SÜLEYMAN DEMĐREL ÜNĐVERSĐTESĐ

SÜLEYMAN DEMĐREL ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ GAMA IŞINLAMANIN MAKARNALIK BUĞDAY BĐTKĐSĐNDE (Triticum durum Desf.) HAPLOĐD EMBRĐYO ÜRETĐMĐ VE BĐTKĐ REGENERASYONUNA ETKĐSĐ Hasan Necati TURAN Danışman: Prof. Dr. Çiğdem SAVAŞKAN YÜKSEK LĐSANS TEZĐ BĐYOLOJĐ ANABĐLĐM DALI ISPARTA 2007 i

ĐÇĐNDEKĐLER ĐÇĐNDEKĐLER... ii ÖZET... iv ABSTRACT... v TEŞEKKÜR... vi ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ... vii ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ...viii SĐMGELER VE KISALTMALAR DĐZĐNĐ... ix 1. GĐRĐŞ... 1 2. KAYNAK ÖZETLERĐ... 10 3. MATERYAL VE YÖNTEM... 20 3.1. Materyal... 20 3.2. Yöntem... 20 3.2.1. Tohum Nem Oranının Belirlenmesi... 20 3.2.1. Tohum Nem Oranının Artırılması... 21 3.2.2. Örneklerin Hazırlanması... 22 3.2.2.1. Lethalite Doz(LD 50 ) Çalışması Đçin Örnek Hazırlanması... 22 3.2.2.2. Doku Kültürü Çalışmaları Đçin Örnek Hazırlanması... 23 3.2.3. Bitkilerin Yetiştirilmesi... 23 3.2.3.1. LD 50 Çalışması Đçin Örneklerin Ekimi... 23 3.2.3.2. Doku Kültürü Çalışması Đçin Örneklerin Ekimi... 25 3.2.4. Melezleme Đşleminin Yapılması... 25 3.2.5. 2,4-D Çözeltisinin Hazırlanması... 26 3.2.6. 2,4-D Çözeltisinin Bitkiye Uygulanması... 27 3.2.7. Embriyo Kültürü Çalışması... 29 3.2.8. Đstatistik Çalışmaları... 31 4. BULGULAR... 32 4.1. Berkmen 469 Çeşidine Ait Tohumların Farklı Gama Işın Dozlarıyla Işınlanması Sonucu Elde Edilen Bulgular... 32 4.2. Berkmen 469 x Mısır Melezlemesi Sonucu Elde Edilen Bulgular... 42 4.2.1. Tohum Kabuğu Sayısı... 42 4.2.2. Embriyo Sayısı... 42 4.2.3. Haploid Bitki Regenerasyonu... 43 Sayfa ii

5. TARTIŞMA VE SONUÇ... 44 6. KAYNAKLAR... 50 ÖZGEÇMĐŞ... 56 iii

ÖZET Yüksek Lisans Tezi GAMA IŞINLAMANIN MAKARNALIK BUĞDAY BĐTKĐSĐNDE (Triticum durum Desf.) HAPLOĐD EMBRĐYO ÜRETĐMĐ VE BĐTKĐ REGENERASYONUNA ETKĐSĐ Hasan Necati TURAN Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Juri: Prof. Dr. Çiğdem SAVAŞKAN(Danışman) Prof. Dr. Hasan ÖZÇELĐK Doç. Dr. Đskender AKKURT Bu çalışmada Triticum durum Def. Berkmen 469 doubled haploid (DH) makarnalık buğday çeşidi gama ışınlaması ve doku kültürü çakışmasında kullanılmıştır. Işınlamadan önce kuru ve dorment haldeki DH Berkmen 469 tohumlarının nem miktarı % 5.491 olarak tespit edildi ve bu değer % 9.750 ye yükseltildi. Daha sonra tohumlar 137 Cs kaynağı kullanılarak 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300 ve 350 Gray gama ışın dozları kullanılarak ışınlandı. Farklı gama ışını dozlarının M1 generasyonundan elde edilen bitkilerde fide boyu kök, uzunluğu ve yaşayan bitki sayısı karakterleri üzerine etkileri belirlendi. Yapılan varyans analiz çalışmasına göre artan doz miktarlarına bağlı olarak ölçümü yapılan karakterlerde önemli farklılıklar bulunmuştur (P<0.01). DH Berkmen çeşidine ait tohumlar doku kültürü çalışması için 0, 150 ve 250 Gray gama doz miktarlarıyla ışınlandı. Farklı gama ışın dozlarının tohum kabuğu, embriyo ve endosperm oluşumuna etkisini belirlemek için bitkiler sera koşullarında yetiştirildi ve mısır ile melezlendi. Melezleme sonrasında embriyo gelişimini desteklemek için başak ve başakçıklara 2,4-D çözeltisi uygulandı. Doubled haploid bitki elde etmek için oluşan haploid embriyolar MS kültür ortamına alındı. Oluşan tohum kabuğu, embriyo ve haploid bitki sayısı belirlendi. Bu çalışmada 0, 150 ve 250 Gray gama doz miktarlarıyla ışınlana tohumlarda sırasıyla 257, 89 ve 69 tohum kabuğu elde edilmiştir. Yapılan istatistik çalışmasında farklı dozlarda ışınlanan gurupların meydana getirdiği tohum kabuğu arasındaki fark P<0.01 düzeyinde önemli bulunmuştur. Anahtar Kelimeler : Triticum durum, ışınlama, gama ışını, haploidizasyon, 2-4,D 2007, 56 sayfa iv

ABSTRACT M.Sc. Thesis THE EFFECT OF GAMMA IRRADIATION DOSES ON HAPLOID EMBRIYO PRODUCTION AND PLAND REGENERATION IN DURUM WHEAT (Triticum durum DESF.) Hasan Necati TURAN Süleyman Demirel University Graduate School of Applied and Natural Sciences Biology Department Thesis Commite: Prof. Dr. Çiğdem SAVAŞKAN (Supervisor) Prof. Dr. Hasan ÖZÇELĐK Assoc. Prof. Đskender AKKURT In this study, doubled haploid (DH) durum wheat cultivar (Triticum durum cv. Berkmen 469) was used for gamma irradiation and plant tissue culture. Moisture content of dry dormant seeds of DH Berkmen 469 (5.491 %) were increased to 9.750 % and were irradiated with seven different gamma rays doses (0, 50, 10, 150, 200, 250, 300, 350) using a 137 Cs source. In M 1 generation; germination rate, seedling height, and root lenght were determinated in a greenhouse. Results were evaluated with variance analysis and found that the degreasing according to the doses in all parameters were significantly different (P<0.01). DH seed of the wheat variety Berkmen 469 were irradiated with 0, 150, and 250 Gray gamma ray doses. After these plants flovering crossed with maize in order to search different doses effect on the formation of caryopsis, embryo and endosperm were evaluated. In spikes and spikelets, 2,4-D was injected for supportation after pollination and MS media component was used for haploid embryos. In wide crosses significant differences were found between different gamma ray doses. In this treatment 257, 89 and 69 caryopsis were taken in control group and groups irradiated with 150 and 250 Gray doses gamma rays, subsequently. There were significant differences between groups which optained the caryopsis (P< 0.01). Key Words: Triticum durum, irradiation, gamma rays, haploidization, caryopsis, 2-4,D 2007, 56 pages v

TEŞEKKÜR Tez konumun belirlenmesi ve çalışmalarımın yürütülmesinde katkıda bulunan, ilgi, destek ve fikirleriyle çalışmalarıma yön veren Danışman Hocam Sayın Prof. Dr. Çiğdem SAVAŞKAN a teşekkür etmeyi bir borç bilirim. Çalışmalarım sırasında destek ve yardımlarını gördüğüm Biyoloji Bölümü Araştırma Görevlileri Yasemin COŞKUN ve R. Ezgi DURAN a teşekkür ederim 1272-YL- 06 No lu proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı na teşekkür ederim. Hasan Necati TURAN ISPARTA, 2007 vi

ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ Şekil 3.1. Desikasyon sisteminin genel görüntüsü... 21 Şekil 3.2. 137 Cs kaynağı... 22 Şekil 3.3. LD 50 değerinin tespiti için kullanılan farklı dozlarda ışınlanmış bitkiler... 23 Şekil 3.4. Bitkilerin fide boyu ve kök uzunluklarının ölçümü... 24 Şekil 3.5. Farklı dozlarda ışınlanmış bitkilerin fide boyu ve kök uzunlukları... 24 Şekil 3.6. Melezlemede kullanılan buğday ve mısır bitkileri... 25 Şekil 3.7. Kınından tamamen çıkmış başak, başaktaki kılçıkların alınması ve kasturasyona hazır başak... 26 Şekil 3.8. Kasturasyon (anterlerin alınması) işlemi, melezleme zarfı ve etiketleme, mısır polenlerinin toplanması ve melezleme işlemi... 27 Şekil 3.9. Đğnenin ucu ile başağın hemen altından gövdeye delik açılması ve üst internoda, internodun alt kısmından başağa doğru 2,4-D çözeltisinin uygulanması. 28 Şekil 3.10. Enjekte edilen kısımların vazelin ile kapatılması ve başakçıkların her birine birer damla oksin çözeltisinin damlatılması... 28 Şekil 3.11. Embriyo gelişme olasılığı olan tohumların kontrol edilmesi... 29 Şekil 4.1. Berkmen 469 çeşidinden alınan haploid embriyo... 43 vii

ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ Çizelge 3.1. Haploid embriyoların gelişimi için hazırlanan MS kültür ortamı... 30 Çizelge 4. 1. Çeşitli Gama radyasyon dozlarının Berkmen 469 dan elde edilen DH bitkilerde fide boyuna etkisi...hata! Yer işareti tanımlanmamış. Çizelge 4.2. Fide boyu karakterinin varyans analiz tablosuhata! Yer işareti tanımlanmamış. Çizelge 4.3. Çeşitli Gama radyasyon dozlarının Berkmen 469 dan elde edilen DH bitkilerde kök uzunluğuna etkisi...hata! Yer işareti tanımlanmamış. Çizelge 4.4. Kök uzunluğu karakterinin varyans analiz tablosuhata! Yer işareti tanımlanmamış. Çizelge 4.5. Çeşitli Gama radyasyon dozlarının Berkmen 469 dan elde edilen DH bitkilerde yaşayan bitki sayısına etkisi...hata! Yer işareti tanımlanmamış. Çizelge 4.6. Çimlenen bitki sayısı karakterinin varyans analiz tablosuhata! Yer işareti tanımlanma Çizelge 4.7. Fide boyu, kök uzunluğu ve uygulanan gama radyasyon dozlarının korelasyon tablosu...hata! Yer işareti tanımlanmamış. Çizelge 4.8. Mutagenik radyasyon kullanılarak DH Berkmen 469 bitkilerinde cinsler arası melezleme ile embriyo kurtarılmasıhata! Yer işareti tanımlanmamış. Çizelge 4.9. Doz miktarındaki artışa bağlı olarak yaşayan bitki sayısının değişim grafiği... 41 Çizelge 4.10. Doz miktarındaki artışa bağlı olarak fide boyu ve kök uzunluğu karakterlerinin değişim grafiği... 41 viii

