PE-FOSFAT-SU SİTEMLERİNDE PROTEİN DAĞILIMI E.DİLAN ve U.ÜNDÜZ azi Üniversitesi, Mühendislik-Mimarlık Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 06570, Mepe, Ankara 1.ÖZET Model protein olarak seçilen Bovine serum albumin (BSA), protein fazlar-arası dağılımı, Polietilen glikol 3 350 (%8, a/a)-potasyum fosfat (%16 ve %20, a/a)-0,01m Sodyum klorür içeren sulu iki-faz sistemlerinde ph 7 de ve 20 ºC sıcaklıkta çalışılmıştır. Potasyum fosfat konsantrasyonunun BSA proteininin dağılım katsayısına etkisi incelenmiş ve protein dağılım katsayıları (K) hesaplanmıştır. Anahtar Kelimeler: Saflaştırma; Sulu-iki faz sistemleri; Polietilen likol; Potasyum Fosfat; Bovine Serum Albumin. 2.İRİŞ Biyokimya mühendisliğinin ilk gelişimi fermentasyon teknolojisinin ve endriyel mikrobiyolojideki uygulamalarla başlamıştır. Moleküler biyoloji ve genetik mühenisliğindeki ilerlemeler sonucunda günümüzde değişik biyomoleküller üretilmektedir. Biyomolekül üretiminde ve işlenmesinde saflaştırma çok önemlidir. Bu amaçla filtrasyon, santrifüj, adsorpsiyon, ekstraksiyon, çöktürme ve kurutma gibi çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Bütün ürünlerde özellikle de klinik uygulamalarda kullanılanlarda yüksek saflık ve verim çok önemlidir. Bu yüzden ayırma ve saflaştırma proseslerindeki maliyet, fermentasyon basamağından daha yüksek olabilir. Saflaştırma işlemlerindeki amaç süspansiyon halindeki maddemizden yüksek saflıkta kuru bir ürün elde etmektir. Bu amaçla uyguladığımız sistemin kabul edilebilmesi için şu sorulara cevap vermeliyiz; Elde edilen ürünün değeri ne? Ürünün kalitesi kabul edilebilir mi? Prosesteki akışta ürün hangi basamakta oluşmakta? Ürünün verimini bozacak kirleticiler oluşuyor mu? Ürünün ve kirleticinin tüm fizikokimyasal özelliklerini biliyor muyuz? Diğer ernatif ayırımlarda bizim için ekonomik olan nedir? Bu çalışmada incelenen sulu iki-faz sistemleri ile ekstraksiyon metodu düşük maliyet, büyük ölçekli operesyonlara uygunluk, proses güvenilirliği, enzimatik aktivitelerin muhafazası, sürekli operasyon ve yüksek verim gibi pek çok avantaja sahip olması nedeniyle son yıllarda biyomolekül saflaştırılması alanında pek çok araştırmaya konu olan bir metoddur. Biyoteknoloji alanında sulu iki-faz sistemlerinin üç temel uygulaması vardır: söz konusu biyomolekülün bulunduğu ortamı konsantre etmek, saflaştırma ve biyo-dönüşüm.
