YÜKSEK LĐSANS TEZĐ. ZEBRA BALIKLARINDA (Danio rerio) GĐNOGENETĐK ÜRETĐM VE ÜRETĐMDE ETKĐLĐ BAZI FAKTÖRLERĐN ARAŞTIRILMASI

ĐSTANBUL ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ YÜKSEK LĐSANS TEZĐ ZEBRA BALIKLARINDA (Danio rerio) GĐNOGENETĐK ÜRETĐM VE ÜRETĐMDE ETKĐLĐ BAZI FAKTÖRLERĐN ARAŞTIRILMASI Rahmi Can ÖZDEMĐR Su Ürünleri Yetiştiriciliği Anabilim Dalı Danışman Yrd. Doç. Dr. Aygül EKĐCĐ Mayıs, 2012 ĐSTANBUL

ĐSTANBUL ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ YÜKSEK LĐSANS TEZĐ ZEBRA BALIKLARINDA (Danio rerio) GĐNOGENETĐK ÜRETĐM VE ÜRETĐMDE ETKĐLĐ BAZI FAKTÖRLERĐN ARAŞTIRILMASI Rahmi Can ÖZDEMĐR Su Ürünleri Yetiştiriciliği Anabilim Dalı Danışman Yrd. Doç. Dr. Aygül EKĐCĐ Mayıs, 2012 ĐSTANBUL

Bu çalı ma stanbul Üniversitesi Bilimsel Ara tırma Projeleri Yürütücü Sekreterli inin 10850 numaralı projesi ile desteklenmi tir. iv

ÖNSÖZ Çalı malarım boyunca gösterdi i her türlü destek ve yardımlarından dolayı çok de erli danı man hocam Yard. Doç. Dr. Aygül EK C ye; denemeler sırasında yardımlarını ve deste ini esirgemeyen çalı ma arkada ım Keriman YÜRÜTEN e; en önemlisi beni her zaman destekleyen annem Sema ÖZDEM R, babam Yard. Doç. Dr. Güven ÖZDEM R ve karde im Gözde Canan ÖZDEM R e en içten te ekkürlerimi bir borç bilirim. Mayıs, 2012 Rahmi Can ÖZDEM R i

Ç NDEK LER ÖNSÖZ... i Ç NDEK LER... ii EK L L STES... v TABLO L STES... vii SEMBOL L STES... viii ÖZET... ix SUMMARY... x 1. G R... 1 2. GENEL KISIMLAR... 2 2.1. ZEBRA BALI ININ (Danio rerio ( Hamilton-Buchanan 1822)) GENEL ÖZELL KLER... 2 2.1.1. Üreme Biyolojisi... 2 2.1.2. Yumurta ve Sperm Hücresinin Özellikleri... 3 2.1.2.1. Yumurta Hücresinin Morfolojisi... 3 2.1.2.2. Spermatozoa Morfolojisi... 3 2.1.2.3. Spermatozoa Motilitesi... 4 2.1.2.4. Spermatozoa Yo unlu u... 4 2.1.3. Döllenme ve Embriyonik Geli im... 5 2.2. B YOTEKNOLOJ K YÖNTEMLER... 5 2.3. C NS YET KONTROLÜ... 6 2.3.1. Do rudan Hormon Uygulama... 7 2.3.2. Dolaylı Hormon Uygulama... 7 2.4. KISIRLA TIRMA... 7 2.5. KROMOZOM MAN PÜLASYONU... 8 2.5.1. Poliploidi Uygulaması... 10 2.5.2. Androgenez Uygulaması... 11 2.5.3. Su ürünlerinde Ginogenez Uygulaması ve Önemi... 12 2.5.3.1. Ginogenez Uygulaması... 12 2.5.3.2. Su Ürünlerinde Ginogenez Uygulamasının Önemi... 14 2.5.3.3. Haploit ve Diploit Ginogenetik Balık Eldesi... 15 2.5.3.4. Mayoginogenez ve Mitoginogenez Yöntemleri... 17 ii

2.5.3.5. Haploit ve Diploit Balıkların Tespit Yöntemleri... 19 3. MALZEME VE YÖNTEM... 23 3.1. MALZEME... 23 3.1.1. Deneme Yeri... 23 3.1.2. Deneme Akvaryumları ve Kullanılan Suyun Özellikleri... 23 3.1.3. Deney Balıkları... 24 3.1.4. Zebra Balıklarında Cinsiyet Ayrımı... 24 3.1.5. Zebra Balı ı Yumurta ve Sperm Hücresi... 25 3.1.6. Üreme Döneminde Kullanılan Akvaryumlar ve Akvaryum Suyunun Özellikleri... 26 3.1.7. Döllenmi Yumurtaların Bakımı ve Suyun Özellikleri... 26 3.1.8. Larva Bakımı ve Su Özellikleri... 26 3.1.9. Çalı mada Kullanılan Cihaz ve Ekipmanlar... 31 3.1.10. Balık Yemleri... 31 3.1.11. Çalı mada Kullanılan Kimyasal Malzemeler... 31 3.1.12. Çalı mada Kullanılan Solüsyonlar ve çerikleri... 31 3.2. YÖNTEM... 33 3.2.1. Zebra Balı ının Laboratuara Ta ınması... 33 3.2.2. Zebra Balı ının Akvaryum Ortamına Aktarılması... 33 3.2.3. Zebra Balı ının Yemleme Programı... 33 3.2.4. Fotoperiyot Uygulaması... 33 3.2.5. Erkek ve Di i Balıklarda Cinsiyet Ayrımı... 33 3.2.6. Anaç Balık Akvaryumları... 34 3.2.7. In vitro Fertilizasyonda Kullanılacak Di i ve Erkek Anaç Zebra Balıklarının Seçimi... 34 3.2.8. Anestezi Uygulaması... 34 3.2.9. Erkek Balıktan Spermatozoa Eldesi... 35 3.2.10. Spermatozoa Sayımı... 35 3.2.11. Spermatozoa Aktivasyonu... 35 3.2.12. Di i Balıktan Yumurta Eldesi... 36 3.2.13. In vitro Fertilizasyon... 36 3.2.14. UV Uygulaması... 36 3.2.15. Sıcak ok Uygulaması... 37 iii

3.2.16. Embriyo ve Larva Bakımı... 37 3.2.17. Kontrol ve Ginogenetik Zebra Balıklarının Morfolojik ncelenmesi... 37 3.2.18. Karyotip Analizi... 38 3.2.18.1. Koryonun Uzakla tırılması... 38 3.2.18.2. Karyotip Analizi... 38 3.2.18.3. Kromozomların Yayılması... 38 3.2.19. statistiksel Analizler... 38 3.2.20. Osmotik Basınç Ölçümü... 39 4. BULGULAR... 40 4.1. SPERMATOZOA MOT L TES NE A T BULGULAR... 40 4.2. SPERMATOZOA YO UNLU UNA A T BULGULAR... 43 4.3. EMBR YO YA AMA ORANLARINA A T BULGULAR... 44 4.4. EMBR YO GEL M NE A T BULGULAR... 46 4.4.1. Kontrol Grubu Embriyo Geli imine Ait Bulgular... 47 4.4.2. Diploit Ginogen Embriyo Geli imine Ait Bulgular... 50 4.4.3. Haploit Embriyo Geli imine Ait Bulgular... 53 4.5. KARYOT P ANAL Z SONUÇLARINA A T BULGULAR... 58 4.5.1. Kontrol Grubu Zebra Balı ı Embriyolarına Ait Karyotip Analiz Sonuçları... 58 4.5.2. Haploit Ginogen Zebra Balı ı Embriyolarına Ait Karyotip Analiz Sonuçları... 59 4.5.3. Diploit Ginogen Zebra Balı ı Embriyolarına Ait Karyotip Analiz Sonuçları... 60 5. TARTI MA VE SONUÇ... 61 6. KAYNAKLAR... 66 7. ÖZGEÇM... 74 iv

EK L L STES ekil 2.1 : Döllenmi zebra balı ı yumurtasının görüntüsü... 3 ekil 2.2 : Zebra balı ı (Danio rerio) spermatazoonun ı ık mikroskobundaki görüntüsü... 4 ekil 2.3 : Triploidi uygulamasının ematik gösterimi... 10 ekil 2.4 : Tetraploidi uygulamasının ematik gösterimi... 11 ekil 2.5 : Androgenez uygulamasının ematik gösterimi... 12 ekil 2.6 : Haploit ve diploit ginogen zebra balı ı (Danio rerio) eldesi... 16 ekil 2.7 : Ginogenez ile mayoginogenetik balık eldesinin ematik gösterimi... 18 ekil 2.8 : Ginogenez ile mitotik ginogenetik balık eldesinin ematik gösterimi... 19 ekil 3.1 : Deney balıklarının bulundu u akvaryum düzene i... 23 ekil 3.2 : Di i zebra balı ı... 24 ekil 3.3 : Erkek zebra balı ı... 24 ekil 3.4 : Döllenmi yumurta hücresinin stereo mikroskop altındaki görüntüsü... 25 ekil 3.5 : Spermatozoon hücresinin ı ık mikroskobundaki görüntüsü... 25 ekil 3.6 : letkenlik ölçüm cihazı... 26 ekil 3.7 : ph ölçüm cihazı... 27 ekil 3.8 : Mikro-Osmometre cihazı... 27 ekil 3.9 : UV Translinker cihazı... 28 ekil 3.10 : Isıtma tablası... 28 ekil 3.11 : I ık mikroskobu... 29 ekil 3.12 : Stereo mikroskop... 29 ekil 3.13 : nvert mikroskop... 30 ekil 3.14 : Thoma lamı... 30 ekil 4.1 : Zebra balı ına ait spermatozoa motilite yüzdesine ait veriler... 40 ekil 4.2 : Zebra balı ı spermatozoası hayatta kalma süresinin zamana ba lı de i imi... 41 ekil 4.3 : Spermatoazoa yo unlu una ait veriler... 43 ekil 4.4 : Kontrol grubu embriyo 1000 hücre safhası..... 47 ekil 4.5 : 13-somit safhası... 47 ekil 4.6 : Kontrol grubu embriyoda notokord (n)... 48 ekil 4.7 : Kontrol grubu embriyoda göz (g) ve melanosit hücrelerin görüntüsü... 48 ekil 4.8 : Kontrol grubuna ait embriyoların genel görünümü... 49 ekil 4.9 :Kontrol grubu larvaya ait genel vücut yapısı... 49 ekil 4.10 : 17-somit safhasındaki diploit ginogen embriyo... 50 ekil 4.11 : 48 saatlik diploit ginogen embriyo... 50 ekil 4.12 : Diploit ginogen embriyo grubunun 75. saatteki geli imi... 51 ekil 4.13 : Diploit ginogen embriyoda larva çıkı ı ve 75. saatteki genel görünüm... 51 ekil 4.14 : Diploit ginogen embriyoda göz (g) melanosit (m), notokord ve otik plakod (op)... 52 ekil 4.15 : 78. saatte yumurtadan yeni çıkmı diploit zebra balı ı larvası... 52 ekil 4.16 : Bud safhası... 53 ekil 4.17 : 13-somit safhası... 53 ekil 4.18 : Haploit embriyoda kalp (k) yeri ve perikardiyal bo luk (pb)... 54 ekil 4.19 : Haploit ginogen embriyo grubunun 70. saatteki geli imi... 54 ekil 4.20 : Kısa vücut yapısına sahip anormal geli im gösteren haploit ginogen embriyonun görüntüsü... 55 ekil 4.21 : Haploit embriyoda notokord (n) görüntüsü... 55 ekil 4.22 : Haploit embriyoya ait kuyruk yapısı... 56 ekil 4.23 : Haploit embriyoda genel vücut yapısı... 56 ekil 4.24 : Haploit ginogen larvanın genel görünümü... 57 v

ekil 4.25 : Fertilizasyondan sonraki 5. günde tespit edilen ölü haploit zebra balı ı larvası... 57 ekil 4.26 : Kontrol grubu embriyoya ait kromozomların da ılımı... 56 ekil 4.27 : Haploit grubu zebra embriyosu kromozom da ılımı... 57 ekil 4.28 : Diploit ginogen embriyoya ait kromozomların da ılımı... 58 vi

TABLO L STES Tablo 2.1 : Kromozom manipülasyonu uygulaması... 9 Tablo 2.2 : Zebra balı ı (Danio rerio) üzerinde karyotip çalı maları... 22 Tablo 3.1 : Kimyasal malzeme listesi... 31 Tablo 4.1 : Spermatozoa örneklerinin zamana ba lı motilite de erleri... 40 Tablo 4.2 : Zebra balı ı spermatozoası UV öncesi ve sonrası motilite yüzdesine ait veriler... 42 Tablo 4.3 : Zebra balı ı spermatozoası UV öncesi ve sonrası motilite süresine ait veriler... 42 Tablo 4.4 : Erkek zebra balıklarında spermatozoa yo unlu unun (adet/ml) ya a ba lı de i imi... 43 Tablo 4.5 : Sıcak ok uygulaması sonucunda embriyoların hayatta kalma ve ölüm oranları (%)... 44 Tablo 4.6 : 41,4 C deki ok uygulaması sonucunda deney gruplarına ait ölüm yüzdesi (%)... 45 Tablo 4.7 : 41 C deki ok uygulaması sonucunda deney gruplarına ait ölüm yüzdesi (%)... 45 Tablo 4.8 : Kontrol ve ginogen gruplara ait embriyo geli imlerinin Kar ıla tırılması... 46 Tablo 4.9 : Kontrol ve ginogen gruplara ait embriyolarda tespit edilen kromozom sayıları... 60 vii

SEMBOL L STES nm : nano metre ml : mililitre l : mikrolitre sp : spermatozoon UV : ultraviyole C : derece santigrat prim : primordium RNA : ribonükleik asit DNA : deoksiribonükleik asit NaCl : sodyum klorür KCl : potasyum klorür Na 2 HPO 4 : sodyum monofosfat K 2 H 2 PO 4 : potasyum difosfat CaCl 2 : kalsiyum klorür MgSO 4 : magnezyum sülfat NaHCO 3 : sodyum bikarbonat dh 2 O : distile su g : gram kg : kilogram : gama ms/cm : milisiemens/santimetre sn : saniye viii