SĐMGELER VE KISALTMALAR DĐZĐNĐ Cobalt-60 ( 60 Co) ve Sezyum-137 ( 137 Cs): Radyobiyolojik çalışmalarda kullanılan ana gama ışın kaynaklarıdır. Botanik ve kalıtsal çalışmalarda kullanılmak üzere büyük boyutlu gama kaynakları seralarda, tarlalarda veya zırhlı odalarda kontrollü olarak kullanılmaktadır. Doubled haploid: Haploid bitki üretme teknikleriyle n sayıda kromozom içeren bitkilerin generatif organlarının oluşmasından önce, kasturasyon ve uygulama süresi belli kimyasal maddelerle kromazom sayısını iki katına çıkarma işlemidir. Gray ( Gy): Işınlanan 1 kg lık maddeye 1 joule enerji veren radyasyon birimidir. Tüm radyasyon tipleriyle kullanılabilir. Gama ışını: Elektromanyetik özelliğe sahip olan iyonlaştırıcı radyasyon tipidir. Foton adı verilen enerji paketlerinden oluşur ve uzayda dalga hareketiyle yayılır. MS ( Murashige ve Skoog): Doku kültürü çalışmaları için geliştirilmiş en eski ve temel besin ortamıdır. Kasturasyon: Çiçekten anterlerin alınması işlemidir. 2,4-D (2,4 diklora fenoksi asetik asit): Bitkinin kök gelişimi ve embriyo oluşumunu destekleyen yapay bir oksin çeşididir. LD 50 : % 50 ölüme neden olan doz miktarı ix

1. GĐRĐŞ Doğanın temel ve evrensel özelliklerinden birisi değişimdir. Gerçekte tam anlamıyla birbirine benzeyen iki bireyi doğada bulmak imkansızdır. Genler canlıda kalıtsal özelliklerin nesilden nesile geçişini sağlamasının yanında canlılar arasındaki sonsuz çeşitliliği de sağlamaktadır. Genler hücrede çekirdek denen organel içinde ve kromozomlar üzerinde bulunurlar. Bir canlının tüm hücrelerindeki genetik bilgi aynı olmasına rağmen doğada ender olarak genetik bilgide değişiklik olabilir. Bununla beraber çeşitli mutagenler bitki kromozomlarının yapı ya da genlerin fiziksel ve kimyasal yapısında ani olarak kalıtsal değişiklikler yaparak bitkilere yeni özellikler kazandırır. Doğal mutasyon frekansını sentetik olarak mutagenlerle artırılarak daha geniş genetik varyasyon yaratmak ve bu genetik varyasyondan arzulanan özelliklere sahip genotiplerin seleksiyonu ile üstün çeşitleri geliştirmek mümkün olmaktadır. Kullanılan mutagenin çeşidine uygulanan yöntemdeki farklılıklara göre mutant bitkilerde yüksek fizyolojik zarar ve düşük mutasyon frekansı ortaya çıkabileceği gibi, zaman zaman düşük fizyolojik zarar ve yüksek mutasyon frekansı da ortaya çıkabilir. Örneğin radyasyon dozunun artması fizyolojik zararların miktarını da artırır ve bitkide %100 e kadar ulaşan ölüm (LD 100 ) görülür. Mutasyon uygulamalarında düşük fizyolojik zarar ve yüksek genetik değişim elde etmek gerekir (Konzak vd., 1972). Bunun için etkili doz veya büyümeyi %50 azaltan doz (LD 50 ) kavramı ortaya atılmıştır. Bu değer her hangi bir morfolojik özellik için; örneğin fide boyunu kontrol grubuna göre %50 azaltan mutagen dozudur. Bu değer her bitki türü için farklı olup mutasyon çalışmalarına başlamadan belirlenmeli ve tohumlar bu değerin %15-20 alt ve üst sınır değerleriyle ışınlanmalıdır. M 1 generasyonunda görülen fizyolojik zarar yada LD 50 değeri fide boyu, kök uzunluğu, tarla koşullarında çıkış veya laboratuar koşullarında çimlenme, tarla koşullarında hayatta kalma gibi özelliklere bakılarak belirlenir (Sağel vd., 2004). Canlılarda mutasyona neden olan çeşitli etmenlerden biri de radyasyondur. Isı ve ışık güneşten gelen radyasyonun doğal formudur. Bunların yanında mikrodalgalar, radyo dalgaları, X ışınları, gama ışınları gibi göremediğimiz ve hissedemediğimiz 1

radyasyon tipleri de vardır. Radyasyon iyonlaştırıcı ve iyonlaştırıcı olmayan radyasyon olmak üzere ikiye ayrılır. Bu çalışmada kullanılan gama radyasyon ise elektromanyetik iyonlaştırıcı radyasyon tipindedir. Bu radyasyon tiplerinin her birinin genel özelliği enerjilerini salıvermeleridir. Böylece çarptığı atom yada molekülde iyonlaşma yada uyarılmaya neden olur. Đyonlaştırıcı radyasyonların canlı sistemlere etki edebilmesi için bunların mutlaka absorbe edilmesi gerekir. Bu absorbe edilen enerji dokuda yayılarak molekül ve iyonların yapısındaki bağları etkiler ve bu bağları koparır. Böylece yeni bağların oluşmasına neden olur. Eğer radyasyon canlı dokuda DNA e etki ederse bu molekülde kopma veya kırılmalara neden olur böylece mutasyon meydana getirilir. Radyasyon yüksek enerjiye sahiptir. Her yüksek enerji ışınlanması atomlara çarparak elektronların serbest kalmasına neden olur. Serbest kalan elektronlar diğer atomlara çarparak daha fazla elektronun serbest kalmasına neden olur. Böylece ortamda daha fazla iyon oluşur. Eğer radyasyon DNA üzerinde doğrudan iyonlaşma meydana getirirse buna direkt etki denir. Bazı durumlarda ise radyasyon organizmada su gibi maddeleri etkileyerek radikaller meydana getirilir. Bu radikaller daha sonra DNA ile etkileşmek suretiyle iyonlaşma meydana getirir. Buna da indirekt etki denir. Bir bitki hücresinin mutagenlere verdiği cevap birçok fiziksel, kimyasal ve biyolojik faktörler tarafından belirlenir. Bu faktörler mutagenin etkisini değiştirir ve kesin sonuçlar almak için bunlar mutlaka kontrol edilmelidir. Kontrol edilebilen faktörlerden en önemlisi materyalin nem miktarıdır. Çünkü nem miktarı radyasyonun DNA üzerine etkisiyle yakından ilgilidir (Srivastava vd., 1988). Radyasyon içinden seçtiği ortamda rasgele iyonlaşma ve uyarılma olaylarına yol açar. Canlı madde ışınlandığında yaklaşık olarak %70-90 oranında su içerdiğinden radyasyon enerjisinin büyük bir kısmı su molekülleri tarafından absorbe edilir. Bu nedenle radyasyonun su moleküllerini ne şekilde etkilediğinin bilinmesi radyobiyolojik açıdan çok önemlidir. Đşte bu sebepten dolayı ışınlanmadan önce tohum nem miktarının tespiti ve ayarlanması gerekmektedir (Bacq and Alexander, 1966). 2

Eğer tek başına suyu ışınlanırsa su molekülleri iyonlaşır ve pozitif yüklü su iyonu ile hızlı bir serbest elektron oluşur. Bu serbest elektron su içerisinde başka bir su molekülü tarafından yakalanana kadar yol alır ve su molekülü ile birleşerek onu negatif yüklü hale getirir. Bu reaksiyon sonucu oluşan su molekülü kararlı değildir. Her biri parçalanarak serbest radikaller ve bir iyon oluşur. Gerek pirimer reaksiyonlar sonucu oluşan OH o, H o o ve HO 2 radikalleri, gerekse sekonder reaksiyonlar sonucu oluşan bioradikaller daha sonra biyolojik açıdan önemli olan moleküllerle reaksiyona girerek radyobiyolojik tahribata yol açar. Burada iyonlaşma önce başka bir molekül içinde olmakta daha sonra hedef moleküle aktarılmaktadır. Hücrede radyasyonun etkisi altındaki en önemli hedef molekül DNA' dır. Radyasyonun bu şekildeki etkisine indirekt etki dendiğini daha önce belirtmiştik ve mutasyona neden olan radyasyon etkisinin büyük bir kısmı bu şekilde meydana gelmektedir (Anonim, 1977). Bitkilerde mutasyon meydan getirmek için en çok kullanılan radyasyon çeşitleri X ve Gama ışınlarıdır. Bu ışınlar birbirlerine çok benzemekte ancak meydana geliş şekilleri farklıdır. Bu çalışmada kullanılan gama ışını, radyoaktif bir çekirdeğin kararlı hale gelmesi sırasında açığa çıkan fazla enerjinin atom çekirdeğinden dışarıya atılması sonucunda oluşmaktadır. Bitkilerde mutasyon meydana getirmek için en çok kullanılan gama ışın kaynağı Cobalt-60 ( 60 Co) ve Caesium-137 ( 137 Cs) dir. Fiziksel mutagenler bitki ıslahında yaygın alarak kullanılmaktadır. Çünkü bu mutagenlerle meydana getirilen mutasyonlar canlıda doğal olarak meydana gelen mutasyonlara çok benzemektedir (Anonim, 1977). Bitkilerde yüksek, verim kısa boyluluk, hastalıklara karşı dirençlilik, ekencilik gibi karakterlerin kazandırılmasında fiziksel mutagenler yaygın olarak kullanılmaktadır. Mutasyon meydana getirme deneylerinde tohum en çok kullanılan materyaldir. Tohum ıslatılabilen, kurutulabilen, dondurulabilen ve ısıtılabilen bir materyaldir ve sahip olduğu bu özelliklerden dolayı normalde canlı moleküllerin dayanamayacağı fiziksel koşullarda bile ışınlanabilir. Oksijen yokluğunda yada diğer gazların yüksek basınçta bulunduğu koşullarda uzun süre canlılığını koruyabilir. Kurak koşullarda 3

tohum biyolojik açıdan neredeyse cansızdır ve bu koşullarda tehlikeli çevresel etkilerden çok az zarar görür. Tohumlar kuru olduğu zaman biyolojik aktivitesi minimum düzeyde olduğundan radyasyonun zararlı etkisi çok fazla görülmez. Uygun genetik etkiyi meydana getirebilmek için diğer bitki kısımlarından daha fazla doz miktarına gereksinim duyar (Anonim, 1977; Şehirali ve Özgen, 1988). Yapay olarak oluşturulacak mutasyonlardan yararlanma fikri ilk olarak 1901 yılında Hugo De Varies tarafından açıklanmıştır. 1922 yılında Đtalyan Alberto Pirovano tarafından X-ışınları ve ultraviyole ışınları kullanılarak bitkinin genetiğinin değiştirilmesi çalışmalarına başlanmıştır. Daha sora 1927 yılında Müller ve 1928 yılında Stadler arpa ve mısırda X-ışınları kullanılarak mutasyonların artırılabileceğini açıklamışlardır. Stadler in açıklamasından sonra birçok bilim adamı X-ışınlarıyla mutasyon elde etmek için çalışmıştır. 1950 yılına kadar mutasyon tekniği ile elde edilen mutant çeşit sayısı 1 iken bu sayı 1960 yılında 15'e ve 1975 yılında 133'e ulaşmıştır. Bu güne kadar 2317 tescilli mutant çeşit geliştirildiği ve bunların 919 u gama ışını kullanılarak meydana getirildiği bilinmektedir. Çeşitli mutagenler kullanılarak elde edilen mutant çeşitlerin 1096 sını tahıllar oluşturmaktadır. Tahıllar içinde çeltik 415 adet mutant çeşit ile ilk sırada yer alırken, bunu 247 adet ile arpa, 223 adet ile buğday, 68 adet ile mısır, 22 adet ile yulaf ve 58 adet ile diğer tahıllar takip etmektedir (Şehirali ve Özgen, 1988). Mutasyon tekniği kullanılarak elde edilen mutant buğday çeşitlerinin 25 ini makarnalık buğday çeşitleri oluşturmaktadır. Ülkemizde ise sadece 5 çeşit tescilli mutant bitki bulunmaktadır. Bu mutant çeşitlerin 2 tanesi soya fasulyesi, 2 tanesi tütün ve 1 tanesi de arpa mutant çeşidi olup, bunların hepsi gama ışınlamayla elde edilmiştir (Başer vd., 2005). Buğdayda mutasyon ıslahı çalışmalarının önemli konularından biri de kısa boyluluktur. Tahıllarda büyük zararlara yol açan yatma sorununun giderilmesi için öncelikle bitki boyunun kısaltılması ve sap sağlamlığının arttırılması gerekmektedir. Bu konuda fiziksel mutagenlerden yararlanılmış ve buğdayda kısa boylu Regini Casteldelmante, Castelporziona, Castelfusona gibi mutant çeşitler elde edilmiştir. Özellikle buğdayda birçok varyete uzun gövde karakterine sahiptir. Başak tane ile dolduğunda yatmaya neden olan başlıca etmen uzun boyluluktur (McClung vd., 4

