ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAZI TURUNÇGİL ANAÇLARINDA FARKLI EKSPLANT KAYNAĞI VE BESİ ORTAMLARININ SOMATİK EMBRİYOGENESİS ÜZERİNE ETKİLERİ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2008

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAZI TURUNÇGİL ANAÇLARINDA FARKLI EKSPLANT KAYNAĞI VE BESİ ORTAMLARININ SOMATİK EMBRİYOGENESİS ÜZERİNE ETKİLERİ YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez../.../2008 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle Kabul Edilmiştir. İmza...... Doç.Dr.Yıldız AKA-KAÇAR DANIŞMAN İmza...... Prof.Dr. Turgut YEŞİLOĞLU ÜYE İmza...... Prof.Dr. Selim ÇETİNER ÜYE Bu tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr.Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Çalışma Ç. Ü. Rektörlüğü Araştırma Fonu Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF2007YL17 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAZI TURUNÇGİL ANAÇLARINDA FARKLI EKSPLANT KAYNAĞI VE BESİ ORTAMLARININ SOMATİK EMBRİYOGENESİS ÜZERİNE ETKİLERİ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR Yıl : 2008, Sayfa : 74 Jüri : Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR Prof. Dr. Turgut YEŞİLOĞLU Prof. Dr. Selim ÇETİNER On turungil genotipinde [Citrus aurantium L. (cv Tuzcu 891 ), Citrus aurantium L. (cv Tuzcu 31-31 ), Citrus aurantium L. (cv Gou Tou ), Citrus sinensis (L.) Osb. (cv Alanya Dilimli ), Citrus reshni Hort. ex.tan. (cv Cyprus Cleopatra mandarine ), Poncirus trifoliata (L) Raf (cv Pomeroy ), Citrus sinensis (L) Osb. x Poncirus trifoliata (L) Raf. (cv Tuzcu M2 Citrange ), Citrus sinensis (L) Osb. x Poncirus trifoliata (L) Raf. (cv Carrizo Citrange ), Citrus paradisi Macf. x Poncirus trifoliata (L) Raf. (cv Swingle Citrumelo), Citrus volkameriana Tan.& Pasg. (cv CRC 01 Volkameriana )] stil ve ovül kültürü kullanılarak kallus oluşumu, somatik embriyogenesis ve bitki rejenerasyonu sağlanmıştır. Eksplantlar farklı besi ortamlarında kültüre alınmıştır. Murashige & Skoog (MS) makro ve mikro elementleri ve Murashige & Tucker (MT) vitaminlerine ek olarak 500mg/l Malt Ekstrakt ile 1mg/l 2.4D, 3 farklı BA konsantrasyonu (0, 0.5, 1mg/l) birinci yıl denemelerinde besi ortamı olarak kullanılmıştır. İkinci yıl stil eksplantları, MS basal ortamı, ME ile beraber 3 farklı BA konsantrasyonu (1, 2, 3mg/l) içeren ortamda kültüre alınmıştır. İkinci yıl denemelerinde MS makro ve mikro elementleri, MT vitaminleri ile ME herhangi bir büyümeyi düzenleyici içermeyen ortamda kültüre alınmış, ayrıca 2.4D (1mg/l) ve 3 farklı BA (0, 0.5, 1mg/l) konsantrasyonu içeren ortamlar ovül eksplantları için kullanılmıştır. Sukroz (50g/l) tüm denemelerde karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. Stil ve ovül kültürlerinden somatik embriyo oluşumuna genotipler farklı tepkiler vermiştir. Stil eksplantlarından somatik embriyo oluşumu %0 (AREC Swingle Sitrumelo, M2 Sitranjı, Volkameriana, Pomeroy üç yapraklısı) ve % 100 (Gou Tou turuncu) arasında değişirken aynı şekilde ovül eksplantlarinde somatik embriyo oluşum oranları %0 (Carrizo Sitranjı, Alanya Dilimli portakalı, AREC Swingle Sitrumelo) ile %100 (Tuzcu 891 ve Kleopatra Mandarini) arasında değişmiştir. Somatik embriyolar yaklaşık 4 hafta sonra bitkiye dönüşmüşlerdir. Anahtar Kelimeler: Turunçgiller, ovül kültürü, stil kültürü, somatik embriyogenesis, in vitro I