ÖZET Zebra Balıklarında (Danio rerio) Ginogenetik Üretim ve Üretimde Etkili Bazı Faktörlerin Ara tırılması Çalı mada ginogen zebra balı ı elde edilmesi amacıyla, 2 dakika süreyle UV ı ınlarına maruz bırakılan spermatozoa dölleme i leminde kullanılarak haploit ginogen elde edilmi tir. Diploit ginogen elde edilmesi amacıyla ise haploit olan zigot fertilizasyondan 10 dakika sonra 2 dakika süreyle sıcak ok uygulamasına maruz bırakılmı tır. Ginogen balık üretiminde etkili faktörlerden biri olan sıcaklık dikkate alınarak ok uygulamasında 41,4 C ve 41 C olmak üzere iki farklı sıcaklık uygulanmı tır. Bu uygulamalar sonucunda, 41,4 C de hayatta kalma oranlarının 12-24-48 ve 72. saatlerde 41 C deki hayatta kalma oranlarına göre daha yüksek oldu u (P<0,05) tespit edilmi tir. Yumurtadan larva çıkı oranları 72-78.saatler arasında yapılan incelemelerde 41,4 C ok uygulaması sonucunda kontrol, diploit ginogen ve haploit ginogen gruplarda sırasıyla; %75±5, %17,3±3 ve %0,5±0,5 olarak tespit edilmi ve 41 C lik ok uygulamasında ise yine sırasıyla; %80±6, %14±2 ve hayatta kalan embriyo olmadı ı (P<0,05) gözlemlenmi tir. Karyotip analizi sonucunda; diploit ginogen embriyoda kromozom sayısı 2n=50 olarak tespit edilmi ken; haploit ginogen embriyolarda kromozom fragmentlerinde parçalanmalar tespit edilmi tir. Fertilizasyondan sonraki 3. günde haploit ginogen embriyoların boy uzunluklarının kontrol ve diploit ginogen gruplara göre %39,6 oranında daha kısa ve vücut kalınlı ının ise %33,3 oranında daha kalın oldu u tespit edilmi tir. ix

SUMMARY A Research on Gynogenetic Production of Zebrafish (Danio rerio) and Some Effecting Factors on Production The present study aimed to obtain gynogenetic zebra fish. For this purpose, zebra fish spermatozoa exposed to UV irradiation for 2 minutes in order to obtain haploid gynogenetic fish. In order to obtain gynogenetic diploid fish; heat shock was applied to haploid zygote 10 minutes after fertilization for 2 minutes at 41,4 C and 41 C. Temperature, which is an important factor of the production, is taken into consideration in this study. In this respect, this study compared the results of 41,4 C and 41 C shock applications and found that 12 nd - 24 th -48 th -72 nd hour survival rate was maximum at 41,4 C (P<0,05). When considered from hatching rate (72 th -78 th hour) view at 41,4 C was 75±5% in control group, was 17,3±3%in gynogenetic diploid group and 0,5±0,5% in haploid group and shock application at 41 C survival rate was 80±6% in control group, 14±2% in gynogenetic diploid group and there is no survivor in haploid group, was observed (P<0,05). The result of the karyotype analysis in haploid gynogenetic embryos, ruptured chromosome fragments was identified. Also in karyotype analysis of diploid gynogenetic embryos, 2n=50 chromosomes was identified. On 3 rd day after fertilization, total body length of the haploid gynogenetic fish was 39,6% shorther and body thickness was 33% thicker than the diploid gynogenetic group. x

1 1. G R Su ürünleri, dünyada yeti tiricilik yoluyla elde edilen ürünler içerisinde en hızlı büyüme gösteren sektördür. Yıllık büyüme oranı % 3.1 olan kara hayvanı üretimi, yıllık büyüme oranı %1.6 olan balıkçılık ile kar ıla tırıldı ında %10 a yakla an bir büyüme hızına sahiptir (Aydın ve ark, 2007). Su ürünlerine olan talebin giderek artması ve avcılık yolu ile elde edilen balı ın sınırlı seviyede olması su ürünleri sektörünün hızla geli mesine olanak sa lamı tır. Bu nedenle su ürünleri sektörünün, gelecek yıllarda besin ihtiyacının kar ılanmasında mevcut üretim sistemleri içinde büyük potansiyele sahip olaca ı ifade edilmektedir (Lymbery, 2000). Birçok alanda kullanılabilen biyoteknoloji, su ürünlerinde 1980 li yıllarda uygulama alanına sahip olmu tur. Bu ba lamda su ürünlerinde üretimi arttırma amacıyla, biyoteknolojik uygulamaların geleneksel yeti tiricilik metodlarıyla birlikte kullanılması yönünde çalı malar yapılmaktadır. Ancak bu çalı malar a ırlıklı olarak laboratuvar çalı malarıyla sınırlı kalmı tır (Turan, 2000). Bu uygulamalar içerisinde sperm kriyoprezervasyonu, gen transfer teknolojisi, kromozom manipülasyonu yer almaktadır. Su ürünlerinde yo un uygulama alanına sahip olan kromozom manipülasyon teknikleri kullanılarak poliploit balık üretilece i gibi ginogen ve androgen balık üretimi de mümkün olmaktadır (Bhise ve Khan, 2002). Bu çalı mada, kromozom manipülasyon tekniklerinden ginogenez tekni i kullanılarak kromozom sayısı ve özelli i (haploit-diploit) de i tirilmi zebra balı ı elde edilerek yumurtadan çıkı ve hayatta kalma oranlarının belirlenmesi, yumurtadan çıkan larvalara karyotip analizleri yapılarak kromozom yapılarının incelenmesi hedeflenmi tir.

2 2. GENEL KISIMLAR 2.1. ZEBRA BALI I NIN (Danio rerio Hamilton, 1822) GENEL ÖZELL KLER Anavatanı Hindistan olan zebra balı ının di er ya am alanları ise Pakistan, Banglade, Nepal ve Myanmar dır. Suyun üst kısımlarında gezmeyi seven zebra balı ı hareketli olup omnivor beslenme alı kanlı ına sahiptir (Alpbaz, 2000). Akvaryum ko ullarında, su sıcaklı ı 22-27 C ve ph 6,5-7,5 arasında olmalıdır (Hekimo lu, 2009). Zebra balı ı larvası vitellus kesesi tüketimini takiben zooplankton, böcek, böcek larvası ve fitoplanktonla beslenirler. Bunların dı ında küçük kabuklular ve tubifeks kurtlar da besinini olu turmaktadır (Alpbaz, 2000; Anthony ve ark., 2009). Barı çıl ve aktif bir balık olan zebra balı ı do ada 6,4 cm boy uzunlu una ula ırken, akvaryum ortamında en fazla 5 cm uzunlu a ula ır (Hekimo lu, 2009). 2.1.1.Üreme Biyolojisi Zebra balı ı (Danio rerio), yumurtadan çıkı ı takip eden 2,5-3 ay içerisinde 26-28 C su sıcaklı ında üreme olgunlu una ula ır (Alpbaz, 2000; Ekici, 2007). Zebra balı ı üreme olgunlu una eri ti inde, erkek balık di i balı ı kovalamaya ba layarak yumurta dökmesi için zorlar. Bir di i zebra balı ı yakla ık 100-300 adet yumurta bırakır (Mills, 1986). Erkek balı a ait spermatozoanın yumurtaların üzerine bırakılmasıyla yumurta hücresi döllenir ve embriyonik geli im ba lar. Döllenmi yumurtalarda embriyo geli imi mikroskop altında gözlemlendi inden zebra balı ı farklı amaçlarla yapılan ara tırmalarda model balık olarak kullanılmaktadır (Wolenski ve Hart, 1987). Embriyonik geli im oldukça hızlıdır ve döllenmeden 36 saat sonra temel organlar meydana gelmi olur (Westerfield, 1995; Ekici, 2007). Larva çıkı ı döllenmeden sonraki 48-72 saat içinde 26.5-28.0 C su sıcaklı ında gerçekle ir (Westerfield, 1995; Alpbaz, 2000; Ekici, 2007).

3 2.1.2. Yumurta ve Sperm Hücresinin Özellikleri 2.1.2.1. Yumurta Hücresinin Morfolojisi Farklı balık türlerine ait yumurta hücresinin morfolojik yapısı birbiriyle benzerlik göstermektedir. Balık yumurtası; chorion adı verilen bir yumurta kılıfı ile çevrili olup, animal ve vejetatif kutup olmak üzere 2 parçaya ayrılır. Bunlar oogenez sırasında yumurta folikülünü çevreleyen zona radiata ile temas halindedir ve fertilizasyon sırasında perivitellin bo lu un olu umunda önemli rol oynar. Balık yumurtasının yüzeyinde bulunan mikrofil deli i vasıtasıyla sperm hücresinin yumurta hücresi içerisine giri i ile fertilizasyon gerçekle ir (German ve ark., 2001; Sava, 2001). Zebra balı ının yumurta hücresi 0,7-0,8 mm çapında olup büyük bir bölümü vejetatif kutuplu yumurta kesesinden olu ur (ùekil 2.1) (Kimmel ve ark., 1995; Poleo ve ark., 2001). ùekil 2.1 Döllenmiú zebra balı ı yumurtasının görüntüsü 2.1.2.2. Spermatozoon Morfolojisi Spermatozoon morfolojik olarak; baú, boyun ve kuyruk bölümden oluúmaktadır. Ancak; baú bölgesinin morfolojik yapısı (ince-uzun, elipsoidal ya da küresel) türlere göre farklılık göstermektedir (Jamieson, 1991). Zebra balı ına ait sperm hücresinin baú kısmı morfolojik olarak küçük, yuvarlak yapılı ve küçük bir ba lantı kısmı ile birlikte uzamıú küre úeklindedir (ùekil 2.1). Iúık mikroskobu kullanılarak yapılan ölçümlerde spermatozoonun baú kısmının yaklaúık 2,2 ȝm ve kuyruk uzunlu unun ise yaklaúık 28 ȝm oldu u tespit edilmiútir (Hagedorn ve ark., 2009).

4 ekil 2.2 Zebra balı ı (Danio rerio) spermatozoonunun ı ık mikroskobundaki görüntüsü (Hagedorn ve ark., 2009) 2.1.2.3. Spermatozoa Motilitesi Testis dokusu içerisinde bulunan spermatozoa hareketsiz olup su ile temas etmesi durumunda hareketlilik (motilite) kazanır. Genellikle her balık türüne ait spermatozoa motilite süresi farklılık göstermekle birlikte motilite süresi oldukça kısadır. Çe itli balık türlerine ait spermatozoa motilitesinin; gökku a ı alabalı ında (Oncorhynchus mykiss) 40-51 sn, sazan balı ında (Cyprinus carpio) 50 78 sn, zebra balı ında (Danio rerio) 35-60 sn ve lepistes balı ında ise (Poecilia reticulata) 30-40 sn oldu u tespit edilmi tir (Tabako lu, 2005; Jonas ve ark., 2007; Rongyan ve ark., 2009; Gasparini ve ark., 2009). 2.1.2.4. Spermatozoa Yo unlu u Hücre sayımında yaygın olarak kullanılan metodlardan hemositometrik sayım (Davis, 2002) çe itlerinden biri olan Thoma lamı kullanılarak gerçekle tirilen sayım; mikrobiyolojide maya sayımında, tıpta spermatozoa ve kan sayımında kullanılmaktadır. Lamın çukur bir kısmı vardır. Kültür, bu kısım üzerine aktarılıp, lamel kapatıldı ında bu çukurda 0,1 mm yüksekli inde bir sıvı kalır. Sayım yapılacak alan cam yüzeyindeki çizgilerle belirlenmi tir. Lamel konduktan sonra üzerine bastırılarak lamın çukuru dı ında kalan düz kısmı ile lamel arasında bir sıvı katmanının kalması önlenir. Böylece çukur alan içinde tam olarak 0,1 mm yüksekli inde sıvı bulunması sa lanmı olur. Thoma lamında 16 büyük kare, her büyük karede 25 küçük kare olmak üzere toplam 400 küçük kare vardır. 25 küçük karenin dı ve iç kenarlar arasında ayrım için birer satır ve sütun sayım yapılırken kullanılmaz. Bu kenarların içerisinde kalan 16 küçük kare içerisinde sayım yapılır. Sayım sonucu elde edilen hücre adeti, 10000 ile çarpılarak 0,1mm 3 te ki hücre yo unlu u hesaplanmı olur (Gürgün ve Halkman, 1990).

5 2.1.3. Döllenme ve Embriyonik Geli im Yumurtalar suya bırakıldı ında döllenme olmadan, II. mayotik bölünmenin metafaz II safhasında balık yumurtalarının genomu olu ur. Yumurtanın aktivasyonu ile bölünme tamamlanır ve 2. kutup hücresi animal kutuba do ru itilir. Geriye kalan haploit kromozom takımı bir di i pronukleusu olu turur. Bu olay döllenmeden ayrı olarak gerçekle ir ve zebra balı ı yumurtalarında da oldu u gibi su ile temas eden bütün yumurtalarda bu yapı görülür (Wolenski ve Hart, 1987). Spermatozoon, kemotaksi ile yolunu bularak kuyruk hareketleri sonucunda mikrofil deli inden yumurtaya giri yapar (Amanze ve Iyengar, 1990). Ço u balık türünde mikrofil deli inin çapı tek bir spermatozoonun girebilece i büyüklüktedir (Kudo, 1980). Spermatozoonun ba kısmı mikrofil deli inden içeri girdikten sonra kuyruktan ayrılır. Çekirdek bundan hemen sonra 180 döner ve aynı zamanda yumurtada i me ba lar. Nukleusun kromatin iplikleri gev er ve spermatazoon nukleusu ince kromatinlerle hafif veziküler erkek pronukleusuna do ru ilerler. Bu yapı; sperm hücresinin sentrozomu etrafında ekillenir ve spermaster olarak adlandırılır ve di i pronukleusuyla kar ı kar ıya gelecek ekilde animal kutubun tam ortasındaki erkek pronukleusuna do ru ilerler. Her iki pronukleus birbirine yakla ır ve i iplikleri onları yakalar. Daha sonra pronuklei yava ça parçalanır ve kromozomlar kendi karakteristik gruplarını olu turur. Sonuç olarak; i iplikleri ilk mitotik bölünmede kromozomları kutuplara çeker ve mitotik bölünmeler ba lar (Dettlaff ve ark., 1993). Zebra balı ı embriyolarının döllenmesini takiben 26-28 C su sıcaklı ında 48-72. saatte larva çıkı ı gerçekle ir. Yumurta döllendikten 48 saat sonra embriyoda gözler, deride pigmentasyon, omurga, kan dola ımı, kalp atı ı ve vitellüs kesesinden beslenme gözlemlenebilmektedir. Döllenmeyi takip eden 70. saatte embriyo chorion u yırtarak çıkma e ilimindedir (Westerfield, 1995; Ekici, 2007). 2.2. B YOTEKNOLOJ K YÖNTEMLER Günümüzde balık yeti tiricili inde teknolojideki geli melere paralel olarak, üretimi yapılan balık türlerinin et kalitesinin ve döl veriminin arttırılması, hastalıklara toleranslı balıkların elde edilmesi amacıyla çe itli çalı malar yapılmaktadır. Bu amaçla yapılan çalı malar geleneksel yeti tiricilik teknikleri ve biyoteknolojik metodların bir arada