1986). Yatma gövdenin eğilmesi ya da kırılması olarak tanımlanır ve buğdayda verim kaybına neden olur. Ayrıca makineli hasatın yapılmasını da engeller. Kısa gövde bitki boyunu azaltan kısa boyluluk genlerinin etkisiyle elde edilmektedir. Buğday boyunu azaltan genler Rht sembolüyle gösterilmektedir ve bunlara Norin genleri denir. Rht taşıyan bitkilerde kısa boyluluk bitkinin internodlarında azalma sonucunda ortaya çıkar ve bunun sonucunda ortalama bitki buyu azalır (Kalia ve Sing, 1993). Đnternodlardaki bu azalma hücre sayısı, hücre boyu veya her iki karakterin de azalmasıyla ortaya çıkar. Bu güne kadar buğdayda 16 çeşit kısa boyluluk geni tespit edilmiştir. Kısa boyluluk genine sahip buğday varyeteleri dışardan gibberellik asit uygulamasına duyarsızdır (Gale and Yossafian, 1985; Börner ve Mettin, 1986). Rht 1 ve Rht 2 'nin hücre hacmi üzerine etkisine ek olarak Rht 2' 'nin hormon metabolizması üzerine pleiotropik etkisi vardır (Mathias ve Atkinson, 1988). Kısa boyluluğun buğdayda primer kaynağı Rht 1 ve Rht 2 genleridir ve bunlar sırasıyla 4A ve 4D kromozomu üzerinde bulunur (Poelman ve Sleeper, 1995). Rht 1 ve Rht 2 buğday ıslahında en çok kullanılan kısa boyluluk genleridir. Çünkü bunlar ürün verimi üzerine arttırıcı etkiye sahiptir. Kısa ya da yarı kısa boylu buğdaylarda yapılan çalışmalarda şu bulgulara ulaşılmıştır; Rht geninin etkisiyle uzunluğun azalmasına ek olarak kardeşlenme sayısı ve başak başına düşen dane sayısı arttığı için verim artmıştır. Ancak yapılan analizlerde dane boyu ve protein içeriğinin azaldığı görülmüştür (Poelman ve Sleeper, 1995). Genellikle bitki boyu ile tane boyunun büyüklüğü pozitif korelasyon gösterir. Bu sebepten dolayı dane boyu ve protein içeriği azalmadan yatmaya dayanıklı kısa ya da yarı kısa boylu genotipler üretmek gerekmektedir. Somatik hücrelerinde n sayıda kromozoma sahip bitkilere haploid bitkiler adı verilir (Pierik, 1987; Şehirali ve Özgen, 1988). Haploid bitkilerde kök, yaprak, dal ve bazı durumlarda meyve vererek normal gelişim gösterirler. Ancak haploid bitkilerin doku ve organlarını oluşturan hücreler diploidlere göre biraz daha küçük olduklarından haploid bireyler morfolojik olarak diploid bireylerin biraz daha küçülmüş halidir (Bilge, 1982; Emiroğlu, ve Gürel 1993). Haploid bitkilerin boyları daha kısa, yaprakları dar ve küçük ve çiçekleri polen oluşturmadığı için kısırdır yani tohum meydana getiremezler ( Abak, 1993; Çağlar ve Abak, 1999). Bu nedenle haploidlerin 5

ıslah çalışmalarında kullanılabilmeleri için kromozomlarının katlanarak doubled habloid hale getirilmesi gerekmektedir. Haploid bitkiler ve bu haploidlerin çeşitli yöntemler kullanılarak double haploid bitkiler elde edilmesi bitki genetikçilerine önemli avantajlar sağlamıştır. Doğal haploid uzun süreden beri biliniyor olmasına rağmen haploid bitkilerin çeşitli yollardan doğada kendiliğinden ortaya çıkma sıklığı türlere hatta tür içindeki genotiplere bağlı olarak değişmekte olup genelde %0,1-0,001 gibi çok düşük seviyede kalmakta bir çok türde ise doğal haploid oluşumuna hiç rastlanılmamaktadır (Pochard ve Dumas de Vaulks, 1979). Bu nedenle doğada kendiliğinden ortaya çıkan haploidler ıslah programlarında kullanılamamıştır. Ancak araştırmacılar bu oranı arttırmak için çeşitli uygulamaların arayışı içinde olmuşlardır (Pierik, 1989; Emiroğlu ve Gürel, 1993). 1970'li yıllardan itibaren anter kültürü ile döllenmemiş ovül ve ovaryum kültürü ümit verici teknikler olarak birçok bitkide haploitlerin elde edilmesine olanak sağlamıştır. Đn vitro veya in situ uyartılı parthenogenesisde embriyolar yumurta hücresinden veya embriyo kesesindeki diğer hücrelerden (sinergit, antipot hücreleri) birinin bölünerek haploid bir embriyo oluşturmasıyla yada anterlerin veya polenlerin doğrudan in vitro kültüre alınması ile oluşmaktadır (Sneep, 1998). Haploidlerin düzenli ve yüksek oranda elde edilmesi için değişik araştırıcılar tarafından birçok bitkide denenen yöntemleri iki grupta toplamak mümkündür (Hosemans ve Bossoutrot, 1983). 1. Đn situ haploid emdriyo uyartımı: Bu uyartımı teşvik amacıyla kullanılan yöntemler şöyle sıralanabilir ( Wenzel, 1985; Pierik, 1989; Sarı ve ark., 1992; Khush ve Virmani, 1996): 1) Uzak akrabalar arası melezleme 2) Melezlemenin geciktirilmesi 3) Işınlanmış polenlerle melezleme 6

4) Değişik kimyasalların uygulanması 5) Sıcaklık şokları 6) X, UV, gama ışınlarının uygulanması 2. Đn vitro dişi veya erkek gamet kültürleri (anter-mikrospor veya ovul-ovaryum kültürleri): Đlk kez Cuha ve Maheswari tarafından Datura innoxia Mill. bitkisinde 1964 yılında in vitro anter kültürü yoluyla düzenli ve yüksek oranda haploid embriyolar ve bitkiler elde edilmesi ıslahçılar ve doku kültürü çalışan bilim adamları arasında heyecanla karşılanmıştır (Nitch, 1981). Kısa sürede Nitsch ve arkadaşları tarafından geliştirilen bu teknik Nicotiana türlerinde başarıyla uygulanmıştır. Bu güne kadar yaklaşık 300'e yakın türde in vitro anter kültür tekniği başarıyla uygulanmıştır. Günümüzde bu teknik buğday, arpa, çeltik gibi tahıllarda başarıyla uygulanmaktadır (Wenzel, 1985; Kuckuck vd., 1991). Bu tekniklerden anter kültürü tahıllarda haploid ve doubled haploid bitki üretmek için yaygın olarak kullanılmaktadır (Savaşkan vd., 1997). Ancak bu teknikte albino bitki probleminin olması, yeşil bitkilerde zayıf kök gelişimi oranının yüksek olması ve yoğun laboratuar çalışması nedeniyle cinsler arası hibridizasyon tekniğinin haploid bitki üretiminde daha kullanışlı olabileceği belirtilmektedir (Baum vd., 1992). Cinsler arası melezleme haploid bitki elde etmek için geliştirilen ve son zamanlarda buğdayda kullanılan en uygun yöntem olarak kabul edilmektedir. Ekmeklik buğdaya (Triticum aestivum L.) göre daha az uyum göstermekle birlikte makarnalık buğdayda (Triticum durum Desf.) doubled haploid bitki üretiminde bu yöntem kullanılmaktadır (Snape, 1998; Knox vd., 2000). Bu yöntem, buğday yumurta hücresinin arpa, mısır, darı gibi türler ile melezlemesi ve zigot meydana getirdikten sonra polen hücrelerine ait kromozomların eliminasyonu esasına dayanır. Buğday x mısır melezlemesinde eliminesyon mekanizması, zigotun birinci ve ikinci hücre bölünmesinin mitoz safhasında buğday yumurta hücrelerinin sentezlediği iğ ipliklerini oluşturan mikrotüpçüklerin yapı proteinlerine mısır kromozomlarının sentromer bölgelerinin uyum gösterememesidir (Suenege ve Nakajimi, 1989). Haploid embriyolar, embriyo 7

kültür ortamında bitki regenerasyonunu meydana getirebilir ve n sayıda kromozomları kök ucu meristem hücrelerinde kontrol edilebilir (Baum vd. 1992; Laurie ve Bennett, 1998). Cinsler arası tozlama tekniği ile eski çeşitlerimizin yenilenmesi ve lokal populasyonların homozigot olarak belirlenmesi mümkündür. Anadolu bir çok kültür bitkisinde olduğu gibi tetraploid (makarnalık) buğdayda da gen merkezi olarak kabul edilmiştir ve bu zenginlik şimdiye kadar tarımda kullanıldığı gibi bundan sonrada korunarak kullanılmaya devam edilmelidir. Porceddu vd. (1988) yerli genotiplerin eski veya eskimiş ticari çeşitlerin yenilenerek, yeniden kullanılmasıyla doğal kaynakların içerisinde bulunan potansiyeli yeni germplazmlar olarak ekonomiye kazandırmanın mümkün olabileceğini, bununda biyoteknolojik yöntemle (cinsler arası melezleme) daha kısa sürede ve daha ucuz gerçekleşebileceğini belirtmiştir (Verma vd., 1999). Doubled haploid bitki üretmek için büyüme koşulları, polen kaynakları, bitkileri yetiştirme yöntemleri ve buğday genotipleri önemli faktörler olmasına rağmen kullanılan kimyasal maddenin çeşit ve konsantrasyonunun en önemli faktör olduğu saptanmıştır (Knox vd. 2000). Sentetik bir oksin çeşidi olan 2,4- Diklorafenoksi asetik asit (2,4-D) buğday x mısır melezlemelerinde embriyo gelişimini sağlamak için günümüzde yaygın bir şekilde kullanılmaktadır (Wedzony ve van Lammeren, 1996; Campbell vd., 1998). Araştırıcıların arasındaki genel ortak görüş ise, haploid embriyo oluşumunda oksinlerin uygulanmasına ihtiyaç duyulduğu ve melezleme sonrasında oksin uygulamasının büyük avantaj sağladığı yönündedir (Prasad, 1997). Buğday x mısır melezlemesinde bir diğer önemli faktör haploid embriyoların transfer edildiği besin ortamıdır. Embriyo kültürü için yaygın olarak MS (Murashige ve Skoog) kültür ortamı kullanılmaktadır. MS ortamı Murashige ve Skoog tarafından tütün için geliştirilmiş yüksek tuz içerikli bir ortamdır. Özellikle düşük yoğunlularda, birçok bitki türündeki köklendirme çalışmalarında başarıyla kullanılmaktadır. Bir başka kültür ortamı ise B5 kültür ortamıdır. Gamborg ve arkadaşlarının 1968 yılında soya kallus kültürleri için geliştirdiği bu ortam nitrat azotu yüksek bir ortamdır. 8