ABSTRACT MSc. THESIS THE EFFICIENCY OF DIFFERENT CULTURE MEDIA AND EXPLANT TYPE OF SOME CITRUS ROOTSTOCK ON SOMATIC EMBRYOGENESIS DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSTY OF CUKUROVA Supervisor : Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR Year : 2008, Pages: 74 Jury : Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR : Prof. Dr. Turgut YEŞİLOĞLU : Prof. Dr. Selim ÇETİNER Callus induction, somatic embryogenesis and plant regeneration were obtained in ten different Citrus genotypes [Citrus aurantium L. (cv Tuzcu 891 ), Citrus aurantium L. (cv Tuzcu 31-31 ), Citrus aurantium L. (cv Gou Tou ), Citrus sinensis (L.) Osb. (cv Alanya Dilimli ), Citrus reshni Hort. ex.tan. (cv Cyprus Cleopatra mandarine ), Poncirus trifoliata (L) Raf (cv Pomeroy ), Citrus sinensis (L) Osb. x Poncirus trifoliata (L) Raf. (cv Tuzcu M2 Citrange ), Citrus sinensis (L) Osb. x Poncirus trifoliata (L) Raf. (cv Carrizo Citrange ), Citrus paradisi Macf. x Poncirus trifoliata (L) Raf. (cv Swingle Citrumelo), Citrus volkameriana Tan.& Pasg. (cv CRC 01 Volkameriana ) from cultures style and ovule explants. Explants were cultured on different culture media. The nutrients of Murashige and Skoog medium (MS) and Murashige and Tucker (MT) vitamins supplemented with 500 mg/l Malt Extract (ME), with 1mg/l 2.4D and three different concentration of BA (0, 0.5, 1 mg/l) were used for first year experiments. MS basal medium was used alone with ME and three different concentration of BA (1, 2, 3 mg/l) for style explants for the second year experiment. MS nutrients and MT vitamins with ME were used alone and 2,4 D (1mg/l) and BA (0, 0.5, 1 mg/l) used for ovule culture experiment for the second year experiments. Sucrose was used as a carbon source (50g/l) for all experiments. The different genotypes showed different embryogenic frequency from style and ovule experiments. Percentages of style explants producing somatic embryos ranged from 0% (AREC Swingle Citrumelo, M2 Citrange, Volkameriana, Pomeroy trifoliate) to 100% (Gou Tou Sour Orange). Percentages of ovule explants producing somatic embryos ranged from 0% (Carrizo Citrange, Alanya Dilimli Sweet Orange, AREC Swingle Citrumelo) to 100% (Tuzcu 891 and Cleopatra Mandarine). About 4 weeks later somatic embryos developed into plantlets. Key words: Citrus, ovule culture, style culture, somatic embryogenesis, in vitro. II

TEŞEKKÜR Yüksek Lisans öğrenimim boyunca tezimin planlanması, yürütülmesi ve sonuçların değerlendirilmesi sırasında yardımlarını esirgemeyen danışman hocam Sayın Doç. Dr. Yıldız AKA-KAÇAR a sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Bu çalışmanın başlangıç aşamasında materyallerimin belirlenmesinde yardımcı olan Sayın Hocam Prof. Dr. Turgut YEŞİLOĞLU na teşekkür ederim. Lisans öğrenimimde beni biyoteknoloji ile tanıştıran, bilgilendiren, eğiten, Yüksek lisans eğitimimde de her zaman yanımda olan beni destekleyen kısaca bugünlere gelmemde çok büyük payları olan hocalarım Sayın Prof. Dr. Selim ÇETİNER e ve Doç. Dr. Yeşim YALÇIN-MENDİ ye sonsuz saygı ve teşekkürü yürekten bir borç bilirim. Tez çalışmam boyunca materyallerimin sağlanmasında yanımda olan, çalışmam boyunca yardımlarını benden esirgemeyen Sayın Hocam Yrd. Doç. Dr. Bilge YILDIRIM a, sevgili arkadaşım Arş. Gör. Meral İNCESU ve çalışmalarım sırasında yardımcı olan Semra GÖNÜL ve Özhan ŞİMŞEK e teşekkür ederim. Yüksek lisans öğrenimim boyunca yardımlarını ve desteklerini esirgemeyen Toros Tarım San. ve A.Ş. ye, Toros Tarım San.ve A.Ş. Genel Müdür Yardımcısı Sayın İskender İŞÇENER e, Genel Müdür Yardımcısı Sayın Necat HAKSAL a, Toros Agripark Müdürü Korel AKLAN a, Toros Agripark İşletme Şefi Sayın İhsan ÜNLÜ ye ve Toros Agripark Biyoteknoloji laboratuarı mesai arkadaşlarıma sonsuz teşekkür ederim. Tezimin her aşamasında yanımda olan, beni destekleyen sevgili iş arkadaşım Zir. Yük. Müh. İsmail VAROL a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmam boyunca tüm sorumluluklarımı paylaşarak hep yanımda olan bana büyük bir özveri ile yardımcı olan iş arkadaşım Zir. Yük. Müh Sezen İNAN a teşekkür ederim. Sevgili mesai arkadaşlarım Zir. Yük. Müh. İjlal EKEN ve meslektaşım Zir. Müh. Senem İNAN a her zaman beni sabırla dinledikleri ve destek oldukları için çok teşekkür ederim. Sera aşamalarında yardımlarını esirgemeyen sevgili mesai arkadaşlarım Ziraat Teknikeri Aynur BAĞRIYANIK ve Hasan YASİN e teşekkür ederim. Verilerimin istatiksel analizleri sırasında yardımlarından ve değerli önerileri için hocam Doç. Dr. Sedat SERÇE ye teşekkürlerimi sunarım. Yaşamım boyunca bana göstermiş oldukları maddi-manevi fedakârlıklardan dolayı sevgili aileme ve eşime yürekten teşekkür ediyorum ve son olarak hayatımın en güzel varlığına kızım Helin e III