6 kullanılması ile elde edilmektedir (Purdom, 1983; Sheperd ve Bromage, 1990; Turan, 2000). Bu ba lamda balık yeti tiricili inde uygulanan biyoteknolojik yöntemler 4 ana ba lık altında ele alınmaktadır (Purdom, 1983; Thorgaard, 1983; Thorgaard, 1995). Bunlar; a) Cinsiyet kontrolü (Do rudan hormon uygulaması, dolaylı hormon uygulaması ve kısırla tırma uygulamaları) b) Kromozom manipülasyonu (poliploidi, ginogenez ve androgenez) c) Sperm kriyoprezervasyonu; çe itli balık türlerine ait genetik materyalin -196 C deki sıvı azot içerisinde uzun süreli muhafazasına olanak sa lar. Bu uygulama ile üreme mevsimi dı ında da döl elde edilir ve ayrıca nesli tehlike altında olan türlerin genetik materyalinin muhafazası i lemi gerçekle tirilir (Beaumont ve Hoare, 2003; Ekici, 2011). d) Gen transferi; rekombinant DNA teknolojisi ile elde edilen gen konstraktı döllenmi balık yumurtasının blastodiskine aktarılarak kromozomal replikasyonda yerini alır ve o hücrenin kalıtım materyalinin bir parçası haline gelir (Purdom, 1993; Ekici, 2007). Su ürünlerinde ço unlukla laboratuvar çalı malarıyla sınırlı kalan gen transfer çalı maları; hızlı büyüme, so u a ve tuzlulu a tolerans ve hastalıklara kar ı direnç kazandırma konuları üzerinde yo unla mı tır (Jiang, 1993). 2.3. C NS YET KONTROLÜ Aynı türe ait erkek ve di i balıklarda ikincil e eysel özelliklerin bir sonucu olarak geli mede farklılıklar görülür ve bu farklılıklar bazı türlerde çok az iken bazılarında ise oldukça belirgindir (Özden ve Güllü, 1996; Timur, 2011; Timur ve Ekici, 2009). Ekonomik açıdan de erlendirildi inde erkek ve di i balıklar arasındaki bu farklılık cinsiyet kontrolünün öneminin anla ılmasına yardımcı olur (Özden ve Güllü, 1996). Bu farklılı ın sonucu olarak balık büyüklüklerinin aynı olmaması bu balıkların satı ında sıkıntı ya anmasına neden olur. Kültürü yapılan türlerden biri olan gökku a ı alabalı ında (Oncorhynchus mykiss); di i balık erkek balı a göre daha hızlı büyür, et kalitesi daha iyi olup hastalıklara daha toleranslıdır (Özden ve Güllü, 1996). Erkek alabalık yeti tiricilik ko ullarında yakla ık 1 yıl sonunda seksüel olgunlu a ula ır ve büyümenin yanı sıra gonad geli imi için de enerji harcandı ından et verimi dü ük olur. Bu sorunların giderilmesi amacıyla cinsiyet dönü ümü ve tek cinsiyetli stokların üretimi yönünde çalı malar yapılmaktadır (Sheperd ve Bromage, 1990). Bu ba lamda tek

7 cinsiyetli ve kısır popülasyonlar elde edilmesinde; do rudan hormon uygulaması, dolaylı hormon uygulaması ve kısırla tırma uygulamaları yapılmaktadır (Purdom, 1983; Sheperd ve Bromage, 1990; Purdom, 1993). 2.3.1. Do rudan Hormon Uygulama Ço u balıkta seksüel geli im, genellikle larval safhada meydana gelmektedir (Degani, 1985). Fenotipik cinsiyetin de i tirilebilece i bu dönem balık türlerine göre de i iklik göstermektedir. Vitellus kesesini tüketmi bir larvanın bu dönemde anabolik steroidleri absorbe etmesi durumunda cinsiyet hücrelerinin geli imi gerçekle ir. Embriyonun genetik yapısına kar ılık, bu a amada meydana gelecek modifikasyonlar, e ey hücrelerini ya ovaryum ya da testis olacak ekilde programlar. Bu nedenle bu dönemde yapılacak bir manipülasyon uygulaması ile cinsiyet kontrolü sa lanır (Degani, 1985; Sheperd ve Bromage, 1990; Lone ve Ridha, 1993; Turan, 2000). 2.3.2. Dolaylı Hormon Uygulama Dolaylı hormon uygulaması, çaprazlamalar sonucu elde edilen balıklara hormon verilerek gerçekle tirilir ve bu uygulama sonucunda süper erkek veya süper di i balıklar elde edilir (Purdom, 1993). 2.4. KISIRLA TIRMA Yeti tiricilikte, normalden daha hızlı büyüyen ve daha fazla et ba lama potansiyeline sahip balıkların üretimi amaçlanmaktadır. Normal ko ullarda balık geli imi süresince büyümenin yanı sıra gonad geli imi içinde enerji harcadı ından verim dü ük olur. Bu sebepten dolayı seksüel olgunla ma ile ilgili birçok önemli sorun tek cinsiyetli stokların üretilmesiyle giderilmesine kar ın, tümüyle di i veya erkek stoklar olgunla madan önce satı a sunulmazsa üretimde olgunla ma ile ilgili kayıplar devam edecektir. Bu sorunların giderilmesi amacıyla kısırla tırma yöntemi uygulanmaktadır. Kimyasal, hormonal, triploidi ve radyasyon uygulamaları içinde yaygın olarak kullanılan kısırla tırma metodu kromozom manipülasyon metodlarından biri olan triploidi uygulamasıdır (Jungalwalla, 1991; Sheperd ve Bromage, 1990).

8 2.5. KROMOZOM MAN PÜLASYONU Balık hücrelerinin ço u di i ve erkek balıklardan gelen 2 kromozom setine sahiptir (Tave, 1986). Gametlerde bu sayı yarıya dü er ve anaç balıklardan gelen setlerden sadece biri döllere geçer. Bu indirgeme i lemi, kromozom manipülasyonlarının anla ılmasında temel noktadır (Arai, 2001). Normal fertilizasyonda haploit sperm hücresi yumurtayı döllerken di iye ait setlerden birisi ( kinci polar cisim) 2. mayotik bölünmenin tamamlanmasıyla kaybolur ve böylece ba langıçtaki embriyonik hücre 2 kromozom seti (biri erkek balı a di eri ise di i balı a ait) içerir (Manickman, 1991; Johnstone, 1992). Kromozom düzeyinde mayotik ve mitotik olaylara farklı amaçlar do rultusunda yapılan çe itli manipülasyon i lemleri vardır (Chourrout, 1980; Purdom, 1993; Colombo ve ark., 1995; Rothbard ve ark., 1999; Galbusera ve ark., 2000). Bu manipülasyon i lemleri; ginogenez (mayoginogenez ve mitoginogenez), androgenez ve poliploidi (triploidi ve tetraploidi) uygulamaları olarak sınıflandırılmaktadır (Tave, 1986). Balıkların büyük bir kısmında dı döllenme meydana geldi inden çe itli manipülasyon uygulamalarıyla kromozom sayısı kısmen de i tirilebilir (Thorgaard, 1983; Arai, 2001). Kromozom manipülasyonu; gametlerin (sperm veya yumurta hücresi) genomlarının tahrip edilmesi için UV, ı ınları ile kimyasal mutajenler ve diploit yapının sa lanması amacıyla farklı ok uygulamaları kullanılarak gerçekle tirilir (Cherfas ve ark., 1990; Manickman, 1991). Bu amaçla, sıcak veya so uk ok, hidrostatik basınç ve kimyasal maddeleri (Kol isin, Sitokalasin B ve N 2 O gibi) içeren çe itli ok uygulamaları gerçekle tirilmektedir (Diter ve ark., 1993; Manickman, 1991; Purdom, 1993; Teskeredzic ve Donaldson, 1993; Malison ve ark., 1993; Jungalwalla, 1991). Bu teknikler içerisinde en yüksek ba arı oranı basınç oku uygulamasında elde edilmesine kar ın di er metodlara göre maliyetinin daha yüksek oldu u bildirilmektedir (Malison ve ark., 1993; Purdom, 1993). Ultraviyole (UV) kullanılarak yapılan ok uygulaması, ucuz ve kullanı lı olması nedeniyle di er ok uygulamalarına göre daha çok tercih edilmektedir (Refstie, 1983; Goryczko ve ark., 1991; George ve ark., 1994; Cherfas ve ark., 1990; Malison ve ark., 1993; Rothbard, 1994). Kromozom manipülasyon teknikleri ve manipülasyon sonucunda elde edilen balı ın kromozom yapısı ile seksüel yapısı tablo (2.1) de gösterilmi tir.

9 Tablo 2.1 Kromozom manipülasyon uygulaması (Thorgaard, 1995) Yumurta ve Sperm Hücresi Döllemeden önce ı ın uygulaması -------- Sperm Hücresi Yumurta Hücresi lk mitotik ok uygulama amacı Polar cisim lk mitotik bölünme Polar cisim lk mitotik bölünme bölünme Heterozigot Uygulama sonucu Triploit Tetraploit ginogenetik Heterozigot ginogenetik Homozigot ginogenetik Homozigot ginogenetik Kısır erkek (XXY) Seksüel karakteristikler ve kısır di i (XXX) Döl verimli erkek (XXYY) ve Döl Di i (XX) Di i (XX) Di i (XX) Erkek (XY) verimli di i (XXXX)

10 2.5.1. Poliploidi Uygulaması Normal ko ullarda bir canlının somatik hücrelerindeki kromozom sayısı 2n dir. Bir genomdaki kromozomların ok uygulamaları ile 3 veya daha fazla kata yükseltilmesine poliploidi adı verilmektedir (Lutz, 2001; Timur ve Ekici, 2009). Döllenmeden hemen sonra uygulanan çevresel ok uygulamaları sonucunda elde edilen triploit balıklar üç kromozom setine (3n) sahip olup kısırdırlar ( ekil 2.3). Triploidi tekni i; ginogenez i lemine benzemekle beraber, bu yöntemde radyasyona maruz bırakılmamı normal spermatozoa kullanılır (Özden ve ark., 2003; Turan, 2000; Purdom, 1983). ekil 2.3 Triploidi uygulamasının ematik gösterimi (Lutz, 2001) Birçok balık türünde triploit balıklar diploitlere kıyasla daha iyi ya ama, büyüme ve yem dönü üm oranına sahiptirler. Fakat bu özellikler seksüel olgunla manın ba langıcına kadar kendini göstermemektedir (Kerby ve Harell, 1990). Triploidi uygulamaları ço unlukla kısır salmonid türlerin elde edilmesi amacıyla kullanılmakta ve su ürünleri endüstrisi açısından birçok avantaj sa lamaktadır. Bu tür manipülasyonların en önemli yararı, metabolik enerjinin gamet üretimi yerine somatik büyüme için kullanılmasıdır (Teskeredzic ve Donaldson, 1993). Triploit balık üretimi, verimlili i artırma çalı malarının yanı sıra biyoteknolojik bir araç olarakta kullanılabilmektedir (Özden ve ark., 2003). Örne in, triploit ot sazanı kısır olması nedeniyle rutin olarak yeti tiricilik yapılan havuzların biyolojik kontrolünde kullanılmaktadırlar (Kerby ve Harell, 1990; Lincoln ve Bye, 1989; Purdom, 1993).

11 Tetraploidi uygulaması ile 4 kromozom setine (4n) sahip balıklar elde edilir. Normal bir yumurta hücresi aktif spermatozoon tarafından döllendikten sonra ilk mitotik bölünme sırasında ok uygulanması ile 4n kromozomlu balıklar (tetraploit) elde edilir ( ekil 2.4) (Özden ve ark., 2003; Ünlü, 2004). Elde edilen tetraploit balıkların diploit balıklarla çaprazlanarak triploit balıkların üretimi sa lanır (Johnstone, 1991). ekil 2.4 Tetraploidi uygulamasının ematik gösterimi (Lutz, 2001) Diploit di ilerin tetraploit erkekler tarafından döllenme oranı normal erkek balıklara kıyasla daha dü üktür. Bu durumun spermatozoon ba ının çapıyla ilgili oldu u ifade edilmektedir (Johnstone, 1991). Bu ba lamda triploit balık üretiminde, tetraploit di ilerin diploit erkekler tarafından döllenmesi ile döllenme ba arısının arttırıldı ı ifade edilmektedir. Bununla birlikte, tetraploit balık üretimi kolay olmamasına ra men gökku a ı alabalıklarında ba arılı tetraploit balık eldesi çalı maları yapılmaktadır (Johnstone, 1991). 2.5.2. Androgenez Uygulaması Androgenez; (gama), X veya UV (ultraviole) ı ınları kullanılarak genetik materyali tahrip edilen yumurta hücresinin normal sperm hücresi ile döllenmesi ve embriyo geli iminin spermatozoaya ait kromozom setinden devam etmesi olayıdır (Purdom, 1993). Androgenetik zigotun ilk bölünme safhasında ok uygulaması (basınç, kimyasal ve sıcaklık) yapılarak hücre bölünmesi engellenir. Böylece elde edilen androgen, erkek balıktan gelen diploit yapıdaki kromozom setine sahip olur (Bhise ve Khan, 2002) ( ekil 2.5).