Bugüne kadar yapılan çalışmalar makarnalık buğdayda, buğday çiçeğinin mısır polenleri ile tozlanması ile elde edilen haploid embriyo oranının % 14-15 olduğunu göstermiştir (Amrani vd. 1993). Makarnalık buğday çeşitlerimizde ise bu oran % 13.7 olmuştur (Savaşkan vd. 1997). Bazı makarnalılık buğday çeşitlerinde ( Triticum durum Desf.) haploid bitki üretim kapasitesi daha önce tespit edilmiştir. Bu çalışmada ise Berkman 469 tohumlarına bazı gama radyasyonu dozları uygulanarak cinsler arası melezleme yoluyla haploid bitki üretim kapasitesi araştırılacaktır. Makarnalık buğdayda melezleme ile kazanılan kısa ya da yarı kısa boylu çeşitlerin genotipinde Norin genleri ( cücelik genleri) vardır. Bu genler dane veriminde artışa neden olmakla birlikte dane büyüklüğü protein oranı gibi kalitatif karakterlerde düşmeye neden olmaktadır. Bazı karakterlerde sorunun mutasyon tekniği ile çözüme kavuşması mümkündür. Bu karakterlerden biri de yatma ve dolayısıyla verimde düşüklüğe neden olan, özellikle yerli çeşitlerde görülen uzun boylu olma özelliğidir. Norin genlerinin ( Rht 1, Rht 2 ) etkisini ortadan kaldırmak için melezleme yapmaya gerek kalmadan mutasyon tekniği ile genotipte değişiklikler meydana getirerek kısa boylu genotipler meydana getirilebilir. Bu çalışma da bir yerel makarnalık buğday çeşidi olan Triticum durum Desf. Berkmen 469 dan üretilmiş doubled haploid (DH-1) genotipi tohumlarına; 1) gama radyasyon dozları uygulanarak fidelerde bazı biyodozimetrik parametreler değerlendirilmiştir. 2) 150 ve 250 Gray dozlarından elde edilen M 1 bitkilerinde cinsler arası melezleme yoluyla haploid embriyo üretim kapasitesi araştırılmıştır. 9

2. KAYNAK ÖZETLERĐ Singh ve Singh (1975), yaptıkları çalışmada bir arpa çeşidi olan Amber varyetesine ait tohumları kullanmışlardır. Bu tohumların nem oranı % 11.2 den sırasıyla % 7.5, 6, 5,5, 4,5, 3,5 ve 3 oranlarında değiştirilerek 60 Co kaynağıyla ışınlamışlardır. Işınlamada kullanılan doz miktarı 150 Gray dir. Işınlamadan 48 saat sonra tohumlar ekilmiş ve tohumda nem miktarının radyobiyolojik etkisini belirlemek için çimlenen bitki sayısı, fide boyu, polen ve yumurta kısırlığı, tarla koşullarında hayatta kalma ve mitoz kromozom anormallikleri ölçülmüştür. Nem miktarı % 11.2 den % 3 e azaldığında ışınlanan tohumlarda çimlenme % 76.8 den % 60.3 e düşmüştür. Tarla koşullarında hayta kalma ise nem oranındaki artışa bağlı olarak % 72.5 den % 49.3 e düşmüştür. Tohum nem miktarının azalmasına bağlı olarak fide boyundaki azalma % 26.4 ten % 42.9 a yükselmiştir. Ayrıca fide boyunda en belirgin azalma tohum nem miktarının % 3-6 arasında olduğu değerlerde elde edilmiştir. Polen ve yumurta hücrelerinde kısırlık oranı nem miktarındaki değişime bağlı olarak sırasıyla % 85.2 den % 59 a ve % 91.7 den % 73.8 e düşmüştür. Mitoz kromozomlarında ki anormallikler ise nem miktarının %11.2 den %3 e düşmesiyle % 22.7 den % 73 e yükselmiştir. Yapılan bu çalışmada Amber çeşidi arpa tohumlarında nem miktarının özellikle % 3-6 aralığında değişmesi tohumun radyasyona duyarlılığını belirgin bir şekilde arttırmaktadır. Böylece düşük nem oranı içeren tohumlarda daha az doz miktarlarıyla daha yüksek frekansta ve daha geniş spektrumlu mutasyonlara ulaşılabileceği araştırıcılar tarafından belirtilmiştir. Nakai ve Saita (1978), yaptıkları çalışmada %13 nem içeren pirinç (Oryza sativa L.) tohumlarını -196 o C de 60 Co kaynağı kullanılarak ışınlanmışlardır. Düşük sıcaklıkta ışınlanan grubun yanında aynı doz miktarlarında ancak oda sıcaklığında bir kontrol grubu gama ışınına maruz bırakılmıştır. Düşük sıcaklıkta ışınlanan grup kontrol grubu ile mukayese edildiğinde fide boyu yüzde yaşam oranı değerlerinin çok düşük olduğu görülmüştür. Çok düşük sıcaklık ve yüksek doz miktarı mutasyon frekansını belirgin bir şekilde arttırmıştır. M 2 generasyonundaki steril ya da yarı steril mutantlar düşük sıcaklıkta ışınlanan grupta çok azdır. Çok düşük sıcaklıkta yapılan ışınlamada 10

fizyolojik hasar ve kromozom kırılmalarının miktarının attığı tespit edilmiştir. Bu durumda kırık, delesyon ve nokta mutasyonları artmıştır. Savaşkan ve Toker (1990), yaptıkları çalışmada çavdar (Seceale sereale L.) bitkisinin kuru ve dormant haldeki tohumlarına 50, 100, 150, 200 Gray gama ışını uygulamışlardır. Işınlama sırasında çavdar tohumlarının nem miktarı % 9.6 dır. Yapılan bu çalışmada çeşitli gama radyasyon dozlarının çavdar bitkisinde kök uzunluğu, fide buyu, yaşam yüzdesi, mitoz indeksi ve kromozom yapısındaki anormallikleri üzerine etkisi araştırılmıştır. En yüksek çimlenme kontrol gurubunda görülürken ışınlanan gruplar arasında doz miktarının artışına bağlı olarak düzenli bir dağılım görülmemiştir. Yani kontrolde 100 tohumdan 93 tanesi çimlenirken 50 Gray de 82, 100 Gray de 87, 150 Gray de 84 ve 200 Gray de 82 tohum çimlenmiştir. 200 Gray de ışınlanan grupta anormal metafaz oranı % 80.76 ile en fazladır. Bu değer 150 Gray de % 79.41, 100 Gray de % 63.33, 50 Gray de % 45.28 ve kontrol gurubunda % 1.53 tür. Normal ve anormal metafaz değerlerinin dağılımı X 2 testi ile değerlendirilmiş ve doz miktarı ile anormal hücre sayısı arasında pozitif korelasyon olduğu bulunmuştur. Kontrol grubunda doğal olarak meydana gelen kromozom kırılmaları diğer gruplarda radyasyonun etkisiyle meydana gelmiştir. Disentrik ve halka kromozom oluşumu en fazla 200 Gray le ışınlanan grupta görülmüştür. Kırılmalarda artış doza bağlı olarak lineer bir şekilde artmamıştır. Yani 200 Gray de 78 tane kırık varken 150 Gray de 88, 100 Gray de 40, 50 Gray de 68 ve kontrolde 1 tane kırık vardır. Ancak disentrik ve halka kromozom oluşumu doz miktarı artıkça doğrusal şekilde atmaktadır. En yüksek mitoz frekansı % 11.8 ile kontrol gurubunda bulunurken en düşük mitoz frekansı ise 200 Gray le ışınlanan grupta % 5.0 olarak bulunmuştur. Çimlenen tohumlardaki mitoz frekansı (bölünen hücre adeti) doz arttıkça azalmıştır. Bunun sonucu olarak fide boyu ve kök uzunluğu giderek azalmıştır. Eser vd. (1990), çeşitli radyasyon dozlarını Pull-11 mercimek çeşidine uygulamışlar ve bu çeşidin LD 50 değerini ve radyasyonun çeşitli karakterler üzerine etkisini belirlemişlerdir. Araştırıcılar laboratuar denemeleri için 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 300, 400 ve 500 Gray tarla denemeleri için 25, 50, 75, 100, 125, 150 ve 200 11

Gray doz miktarında mercimek tohumlarını 60 Co kaynağında gama ışınıyla ışınlamışlardır. Tohumların nem miktarı % 12 dir. Laboratuar çalışmaları sonucunda şu bulgulara ulaşılmıştır; kontrol grubu ile karşılaştırıldığında fide buyu ışınlanan gruplarda azalmıştır. Kontrolde fide boyu 9,13 cm iken ışınlana gruplarda bu değer 8,25-0,76 cm arasında değişmektedir. Kontrol gurubunda kök uzunluğu 8,27 cm dır. Işınlana grupta radyasyonun etkisiyle kök uzunluğu azalmış ve 7,63-1,30 cm arasında değerler almıştır. Tarla denemesi sonuçunda ise şu bulgulara ulaşılmıştır; kontrol gurubu ile karşılaştırıldığında çimlenen tohum sayısı ışınlanan gruplarda daha azdır. Pull-11 mercimek varyetesinde kontrol gurubu % 95,4 çimlenme gösterirken ışınlanan gruplarda bu değer % 8.9 86.1 arasında değişmektedir. Çimlenmedeki bu değişim doz miktarına bağlı olarak lineer şekilde azalmaktadır. Yani doz miktarı arttıkça çimlenen bitki sayısı azalmaktadır. Yine kontrol gurubu ile karşılaştırıldığında bitki boyu ışınlanan gruplarda azalmıştır. Kontrolün ortalama bitki boyu 28,81 cm iken ışınlana gruplarda bu değer 30,87-20,58 cm arasında değişmektedir. Buradaki azalma doğrusal bir şekilde gerçekleşmemiştir. Kontrol grubunun bitki kök uzunluğu 9,78 cm iken diğer gruplarda bu değer 10,86-4,66 cm arasında değişmektedir ve burada da değişim doğrusal değildir. Pull-11 mercimek çeşidinin tarla denemesinde bitki başına bakla sayısı, dane sayısı, dane verimi, bitki boyu ve ilk bakla yüksekliğinin artan radyasyon dozlarına bağlı olarak kontrole göre azaldığı saptanmıştır. Verimle ilgili bu özellikler bakımından yapılan istatistik analiz sonucuna göre dozlar arası fark önemli bulunmuştur. Bu mercimek çeşidi için % 50 öldürücü doz (LD 50 ) ise 80 Gray olarak bulunmuştur. Savaşkan ve Atila (1991), yaptıkları çalışmada Çukurova 1518 çeşidine ait pamuk tohumlarına 60 Co kaynağı kullanarak 50, 100, 200, 300 ve 400 Gray dozlarda ışınlamışlardır. Polen örnekleri M 1 ve M 2 generasyonuna ait bitkilerden alınmıştır. Kontrol ve ışınlanmış grupların M 1 ve M 2 generasyonlarına ait boyanmamış ve anormal (heteromorf) polen sayısı belirlenmiş ve anormal polen yüzdesi hesaplanmıştır. M 1 generasyonunda % 10.39 ve M 2 generasyonunda % 7.1 oranı ile 400 Gray le ışınlanan grup en yüksek değere sahiptir. Kontrol grubundan ve M 1 generasyonundan elde edilen normal polenlerin ölçümü yapılmıştır. Kontrol grubunda polen büyüklüğü 120.35 µm, 50 Gray de 121.27 µm, 100 Gray de 125.27 12