Biyokimyasal ayırma ve saflaştırma işlemlerini değişik biyomoleküller için birbirine benzer dört aşamada inceleyebiliriz; 1.Çözünmeyen Safsızlıkların iderilmesi: Çoğunlukla küçük konsantrasyonda veya ürün kalitesini yükseltmek için uygulanır. Santrifüj ve filtrasyon bu bölümün temelini oluşturmaktadır. 2.Ürünlerin İzolasyonu: Bu aşamada istenilen ürün haricinde farklı özelliklere sahip istenmeyen kirleticilerin giderilmesini sağlar. Adsorpsiyon ve ekstraksiyon tipik örneklerdir. 3.Saflaştırma: Ürünü ve aynı kimyasal fonksiyonlara sahip safsızlıkları gidermek için bu üretim teknikleri tercih edilmektedir. Kromotografi ve çöktürme teknikleri bu tekniklerin örnekleri olarak verilebilir. 4.Son Saflaştırma: Ürüne son hali verecek olan bu aşama sistemin en sonunda kullanılır. Bu aşamada kristalleştirme ve kurutma gibi iyileştirmeler uygulanır. Sulu iki-faz sistemleri iki polimerin veya bir polimer ile tuzun belli konsantrasyonlardaki çözeltilerinin karıştırılması sonucunda elde edilir. Sulu iki fazlı sistemlerininde her bir faz, bir bileşence zengindir. Polimer-polimer veya polimer-tuz faz sistemlerindeki en önemli özellik fazların %85-%99 arasında değişen oranlarda su içermesi ve değişik orijinli biyomoleküllerin ve hücresel partiküllerin yapılarında herhangi bir değişiklik olmadan saflaştırılmasına olanak sağlamasıdır [1]. Sulu iki-faz sistemlerinde iyonik olan ve olmayan polimerlerin her ikiside kullanılabilir. İkili faz sistemlerinde dağılım pek çok faktöre bağlıdır. Dağılan biyomoleküller ile her bir faz arasındaki etkileşim sırasında beklenen hidrojen bağları, yük etkileşimleri, van der Waals kuvvetleri, hidrofobik etkileşimler ve sterik etkiler kompleks olaylardır. Partiküllerin faz bileşenleri ile etkileşimi ve dağılımı yüzeye bağımlı bir olaydır [2]. Dağılım bu kadar çok faktöre bağlı olduğundan sulu iki-faz sistemleri ile saflaştırma işleminin ve sonuçlarının açıklanması oldukça zordur. Dağılım tiplerini şu şekilde sınıflandırabiliriz [2]; 1. Boyuta Bağlı Dağılım: Partikülün molekül boyutu veya yüzey alanı etkin faktördür. 2. Elektrokimyasal Dağılım: Fazlar arasındaki elektriksel potansiyel biyomoleküllerin yük durumlarına göre ayırma işleminde değerlendirilir. 3. Hidrofobik Dağılım: Faz sisteminin hidrofobik özellikleri biyomolekülerin hidrofobik olma durumlarına göre ayırma işlemlerinde kullanılır. 4. Biyospesifik İlgi Dağılım: Biyomoleküller üzerindeki belli bölgeler arasındaki ilişkiler ve faz polimerine bağlanan ligandlar ayırma işleminde etkindir. Bunların ışığında dağılım katsayısı (K = c / c), lnk = ln Ko + ln Kel + ln Khfob + lnkbiyo + ln Kboyut (1) şeklinde yazılabilir. Kısmaları sırasıyla elektrokimyasal, hidrofobik, biyospesifik ve boyut etkilerini temsil eder. Ko ise diğer faktörleri içerir [1]. Dağılım katsayısı biyomolekülün fazdaki konsantrasyonunun fazdaki konsantrasyonuna oranıdır. Dağılım davranışını belirleyen diğer bir ifade ayırma derecesi () dir.
Ayırma derecesi () iki faz arasında dağılmış maddenin kütle oranı olarak tanımlanır. Fazların hacim oranı ve K ya bağlıdır. m = (2) m Kütle, konsantrasyon ve hacim cinsinden ifade edilirse aşağıdaki denklem elde edilir. c c V V V = K V = (3) Bu çalışmada Bovine serum albumin (BSA), proteinin polietilen glikol-fosfat-su sistemlerinde fazlar-arası dağılımı çalışılmış ve tuz konsantrasyonunun dağılım katsayısına etkisi incelenmiştir. 