12 ekil 2.5 Androgenez uygulamasının ematik gösterimi (Lutz, 2001) Androgenez uygulaması; gökku a ı alabalı ı (Oncorhynchus mykiss), ot sazanı (Ctenopharyngodon idella), adi sazan (Cyprinus carpio), dere alabalı ı (Salvelinus fontinalis) ve beyaz mersin (Acipenser transmontanus) türlerinde ba arıyla gerçekle tirilmi tir (Turan, 2000; Rothbard ve ark., 1999). Kendi kendini e leyen kromozomlar tek bir kromozom takımından geldi inden yüksek derecede akraba ve %100 homozigotturlar. Böyle balıklarda ölüm oranı yüksektir, çünkü herhangi bir mutant çekinik allel mevcut ise bu uygulama sonucunda açı a çıkmaktadır (Turan, 2000). Yapılan uygulama ve ara tırma sonuçlarına göre zebra balıklarında lethal mutant çekinik allel genin mevcut olmadı ı bildirilmi tir (Walker ve Walsh, 2009). 2.5.3. Su Ürünlerinde Ginogenez Uygulaması ve Önemi 2.5.3.1.Ginogenez Uygulaması Kromozom manipülasyon tekniklerinden biri olan ginogenez uygulaması, erkek balı a ait genetik materyalin etkisini ortadan kaldırmak amacıyla mutajenlerle muamele edilen spermatozoanın normal yumurta hücrelerini döllemesi olarak ifade edilir (Thorgaard, 1983; Purdom, 1993; Jiang, 1993). Yani yumurtalar biyolojik olarak aktif; ancak genetik açıdan etkisiz olan spermatozoa tarafından döllenirler (Dunham, 2004; Ekici, 2011). Söz konusu bu spermatozoon yumurta hücresini dölledi inde hücre içi mekanizma harekete geçerek ikinci polar cismi çıkarır. Bu kritik noktada sıcak, so uk ya da basınç gibi fizyolojik ok uygulamalarından biri kullanılarak ikinci polar cismin çıkı ı engellenir ve embriyonun diploitlik durumu tekrar sa lanır. Uygulanan bu oklar, mikrotübülleri tahrip ederek hücre bölünmesini engeller (Galbusera ve ark., 2000).

13 lk kez 1911 yılında Hertwig ve 1983 yılında Thorgaard, kurba a spermatozoasını radyum-gama ı ınlarına maruz bırakarak ginogenetik embriyoları elde etmi lerdir (Karayücel, 1999). Omurgalılarda spontane geli en ginogenez ise sürüngen, amfibi hayvanlar ve teleost balıklarda tespit edilmi tir (Komen ve Thorgaard, 2007). Dü ük dozda uygulanan gama ı ınları spermatozoa genomunu tamamen tahrip etmedi inden dü ük ya ama oranının elde edildi i, yüksek doz uygulandı ında ise spermatozoa genomunun tamamen tahrip edilmesi nedeniyle ya ama oranının arttı ı tespit edilmi tir. Bu doza ba lı etkiye Hertwig Etkisi adı verilmektedir (Karayücel, 1999; Karayücel ve Karayücel, 2000; Dahm ve ark., 2005). Ginogenez uygulaması ile akraba hatların ve tek cinsiyetli popülasyonların üretimi gerçekle tirilir. Yüksek derecede akraba olan balıkların üretiminde kullanılabildi inden, teleost balıklarda akrabalı yeti tirme çalı malarında tercih edilen bir metoddur (Galbusera ve ark., 2000; Turan, 2000). Sperm hücresinin kalıtım materyali mutajenlerle etkisiz hale getirildi inden farklı balık türlerinden elde edilen sperm hücreleri de yumurtaların döllenmesinde kullanılabildi i ifade edilmektedir (Purdom, 1983). Bu çalı malarda ginogenez uygulamasının ba arılı olup olmadı ının anla ılması amacıyla farklı tür yada varyetede ki balık türlerine ait spermatozoa veya yumurta hücresi kullanılmaktadır. Balı ın vücut veya yüzgeç ekli gibi morfolojik özelliklerine dayanarak de erlendirme yapılmaktadır (Paschos ve ark., 2001). Ginogenez metodu ile sadece di i balı a ait kalıtım materyalini ta ıyan nesillerin elde edilmesi amaçlanmaktadır (Thorgaard, 1983). Bu amaçla, X veya UV ı ınları kullanılarak genetik materyali tahrip edilmi spermatozoa yumurta hücresinin döllenmesinde kullanılır (Purdom, 1993). Spermatozoaya ait kalıtım materyalinin tahrip edilmesinde kullanılan iyonize ı ınlar (X ı ınları ve 60 Co gama ı ınları), güçlü geçirgenlikleri sayesinde yo un miktarda spermaya uygulanabilirler. Ancak bu çalı malarda erkek balı a ait özelliklerin veya kromozom parçalarının varlı ının tespit edilmesi ile bu ı ınların spermatozoa DNA sını tahrip etmek için yeterince etkili olmadı ı gösterilmi tir (Karayücel, 1999).

14 UV veya gama ı ınları kullanılarak erkek veya di i balı ın çekirde e ait genomu tahrip edilebilir. UV ı ınları, gama ı ınlarına göre daha etkili olup daha fazla avantaja sahiptir. E er gama radyasyonu uygulamasında kullanılan doz çok dü ük olursa kromozom fragmentleri gözlemlenebilir. Bu kromozom fragmentleri konak genomunda hücre bölünmeleri ile ba ımsız olarak kopyalanarak ço alır ve embriyoda anlatım yapar (Dunham, 2004). Gama ı ınları, UV ı ınlarından çok daha fazla geçirgendir ve UV ı ınları dü ük geçirgenlikleri nedeniyle ancak sperma seyreltildi inde ve ince bir tabaka halinde yayıldı ında etkili olur (Dunham, 2004). UV ı ınları; ucuz, kullanımının kolay olması ve uygulamanın di er metodlara göre daha güvenilir olması sebebiyle son yıllarda daha çok tercih edilmektedir. Ayrıca UV ı ınları, gama ı ınlarının tersine kromozom parçaları bırakmamaktadır (Özden ve ark., 2003). Bu ba lamda UV uygulamasına maruz bırakılmı spermatozoanın kullanıldı ı fertilizasyon çalı ması sonucunda geli en haploit embriyonun erkek balıktan gelen genetik materyale sahip olmadı ı bildirilmektedir (Pelegri ve Schulte-Merker, 1999). Kimyasal mutajenler; örne in dimetilsülfat (DMS), tolüdin mavisi ve etilen üre çok miktarda spermatozoaya ait DNA nın tahrip edilmesi amacıyla kullanılmaktadır. Fakat bu maddelerin kullanımı sonucunda kromozom parçalarının görüldü ü tespit edilmi tir (Karayücel ve Karayücel, 2000; Dunham, 2004; Komen ve Thorgaard, 2007). 2.5.3.2. Su Ürünlerinde Ginogenez Uygulamasının Önemi Ginogenez uygulaması, su ürünleri yeti tiricili inde ve ara tırma amaçlı olarak soy içi üretimde (inbreeding) kullanılmaktadır (Varadaraj, 1990; Komen ve Thorgaard, 2007). lk ba larda genler arasında az miktarda/seyrek olması beklenen crossing-over olayının aslında bazı genlerde fazla miktarlarda oldu u bildirilmektedir (Purdom, 1993). Buna ra men mayotik ginogenez uygulaması, gen-sentromer rekombinasyon oranı bulunarak kromozom haritalanmasında yo un olarak kullanılmaktadır. Di er taraftan mitotik ginogen ve androgenler, tek bir jenerasyonda tüm gen lokuslarında tamamen homozigot olup ikinci jenerasyonda klonların üretilmesinde kullanılmaktadır (Purdom, 1993). Gerek ginogenez gerekse androgenez teknikleri ile canlılardaki karakterlerin genetiksel analizleri kolaylıkla yapılabilir. Ginogenetik di ilerin hormon kullanılarak erkekle tirilmesi ve normal di ilerle çaprazlanması ile sadece di i balık üretiminin

15 devamı nesiller boyu sa lanabilir. Di er taraftan erkek heterogameti sistemine sahip balıklarda androgenez ile %50 YY erkekler ve %50 XX di iler üretmek mümkündür. Bu ekilde elde edilen YY erkeklerin normal di ilerle çaprazlanması ile sadece erkek balık üretimi gerçekle tirilir (Purdom, 1993; Dahm ve ark., 2005; Komen ve Thorgaard, 2007). Kemikli balıklarda ginogez olayının spontane olarak görüldü ü bazı durumlar tespit edilmi tir. Ancak su ürünlerinde yapılan çalı malar ço unlukla laboratuvar ara tırmalarıyla sınırlı kalmı tır. Özellikle hobi amaçlı üretimi yapılan bazı balık türlerinde, renklerin ve renklenme desenlerinin döllere aktarımının tespit edilmesi amacıyla ginogenetik çalı malar yapılmaktadır (Lutz, 2001). Ginogenez uygulaması; tamamen yada kısmen soy içi geli imi ve tek cinsiyetli popülasyonların üretimi amacıyla su ürünlerinde kullanılmaktadır (Varadaraj, 1990; Lutz, 2001). Kısmen inbred olan balık üretimi (mayo-ginogenetik balık) ile genom çalı malarında kromozomların sentromerleriyle ba lantılı olan farklı gen lokuslarının pozisyonlarının incelenmesi gerçekle tirilir. Ginogenez uygulaması ile do ru klonlar üretildi inde beslenme, hastalık direnci gibi konular hakkında genetik bilgi elde edilebilir (Lutz, 2001). Diploit ginogen balıkların %30 unda anormal ovaryum geli iminin söz konusu oldu u bildirilmektedir. Bu durumun spermatozoa genomunun tahrip edilmesi sürecinde meydana gelen ekstra kromozom fragmentlerinin neden oldu u dü ünülmektedir (Krisfalusi ve ark., 2000). Farklı türler üzerinde gerçekle tirilen ginogenez çalı maları, spermatozoanın radyasyona maruz bırakılma süresi, yo unlu u ve fiziksel okun zamanı gibi parametrelere ait optimum artların belirlenmesi amacıyla da yapıldı ı bildirilmektedir (Lutz, 2001). 2.5.3.3. Haploit ve Diploit Ginogenetik Balık Eldesi Radyasyona maruz bırakılmı spermatozoa ile gerçekle tirilen fertilizasyonda 2. polar cismin ayrılması ile haploit embriyolar geli ir. E er bu haploit embriyolar üzerinde herhangi bir i lem uygulanmazsa ölüm gerçekle ir (Dunham, 2004). Çevresel okun

16 uygulanmadı ı durumlarda geli en söz konusu haploit embriyolarda çe itli deformasyonların gözlemlendi i ve larval dönemin 4. ve 5. gününe kadar hayatta kaldıkları ifade edilmektedir ( ekil 2.6) (Purdom, 1993; Walker, 1999; Dahm ve ark., 2005). Haploit embriyoların, genetik haritalama ve mutantların izlenmesi amacıyla yapılan çalı malarda kullanıldı ı bildirilmektedir (Brandhorst ve Corley-Smith, 2004). ekil 2.6 Haploit ve diploit ginogen zebra balı ı (Danio rerio) eldesi (Dahm ve ark., 2005) Haploit ginogen embriyolar yumurtadan çıkı a amasında anormal yapıda olup do ada birkaç istisna dı ında ya amaları imkansızdır. Bu nedenle, haploit ginogenlerin hayatta kalması amacıyla çe itli ok uygulamaları kullanılarak diploit ginogen balık elde edilmelidir. Bu ba lamda spermatozoaya ait genomun etkisiz hale getirilmesini takiben gerçekle tirilen fertilizasyonda 2. polar cismin çıkı ının engellenmesi (sıcak ok ya da basınç oku) ile diploit ginogenler elde edilmektedir. Elde edilen diploit ginogen, di iye ait 2 set kromozoma sahiptir. Bu tip ginogen; mayotik ginogen olarak adlandırılır

17 (Dunham, 2004). okun en etkili oldu u zaman türlere göre de i iklik gösterir. Ayrıca diploit ginogenler ilk bölünmenin baskılanmasıyla da elde edilebilirler (Dunham, 2004). DNA sı tahrip edilmi spermatozoa ile döllenen yumurtaların kendili inden diploit olmaları çok sık görülmese de, adi sazan (Cyprinus carpio), ot sazanı (Ctenopharyngodon idella) ve gökku a ı alabalı ında (Onchornychus mykiss) bu durumun gözlemlendi i ifade edilmektedir (Karayücel ve Karayücel, 2000; Komen ve Thorgaard, 2007). Haploit ginogen balıkların diploit ginogen haline dönü türülmesi amacıyla uzun so uk ok, kısa sıcak ok ve kısa basınç ok olmak üzere 3 tür ok uygulaması kullanılmaktadır. Bu ok uygulamaları, kromozom bölünmesinde aktif rol oynayan mikrotübüller üzerinde meydana getirdikleri etki ile bölünmeyi engeller (Dunham, 2004). Uygulanacak okun çe idi, balık türünün ya ama ortamına göre de i iklik gösterir. Balıklar poikiloterm canlılar oldukları için ya adı ı ortamın sıcaklı ı vücut sıcaklı ıyla do ru orantılı olarak de i ir (Timur, 2011). Buna göre; so uk suda ya ayan balıklar için kısa sıcak ok, sıcak ya da ılık suda ya ayan balıklar için uzun so uk ve kısa sıcak oklar uygulanır. Kısa basınç oklarının ise bütün balık türlerinde uygulanabilece i ifade edilmektedir (Dunham, 2004). Her bir ok 3 test parametresi ile karakterize edilir: a) sıcaklık derecesi veya basınç yo unlu u b) okun ba langıç zamanı ve süresi c) okun süresi Sıcak ok, uygulama ve kullanım açısından en kolay olan ok çe ididir. So uk ok uygulamasında kullanılan gereçler sıcak ok uygulamasında kullanılanlara göre daha pahalıdır. Basınç oku uygulamasında ise di er metodlara göre daha detaylı ekipmanlar gerekli olup teknik bilgiye ihtiyaç vardır (Dunham ve ark., 2004). 2.5.3.4. Mayoginogenez ve Mitoginogenez Yöntemleri Ginogen balıkların üretiminde, mayoginogenez ve mitoginogenez olmak üzere iki farklı yöntem uygulanmaktadır. Bu yöntemlerle; genetik harita olu turma, soy içi nesiller ve isogenetik üretim, seksüel organların geli imi ve yapısal farklılıkların incelenmesi çalı malarında kullanılacak balıkların üretimi gerçekle tirilir (Thorgaard, 1983; Cherfas ve ark., 1993).