µm, 200 Gray de 119.60 µm, 300 Gray de 104.67 µm ve 400 Gray de 108.30µm olarak bulunmuştur. M 1 generasyonunda steril polen miktarının M 2 generasyonundan daha fazla olduğu bulunmuştur. M 1 generasyonunda toplam boyanmamış ve heteromorf (steril) polen 50 Gray de % 1.36 iken M 2 de bu değer % 0.61 e düşmüştür. Yine M 1 generasyonunda 400 Gray ile ışınlanan grupta bu anormallik % 10.39, M 2 generasyonunda % 7.10 olmuştur ve her iki generasyonda da 400 Gray ile yapılan ışınlamada en yüksek değere ulaşılmıştır. Elde edilen varyetelerdeki çeşitliliğin farklı nedenleri vardır; uygulanan radyasyon tipinin penetrasyon kabiliyeti, türler arası çeşitlilik, polen çeperinin kalınlığı, polen şekli ve ölçüsü gibi etmenlerin yanında Anafaz I ve Anafaz II de farklı boyuttaki kromozomlar ve kromatitler anormal tetrat oluşumuna neden olmakta ve bu da yüksek oranda polen sterilizasyonuna yol açmaktadır. Prasad (1997), 5 farklı arpa çeşidine ait tohumları 100, 200, 300 ve 400 Gray doz miktarlarında ışınlanmıştır. Kontrolde dahil olmak üzere ışınlanan gruplar tarla koşullarında yetiştirilmiştir. Her bir varyeteye ait 200 başak toplanmıştır. Bu başaklardan elde edilen tohumlar ekilerek M 2 generasyonu yetiştirilmiştir. Mutasyon frekansı göz önüne alındığında varyeteler arasında belirgin farklar görülmüştür. Uygulanan gama radyasyon dozu ile varyete arasında belirgin bir interaksiyon vardır. En yüksek mutasyon oranı % 4.428 ile KN 27 varyetesinde elde edilmiştir. Bunu % 2.315 ile P 167, % 2.240 ile BR 31, % 2.106 ile Mex 22 ve % 1.896 ile DL 36 izlemektedir. KN 27 300 Gray de en yüksek mutasyon frekansını gösterirken bu değer 400 Gray de azalmıştır. Toplam 9 tip klorofil mutasyonu görülmüştür. KN 27, bu 9 tip mutasyonun hepsine sahipken diğer varyeteler daha az klorofil mutasyonuna sahiptir. Mutant tiplerin frekansları farklı varyetelerde farklılık gösterir. Mex 22 de albino frekansı % 52.1 iken DL 36 da ise viridis ve xantha mutant frekansı Mex 22 de daha fazladır. Başlıca mutant tipleri olan albino, viridis, xantha sırasıyla % 33.9, % 28.6 ve % 19.1 oranlarında en fazla 300 Gray gama ışını ile ışınlanan gruplardan elde edilmiştir. Sağel vd. (2002) yaptıkları çalışmada Türkiye Atom Enerjisine bağlı Ankara Nükleer Tarım ve Hayvancılık Araştırma Merkezi (ANTHAM) nde günümüze kadar nükleer 13

ve ileri teknikler kullanılarak yapılan mutasyon ıslahı ve doku kültürü çalışmalarını içeren bir derleme yayımlamışlardır. Mutasyon ıslahı projelerine başlamadan önce tahıl, baklagil ve endüstri bitkileri tür ve çeşitlerinde uygulanabilir doz oranının belirlenmesi amacıyla tohumlar 60 Co kaynağında 50 ila 1000 Gray dozları arasında ışınlanmışlardır. Ekimden sonraki 7. günden itibaren 14. güne kadar çıkış yüzdeleri tespit edilir. 14. günde birinci yaprakta gelişimin durduğu devrede bitkiler köklü hasat edilerek fide boyu, kök uzunluğu, yaşam oranı, bitki ağırlığı, kök ağırlığı gibi özellikleri hesaplanmıştır. Uygun doz fide boyunu % 50 azaltan doz olarak belirlenir. Her çeşit için tespit edilen değerin % 10 üstü ve altı baz alınarak ışınlanan tohumlarda tarla denemeleri kurulmuştur. M 2 generasyonundan itibaren her bitki kendi ekolojisinde yetiştirilerek ıslah amacına uygun seleksiyon baskısına tabi tutulmuş kalitatif ve kantitatif analizler laboratuarda yapılarak seleksiyon tamamlanmıştır. ANTHAM Nükleer Tarım Radyobiyoloji Bölümünde tahıllarda (arpa, çavdar, buğday) yapılan çalışmalar şöyle özetlenebilir; bu araştırmalar bölgeye adapte olmuş yüksek, verimli, yatmaya dayanıklı ve sağlam saplı arpa çeşitlerinin ıslah edilmesi amacıyla başlamıştır. Mutagen olarak 100, 150, 200, 250 Gray gama ışını kullanılmıştır. M 2 generasyonundan elde edilen 7000 bitkiden 25 hatla çalışmalar sürdürülmüş, elde edilen ümitvar hatlar veri denemelerine alınmıştır. Mutasyon çalışmalarının yanında organda anter kültürü ve melezleme çalışmalarında devam etmektedir. Elde edilen mevcut M 6 ve M 7 generasyonuna ait hatlarla yatmaya dayanıklı, sağlam saplı ve Norveç orijinli bir arpa çeşidi ile Tokak mutantları 1999 yılında melezlenmiş, oluşan bitkilerinden elde edilen anterler doku kültürü laboratuarlarında haploid bitki elde etmek amacıyla kültüre alınmıştır. Kültüre alınan bitkiler Colchisin uygulaması sonucunda doubled haploid hale getirilmiştir. 2001 yılı ekim ayından itibaren bu doubled haploid bitkinin verim kapasiteleri ve tarımsal özellikleri incelemeye alınmıştır. Cheema ve Atta (2003), Basmati 370 Basmati Pak ve Süper Basmati adlı pirinç varyetelerine ait tohumları 150, 200, 250, 300 Gray gama ışını kullanarak ışınlanmıştır. Bu işlemde kullanılan tohumların nem miktarı % 13 dür. Her doz için 500 tohum kullanılmıştır. Ekimden 30 gün sonra fideler toprağa nakledilmiş, M 1 ve M 2 generasyonlarında çeşitli ölçüm ve gözlemler yapılmıştır. Doz miktarının artışına 14

bağlı olarak çimlenme, bitki boyu, kök uzunluğu dağılımında azalma olduğu M 1 generasyonunda yapılan ölçümlerde görülmüştür. Çimlenme oranında azalma her üç varyetede de görülmüştür. Ancak azalma doz miktarında ki artışa bağlı olarak lineer bir şekilde gerçekleşmemiştir. Radyasyon uygulanan tohumlardan elde edilen fidelerde belirgin boy azalması olduğu görülmüştür. Her üç varyetede 300 Gray doz uygulanan grupta bitki boyu % 50 azalmıştır. Tarla koşulları altında kök uzunluğu ve kök dağılımında azalma görülmüştür. Kök uzunluğunda azalma en fazla 150 Gray da gerçekleşmiştir. Kök dağılımına etki eden doz ise 250 ve 300 Gray dir. Bitki boyunda ise en fazla azalma 150 Gray ile ışınlanan tohumlarda görülmüştür. Her bir varyete için bitki boyunu azaltan doz miktarı arasında belirgin bir fark bulunmamıştır. M 2 generasyonunda ise çeşitli klorofil mutasyonların olduğu görülmüştür. 150, 200, 250 Gray doz miktarlarıyla ışınlanan gruplarda klorofil mutasyon miktarı artarken 250 Gray de azalmıştır. Bu üç varyete için en yüksek mutasyon frekans 200 ve 250 Gray doz miktarında elde edilmiştir. Başer vd. (2005) yaptığı çalışmada 6 farklı gama ışın dozlarının M 1 generasyonunda bitki gelişimi üzerine etkisi araştırılmıştır. Bu çalışmada makarnalık buğday (Triticum durum Desf.) çeşitlerinden Kunduru 1149 ve Altındaş 97 materyal olarak kullanılmıştır. Işınlama Türkiye Atom Enerjisi Kurumunda 60 Co kaynağından 100, 200, 300, 400, 500, 600 Gray dozlarında olmak üzere yapılmıştır. Işınlanan tohumlar da ortalama nem miktarı Kunduru 1149 da % 14.5 Altındaş ta % 14 olarak belirlenmiştir. Ekimden 3 hafta sonra bitkiler sökülmüş ve üzerinde ölçümler yapılmıştır. Bitkilerde yaprak sayısı, kök sayısı, fide boyu, fide ağırlığı, yaprak ağırlığı gibi karakterlerin ölçümü yapılmıştır. Đki makarnalık buğday çeşidine uygulanan farklı gama ışın dozlarının fide döneminde bazı gelişim özellikleri üzerine etkisi şöyle bulunmuştur; Ele alınan çeşitlerin fidelerinde yaprak sayısı 0.00-3.25 arasında değişirken en yüksek yaprak sayısı 300-200 Gray gama ışını uygulamalarında elde edilmiştir. 500 Gray gama ışını uygulamasında yaprak sayısı düşük düzeyde kalırken 600 Gray gama ışın uygulamasında tohumlarda herhangi bir canlılık belirtisi görülmemiştir. 200 ve 300 Gray gama ışın uygulanan tohumlardan gelişen fidelerde yaprak sayısı kontrolden daha yüksek bulunmuştur. Mutagen uygulamasında en yüksek varyasyon yaprak sayısı için 400 ve 300 Gray 15