3. YÖNTEM Dağılımın gerçekleştiği sulu iki-fazlı sistemleri, 20 C sıcaklıkta, belirli miktarlardaki faz oluşturan polimer stok çözeltisi, BSA stok çözeltisi, tampon çözeltileri ve NaCl stok çözeltisi, 15 cm 3 hacimli deney tüplerinde karıştırıldıktan sonra distile su ile 10g a tamamlanarak oluşturulmuştur. Sistemler vorteks karıştırıcı ile iyice karıştırıldıktan sonra su banyosunda bir gece bekletilmiştir. BSA konsantrasyonunu belirlemek için her bir fazdan belli hacimde alınan çözeltiler, bilinen hacimde distile su ile seyreltilerek spektrofotometrede (HACH Dr/4000 UV- VİS, Colorada, Amerika) 280 nm de absorbansları ölçülmüştür. 4. SONUÇLAR İki farklı sistemde, ph 7 ve 0,1 M NaCl konsantrasyonunda (Sistem 1: PE 3 350 (% 8, a/a ) - Potasyum Fosfat (%16, a/a)-su ve sistem 2: PE 8000 (% 8, a/a) - Potasyum Fosfat (%20, a/a)- su) BSA dağılımı incelenmiştir. Tablo 1 ve Şekil 1 de de görüldüğü gibi K değerleri, sistem 1 ve 2 için, sırayla, 1,28 ve 6,14 olarak belirlenmiştir. değeri ise, sistem 1 ve 2 için, sırayla, 1,48 ve 10,34 olarak hesaplanmıştır. Potasyum fosfat konsantrasyonunun artışı ile BSA dağılım katsayısında artış gözlenmiştir. Tablo 1. Fosfat konsantrasyonun %8 (a/a) PE -fosfat-su sistemlerinde BSA dağılımına etkisi (ph = 7 ve T = 20 C) Potasyum fosfat (%, a/a) K V V 16 1,28 4,63 5,33 1,48 20 6,14 4,02 6,83 10,34
10 8 6 K 4 2 0 10 15 20 25 Potasyum Fosfat (a/a) Şekil 1. Bovine serum albumin dağılım katsayısı (sistem : %8 PE-fosfat-su, ph=7 ve T= 20 C) 10 8 6 4 2 0 10 15 20 25 Potasyum Fosfat (a/a) Şekil 2. Bovine serum albumin ayırma derecesi (sistem : %8 PE-fosfat-su, ph=7 ve T= 20 C) Literatürde [5], PE (1000, 1450)-fosfat-su sistemlerinde, proteinin PE ce zengin fazda yoğunlaştığı rapor edilmiştir. PE un molekül ağırlığı arttırıldığında ise van der Walls etkisi azaldığından dolayı Bovine serum albuminin PE ce zengin faz yerine potasyum fosfatça zengin olan a faza doğru yöneldiği belirlenmiştir. Literatür araştırmaları ile çalışılan sistemin sonuçları paralellik göstermektedir.
5. SEMBOLLER BSA PE c c M K K 0 K boyut K biyo K hfob. K el : Bovine serum albumin : Polietilen glikol : BSA proteinin fazdaki konsantrasyonu : BSA proteinin fazdaki konsantrasyonu : Tuz iyonu konsantrasyonu : Ayırma derecesi : Dağılım katsayısı : Elektrokimyasal potansiyel farkının sıfır olduğu durumdaki dağılım katsayısı : Partikülün molekül boyutu veya yüzey alanına bağlı dağılım katsayısı : Biyomoleküller üzerindeki belli bölgeler arasındaki ilişkilere bağlı dağılımı : Faz sisteminin hidrofobik özelliğine bağlı dağılım katsayısı : Fazlar arasındaki elektriksel potansiyel biyomoleküllerin yük durumlarına bağlı dağılım katsayısı TEŞEKKÜR Bu çalışma, azi Üniversitesi MMF 2001-31 projesi ile desteklenmiştir. 6. KAYNAKLAR 1. Albertsson, P. A., Partition of Cell Particles and Macromolecules, 3 rd edition, John Wiley and Sons, New York, 1986. 2. Zaslavsky, B. V., Miheeva, L. M., Mestechkina, N. M., Shchyukina, L.., Chlenov, M. A., and Rogozhin, S. V., J. Chromatogr., Use of solute partition for comparative charecterization of several aqueous biphasic polymeric systems Journel of Chromotography,vol 202, 63-73, 1980. 3. Bungerberg de jong H.., Colloid Secience, 2, Elsevier, Amsterdam, 1949. 4. Korkmaz, K., Sulu iki-faz sistemlerinde protein dağılımı, Y.Lisans Tezi, azi Üniversitesi, Ankara, 1999. 5. B.Farruggia, B.Nerli,.Pico Study of the Serum Albumine-Polyethyleneglycol Interaction to Predict the Protein Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems Journal, of Chromatography B, Vol 798, 25-33, 2003.