18 Döllenmeyi takiben meydana gelen mayoz bölünmenin ilk a amasında 2. polar cismin ayrılması engellenerek mayotik ginogenetik balık elde edilir ( ekil 2.7) (Purdom, 1993; Lutz, 2001). ekil 2.7 Ginogenez ile mayoginogenetik balık eldesinin ematik gösterimi (Lutz, 2001) Gadus morhua ve Acipenser transmontanus gibi balık türlerinde yapılan uygulamalarda juvenil safhaya kadar ölüm oranı çok dü ükken bu safhadan sonra ölüm oranı artı göstermi tir (Van Eenennaam ve ark., 1995; Ottera ve ark., 2011). kinci polar cisimde ve ovumda meydana gelen farklı gen kombinasyonları sonucunda ve oogenez süresince gözlemlenen rekombinasyon ve crossing-over nedeniyle elde edilen mayotik ginogenlerin hepsi homozigot de ildir (Dunham, 2004). Mayoz bölünme bitiminden hemen sonra ba layan mitoz bölünme a amasında gerçekle tirilen ok (hidrostatik basınç veya sıcaklık) uygulamasıyla bölünme engellendi inde mitotik ginogen balık elde edilir ( ekil 2.8) (Lutz, 2001; Mingyi ve ark., 2010). Mitoginogenez; genom duplikasyonundan sonra ilk mitotik bölünmenin engellenmesiyle gerçekle tirildi inden sadece homozigot nesiller elde edilir. Bu metod kullanılarak 2 nesil sonrasında genetik açıdan benzerlik gösteren balıkların homozigot akrabalı (inbred) hatları elde edilebilmektedir (Cherfas ve ark., 1993).

19 ekil 2.8 Ginogenez ile mitotik ginogenetik balık eldesinin ematik gösterimi (Lutz, 2001) Mitoginogenez uygulamasında okun ba langıç zamanı, yo unlu u ve süresi önemlidir. okun ba langıç zamanı en önemli parametrelerden biri olup üretimde önemli de i ikliklere neden olabilir. Üretim kaynaklı sorunlar ve mito-ginogenez uygulamasındaki engeller nedeniyle yavru balık eldesinde dü ük verim ve ya ama oranı gözlemlenir (Komen, 2007). Bu dü ük verim ve ya ama oranının; ok uygulaması nedeniyle meydana gelen fiziksel zarar, zararlı genlerin homozigot halde bulunması, dü ük yumurta kalitesi ve senkronize olmayan embriyo geli imi kaynaklı oldu u ifade edilmektedir (Komen ve Thorgaard, 2007). 2.5.3.5. Haploit ve Diploit Balıkların Tespit Yöntemleri Morfolojik Tespit Spermatozoaya uygulanan ok uygulaması sonucunda yapılan dölleme ile elde edilen haploit embriyolar döllenmeden 12-24-48 ve 72 saat sonra morfolojik olarak incelenir. Kuyruk olu umunun ba ladı ı (tail bud) safhada (10-12.saat) embriyo, gastrula evresini tamamlamak üzeredir (Kimmel ve ark., 1995; Walker, 1999). Mutasyonların etkiledi i epiboli, aksis ve hücre çemberi bu a amada gözlemlenir. Embriyoda 24-30. saat temel organların olu tu u evredir. Bu evrede vücut yapısı, gözler, omurga, hücre gruplarının ekli ve ölü hücreler gözlemlenir. Embriyoda kalp atı ı, kan, pigment hücreleri, pektoral yüzgeç, yeni ölen hücreler ve vücut ekli ise 48-54. saatlerde gözlemlenir. Üçüncü günde ise (72-78. saat) hayatta kalan haploit larvaların bazılarında yüzme hareketi gözlemlenir. Fakat bu larvaların hücrelerinde deformasyon oldu u için diploit embriyodaki gibi de ildir (Walker, 1999).

20 Haploit embriyoda kuyruk daha kısa ve diploit embriyoya göre fenotipinde çok daha belirgin farklılıklar görülmektedir. Haploit embriyoların diploit embriyolara göre hücre yapılarının daha küçük oldu u, kısa- ince ve e ri vücut yapısına sahip oldu u ve organogenezde deformasyonların (beyin morfolojisindeki az geli im, kardiovasküler sistemdeki bozukluklar, i kin perikardial bo luk ve kan dola ımının yava olması gibi) oldu u tespit edilmi tir (Walker, 1999). Haploit embriyoların döllenmeyi takiben 4-5 gün süre ile hayatta kaldıkları bildirilmektedir. lk geli im evreleri haploit ve diploit embriyolarda oldukça benzerlik gösterir. Haploit embriyolar mid-blastula evresine geçtiklerinde diploit embriyolara göre bir hücre bölünme safhası daha geç geli im gösterirler. Bu nedenle; haploit embriyolar diploit embriyolara göre daha çok sayıda küçük hücre içerirler (ço unlukla bu hücreleri pigment hücreleri olu turur). Bu nedenle embriyodan embriyoya de i iklik gösteren haploit sendromu meydana gelir ki bu haploit embriyoda; kısa ve kalın bir vücut yapısı olarak gözlemlenir. Ancak kas segmentlerinin sayısı haploit ve diploit embriyolarda benzerlik gösterir. Haploit embriyolarda kan hücreleri, kan damarlarına göre daha büyük yapıdadırlar. Bu nedenle haploit embriyoların ço unda kan dola ımı problemi gözlemlenir. Geli im evrelerinde; perikardial bo luk gibi vücudun belirli bölgelerinde tespit edilen ödem nedeniyle embriyo ölümü gerçekle ir. Ayrıca de i ken sayıdaki kusurlu embriyo kümeleri nedeni ile haploit embriyolar iyi geli mi embriyolardan kolaylıkla ayırt edilir. Çünkü zararlı genler haploit embriyolarda maskelenemez ve anaç balıktaki genetik yapının bozuklu u embriyoya da geçer (Walker, 1999). Davranı sal Tespit Haploit embriyolar, normal yüzme hareketi göstermemekle birlikte erken geli im safhasında motilite ve duyusal bozukluklar tespit edilebilir. 24 saatlik embriyolarda motilite testi ve 30 saatlik embriyolara duyusal reflekslerinin ölçülmesi amacıyla müdahale edilmeden mikroskopta gözlemlenmektedir. Haploit embriyolar, diploitler gibi 24 saatlik geli im süreçlerinde spontane kasılma hareketleri gerçekle tirirler; fakat daha sonra ki a amalarda bu durum gözlemlenmez. Embriyolarda gözlemlenen davranı bozuklu una nöronlar, kaslar veya sinir-kas ba lantısındaki sorunlar neden olmaktadır. Erken duyusal test embriyo olu umunu takiben 30 saat içerisinde gerçekle tirilir.

21 Diploit embriyolarda oldu u gibi haploit embriyolarda, ince problu naylon monofilament vücuda yada ba kısmına dokunduruldu unda keskin kasılmalar yaparak kar ılık verdi i tespit edilmi tir (Walker, 1999). In situ Tespit RNA in situ hibridizasyonu; genlerde meydana gelebilecek farklılıkları görüntülemek amacıyla kullanılır (Walker, 1999). Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Tespit Polimeraz zincir reaksiyonu çe itlerinden olan çoklu PCR metodu kullanılarak bilinen gen dizilerinin delesyonlarının tespitinin yapıldı ı bildirilmektedir (Fritz ve ark., 1996). Karyotip Analizi Her balık türü için kromozom sayısı ve morfolojisi farklılık göstermektedir. Bu farklılıklar nedeniyle karyotip analizi canlıyı tanımlamada yaygın olarak kullanılan metotlardan biridir. Türler arasında kromozom sayısı ve morfolojisindeki benzerli in derecesine ba lı olarak da evrimsel ili kilerin tespiti yapılabilmektedir. Popülasyonlar arasında ve popülasyonların kendi içinde gözlemlenen farklılıklar sayesinde evrimsel ili kilerin tahmini ve stokların belirlenmesinde de karyotip analizi kullanılabilir (Thorgaard ve Disney, 1990). Balık kromozomları memeli kromozomlarına göre sayılarının daha fazla ve daha küçük oldu u tespit edilmi tir (Bilgin, 2004; Timur ve Ekici, 2009). Balık kromozomları mitozun metafaz safhasında ı ık mikroskobunda incelenebilir. Kromozom preparatlarının hazırlanmasında metafaz hücreleri bakımından yo un olan aktif olarak bölünen dokular kullanılır. Bu amaçla, embriyonik dokular, solungaç, ön böbrek, ba ırsak ve pul epiteli balıkta bölünen hücreler için iyi birer kaynaktırlar (Thorgaard ve Disney, 1990). Kromozomlar hücre bölünmesinin metafaz evresinde iken kısalıp kalınla ması ile daha iyi görünür hale gelirler. Bölünmekte olan hücre colchicine, colcemid ve vinblastine sulfate adı verilen maddeler kullanılarak hücre bölünmesi sırasında i ipliklerinin parçalanması sa lanır (Thorgaard ve Disney, 1990). Hipotonik solüsyon kullanılarak hücre içerisindeki kromozomların görünür hale getirilmesi amacıyla hücre i irilerek kromozomların da ılması sa lanır. Bu i lemden sonra, hücre

22 iç unsurları tahrip edilmeden hücreyi öldürmek için fiksasyon i lemi uygulanır (Blaxhall, 1975). Zebra balı ı kromozom yapısıyla ilgili ilk bulgular 1960 lı yıllarda ortaya çıkmı ve bu çalı malarda diploit sayısı 48 olarak tespit edilmi tir. Fakat daha sonraki yıllarda yapılan çalı malar sonucunda kromozom diploit sayısının 50 oldu u tespit edilmi tir (Tablo 2.2) (Sola ve Gornung, 2001) Tablo 2.2 Zebra balı ı (Danio rerio) üzerindeki karyotip çalı maları (Sola ve Gornung, 2001) Referans Diploid sayısı Karyotip Post, 1964 48 Endo ve Ingalls, 1968 50 50m, sm, st Fontana, 1970 50 10m, 40sm Rishi, 1976 50 10m, 12sm-st, 28a Schreeb, 1993 50 16m, 32sm, 2a Pijnacker ve Ferwerda, 1995 50 12m, 26sm, 12st Daga, 1996 50 4m, 16sm, 30st Gornung, 1997 50 4m, 16sm, 30st Sharma, 1998 50 F: 7m, 7sm, 36st M: 6m, 8sm, 36st Ueda ve Naoi, 1999 50 12m, 26sm, 12st Amores ve Postlethwait, 1999 50 4m, 30sm, 16st Phillips ve Reed, 2000 50 4m, 16sm, 30st m: metasentrik, sm: sub-metasentrik, st: sub-telosentrik

23 3. MALZEME ve YÖNTEM 3.1. MALZEME 3.1.1. Deneme Yeri Çalı ma stanbul Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Yeti tiricilik Bölümü laboratuvarları ve akvaryum ünitesinde yürütülmü tür. 3.1.2. Deneme Akvaryumları ve Kullanılan Suyun Özellikleri Çalı mada 75x35x35 cm ebatlarında 5 adet cam akvaryum, havalandırma ve filtrasyon amacıyla Aquaticlife marka iç filtre ve akvaryum suyunun sıcaklı ının ayarlanması amacıyla termostatlı termometre kullanılmı tır ( ekil 3.1). Üreme döneminde ebatları 20x20x45 cm olan akvaryumlarda su sıcaklı ı 26-28 C, ph 6,5-7,5 ve iletkenlik 5,11 ms/cm olacak ekilde düzenlenmi tir. Akvaryumlarda kullanılan ehir ebeke suyu dinlendirme tankında kloru 2 gün süreyle uçurulmu ve daha sonra akvaryumlara aktarılmı tır. Deneme akvaryumlarında kullanılan su de erleri; ph: 7,0-7,5, sıcaklık: 27,0-28,0 C, iletkenlik: 5,41 ms/cm olacak ekilde düzenlenmi tir. ekil 3.1 Deney balıklarının bulundu u akvaryum düzene i

24 3.1.3. Deney Balıkları Çalı mada kullanılan 1,5-2 aylık 50 adet di i ve 150 adet erkek zebra balı ı (Danio rerio) ithalatçı bir firmadan temin edilmi tir. 3.1.4. Zebra Balıklarında Cinsiyet Ayrımı Erkek zebra balıkları 2-3 cm uzunlu unda, vücutları ince-uzun bir yapı göstermekte olup yüzgeçleri kısadır (ùekil 3.3), diúi balıklar ise 4-5 cm uzunlu unda, abdomen kısmı úiúkin ve yüzgeçleri tül úeklinde uzamıútır (ùekil 3.2). Üreme döneminde; ise erkek balıkta sarı-mavi belli belirsiz çizgiler, diúi balıkta ise anal yüzgecin bulundu u bölge krem beyazı renginde olan balıklar in vitro fertilizasyonda kullanılmak üzere üreme akvaryumlarına aktarılmıútır. ùekil 3.2 Diúi zebra balı ı (Danio rerio) ùekil 3.3 Erkek zebra balı ı (Danio rerio)

25 3.1.5. Zebra Balı ı Yumurta ve Sperm Hücresi Abdominal masaj ile di i zebra balı ından yumurta ( ekil 3.4) eldesi ve erkek zebra balı ından diseksiyon yolu ile çıkarılan testis dokusundan sperma ( ekil 3.5) eldesi gerçekle tirilmi tir. ekil 3.4 Döllenmi yumurta hücresinin stereo mikroskop altındaki görüntüsü ekil 3.5 Spermatozoon hücresinin ı ık mikroskobundaki görüntüsü (Giemsa)

26 3.1.6. Döllenmi Yumurtaların Bakımı ve Suyun Özellikleri Döllenmi yumurtalar embriyonik geli imleri süresince 90 mm çapındaki steril petri kutusunda muhafaza edilerek inkübasyonları gerçekle tirilmi tir. 26-28 C sıcaklıktaki etüvde; ph 6,5-7,0 ve iletkenlik 1,51±0,4 ms/cm olacak ekilde düzenlenmi tir. 3.1.7. Larva Bakımı ve Su Özellikleri Larva çıkı ını takip eden 1. günde zebra balı ı larvası için 500 ml lik beher kullanılmı tır. Vitellus kesesinin tüketilmesine yakın 4.-5. günlerde ha lanmı yumurta sarısı süspansiyonu ve Artemia sp. ile beslenmi tir. ph 6,5-7,5, sıcaklık 26-28 C ve iletkenlik 5,01 ms/cm olacak ekilde düzenlenmi tir. 3.1.8. Çalı mada Kullanılan Cihaz ve Ekipmanlar letkenlik ölçümü için HANNA 8633 marka mikrosicuens ölçüm cihazı ( ekil 3.6) ve ph ölçümü için Hanna 83141 marka ph metre ( ekil 3.7) kullanılmı tır. ekil 3.6 letkenlik ölçüm cihazı

27 ekil 3.7 ph ölçüm cihazı ekil (3.8) da gösterilen Fiske-210 marka mikro-osmometre cihazı kullanılarak deneme sırasında kullanılan solüsyonların ve spermanın ozmotik basınçları tespit edilmi tir. Zebra balı ına ait spermatozoa DNA sının etkisiz hale getirilmesi amacıyla UVP TL- 2000 marka UV translinker cihazı kullanılmı tır ( ekil 3.9). Karyotip analizinde kullanılmak amacıyla ise ekil (3.10) daki ısıtma tablası kullanılmı tır. ekil 3.8 Mikro-Osmometre cihazı

28 ùekil 3.9 UV translinker cihazı ùekil 3.10 Isıtma tablası Zebra balı ına (Danio rerio) ait spermatozoa motilitesinin ve kromozom preperatlarının incelenmesinde Olympus CX21 marka ıúık mikroskobu kullanılmıútır (ùekil 3.11). Çalıúmada kontrol, haploit ve diploit zebra balı ı embriyolarında geliúimin morfolojik olarak incelenmesi amacıyla SZ-PT-11 Olympus marka foto raf makinası ataçmanlı stereo mikroskop (ùekil 3.12) ve Olympus CK40-F200 marka foto raf makinası ataçmanlı invert mikroskop kullanılmıútır (ùekil 3.13).