İÇİNDEKİLER SAYFA NO ÖZ... I ABSTRACT... ІІ TEŞEKKÜR... ІІІ İÇİNDEKİLER... IV KISALTMALAR... VI ÇİZELGELER DİZİNİ... VII ŞEKİLLER DİZİNİ... IX 1.GİRİŞ... 1 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR... 5 3. MATERYAL ve YÖNTEM... 12 3.1. BİTKİSEL MATERYAL... 12 3.2. YÖNTEM... 17 3.2.1.DOKUKÜLTÜRÜ ÇALIŞMALARI. 17 3.2.1.1. Çiçek ve Meyve Örneklerinin Alınması 17 3.2.1.2. Kültüre Alınacak Bitki Parçacığının Sterilizasyonu ve Kültür Ortamlarının hazırlanması.. 18 3.2.1.3. Stil - Stigmaların Kültüre Alınması. 22 3.2.1.4. Ovüllerin Kültüre Alınması... 23 3.2.1.5. Elde Edilen Kalluslardan Embriyogenik Kallus ve Somatik Embriyo Elde Edilmesi.. 24 3.2.1.6. Elde Edilen Somatik Embriyoların Çimlendirilmesi 25 3.2.1.7. Somatik Embriyolardan Elde Edilen Bitkiciklerin Dış Koşullara Aktarılması 25 3.2.2. Çalışmada Yapılan Sayım ve Gözlemler.. 26 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA. 27 4.1. Ovül Kültürü Deneme Sonuçları... 27 4.1.1. Ovüllerde Canlılık Oranlarının Saptanması.. 27 IV

4.1.2. Ovüllerden Elde Edilen Kallus Ağırlık Ortalamalarının Saptanması 32 4.1.3. Ovüllerden Elde Edilen Kallus Oluşum Oranlarının Saptanması. 34 4.1.4. Ovüllerden Elde Edilen Embriyogenik Kallus Oluşum Oranlarının 40 Saptanması.. 4.1.5. Ovüllerden Elde Edilen Somatik Embriyo Oluşum Oranlarının 42 Saptanması.. 4.1.6. Ovüllerden Elde Edilen Somatik Embriyoların Bitkiye Dönüşüm Oranlarının Saptanması.. 49 4.1.7. Ovüllerden Elde Edilen Bitkilerin Sera Koşullarına Aktarılması. 50 4.2. Stil Kültürü Deneme Sonuçları... 52 4.2.1. Stillerden Elde Edilen Kallus Oluşum Oranları. 52 4.2.2. Stillerden Elde Edilen Somatik Embriyo Oluşum Oranlarının 57 Saptanması... 4.2.3. Stillerden Elde Edilen Somatik Embriyoların Bitkiye Dönüşüm Oranlarının Saptanması... 59 4.2.4. Stillerden Elde Edilen Bitkilerin Sera Koşullarına Aktarılması.. 60 5. SONUÇ VE ÖNERİLER.. 63 KAYNAKLAR.. 68 ÖZGEÇMİŞ... 74 V