uygulamasında fide ağırlığı için 0 ve 400 Gray uygulamasında ve fide uzunluğu için 400 ve 300 Gray uygulamasında elde edilmiştir. Gama ışın dozlarının fide ağırlığı yönünden değişimi incelendiğinde, dozlar arasında fide gelişiminde istatistiki olarak önemli farklılıklar bulunmuştur. En fazla fide ağırlığı sırası ile 100, 0, 200, 300 Gray dozlarında görülürken 400 ve 500 Gray dozlarda önemli azalmalar görülmüş, 600 Gray de ise tohumlarda canlılık belirtisi görülmemiştir. Fide boyu karakteri ele alındığında uygulanan doz miktarı ve buğday çeşitleri arasında önemli farklılıklar görülmüştür. En fazla fide boyu 100 Gray gama ışın uygulamasında elde edilirken bunu sırasıyla 0, 200, 300, Gray ışın uygulamaları izlemiştir. 400, 500 Gray da fide boyu önemli oranda azalmıştır. Kök ağırlığı ve kök uzunluğu gibi toprak altı organ gelişimi üzerine gama ışını etkisi toprak üstü organlar üzerine olan etkiden daha az bulunmuştur. Kök ağırlığı yönünden kontrol ilk sırada yer alırken, 100, 200 ve 300 Gray gama ışını uygulamalarında elde edilen kök uzunluğu ve sayısı kontrole yakın değerler olmuştur. 400 Gray da kök ağırlığı karakterinde önemli düzeyde azalma görülmüştür. 400 Gray da görülen azalmanın sebebi köklerin oldukça zayıf bir gelişim göstermesi olarak bulunmuştur. Kök uzunluğu yönünden 18.70 cm ile 100 Gray gama uygulamasında en yüksek değerler elde edilirken bunu 100, 300 ve 200 Gray dozlarda elde edilen kök uzunlukları izlemiştir. Bu makarnalık buğday çeşitlerine farklı gama ışını dozlarının çıkış yüzdesi üzerine incelendiğinde gama ışınlarının 100, 200, ve 300 Gray uygulamalarının çimlenme üzerine etkileri önemli bulunmazken 400 Gray uygulamasında önemli azalma görülmüş, 500 Gray da bu azalma oldukça yüksek düzeye çıkarken, 600 Gray da sadece 1 bitki (Altındaş) canlılığını sürdürmüştür. Makrobia vd. (2006), bu çalışmasında gama radyasyonunun mısır (Zea mays) bitkisinde ürün verimi üzerine etkisini araştırmışlardır. Radyasyon uygulamasından sonra tohumlar tarla koşullarında yetiştirilmiştir. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında ürün verimi 250 Gray a kadar olan dozlarda artış gözlenmiştir. Ve en uygun verim 150 Gray de elde edilmiştir. 250 Gray de fazla olan doz miktarları mısırda verimi azaltmıştır. 16

Savaşkan vd. (1997), ülkemizde özellikle orta Anadolu da tarımı yapılan Kunduru 1149, Berkman 469, Çakmak 79 tetraploid buğday çeşitlerini mısır ile melezlenmesi sonucunda elde edilecek haploid embriyo, farklılaşma ve doubled haploid bitki üretim kapasitesini araştırmışlardır. Bu çeşitlere ait 2960 çiçek mısır ile melezlenmiş ve 19-21 gün sonra melezlenen çiçeklerin % 13.65 i haploid embriyo üretmiştir. Çeşitlerden alınan haploid embriyo sayısı ve doubled haploid bitki sayısı ayrı ayrı irdelenmiştir. Kunduru 1149 ve Berkmen 469 çeşitlerinin haploid embriyo üretimi arasında önemli bir fark bulunamamıştır. Bu çeşitlerin Çakmak 79 çeşidine göre verdikleri haploid embriyo sayısı P<0.01 seviyesinde önemli bulunmuştur. Bunun yanında meydana gelen haploid embriyo formasyonlarının hepsi farklılaşarak bitki meydana getirmiştir. Üç çeşide ait embriyo kabuğu oluşumu toplam değeri % 52.27 dir. Farklılaşma gösteren ve göstermeyen embriyo sonuçları arasında fark her çeşit için kendi içinde önemsiz bulunmuştur. Varma vd. (1999), buğday x mısır melezleme metodunda haploid bitki üretimini arttırmak amacıyla mısır genotiplerinin hapoid embriyo oluşumuna ve bitki regenerasyonuna etkilerini araştırmışlardır. 15 farklı mısır genotipi 5 farklı buğday hibriti ile melezlenmiştir. Döllenmeden 24 saat sonra başaklara 2,4-D oksin çeşidi uygulanmıştır. Oluşan haploid embriyolar MS kültür ortamı bulunan test tüplerine aktarılmıştır. Yapılan istatistik çalışmalarında, tohum kabuğu oluşum yüzdesi embriyo oluşum yüzdeleri hesaplanmıştır. Mısır ve buğday genotiplerinin ayrı ayrı bu iki parametre üzerinde farklı sonuçları olmuştur. Mısır genotiplerinin embriyo oluşturma yüzdesi % 1.1 den % 23.4 e kadar değişirken buğday genotiplerinin embriyo oluşturma yüzdesi ise % 8.4 den % 10.2 ye kadar değişmiştir. Yapılan denemeler sonucu mısır genotiplerindeki farklılığın etkili olduğu ve en iyi dölleyicinin bir patlamış mısır çeşidi olan Pearl Pop Corn olduğu, beş buğday genotipi ile melezlenmesi sonucu embriyo oluşturma frekansının % 15.1 ve haploid bitki oluşturma frekansının % 9.9 olduğu görülmüştür Knox vd. (2000), durum buğdayda cinsler arası melezleme yöntemiyle daha fazla doubled haploid bitki elde etmenin yollarını araştırmışlardır. Durum buğdayın stigmaları, mısır polenleriyle melezlenmiştir. Döllenmeden bir gün sonra 100 mg/l 17

2,4-D ve 500mg/l dicamba çözeltileri başakçıklara püskürtme yöntemiyle uygulanmıştır. Döllenmeden 13 veya 15 gün sonra oluşan embriyolar B5 kültür ortamına aktarılmıştır. Yapılan çalışmada, melezleme sonrası elde edilebilecek tohum kabuğunun, haploid embriyoların, doubled haploid bitkilerin ve tohum veren doubled haploid bitkilerin sayıları hesaplanmıştır. Bitki yetiştirme koşulları polen kaynakları, bitkileri kullanma yöntemleri ve buğday genotipleri durum buğdayda cinsler arası melezleme metoduyla doubled haploid bitki elde etmede önemli kriterler olmasına rağmen bu işlemde en önemli faktör kullanılan oksin çeşididir. Yapılan çalışmada 100 mg/l 2,4-D yerine 500 mg/l dicamba kullanıldığında her başaktan alınan doubled haploid bitki sayısı 0.2 den 1.3 e yükselmiştir. Dicamba uygulanan başaklardan alınan tohum kabuğu sayısı 0.75 iken 2,4-D uygulanan başaklardan elde edilen tohum kabuğu sayısı 0.41 dir. Haploid bitki alımında ise dicamba uygulanan her 100 başakçıktan 12, 2,4-D uygulanan her 100 başakçıktan ise 1.6 ürün elde edilmiştir. Doğramacı ve Jauhar (2001), mısır x buğday melezleme metodunda durum buğday kromozomlarının bu tekniğe olan etkisini ve haploidlerin sitilojik karakterlerini araştırmışlardır. 14 Langdon (LDN) disomik (n+1) hattı, bir LDN ve normal Langdon çeşidi mısır poleni ile melezlenmiştir. Melezlemeden sonra 14 gün boyunca oksin uygulaması yapılmıştır. Oluşan embriyolar MS kültür ortamına aktarılmıştır. Toplam 55.358 başakçık melezlenmiş ve bunlardan 895 tanesinde embriyo oluşmuştur. Bu embriyolardan sadece 14 tanesi embriyo gelişimini tamamlayıp sağlıklı bitkiler oluşturmuştur. Farklı hatlar çeşitli oranlarda başarı göstermiştir. Yapılan denemede en başarılı hat 5D(5B) hattı olmuştur. Ballesteros vd. (2003), durum buğday ile mısır melezleme metodunda çevresel nispi nem oranının haploid bitki üretimi üzerindeki etkisini araştırmışlardır. Durum buğdayın 8 melezinden 38 F 3 hattı ile 3 ticari mısır ( Zea mays) hibritinin polenleri melezlenmiştir. Döllemeden 1 gün sonra başaklar 95 mg/l 2,4-D ve 5 mg/l dicamba karışımı bulunan sıvı kültür ortamına aktarılmıştır. 48 saat sonra bu başaklar oksin bulunmayan MS/2 ortamına aktarılmıştır. % 65-85 çevresel nem oranı yerine % 55-65 çevresel nem oranı kullanıldığından başak başına alınan haploidlerin sayısı 18

önemli oranda artmıştır. Başak başına, % 15.2 ve % 9.3 tohum kabuğu; % 5 ve % 2.8 embriyo ile % 3.1 ve % 0.6 haploid bitki sırasıyla düşük ve yüksek nem koşulları altında alınan ürünler olmuştur. 19

3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal Yapılan çalışmada Triticum durum Desf. cvs. Berkmen 469 makarnalık buğday çeşidi kullanılmıştır. Orta Anadolu' da tarımı yapılan bu buğday çeşidinin kromozom sayısı 2n=28'dir. Berkmen 469 Ankara Tarımsal araştırma Merkezi' nde seleksiyon yoluyla ıslah edilen eski çeşitlerimizdendir. Bu çalışmada Savaşkan ve arkadaşları tarafından 1997 yılında bu çeşitten cinsler arası melezleme yoluyla elde edilen doubled haploid DH-1 genotip kullanılmıştır. Melezleme (polen tozlaması) için mısır (Zea mays L.) bitkisi kullanılmış ve kromozom sayısı 2n=20' dir. Mısır tohumları Isparta Tarım Đl Müdürlüğü'nden temin edilmiştir. 3.2. Yöntem 3.2.1. Tohum Nem Oranının Belirlenmesi Dara ağırlığı ayrıca hesaplanan örnekler net 6 g olarak ağzı kapalı cam kapta tartıldı. Daha sonra bu kap ağzı açık bir şekilde etüvde 140 0 C 'de 40 dakika bekletildi. Etüvden alınan örneğin hemen ağzı kapatılarak 20 dakika soğumaya bırakıldı. Bu süre sonunda örnek yeniden tartıldı ve ağırlık kaybı hesaplandı. Deneme üç kez tekrarlandı. (Ağırlık farkı / Tohumun ilk ağırlığı) X 100 formülü kullanılarak tohumum % nem miktarı belirlendi. Her bir örneğin nem miktarı belirlendikten sonra üçünün ortalaması alındı. I. örnek: (48.4161-48.0882) X 100= 5.491 II.örnek: (51.0535-50.7332) X 100= 5.338 III.örnek: (50.2748-49.9346) X 100= 5.670 Ortalama % nem miktarı: (5.491+5.338+5.670) / 3 = 5.491 Yapılan işlem sonucunda % tohum nemi miktarı 5.491 olarak bulundu. 20

3.2.1. Tohum Nem Oranının Artırılması Berkmen 469' den elde edilen DH-1 tohumlarının nem miktarı tespit edildi ve bu değer 5.491 olarak bulundu. Nem miktarının ayarlanmasından önce kontrol gurubu ve her bir doz için 3 tekrarlı olmak üzere tohumlar desikatör içine yerleştirildi. Nem miktarının % 9-10 olması için tohumlar desikatör içinde 4 gün süreyle 9.4 mmhg basınç altında bekletildi. Nem miktarını arttırmak için % 85'lik gliserol ve CaCI 2 kullanıldı (Konzak vd., 1972). % 85' lik gliserol desikatörün kapak cidarına bir pamuk yardımıyla sürüldü ve desikatörün alt kısmına CaCI 2 konuldu. Desikatörde 9.4 mmhg basınç elde etmek için bu sisteme bir vakum pompası ve sistemin kapak kısmına da bir manometre bağlandı. Vakum pompası ilk başta birkaç kez çalıştırıldı ve içerdeki basınç değerinin istenen düzeye gelmesi sağlandı, 4. gün sonunda tohumlar alındı. Şekil 3.1. Desikasyon sisteminin genel görüntüsü 21