29 ùekil 3.11 Iúık mikroskobu ùekil 3.12 Stereo mikroskop

30 ekil 3.13 nvert mikroskop Çalı mada zebra balı ı spermatozoa yo unlu unun tespitinde hücre sayımının gerçekle tirilmesi amacıyla Thoma lamı kullanılmı tır ( ekil 3.14). ekil 3.14 Thoma lamı

31 3.1.9. Balık Yemleri Zebra balıklarının beslenmesinde kurutulmu Daphnia (Tropical) ve dondurulmu Tubifex (Sanyu) ile canlı yem olarak Artemia (Sera) kullanılmı tır. 3.1.10. Çalı mada Kullanılan Kimyasal Malzemeler Deneme süresince kullanılan kimyasal malzemelere ait liste Tablo (3.1) de gösterilmi tir. Tablo 3.1 Kimyasal malzeme listesi Kimyasal Katalog no. Marka Colchicine (Kol isin) C9754 Sigma-Aldrich Tricaine A5040 Sigma-Aldrich Sodyum klorür 567440 Merck Potasyum klorür 529552 Merck Sodyum bikarbonat 6329 Merck Sodyum sekonder fosfat 106370 Merck Magnezyum sülfat 106067 Merck Alkol 100986 Merck Kalsiyum klorür 2739 Merck HEPES H4034 Sigma-Aldrich Mono potasyum fosfat 104877 Merck Deniz tuzu 07711 Merck Sodyum asetat anhibrid 106264 Merck Magnezyum klorür 814733 Merck Tris tamponu T6789 Sigma-Aldrich Glasiyel asetik asit 632500 Merck Kloroform 02445 Merck 3.1.11. Çalı mada Kullanılan Solüsyonlar ve çerikleri Tricaine Balı ın anesteziye alınması amacıyla tricaine kullanılmaktadır. Stok solüsyon hazırlamak amacıyla 400 mg tricaine 97,9 ml distile su içerisinde çözdürülür ve üzerine 2,1 ml 1 M Tris eklenir. Hazırlanan bu stok solüsyonundan 4,2 ml alınarak 100 ml temiz akvaryum suyu içerisine eklenir.

32 Carnoy s Fiksatifi Karyotip analizinde hücrelerin fikzasyonunda kullanılır. 10 ml glasiyel asetik asit üzerine 60 ml saf alkol ve 30 ml kloroform eklenerek hazırlanır. Hank s Solüsyonu Erkek zebra balı ından alınan spermanın fertilizasyon a amasına kadar canlı olarak muhafaza edilmesi amacıyla kullanılır. Hank s solüsyonunun hazırlanmasında kullanılan solüsyon içerikleri u ekildedir. Sol-I: 8 g NaCl ve 0,4 g KCl, 100 ml distile su içerisinde çözdürülür. Sol-II: 0,358 g Na 2 HPO 4 ve 0,6 g K 2 H 2 PO 4 100 ml distile su içerisinde çözdürülür. Sol-III: 0,72 g CaCl 2 50 ml distile su içerisinde çözdürülür. Sol-IV: 1,23 g MgSO 4 7H 2 O 50 ml distile su içerisinde çözdürülür. Sol-V: 0,35 g NaHCO 3 10 ml distile su içerisinde çözdürülür.bu solüsyonlardan 10 ml sol. I, 1 ml sol. II, 1 ml sol. III, 86 ml dh 2 O ve 1 ml sol. IV den eklenerek hazırlanır. Hazırlanan bu karı ımdan 9,9 ml alınarak üzerine 0,1 ml sol. V den eklenir ve ph 7 olacak ekilde ayarlanır. Ringer Solüsyonu Spermatozoa yo unlu unun hesaplamasında kullanılır. Ringer solüsyonu, 3,25 g NaCl, 2,5 g KCl, 0,1 g NaHCO 3 ve 0,15 g CaCl 2 500 ml distile su içerisinde çözdürülerek hazırlanır. Colchicine (Kol isin) solüsyonu Karyotip analizinde hücre bölünmesinin engellenmesi amacıyla kullanılır. Kol isin solüsyonu hazırlamak için 0,011 g kol isin 50 ml dh 2 O içerisinde çözdürülür. Ovaryum Sıvısı Di i zebra balı ından sa ım yoluyla elde edilen yumurta hücrelerinin fertilizasyon a amasına kadar canlı olarak muhafaza edilmesi amacıyla kullanılır. Ovaryum sıvısı hazırlamak için 40 g deniz tuzu 1 litre dh 2 O içerisinde çözdürülerek stok solüsyonu hazırlanır. Final konsantrasyonu dh 2 O ile stok solüsyonu karı tırılıp 60 mg/ml olacak ekilde ayarlanır.

33 3.2. YÖNTEM 3.2.1. Zebra Balı ının Laboratuvara Ta ınması 1,5-2 aylık di i ve erkek zebra balıkları toptancıdan ta ıma po etleri içerisinde deneyin yapılaca ı akvaryum ünitesine getirilmi tir. 3.2.2. Zebra Balı ının Akvaryum Ortamına Aktarılması çerisinde zebra balıklarının bulundu u ta ıma po etleri akvaryum suyu içerisinde 15 dakika tutulduktan sonra po etin a zı açılarak balıkların akvaryum suyuna geçi i sa lanmı ve ilk gün yem verilmemi tir. Karantina akvaryumlarında 15 gün süreyle tutulan ve sa lıklı oldukları gözlemlenen zebra balı ı bu sürenin sonunda deney akvaryumlarına aktarılmı tır. 3.2.3. Zebra Balı ının Yemleme Programı Zebra balı ı; Artemia sp., dondurulmu tubifeks, kurutulmu Daphnia sp. ve toz yem kullanılarak beslenmi lerdir. Yemleme; 09:00, 11:30, 13:30 ve 16:00 saatlerinde günde dört kez balıklar doyana kadar (Adlibitum) yapılmı tır. 3.2.4. Fotoperiyot Uygulaması Deney balıklarında üreme periyodunu kontrol altına almak amacıyla akvaryumlarda 14 saat aydınlık ve 10 saat karanlık olacak ekilde fotoperiyot uygulaması gerçekle tirilmi tir. 3.2.5. Erkek ve Di i Balıklarda Cinsiyet Ayrımı Vücut morfolojisindeki farklılıkların yanı sıra üreme döneminde sergiledikleri davranı lar açısından da erkek ve di i balıkların ayrımını yapmak mümkündür. Üreme döneminde di i balık erkek balıktan daha iri ve karın bölgesi daha i kinken, erkek balı ın daha ince ve renklerinin daha parlak oldu u gözlemlenmi tir. Akvaryum içerisinde erkek balı ın, di i balı ı yumurta dökmesi amacıyla sürekli kovalaması gözlemlenen üreme aktivitesi davranı özellikleridir.

34 3.2.6. Anaç Balık Akvaryumları Anaç balıklar için tel bölmeli akvaryumlar kullanılmı tır. Deneyden 1 gün önce üreme davranı ı gösteren erkek ve di i zebra balıkları söz konusu bu akvaryumlara nakledilirler. Kontrolsüz olarak yumurta bırakılmasını engellemek amacıyla di i ve erkek balıklar ayrı akvaryumlarda tutulurlar. Deney günü erkek ve di i anaç balıklar ı ık döngüsünün ba lamasını takiben 1-1,5 saat içerisinde fertilizasyonda kullanılırlar. 3.2.7. In vitro Fertilizasyonda Kullanılan Di i ve Erkek Anaç Zebra Balıklarının Seçimi Fotoperiyot uygulamasında ı ık döngüsünün ba langıcından kısa bir süre sonra 1:3 (di i:erkek) oranında olacak ekilde zebra balıkları üreme akvaryumlarına aktarılmı tır. Bu amaçla fertilizasyonda, ince yapılı ve sarımtırak renkli erkek anaç zebra balıkları ile abdomen bölgesi gümü i renkte ve i kin bir görünüme sahip di i balıklar kullanılmı tır. Anaç balıkların davranı ları gözlemlenerek üreme aktivitesi (erkek balık di i balı ı kovaladı ında) gösteren bu balıklardan yumurta ve sperma elde edilmi tir. Sarımsı renk, yarı- effaf ve granüler yapı gösteren yumurta ile %80 in üzerinde motiliteye sahip olan spermatozoa fertilizasyonda kullanılmı tır. 3.2.8. Anestezi Uygulaması In vitro fertilizasyonda, anaç balıklardan döl alımı sırasında balıkların stres altında kalması kalitesiz sperma ve yumurta eldesine neden olaca ından ve bu uygulama sırasında nadir de olsa balık ölümü gerçekle ebilece inden balıklar bir süre anestezi solüsyonunda tutulmu lardır. Anestezi uygulamasında tricaine (0,2 mg/ml) solüsyonu kullanılmı tır. Balıkların anestezi solüsyonunda çok uzun süre tutulmamasına dikkat edilerek solungaç hareketleri yava ladı ında solüsyondan çıkarılmı lardır. Erkek zebra balıkları 1-3 dakika süre ile di i zebra balıkları ise 30-60 sn süre ile solungaç hareketleri yava layana kadar anestezi solüsyonunda tutulmu lardır.

35 3.2.9. Erkek Balıktan Spermatozoa Eldesi Anestezi solüsyonundan çıkarılan erkek zebra balı ı akvaryum suyuna 1 kez daldırılıp çıkarılmı ve spatula yardımıyla ka ıt mendil kullanılarak kurulanmı tır. Anestezi uygulanan erkek zebra balı ından testis dokusu (iki parçalı) fazla miktarda sperma eldesi amacıyla diseksiyon yoluyla alınmı tır. Çıkarılan testis dokusu +4 C de tutulan 50 l lik Hank s solüsyonuna aktarılmı ve spermatozoanın serbest kalması amacıyla testisler bir pens yardımıyla parçalanmı tır. In vitro fertilizasyon a amasına kadar spermatozoanın canlılı ını kaybetmeden hareketsiz bir ekilde kalması amacıyla bu solüsyonda +4 C de muhafaza edilmi lerdir. 3.2.10. Spermatozoa Sayımı Çalı mada zebra balı ı spermatozoa yo unlu unun belirlenmesi amacıyla; 490 l ringer solüsyonu içerisine 10 l sperma eklenmi ve bu karı ımdan 10 l alınarak 90 l ringer solüsyonuna aktarılmı ve stok solüsyon elde edilmi tir. Spermatozoa sayımı sırasında stok solüsyondan 20 l alınarak 180 l ringer solüsyonu üzerine eklenerek ve insülin ırıngası yardımıyla Thoma lamına aktarılmı tır. Daha sonra Thoma lamında 10 çok küçük karedeki hücre sayısının toplamı belirlenmi ve a a ıdaki formüle göre spermatozoa yo unlu u hesaplanmı tır (Tanalp ve Uzalp, 1975). 3.2.11. Spermatozoa Aktivasyonu Zebra balı ı spermatozoasının aktivasyonunda distile su kullanılmı tır. Hank s solüsyonu içerisinde +4 C de tutulan spermadan 1 l lam üzerine alınarak üzerine oda sıcaklı ında tutulan 7 l dh 2 O eklenmi tir. Lamel ile kapatılan örnek ı ık mikroskobunda incelenerek motilite yüzdesi tespit edilmi tir. Spermatozoa motilitesi %80 nin üzerinde olan örnekler in vitro fertilizasyonda kullanılana kadar +4 C de muhafaza edilmi tir. Hank s solüsyonu içerisinde hareketsiz olarak muhafaza edilen spermatozoanın su ile muamelesi, motilite süresi çok kısa olan zebra balı ı spermatozoasının aktivasyonuna neden olur. Bu nedenle zebra balı ı spermatozoasının fertilizasyon öncesinde su ile temas etmemesine dikkat edilmi tir.

