip olmalıdır.
Sıvı kromatografi dedektörlerinin performansları
Elüsyon metotları 1. İzokratik Elüsyon: Tek bir çözücü veya sabit bileşimdeki çözücü karışımı kullanılarak yapılan ayırma 2. Gradient Elüsyon: Polarlıkları birbirinden farklı iki veya daha fazla çözücü sistemlerinin kullanıldığı ve ayırma sırasında bileşimlerinin değiştirildiği ayırma tekniğine %50 su, %50 metanol karışımı Başlangıç karışımı: %60 su, %40 metanol Bir süre sonra metanol konsantrasyonu %8/dakika artırılmıştır.
HPLC analizi sonucu elde edilen standart bir kromatogram
HPLC
GAZ KROMATOGRAFISI (GC) Gaz kromatografide, buhar haline getirilmiş bir numunenin bileşenleri, hareketli bir faz ile bir kolonda tutulan katı durgun faz arasında dağılması sonucu birbirinden ayrılır. Gaz kromatografide numune buharlaştırılır ve kromatografik kolonun girişine enjekte edilir. İnert bir hareketli gaz fazı ile elüsyon yapılır.
Dolgulu ve Kılcal (kapiler) olarak adlandırılan iki tür kolon kullanılır. Günümüzdeki uygulamaların pek çoğunda kılcal kolonlar kullanılmaktadır. Kromatografi kolonlarının boyu, dolgulu tüpler için 0,5-10 m, kapilerler için ise 5-100 m olabilir. Çoğu zaman paslanmaz çelik ve silis, daha seyrek olarak da cam veya teflondan yapılmış olanlar kullanılır. Sabit sıcaklık sağlamakta kullanılan bir etüve sığmaları için genellikle çapları 10-30 cm arasında değişen bobinler şeklinde sarılıdırlar. Kolonlar sıcaklıklarının kontrol edilebilmesi için doğal olarak termostatlı bir fırın içinde tutulurlar.
Uçuculuğu sınırlı olan bazı analitler, kimi zaman daha uçucu maddeler olan türevlerine dönüştürülerek ayrılabilir. Yeterince iyi ayrılmayan uçucu maddeleri aha iyi ayırmak veya dedektör duyarlılığını artırmak için de bazen türevlendirilmeye başvurulabilir. Gaz kromatografide kullanılan ideal dedektörler şu özellikleri taşımalıdır: 1. Yeterli duyarlılık 2. İyi bir kararlılık ve tekrarlanabilirlik 3. Geniş bir doğrusal çalışma aralığı 4. 400 o C a kadar varan sıcaklık aralığı 5. Akış hızından bağımsız kısa cevap zamanı 6. Yüksek güvenilirlik ve kullanım kolaylığı 7. Her türden analite benzer cevap alınmalı 8. Numuneyi parçalamamalı Yalnız hiçbir dedektör bu şartların hepsini birden sağlamaz. En fazla kullanılan dedektörler:
Gaz kromatografisi yöntemi, sadece uçucu bileşiklere uygulanabildiği halde, HPLC yöntemi uygun çözücü, kolon ve dedektör kullanılması durumunda bütün bileşiklere uygulanabilmektedir. LC de yöntem geliştirilmesi, gaz kromatografiye göre daha zordur. Çünkü hareketli sıvı fazdaki numune bileşenleri durgun ve hareketli sıvı fazların her ikisiyle de etkileşir. Gaz kromatografide hareketli faz ideal bir gaz olarak davranır ve ayırma işlemine herhangi bir katkısı olmaz. Gaz kromatografideki ayırmalar, hareketli fazın helyum, azot ya da hidrojen olmasından önemli ölçüde etkilenmez. Bunun aksine, LC de ayırma hareketli fazın asetonitril, hekzan veya dioksan olmasından etkilenir. Özet olarak, iyi bir kromatografik ayırmanın makul sürelerde gerçekleştirilmesi isteniyorsa, çözünen madde, hareketli faz ve durgun fazın polariteleri dikkatlice seçilmelidir.