KISALTMALAR 2.4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Atm : atmosfer BAP : Benzylamino Purine o C dk : santigrad derece : dakika ETOH : ethanol EK : Embriyogenik kallus g : gram GA 3 : Giberillic Acid l : litre ME : Malt Extract MS : Murashige & Skoog MT : Murashige & Tucker Mg : miligram NAA : Naphthalene acetic acid VI

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA NO Çizelge 3.1. Denemede Kullanılan Bitkisel Materyal... 15 Çizelge 3.2. Çalışmada stil, stigma ve ovüllerden kallus oluşumu için 1. deneme yılında kullanılan ortam içerikleri... 21 Çizelge 3.3. Çalışmada stil ve stigmalardan kallus oluşumu için 2. deneme yılında kullanılan ortam içerikleri... 21 Çizelge 3.4. Çalışmada ovüllerden kallus oluşumu için 2. deneme yılında kullanılan ortam içerikleri... 21 Çizelge 3.5. Çalışmada kullanılan, MS vitaminden modifiye edilmiş MT vitamin içeriği... 22 Çizelge 3.6. Çalışmada kullanılan, MS ortamı (Murashige ve Skoog, 1962) makro ve mikro elementleri ve miktarları... 22 Çizelge 4.1. Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik BA uygulamaları içeren ortamlardaki ovül kültürlerinin canlılık yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları... 28 Çizelge 4.2. İkinci deneme yılında ovül kültürlerinin canlılık yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları... 30 Çizelge 4.3. Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik BA uygulamaları içeren ortamlardaki ovül kültürlerinin kallus ağırlıklarına ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları... 32 Çizelge 4.4. Ovül kültürlerinin kallus oluşum yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları... 34 Çizelge 4.5. İkinci deneme yılında ovül kültürlerinin kallus oluşum yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları... 36 Çizelge 4.6. İkinci deneme yılında elde edilen somatik embriyo oluşum oranları... 45 Çizelge 4.7. İkinci deneme yılında elde edilen bitki oluşum oranları... 49 VII

Çizelge 4.8. İkinci deneme yılında seraya aktarılan bitki oranları... 51 Çizelge 4.9. Stil kültürlerinin kallus oluşum yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları... Çizelge 4.10. Stillerden elde edilen somatik embriyo oluşum oranları... 58 Çizelge 4.11. Stillerden elde edilen bitki oluşum oranları... 60 Çizelge 4.12. Bazı turunçgil genotiplerinde embriyogenik kallus ve somatik embriyo eldesi için kullanılan farklı eksplant ve kültür ortamları... 54 62 VIII

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA NO Şekil 3.1. Denemede kullanılan bitkisel materyallerin görünüşleri (a. Kleopatra, b. M2, c. Volkameriana, d. Carizo, e. Pomeroy)... 16 Şekil 3.2. Denemede kullanılan stil-stigmaların izole edildiği çiçekler... 17 Şekil 3.3. Denemede kullanılan ovüllerin izole edildiği meyveler... 18 Şekil 3.4. Çiçek tomurcuklarının temizlenmesi... 20 Şekil 3.5. Çiçeklerin sterilizasyonu... 20 Şekil 3.6. Tüm çiçek tomurcuklarının sterilizasyonu... 20 Şekil 3.7. Meyvelerin sterilizasyonu... 20 Şekil 3.8. a. Dişi organın temizlenmesi b. Stil eksplantının kesilmesi c. Yumurtalıktan ayrılmış stil eksplantı d. Stigma,stil ve ovarium e. Stil eksplantlarının ortam içerisine yerleştirilmesi f. Ortam içerisine yerleştirilmiş stil eksplantı... 23 Şekil 3.9. Stil eksplantlarından elde edilen kalluslar (a.üç haftalık kallus gelişimi b. dört haftalık kallus gelişimi c-d. beş haftalık kallus gelişimi)... 23 Şekil 3.10. Meyvelerden izole edilen ovüllerin görünüşleri (a.steril edilen meyvenin kabin içerisinde kesilmesi b. meyveden ovüllerin izole edilmesi c-d. izole edilen ovüller e. ovül eksplantının ortam içerisine yerleştirilmesi)... 25 Şekil 3.11. Ovül eksplantlarından elde edilen kalluslar (a. iki haftalık kallus gelişimi b. üç haftalık kallus gelişimi c. dört haftalık kallus gelişimi)... 25 Şekil 4.1. Turuçgil genotiplerinin değişik BA uygulamaları içeren ortamlarındaki ovül kültürlerinin canlılık yüzdelerine ait ortalamalar. Hata çubukları ve standart sapma değerlerini 29 göstermektedir... IX