36 3.2.12. Di i Balıktan Yumurta Eldesi Erkek balıktan testis dokusu elde edildikten sonra di i balık anestezi i lemine tabi tutulmu tur. Anestezi solüsyonundan çıkarılan di i balı ın vücudu hafif nemli kalacak ekilde genital bölge ise tamamen kurulanmı tır. Di i balıktan yumurta, iki parmak kullanılarak abdomen bölgesine uygulanan hafif baskı ile masaj yapılarak elde edilmi tir. Elde edilen yumurtalar spatula yardımıyla 90 mm lik steril petri kutusuna aktarılmı tır. Di i balıktan yumurta eldesi sırasında yumurtaların su ile temas etmemesine dikkat edilmi tir. Yumurta alımından sonra di i balıklar anestezinin etkisinden kurtulmaları amacıyla akvaryum suyuna bırakılmı tır. Dölleme i lemi öncesinde petri kutusuna aktarılmı olan ölü (beyaz, opak renkli) yumurtalar plastik steril Pasteur pipeti kullanılarak ortamdan uzakla tırılmı tır. Yumurta hücresi spermatozoon tarafından döllenmeden hemen önce su ile temas etmesi durumunda su alarak i er ve mikrofil deli i kapanarak fertilizasyonun engellenmesine neden olur. Bu nedenle in vitro fertilizasyon öncesinde spermada oldu u gibi yumurta hücresinin de su ile temas etmemesine dikkat edilmi tir. 3.2.13. In vitro Fertilizasyon In vitro fertilizasyonda, bir di i balıktan elde edilen yakla ık 250-300 adet yumurta için 4 adet erkek zebra balı ından elde edilen ve Hank s solüsyonunda muhafaza edilen sperma kullanılmı tır. Yarı- effaf özellik gösteren canlı yumurtalar üzerine 50 l Hank s solüsyonu+spermatozoa karı ımı, 1 ml akvaryum suyu ve 1 ml ovaryum sıvısı ilave edilerek 1-2 dakika süre ile 90 mm lik petri kutusunda tutulmu lardır. Bu sürenin sonunda petri kutusu içerisine 50 ml akvaryum suyu ilave edilerek 26-28 C de ki etüvde larva çıkı ına kadar 2-3 gün muhafaza edilmi tir. In vitro fertilizasyon sırasında spermatozoanın su ile aktivasyonu gerçekle tirilerek bu ekilde yumurtaların e zamanlı döllenmesi gerçekle tirilmi tir. 3.2.14. UV Uygulaması UV uygulamasında kullanılan saat camı deneyden 2-3 dk önce buz üzerine konmu tur. Bu sürenin sonunda saat camı üzerine, buz içerisinde bekletilen 50 l Hank s solüsyonu+spermatozoa karı ımı aktarılmı tır. UV cross-linker cihazına yerle tirilen saat camı üzerindeki sperma UV lambasından 28 cm uzaklı a yerle tirilerek UV

37 uygulamasına (254 nm) 2 dakika süre ile maruz bırakılmı tır. Bu uygulama sonrasında spermatozoa aktivasyonu amacıyla distile su kullanılmı ve motilite yüzdesi tespit edilmi tir. 3.2.15. Sıcak ok Uygulaması UV translinker cihazı kullanılarak 2 dakika süreyle UV ı ınlarına maruz bırakılan spermatozoa, dölleme i leminde kullanıldıktan 13 dakika sonra 41 C veya 41.4 C de 2 dakika süre ile sıcak ok uygulaması yapılmı tır. 3.2.16. Embriyo ve Larva Bakımı In vitro fertilizasyondan hemen sonra kontrol grubu, haploit ve diploit ginogen zebra balıklarına ait döllenmi yumurtalar steril petri kutusu içerisinde 26-28 C deki inkübatöre aktarılmı tır. Fetilizasyondan bir saat sonra döllenmemi yumurtalar steril plastik Pasteur pipeti kullanılarak ortamdan uzakla tırılmı tır. Embriyolar ilk 24 saat fazla hareket ettirilmemi ve bu süre boyunca karanlık ortamda tutulmu lardır. Döllenmeden 48 saat sonra Pasteur pipeti kullanılarak 1/3 oranında su de i imi gerçekle tirilmi ve embriyolar minimum seviyede hareket ettirilmi tir. Yumurtadan larva çıkı ı gerçekle tikten sonra zebra balı ı larvası petri kutusundan aynı su ko ullarındaki 250 ml lik beher içerisine aktarılmı tır. Vitellus kesesinin bitimine kadar (2-3 gün) 250 ml lik beher içerisinde tutulan zebra balı ı larvası daha sonra 500-1000 ml lik behere aktarılmı ve yumurta sarısı süspansiyonundan 1-2 damla verilerek beslenmi tir. Kontrol grubu ve diploit ginogen zebra balıkları 14. ve 21. günlerde ise Artemia sp. ile beslenmeye ba lanmı tır. 3.2.17. Kontrol ve Ginogenetik Zebra Balıklarının Morfolojik ncelenmesi Kontrol grubu, haploit ve diploit ginogenetik embriyo ve larvaların döllenmeden itibaren 5. güne kadar geli im farklılıklarının tespit edilmesi amacıyla stereo ve invert mikroskopta incelenerek foto raf çekimleri gerçekle tirilmi tir.

38 3.2.18. Karyotip Analizi 3.2.18.1. Chorion un Uzakla tırılması Döllenmeden 24 saat sonra zebra balı ı embriyosuna ait chorion ince keskin uçlu pens yardımıyla uzakla tırılmı ve steril Pasteur pipeti kullanılarak steril petri kutusuna aktarılmı tır. 3.2.18.2. Karyotip Analizi Chorion uzakla tırma i leminden sonra zebra balı ı embriyosu 28,5 C deki taze hazırlanmı kol isin solüsyonuna (4 mg/ml) aktarılmı ve 90 dk. boyunca karanlık ortamda tutulmu tur. Daha sonra oda sıcaklı ında %1,1 lik sodyum sitrat içerisine konmu ve vitellus kesesi delinerek uzakla tırılmı tır. Bu i lemden 8 dakika sonra petri kabı buz üstüne alınmı ve 8 dakika süre ile buz üstünde tutulmu tur. Bu sürenin sonunda zebra balı ı embriyosu 3:1 methanol/asetik asit içerisine aktarılarak, 20 dakika bekletilip daha sonra aynı oranda methanol/asetik asit fiksatifi eklenerek gece boyunca buz dolabında +4 C de muhafaza edilmi tir. 3.2.18.3. Kromozomların Yayılması Methanol/asetik asit fiksatifinde +4 C de muhafaza edilen embriyolar teker teker petri kutusuna alınarak havada kurutulmu tur. Havada kurutulmu embriyo saat camına alınarak üzerine 2-3 damla %50 lik asetik asit eklenerek 1 dakika boyunca embriyo ezme i lemi gerçekle tirilmi tir. Ezme i lemi sonucunda elde edilen örnek kapillar tüpe alınmı ve 50 l si 20 cm yükseklikten lama (ısıtma tablasında 50 C de ısıtılmı ) damlatılmı tır. Preparatlar, 50 C de 10 dakika süreyle tutularak kurutulmu tur. Daha sonra örnekler 20 dakika Giemsa ile boyanmı ve bu sürenin sonunda saf suya (2 kez) daldırılıp çıkarılmı tır. Oda sıcaklı ında kurumaya bırakılan örnekler, entellan ile kapatılarak preparatlar ı ık mikroskobunda incelenmi tir. 3.2.19. statistiksel Analizler Deneyde elde edilen verilerin ortalama ve standart sapma (±Std) de erleri Microsoft Office Excel programı yardımıyla hesaplanmı tır. Bu verilere SPSS istatistiki program (SPSS 14.0) uygulanarak Varyans Analizi (ANOVA) yapılmı tır. Tukey çoklu kar ıla tırma testi kullanılarak, gruplara ait verilerin P<0,05 olması durumunda farklılık oldu u tespit edilmi tir.

39 3.2.20. Osmotik Basınç Ölçümü Çalı mada kullanılan Hank s solüsyonundan 20 l örnek alınarak F SKE marka mikro osmometre cihazında ölçümü yapılmı ve 300 mosm/kg olarak hesaplanmı tır. Spermatozoa osmotik basıncı ise Hank s solüsyonu içerisinde ezilerek çıkarılan spermatozoa hücreleri 12000 rpm hızında 5 dakika süreyle santrifüj edilerek ayrı ması sa lanarak 20 l spermatozoa örne inin F SKE marka mikro osmometre cihazında ölçümü yapılmı ve 306 mosm/kg olarak hesaplanmı tır.

40 4. BULGULAR 4.1. SPERMATOZOA MOT L TES NE A T BULGULAR Spermatozoa motilite yüzdelerinin incelenmesi amacıyla 28 adet erkek zebra balı ından (Danio rerio) elde edilen testis dokusu bistüri ile parçalanarak Hank s solüsyonunda muhafaza edilmi tir. Her bir balı a ait örneklerden 4 er tanesi bir araya getirilerek pooling yapılmı ve böylece elde edilen 7 gruba ait spermatozoanın 1., 2. ve 3. saate ait motilite yüzdeleri incelenmi tir. Sonuçta; 1. saatte %95 olan motilite yüzdesi 2. saatte %5 oranında ve 3. saatte ise %10-20 oranında azalma tespit edilmi tir ( ekil 4.1). ekil 4.1 Zebra balı ına ait spermatozoa motilite yüzdesine ait veriler ekil (4.1) de gösterilen spermatozoa örneklerinin zamana ba lı olarak motilite yüzdelerindeki de i im Tablo (4.1) de gösterilmi tir. +4 C de muhafaza edilen spermatozoa örneklerinin 0., 1., 2. ve 3. saatte motilite yüzdeleri kar ıla tırıldı ında 3. saatte motilite yüzdesinde dü ü oldu u tespit edilmi tir. Tablo 4.1 Spermatozoa örneklerinin zamana ba lı motilite de erleri Spermatozoa alınma zamanı lk alındı ı zaman 1.saat 2.saat 3.saat Ortalama motilite de erleri %92,50±5 a %92,50±5 a %92,50±5 a %73,75±5 b

41 ekil (4.2) de gösterilen 5 grubun her birinde 4 adet erkek zebra balı ından elde edilen spermatozoa örne i pooling yapılarak Hank s solüsyonunda 3 saat süreyle muhafaza edilmi tir. Spermatozoa motilite süresinin 3. saatte alınan örneklerde 0. saate göre ortalama %15±5 oranında azalma tespit edilmi tir ( ekil 4.2). ekil 4.2 Zebra balı ı spermatozoası hayatta kalma süresinin zamana ba lı de i imi Tablo (4.2) ve Tablo (4.3) te gösterilen 8 grubun her birinde 4 erkek zebra balı ından elde edilen sperma örneklerine ait pooling UV ye maruz bırakılmı tır. Ultraviyole sonrası spermatozoa motilite yüzdesi, UV öncesi motilite yüzdesine göre %25±5 oranda dü ü gösterdi i tespit edilmi tir (Tablo 4.2). Aynı ekilde UV sonrası motilite süresinin UV öncesi motilite süresine göre %8±5 oranında dü ü gösterdi i tespit edilmi tir (Tablo 4.3). Fakat motilite yüzdesi ve süresindeki dü ü ün istatistiksel açıdan önemli olmadı ı tespit edilmi tir (P>0,05).

42 Tablo 4.2 Zebra balı ı spermatozoası UV öncesi ve sonrası motilite yüzdesine ait veriler UV sonrası Motilite yüzdesi motilite (%) yüzdesi (%) 1. grup 90 70-80 2. grup 75 50-60 3. grup 90 65 4. grup 80 60 5. grup 95 60-65 6. grup 95 60 7. grup 90 50 8. grup 80-90 50-60 Tablo 4.3 Zebra balı ı spermatozoası UV öncesi ve sonrası motilite süresine ait veriler Motilite süresi (sn) UV sonrası motilite süresi (sn) 1. grup 60 45-50 2. grup 40 35 3. grup 50 30 4. grup 55 40 5. grup 65 35-40 6. grup 65 40 7. grup 60 30-35 8. grup 60 35-40

43 4.2. SPERMATOZOA YO UNLU UNA A T BULGULAR 15-16 aylık 100 adet erkek zebra balı ından elde edilen sperma; her bir grupta 4 adet balı a ait sperma örne i olacak ekilde 25 gruba ayrılmı ve Hank s solüsyonunda muhafaza edilmi tir. Her bir gruba ait sperma örneklerinden Thoma lamında spermatozoa sayımı yapılarak yo unluk hesaplanmı tır. Bu örneklerin spermatozoa yo unlu una ait standart sapma de eri 4,36x10 6 ± 0,62x10 6 sp/ml olarak hesaplanmı tır ( ekil 4.3). ekil 4.3 Spermatozoa yo unlu una ait veriler Tablo 4.4 Erkek zebra balıklarında spermatozoa yo unlu unun (adet/ml) ya a ba lı de i imi 7-8 aylık erkek zebra balı ı 15-16 aylık erkek zebra balı ı Spermatozoa yo unlu u 2,42x10 6 ±1,15x10 6 4,36x10 6 ± 0,62x10 6

44 4.3. EMBR YO YA AMA ORANLARINA A T BULGULAR Çalı mada, 15-16 aylık di i zebra balı ından elde edilen 300 adet yumurtanın 100 tanesi haploit ginogen, 100 tanesi diploit ginogen ve kalan 100 adet yumurta ise kontrol grubun elde edilmesi amacıyla fertilizasyonda kullanılmı tır. Diploit ginogenlerin elde edilmesi amacıyla 41,0 C ve 41,4 C lik iki farklı sıcak ok uygulaması kullanılmı tır. Bu iki sıcak ok uygulamasında da 100 er adet embriyo kullanılmı tır. Bu sıcak ok uygulamaları sonucunda 72. ve 78. saatler arasında embriyoların hayatta kalma oranının 41,4 C de 41,0 C ye göre daha yüksek oldu u tespit edilmi tir (P<0,05) (Tablo 4.5). Tablo (4.5) de 72.-78. saatler arasında embriyolarda gözlemlenen ölüm oranları; 41,4 C sıcak ok uygulanan diploit ginogen grupta %80±3, kontrol grubunda %20±5, haploit ginogen grupta %99±1 ve 41 C sıcak ok uygulamasının yapıldı ı diploit ginogen grupta ise %85±2, kontrol grubunda %15±5 ve haploit ginogen grupta ise %100 oldu u tespit edilmi tir. Tablo 4.5 Sıcak ok uygulaması sonucunda embriyoların hayatta kalma ve ölüm oranları (%) ok Uygulama Sıcaklı ı ( C) Kontrol Diploit Ginogen Haploit Ginogen canlı ölü canlı ölü canlı ölü 41,4 75±5 20±5 17,3±3 80±3 0,5±0,5 99±1 41,0 80±6 15±5 14±2 85±2 0 100 Tablo (4.6) da diploit ginogen balıkların eldesi amacıyla uygulanan 41,4 C deki sıcak ok sonucunda embriyolarda zamana ba lı olarak tespit edilen ölüm yüzdeleri verilmi tir. Buna göre fertilizasyondan sonraki 12-24. ve 24-48. saatler arasında diploit ginogen embriyolarda ölüm oranının daha fazla oldu u, haploit ginogen grupta ise 12-24. ve 24-48. saatler arasında ölüm oranının yüksek oldu u, 48-72. saatler arasında ise hayatta kalan embriyo sayısının çok dü ük oldu u tespit edilmi ve 73. saatte 1 tane haploit larvanın hayatta kaldı ı tespit edilmi tir.