3.2.2. Örneklerin Hazırlanması T. durum Berkmen 469 DH-1 tohumlarının nem miktarı desikatörden çıkarıldıktan sonra yukarıda belirtilen formüle göre yeniden hesaplandı ve sonuç olarak nem miktarı % 9.750 olarak belirlendi. Gama ışını ile ışınlamak için poşetlere konuldu ve etiketlendi. 3.2.2.1. Lethalite Doz(LD 50 ) Çalışması Đçin Örnek Hazırlanması Bu çalışma için kontrol ve yedi doz kullanıldı. Bu dozlar 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 Gray olarak belirlendi. Her kontrol grubu ve doz için ellişer tohum sayıldı ve üç tekrarlı hazırlandı. Işınlama işlemi için TAEK'a bağlı Ankara Nükleer Tarım ve Hayvancılık Araştırma Merkezindeki 137 Cs kaynağı kullanılmıştır. Şekil 3.2. 137 Cs kaynağı 22

3.2.2.2. Doku Kültürü Çalışmaları Đçin Örnek Hazırlanması Bu çalışma için kontrol, 150 ve 250 Gray doz miktarları kullanıldı. Kontrol ve her doz için yüzer örnek üç tekrarlı olarak hazırlandı. Türkiye Atom Enerjisi Kurumu'na bağlı Nükleer Araştırma ve Uygulama Merkezi'nde 60 Co kaynağı ile ışınlama yapıldı. Kullanılan 60 Co kaynağının gücü 1.39 kgray/saat dir. Işınlama yapılacak örnekler kaynak içine yerleştirildi. 150 Gray ile ışınlanacak grup 5 dakika 50 saniye ve 250 Gray le ışınlanacak grup 10 dakika 7 saniye kaynak içinde bekletilerek ışınlama yapıldı. 3.2.3. Bitkilerin Yetiştirilmesi Işınlanan tohumlar daha önce hazırlanmış olan saksılara ekildi. Saksılar 1/3 gübre 2/3 toprak oranında karıştırılarak hazırlandı. 3.2.3.1. LD 50 Çalışması Đçin Örneklerin Ekimi Ekim işlemi Süleyman Demirel Üniversitesi Ziraat Fakültesi Araştırma ve Uygulama Seraları'nda yapıldı. Her 5 günde bir bitkiler sulandı (Şekil 3.3). Ekimden itibaren 21 gün sonra bitkiler saksılardan çıkartıldı fide boyu, kök uzunluğu ölçüldü ve her gurubun yaşayan birey sayısı hesaplandı (Şekil 3.4). Şekil 3.3. LD 50 değerinin tespiti için kullanılan farklı dozlarda ışınlanmış bitkiler 23

Şekil 3.4. Bitkilerin fide boyu ve kök uzunluklarının ölçümü Şekil 3.5. Farklı dozlarda ışınlanmış bitkilerin fide boyu ve kök uzunlukları 24

3.2.3.2. Doku Kültürü Çalışması Đçin Örneklerin Ekimi Işınlanan tohumlar Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü' ne bağlı Bitki Doku Kültürü ve Biyodozimetri Laboratuarı nda bulunan bitki yetiştirme odasında saksılara ekildi Buğdayların her biri küçük saksılara ve ışınlandıkları doz miktarına göre farklı gruplara ayrılarak ekimi yapıldı. Mısır tohumları ise büyük saksılara dörder adet olarak üç hafta buyunca pazartesi ve perşembe günleri periyodik olarak ekildi. Böylece buğday bitkisinin başak verdiği zamanla mısır bitkisinin çiçeklenme zamanı çakıştırılmaya çalışıldı. Bitki yetiştirme odasında hızlı bir çimlenme ve gelişim döneminden sonra saksılar Süleyman Demirel Üniversitesi Park ve Bahçeler Müdürlüğü' ne bağlı bitki yetiştirme serasına taşındı. Burada periyodik olarak sulama, gübreleme, ilaçlama ve başakların kuvvetli olması için oluşan kardeşler alındı (Şekil 3.6.). Şekil 3.6. Melezlemede kullanılan buğday ve mısır bitkileri 3.2.4. Melezleme Đşleminin Yapılması Buğday başakları yapraktan (kınından) tam olarak çıktıktan sonra başaktaki kılçıklar çiçeğin hemen üzerinden kesilerek alındı. Böylece başak kasturasyona hazır hale getirildi (Şekil 3.7). Çiçekteki anterler stigmaya zarar vermeden dikkatlice alındı. 25

Daha sonra başaklar şeffaf melezleme torbalarıyla kapatıldı ve etiketlendi. Đki gün sonra mısır bitkilerinin çiçeklerini bir kağıt üzerine eğerek ve hafifçe silkelemek suretiyle polenler toplandı. Bu işlem sabah saat 8.00-9.00 arasında yapıldı. Alınan polenler bir pinset yardımıyla iki gün önce kasture edilen başakçıkların sitigması üzerine konuldu (Şekil 3.8). Bu işlem sonrasında başak yeniden melezleme torbasıyla kapatıldı ve melezleme tarihi etikete kaydedildi. Şekil 3.7. Kınından tamamen çıkmış başak, başaktaki kılçıkların alınması ve kasturasyona hazır başak 3.2.5. 2,4-D Çözeltisinin Hazırlanması 2.4-D çözeltisini uygulamak için 100 ml lik bir çözelti hazırlandı. 0.1 gram 2.4-D kristalleri hassas terazide tartıldı ve 1 ml'lik % 95'lik etenol ile eritilerek önce 100 ml 'ye daha sonra 1000 ml ye saf su ile tamamlanarak etiketlendi. Çözelti +4 O C'de buzdolabında muhafaza edildi. 26

Şekil 3.8. Kasturasyon (anterlerin alınması) işlemi, melezleme zarfı ve etiketleme, mısır polenlerinin toplanması ve melezleme işlemi 3.2.6. 2,4-D Çözeltisinin Bitkiye Uygulanması Buğday x mısır döllenmesi ve sağlıklı embriyo oluşumunu desteklemek için başaklara 24 saat sonra sentetik bir oksin çeşidi olan 2,4-D uygulandı. 2,4-D çözeltisi enjekte etmeden önce başağın hemen altından gövdeye iğnenin ucuyla bir delik açıldı (Şekil 3.9). Böylece çözeltinin gövde içinde iletimi sağlandı ve gövdenin basınç durumunda patlaması önlendi. Üst internoda, nodun hemen üstünden başağa doğru 1 ml'lik şırınga ile üstte açılan deliklerden çözelti gelene kadar 2,4-D enjekte edildi (Şekil 3.9). Çözelti enjekte edildikten hemen sonra açılan delikler çözeltinin geri 27

boşalmasını önlemek için hemen vazelin ile kapatıldı (Şekil 3.10). Ayrıca döllenen başakçıkların her birine birer damla 100 ppm'lik 2,4-D çözeltisi enjekte edildi (Şekil 3.10). Başak melezleme torbasıyla kapatıldı etikete hormonlama tarihi not edildi. Şekil 3.9. Đğnenin ucu ile başağın hemen altından gövdeye delik açılması ve üst internoda, internodun alt kısmından başağa doğru 2,4-D çözeltisinin uygulanması Şekil 3.10. Enjekte edilen kısımların vazelin ile kapatılması ve başakçıkların her birine birer damla oksin çözeltisinin damlatılması 28

3.2.7. Embriyo Kültürü Çalışması 2.4-D uygulamasından 16-18 gün sonra başaklar toplandı bir steril kabinete alındı ve bir petri kutusunun içinde başakçıklarına ayrıldı. Başakçıklar teker teker açıldı, olgunlaşmış tohum kabukları çıkartıldı, yüzey sterilizasyonu yapıldı. Yüzey sterilizasyonu için tohumların kabukları önce % 20 lik hipoklorit çözeltisinde 1 dakika, ardından % 70 lik alkol çözeltisinde 30 saniye steril edildi ve iki defa steril su ile yıkandı. Her bir tohum kabuğu içinde oluşma olasılığı olan embriyolar bir binoküler mikroskop yardımıyla kontrol edildi (Şekil 3.11). Tohum kabuğu embriyolar sayıldı, embriyolar kültür ortamına alındı. Embriyo kültürü için MS (Sigma-m5525) hazır kültür ortamı kullanıldı. Kültür ortamları hazırlanırken 20 g/i sükroz ve 7 g/l Difco bakto agar ilave edilerek ph'si 5.8'e ayarlandı. PH'nin 6.00 + 0.05 olarak ayarlanması için NaOH ve HCI çözeltileri kullanıldı. ph'si ayarlanan ve otoklavda 121 O C'de 20 dakika sterilize edilen kültür ortamları 9 cm çapındaki petri kaplarına 1/3'ü dolacak şekilde paylaştırıldı (Çizelge 3.1). Kültür ortamı soğuyup katılaştıktan sonra petri kaplarının çevresi parafilm ile kapatılarak kullanılana kadar +4 O C'de buzdolabında muhafaza edildi. Kültür ortamına alınan embriyolar 20+1 O C de 16s/8s gece/gündüz periyodunda inkübatüre alındı. Yaklaşık bir hafta sonunda haploid regenerant bitkilerin çıkışı gözlendi. Şekil 3.11. Embriyo gelişme olasılığı olan tohumların kontrol edilmesi 29

Çizelge 3.1. Haploid embriyoların gelişimi için hazırlanan MS kültür ortamı BĐLEŞĐKLER Makrotuzlar Kültür ortamındaki konsantrasyonlar (ppm) MS KNO 3 1900 NH 4 NO 3 1650 MgSO 4.7H 2 O 370 CaCI 2.2H 2 O 440 KH 2 PO4 170 Mikrotuzlar MnSO 4.4H2O 22.3 KI 0.83 H 3 BO 4 6.2 ZnSO 4.7H 2 O 8.6 CuSO 4.5H 2 O 0.025 Na 2 MoO 4.2H 2 O 0.25 CoCI 2.6H 2 O 0.025 FeSO 4.7H 2 O 27.8 Na 2 EDTA 37.3 Vitaminler Nikotinik asit 0.5 Pridoksin-HCI 0.5 Tiamin-HCI 0.1 Myo-inositol 100 Glisin 2 Sukroz 30000 Bacto-agar 7000 ph 5.8 30