45 Tablo 4.6 41,4 C deki ok uygulaması sonucunda deney gruplarına ait ölüm yüzdesi (%) Kontrol Diploit ginogen Haploit ginogen 1. saatte 5,1±6,8 18,89±14,44 36,24±21,02 1.-12.saat arası 7,3±5,95 27,54±8,05 39,16±12,76 12.-24.saat arası 8,7±6,35 41,28±5,12 60,32±13,46 24.-48.saat arası 8,75±7,03 48,89±21,22 53,03±15,80 48.-72.saat arası 0±0 28,35±20,83 90±8,6 Tablo (4.7) de diploit ginogen balıkların eldesi amacıyla uygulanan 41 C deki ok uygulamasındazamana ba lı olarak gerçekle en ölüm yüzdeleri verilmi tir. Buna göre fertilizasyondan sonra 12-24. ve 24-48. saatler arasında diploit ginogen embriyolarda ölüm oranının daha fazla oldu u, haploit ginogen grupta ise 12-24. ve 24-48. saatler arasında ölüm oranının yüksek oldu u ve yine haploit ginogen grupta 48-72. saatler arasında hayatta kalan embriyo olmadı ı tespit edilmi tir. Tablo 4.7 41 C deki ok uygulaması sonucunda deney gruplarına ait ölüm yüzdesi (%) Kontrol Diploit ginogen Haploit ginogen 1. saatte 4,9±4,6 20,49±16,24 31,84±22,72 1.-12.saat arası 6,2±4,75 27,54±10,25 43,46±14,36 12.-24.saat arası 8,1±4,15 43,78±5,82 71,52±15,16 24.-48.saat arası 8,25±7,03 54,89±21,72 73,03±15,80 48.-72.saat arası 0±0 30,35±27,83 100

46 4.4. EMBR YO GEL M NE A T BULGULAR Çalı mada 41,4 C deki sıcak ok uygulaması sonucunda elde edilen diploit ginogen embriyoların zamana ba lı morfolojik geli imleri incelendi inde; fertilizasyondan sonraki 12. saatte haploit ginogen embriyoların 8 saatlik evrede (%75 epiboli), diploit ginogen ve kontrol gruplarının ise normal geli im gösterdi i yani 12 saatlik evrede (bud safhası) oldu u tespit edilmi tir. Fertilizasyondan sonraki 24. saatte; haploit ginogen embriyoların 18 saatlik evrede (18-somit) oldu u, diploit ginogen ve kontrol gruplarının ise 24 saatlik evrede (prim-6) oldu u tespit edilmi tir. Embriyo geli iminin 48. saatinde; haploit ginogen embriyoların 36 saatlik evrede (prim-22) oldu u, diploit ginogen grubun 42 saatlik evrede (pektoral yüzgeç olu umu ba langıcı) ve kontrol grubunun 48 saatlik evrede (uzun kuyruk yapısı) oldu u tespit edilmi tir. 72. saatte; haploit ginogen embriyoların 60 saatlik evrede (pektoral yüzgeç olu umu), diploit ginogen ve kontrol grubunun 72 saatlik evrede (a ız olu umu) oldu u tespit edilmi tir. Bu verilere göre haploit embriyoların morfolojik geli iminin kontrol grubuna göre daha geç gerçekle ti i tespit edilmi tir. Diploit ginogen grupta ise embriyoların morfolojik geli imlerinin kontrol grubuna ait embriyolarla benzer oldu u tespit edilmi tir (Tablo 4.8). Tablo 4.8 Kontrol ve ginogen gruplara ait embriyo geli imlerinin kar ıla tırılması Deney Grupları Morfolojik Geli im Zamanları 12. saat 24. saat 48. saat 72. saat Kontrol Bud safhası Prim-6 Uzun kuyruk yapısı A ız olu umu Haploit Ginogen %75 epiboli 18 somit Prim-22 Pektoral yüzgeç olu umu Diploit Ginogen Bud safhası Prim-6 Pektoral yüzgeç olu umu ba langıcı A ız olu umu

47 4.4.1. Kontrol Grubu Embriyo Geli imine Ait Bulgular Kontrol grubuna ait embriyo geli imi stereo ve invert mikroskop kullanılarak 12 ve 72. saatler arasında incelenmi tir. Yumurtadan larva çıkı ını takip eden 1., 2. ve 3. günlerde yapılan incelemelerde kontrol grubu larvaların geli iminde anormallik gözlemlenmemi tir. Kontrol grubuna ait embriyoların stereo mikroskopta yapılan incelemelerinde fertilizasyondan 3 saat sonra hücre bölünmeleri geçirerek 1000 hücre sahfasına ula tı ı tespit edilmi tir ( ekil 4.4). ekil 4.4 Kontrol grubu embriyo 1000 hücre safhası (3.saat) x1,8 Fertilizasyondan sonraki 15. ve16. saatler arasında yumurta sarısı hücrelerinin böbrekfasülye ekline benzer bir yapı gösterdi i ve yumurta sarısı ekstansiyonunun ba ladı ı tespit edilmi tir ( ekil 4.5). ekil 4.5 13-somit safhası (15-16.saat) x1,8

48 ekil (4.6) da kontrol grubu embriyoda 60. saatte invert mikroskopta yapılan incelemelerde notokordun görüntüsü verilmi tir. n ekil 4.6 Kontrol grubu embriyoda notokord (n) (60. saat) x10 Kontrol grubuna ait embriyoda 72. saatte invert mikroskopta yapılan incelemelerde göz olu umunun normal oldu u ve melanosit hücrelerin varlı ı tespit edilmi tir ( ekil 4.7). g m ekil 4.7 Kontrol grubu embriyoda göz (g) ve melanosit hücrelerin görüntüsü (72. saat) x4

49 Kontrol grubu embriyoların stereo mikroskopta yapılan incelemelerinde 75. saatte farklı geli im safhalarında oldu u tespit edilmi tir ( ekil 4.8). ekil 4.8 Kontrol grubuna ait embriyoların genel görünümü (75.saat) x1.8 Kontrol grubuna ait embriyoda yumurtadan larva çıkı ını takip eden 78. saatte stereo mikroskopta ölçülen boy uzunlu u 2497 µm olarak tespit edilmi tir ( ekil 4.9). ekil 4.9 Kontrol grubu larvaya ait genel vücut yapısı (78. saat) x1,8

50 4.4.2. Diploit Ginogen Embriyo Geli imine Ait Bulgular Diploit ginogen gruba ait embriyo geli imi stereo ve invert mikroskop kullanılarak 12. ve 72. Saatler arasında incelenmi tir. Yumurtadan larva çıkı ını takip eden 1., 2. ve 3. günlerde yapılan incelemelerde diploit ginogen larvaların geli iminde anormallik gözlemlenmemi tir. embriyo geli imine ait foto raflar verilmi tir. Fertilizasyondan 14-16 saat sonra diploit ginogen embriyonun 17-somit safhasında oldu u ( ekil 4.10) ve 48. saatte ise gözler ve genel vücut yapısı gözlemlenmi tir ( ekil 4.11). ekil 4.10 17-somit safhasındaki diploit ginogen embriyo (14-16. saat) x1.8 ekil 4.11 48 saatlik diploit ginogen embriyo x1.8

51 Diploit ginogen embriyoların fertilizasyondan sonraki 75. saatte stereo mikroskopta yapılan incelemelerinde kontrol grubu embriyolara göre geli imlerinin daha hızlı oldu u ve normal geli im gösteren embriyoların yanı sıra geli im sürecinde anormallikler ( ekil 4.12) ve larva çıkı ı sırasında ölüm tespit edilmi tir ( ekil 4.13). ekil 4.12 Diploit ginogen embriyo grubunun 75. saatteki geli imi x 1.8 ekil 4.13 Diploit ginogen embriyoda larva çıkı ı ve 75. saatteki genel görünüm x 1.8

52 ekil (4.14) de invert mikroskopta yapılan incelemede diploit ginogen embriyoda 75. saatte göz, melanosit, optik plakod ve notokordun yapısı gösterilmi tir. n m op g ekil 4.14 Diploit ginogen embriyonun göz (g) melanosit (m), notokord (n) ve otik plakod (op) 75. saatteki görünümü x4 Diploit ginogen gruba ait yumurtadan yeni çıkmı larvanın (78. saat) stereo mikroskopta boy uzunlu u 2553 µm olarak ölçülmü tür ( ekil 4.15). ekil 4.15 78. saatte yumurtadan yeni çıkmı diploit zebra balı ı larvası x 1.8

53 4.4.3. Haploit Embriyo Geli imine Ait Bulgular Haploit ginogen gruba ait embriyo geli imi stereo ve invert mikroskop kullanılarak 12. ve 72. saatler arasında incelenmi tir. Yumurtadan larva çıkı ını takip eden 1., 2. ve 3. günlerde yapılan incelemelerde haploit ginogen larvaların geli iminde anormalliklerin oldu u ve 2. günün sonunda tüm larvaların öldü ü gözlemlenmi tir. ekil (4.16) da haploit embriyoda fertilizasyondan sonraki 14. saatte stereo mikroskopta embriyonun yapısı gösterilmi tir. ekil 4.16 Bud safhası (14.saat) x1.8 Fertilizasyondan sonraki 18. ve 19. saatler arasında 13-somit safhasında oldu u tespit edilen embriyoda vücut aksisinin kontrol grubuna göre kısa oldu u tespit edilmi tir ( ekil 4.17). ekil 4.17 13-somit safhası (18.-19. saat) x1.8

54 nvert mikroskopta yapılan incelemelerde fertilizasyondan sonraki 55. saatte kalp ve perikardiyal bo lu un yeri ekil (4.18) de gösterilmi tir. k pb ekil 4.18 Haploit embriyoda kalp (k) yeri ve perikardiyal bo luk (pb) (55. saat) x4 Fertilizasyondan sonraki 70. saatte haploit embriyoların stereo mikroskoptaki görüntüsü ekil (4.19) da verilmi tir. ekil 4.19 Haploit ginogen embriyo grubunun 70. saatteki geli imi x 1.8

55 Fertilizasyondan sonraki 72. saatte haploit ginogen embriyonun invert mikroskopta yapılan incelemelerinde kısa ve kalın vücut yapısına sahip oldu u gözlemlenmi tir ( ekil 4.20). ekil 4.20 Kısa vücut yapısına sahip anormal geli im gösteren haploit ginogen embriyonun görüntüsü (72. saat) x4 nvert mikroskopta yapılan incelemelerde 72. saatte haploit embriyoda notokordda gözlemlenen deformasyon ekil (4.21) de ok ile gösterilmi tir. n ekil 4.21 Haploit embriyoda notokord (n) görüntüsü (72. saat) x10

56 nvert mikroskopta yapılan incelemelerde 72. saatte haploit embriyonun kuyruk bölgesinde deformasyon ve kalınla ma tespit edilmi tir ( ekil 4.22). ekil 4.22 Haploit embriyoya ait kuyruk yapısı (72. saat) x4 Fertilizasyondan sonraki 72. saatte stereo mikroskopta yapılan incelemelerde larvalarda yüzme aktivitesinin oldu u tespit edilmi tir. Fakat bunlar hücrelerinde deformasyon oldu u için diploit bireyde oldu u gibi yüzme hareketini gerçekle tiremez. Bu ekilde özellik gösteren haploit larvaların bir kısmında stereo mikroskopta boy uzunlu u 2331µm olarak ölçülmü tür ( ekil 4.23). ekil 4.23 Haploit embriyoda genel vücut yapısı (72. saat) x1.8

57 Fertilizasyondan sonraki 76. saatte haploit ginogen larvaların bir kısmında boy uzunlu unda kısalık, vücut eninde kalınla ma ve vücut morfolojisinde anormallikler tespit edilmi olup bu özelliklere sahip olan larvaların boy uzunlu u 1277 µm olarak ölçülmü tür ( ekil 4.24). ekil 4.24 Haploit ginogen larvanın genel görünümü (76. saat) x1.8 Fertilizasyondan sonraki 5. günde haploit larvada ölüm tespit edilmi tir ( ekil 4.25). ekil 4.25 Fertilizasyondan sonraki 5. günde tespit edilen ölü haploit zebra balı ı larvası x4

58 4.5. KARYOT P ANAL Z SONUÇLARINA A T VER LER 4.5.1. Kontrol Grubu Zebra Balı ı Embriyolarına Ait Karyotip Analiz Sonuçları UV ı ınlarına maruz bırakılmamı sperm hücresi ile normal yumurta hücresinin fertilizasyonu sonucunda elde edilen embriyolarda, embriyo geli iminin 24. saatinde yapılan karyotip analizi sonucunda kromozomların da ılımı ekil 4.26 da gösterilmi tir. I ık mikroskobunda incelenen preparatlarda hücrelerde patlama sonucunda kromozomlar tespit edilmi tir ( ekil 4.26) ekil 4.26 Kontrol grubu embriyoya ait kromozomların da ılımı (x100)

59 4.5.2. Haploit Ginogen Zebra Balı ı Embriyolarına Ait Karyotip Analiz Sonuçları Fertilizasyondan sonraki 24. saatte haploit ginogen embriyolardan yapılan karyotip analizi sonucunda kromozom kollarında kopma ve parçalanmalar oldu u tespit edilmi tir ( ekil 4.27). ekil 4.27 Haploit ginogen embriyoda kromozomların da ılımı (x100)

60 4.5.3. Diploit Ginogen Zebra Balı ı Embriyolarına Ait Karyotip Analiz Sonuçları Diploit ginogen embriyolardan fertilizasyondan sonraki 24. saatte yapılan karyotip analizi sonucunda kromozom preparatlarının ı ık mikroskobundaki görüntüsü ekil (4.28) de verilmi tir. ekil 4.28 Diploit ginogen embriyoda kromozomların da ılımı (x100) Fertilizasyondan sonraki 24. saatte kontrol ve ginogen gruplara ait embriyolardan yapılan karyotip analizi sonucunda kromozom sayısının; kontrol ve diploit ginogen gruplarda 2n=50, haploit ginogen grupta ise n=25 oldu u tespit edilmi tir (Tablo 4.9). Tablo 4.9 Kontrol ve ginogen gruplara ait embriyolarda tespit edilen kromozom sayıları Kontrol Grubu Haploit Ginogen Diploit Ginogen Kromozom Sayısı 50 25 50