3.2.8. Đstatistik Çalışmaları LD 50 değerinin tespitinde uygulanan doz miktarının fide boyu, kök uzunluğu ve yaşayan bitki sayısı üzerine etkilerini gösteren verilerin analizinde MSTAT-C paket istatistik programı kullanılmıştır. Fide boyu, kök uzunluğu ve yaşayan bitki sayısı için varyans analizi yapılmış, hesap edilen F değeri tablo değeri ile 0.01 ve 0.05 seviyesinde kontrol edilerek P olasılığı tespit edilmiştir. Ayrıca dozlarda fide boyu ve kök uzunluğuna ait değerlerin mukayesesi yapılarak r (korelasyon katsayısı) değerinin önemi hesaplanmıştır. Buğday x mısır melezleme tekniğinde kullanılan değişkenlerden alınan sonuçlar ile Berkmen 469 çeşidinin melezleme tekniğine verdiği cevabın tohum kabuğundan alınan veriler ile değerlendirilmesi; 0, 150 ve 250 Gray ile ışınlanmış grupların buğday x mısır melezlemesi ve sağlıklı embriyo oluşumuna etkileri karşılaştırılarak istatistiki olarak hesaplandı. Sonuçlar ki-kare (X 2 ) testi ile kontrol edildi. 31

4. BULGULAR 4.1. Berkmen 469 Çeşidine Ait Tohumların Farklı Gama Işın Dozlarıyla Işınlanması Sonucu Elde Edilen Bulgular Tetraploid Triticum durum Desf. Berkmen 469 DH-1 buğday eski ve yerel bir çeşittir. Ele aldığımız çeşidin tohumlarına kontrol de dahil olmak üzere 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 Gray gama ışınları kullanıldı. Tohumlara uygulanan dozlar fide boyunda belirgin bir azalmaya neden oldu. Fide boyundaki bu azalma uygulanan dozların artışına bağlı olarak doğrusal bir şekilde gerçekleşmemiştir. Yani fide boyundaki azalma 100, 150 Gray de belirgin bir şekilde görülürken 200, 250 Gray de azalma daha azdır, ancak 300, 350 Gray de yeniden belirgin bir azalma görülmüştür (Çizelge 4.1). Gama radyasyon dozlarının fide boyundaki azalmaya etkisi istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (P< 0.01) (Çizelge 4.2). Tohumlara uygulanan Gama radyasyonun artışına bağlı olarak kök uzunluğunda da belirgin bir azalma görülmüştür. Yine fide boyu değerlerinde görüldüğü gibi kök uzunluğunda da azalma doğrusal olmamıştır. Azalma 50, 100, 150 Gray de belirgin bir şekilde görülürken 250, 300 Gray de kök uzunluğu artmış ancak 350 Gray de yeniden kök uzunluğunda azalma görülmüştür (Çizelge 4.3). Uygulana gama radyasyon dozlarının kök uzunluğundaki azalmaya etkisi istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (P< 0.01) (Çizelge 4.4.) Dozun artışı ile fide boyu arasındaki ilişki negatif yönde önemlidir (r 1 = - 0,723). Dozun artışı ile kök uzunluğu arasındaki ilişki negatif yöndedir ancak önemli değildir (Çizelge 4.5). Fide boyu ile kök uzunluğu arasında ise korelasyon ilişkisi pozitiftir (r 3 = 0.576) (Çizelge 4.5). Yani fide boyundaki azalma ile kök uzunluğundaki azalma doğru orantılıdır. Kullanılan gama radyasyonun doz miktarına bağlı olarak birey sayısında azalma görülmüştür. Kontrol grubunda birey sayısı 150 iken 50 Gray de 147, 100 Gray de 142, ve 150 Gray de 138 e düşmüş 200 Gray de birey sayısı artarak 146 ya ulaşmış ve tekrar 300, 350 Gray de birey sayısı azalmıştır (Çizelge 4.6). Varyans analizi sonuçlarına göre gama radyasyonun artışının birey sayısına etkisi önemlidir (Çizelge 4.7). 32

Çizelge 4. 1. Çeşitli Gama radyasyon dozlarının Berkmen 469 dan elde edilen DH bitkilerde fide boyuna etkisi Dozlar (Gray) Kontrol 50 100 150 200 250 300 350 1. tekrar 25.45 25.42 16.52 17.36 20.58 20.90 20.23 16.91 2. tekrar 22.55 23.97 19.22 18.30 20.92 16.83 15.44 16.14 3. tekrar 24.07 22.63 17.85 21.00 19.34 22.21 15.35 13.34 Ortalama (X) 24.02 24.00 18.86 18.88 20.28 20.02 17.00 15.34 33

Çizelge 4.2. Fide boyu karakterinin varyans analiz tablosu Varyasyon Serbestlik Kareler Kareler Hesap Tablo F Kaynağı derecesi toplamı ort. F. %5 %1 Tekerrür 2 6,805 3,402 0,919 ö.d. 3,740 6,510 2,760 4,280 7,739 Faktör A 7 200,672 28,667 Hata 14 51,857 3,704 Genel 23 259,334 11,274 ö.d. = önemli değil * = önemli % 5 alfa seviyesinde ** = önemli % 1 alfa seviyesinde 34

Çizelge 4.3. Çeşitli Gama radyasyon dozlarının Berkmen 469 dan elde edilen DH bitkilerde kök uzunluğuna etkisi Dozlar (Gray) Kontrol 50 100 150 200 250 300 350 1.tekrar 30.17 24.25 17.92 17.42 20.06 23.55 25.79 19.61 2.tekrar 30.15 24.59 19.45 18.31 20.08 21.35 24.74 19.43 3.tekrar 29.93 21.35 21.04 19.62 19.48 22.59 22.44 21.40 Ortalama (X) 29.75 23.49 19.47 18.48 19.87 22.49 24.32 20.14 35

Çizelge 4.4. Kök uzunluğu karakterinin varyans analiz tablosu Varyasyon Serbest Kareler Kareler Hesap Toplam F Kaynağı derecesi toplamı ort. F. %5 %1 Tekerrür 2 0,307 0,154 0,083 ö.d. 3,740 6,510 Faktör A 7 283,199 40,465 2,760 4,280 21,989 Hata 14 25,821 1,844 Genel 23 309,317 13,449 ö.d. = önemli değil * = önemli % 5 alfa seviyesinde ** = önemli % 1 alfa seviyesinde 36

Çizelge 4.5. Çeşitli Gama radyasyon dozlarının Berkmen 469 dan elde edilen DH bitkilerde birey sayısına etkisi Dozlar (Gray) Kontrol 50 100 150 200 250 300 350 1.tekrar 50 50 47 46 48 49 46 44 2.tekrar 50 48 48 47 50 49 45 45 3.tekrar 50 49 47 45 48 48 45 43 Toplam( ) 150 147 142 138 146 146 136 131 X 37

Çizelge 4.6. Çimlenen bitki sayısı karakterinin varyans analiz tablosu Varyasyon Serbest Kareler Kareler Hesap Toplam F Kaynağı derecesi toplamı ort. F. %5 %1 Tekerrür 2 3,250 1,625 3,067 ö.d. 3,740 6,510 Faktör A 7 90,958 2,760 4,280 24,529 12,994 Hata 14 7,417 0,530 Genel 23 101,625 4,418 ö.d. = önemli değil * = önemli % 5 alfa seviyesinde ** = önemli % 1 alfa seviyesinde 38

Çizelge 4.7. Fide boyu, kök uzunluğu ve uygulanan gama radyasyon dozlarının korelasyon tablosu Doz Fide Boyu Kök Uzunluğu -0,723 1,000 Doz -0,399ö.d. 1,000 0,576-0,723 Boyu Fide 1,000-0,399ö.d. 0,576 Kök Uzunluğu ö.d. = önemli değil * = önemli % 5 alfa seviyesinde ** = önemli % 1 alfa seviyesinde 39

Çizelge 4.5. Mutagenik radyasyon kullanılarak DH bitkilerde (Berkmen 469' den üretilen) cinsler arası melezleme ile embriyo kurtarılması Doz (Gy Çimlene Bit. Kul. Bit. Kul. Başak Tozlanan Çiçek Tohum. Kab. Emb. Habloid Bit. Say. (n) Say. (n) Say. (n) Sayısı (n) Say.(n) Say.(n) Say.(n) 0 297 30 78 1531 257 1-150 286 39 69 1362 98 1-250 271 35 57 1154 69 - - Toplam( ) 854 104 204 4047 424 2 - X Tablo X P 40

Çizelge 4.9. Doz miktarındaki artışa bağlı olarak yaşayan bitki sayısının değişim grafiği Birey sayısı 160 155 150 145 140 135 130 125 120 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Doz (Gy) Çizelge 4.10. Doz miktarındaki artışa bağlı olarak fide boyu ve kök uzunluğu karakterlerinin değişim grafiği (cm) 35 30 25 20 15 10 5 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Doz (Gy) = Fide boyu P<0,01 ---------= Kök uzunluğu P<0,01 fide boyu- doz miktarı arasındaki korelasyon katsayısı (r 1 ): -0,723** kök uzunluğu- doz miktarı arasındaki korelasyon katsayısı (r 2 ): -0,399 ö.d. fide boyu kök uzunluğu arasındaki korelasyon katsayısı(r 3 ): 0,576** 41

4.2. Berkmen 469 x Mısır Melezlemesi Sonucu Elde Edilen Bulgular Bitkilerde tohum üç kısımdan oluşur; 1) Tohum kabuğu (testa), 2) Embriyo, 3) Endosperm. Testa tohumun diğer kısımlarını dış faktörlerden korur, tohuma belirli bir şekil verir ve sistematik çalışmalarda önemli bir yer tutar. Embriyo (2n) canlı organizmayı meydana getiren ilk hücre, döllenmiş yumurta hücresidir. Endosperm (3n) tohumun besin deposudur, buğday tanesinde bir sıra alevron tabakası içinde depo halinde karbonhidrattan meydana gelir. Çimlenen bitkinin ilk besin kaynağıdır. 4.2.1. Tohum Kabuğu Sayısı Melezleme çalışmasında toplam 854 bitki kullanılmıştır. Bu bitkilerden 279 tanesi kontrol grubuna, 286 tanesi 150 Gray le ışınlanan gruba ve 271 tanesi 250 Gray le ışınlanan gruba aittir. Çimlenen bitki sayısında ve kullanılan başak sayısında, kontrol grubundan 250 Gray a olan azalış X 2 testi ile önemli bulunmuştur (P< 0.05) (Çizelge 4.8). Tozlanan çiçek sayısın kontrol grubunda 1531 adet iken 150 gray ile ışınlanan grupta 1362 ve 250 gray ile ışınlanan grupta 1154 dür. Yapılan X 2 testinde tozlana çiçek sayısındaki azalış önemli bulunmuştur (P< 0.01) (Çizelge 4.8). Bu bitkilerden toplam olarak 4047 çiçek melezlenmiştir ve bunlardan 424 tanesi tohum kabuğu oluşturmuştur. Meydana gelen tohum kabuklarının 257 tanesi kontrol grubuna, 98 tanesi 150 Gray le ve 69 tanesi de 250 Gray le ışınlanan gruplara aittir. Işınlanan gruplardan meydana gelen tohum kabuğu sayısı kontrolle karşılaştırıldığında çok azdır ve bu azalma önemlidir (P< 0.05). 4.2.2. Embriyo Sayısı Toplam olarak iki embriyo oluşmuştur. Kontrol ve 150 Gray le ışınlana gruplarda birer embriyo elde edilirken 250 Gray le ışınlanan gruptan hiç embriyo elde edilmemiştir (Şekil4.1). 42

4.2.3. Haploid Bitki Regenerasyonu Yapılan çalışmada alınan haploid embriyolardan regenerant bitki verimi alınmamıştır. Şekil 4.1. Berkmen 469 çeşidinden alınan haploid embriyo 43