Şekil 4.2. Şekil 4.3. Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik BA uygulamaları içeren ortamlarındaki ovül kültürlerinin canlılık yüzdelerine ait ortalamalar. Hata çubukları ve standart sapma değerlerinigöstermektedir... Turunçgil genotiplerinin değişik BA uygulamaları içeren ortamlarındaki ovül kültürlerinin kallus ağırlıklarına ait ortalamalar. Hata çubukları ve standart sapma değerlerini göstermektedir... 31 33 Şekil 4.4. Birinci deneme yılı ovül kültürlerinin kallus oluşum yüzdelerine ait ortalamalar. Hata çubukları ve standart sapma değerlerini göstermektedir... 35 Şekil 4.5. İkinci deneme yılı ovül kültürlerinin kallus oluşumlarına ait ortalama grafikleri... 37 Şekil 4.6. Ovül kültürlerinden elde edilen kalluslar (A.Tuzcu 891, B. Tuzcu 31-31, C. AREC Swingle Citrumelo, D.Carizo Sitranjı, E. Gou Tou, F. M2 Sitranjı)... 39 Şekil 4.7. Ovül kültürlerinden elde edilen kalluslar (A. Kleopatra, B. Pomeroy, C. Volkameriana)... 40 Şekil 4.8. Kleopatra mandarini (A, B, C) ve Tuzcu 891 genotiplerine ait (D) ovül kültüründen gelen embriyogenik kalluslar... 41 Şekil 4.9. Tuzcu 891 e ait somatik embriyolar... 45 Şekil 4.10. Kleopatra ya ait somatik embriyolar... 45 Şekil 4.11. M2 Sitranjına ait somatik embriyolar 45 Şekil 4.12. A. Gou Tou B. Pomeroy Üç yapraklısına ait somatik embriyolar 46 Şekil 4.13. A. Tuzcu 31-31 B. Volkameriana anacına ait somatik embriyolar 46 Şekil 4.14. Tuzcu 891 turuncuna ait somatik embriyogenesis aşamaları A) 47 globüler, B) kalp, C) torpedo, D) kotiledon.. Şekil 4.15. Gou Tou turuncuna ait somatik embriyogenesis aşamaları a) globüler, b) kalp, c) torpedo-kotiledon 48 X

Şekil 4.16. Kıbrıs Kleopatra mandarinine ait somatik embriyogenesis aşamaları a) globüler, b) kalp, c) torpedo.. 48 Şekil 4.17. Ovül kültürlerinde elde edilen bitkicikler.. 50 Şekil 4.18. Ovül kültürlerinden elde edilen bitkicikler (A. Tuzcu 31-31, B. M2 Sitranj, C. Tuzcu 891, D. Gou Tou). 51 Şekil 4.19. İkinci deneme yılı stil kültürlerinin kallus oluşumlarına ait ortalama grafikleri.. 55 Şekil 4.20. Stil eksplantından elde edilen kalluslar (A. Tuzcu 31-31, B. 56 Tuzcu 891, C. Alanya, D. AREC Swingle Citrumelo, E. Carizo). Şekil 4.21. Stil eksplantından elde edilen kalluslar (A. Kleopatra, B. M2, C. 57 Pomeroy Üç Yapraklısı, D. Volkameriana)... Şekil 4.22. Stil eksplantlarından elde edilen somatik embriyolar (A-B. Tuzcu 31-31, C- D. Tuzcu 891). 58 Şekil 4.23. Stil eksplantlarından elde edilen somatik embriyolar(a. Alanya Dilimli, B. Carizo, C.Gou Tou, D. Kleopatra).. 59 Şekil 4.24. Stillerden elde edilen bitkicikler (A. Tuzcu 31-31, B. Tuzcu 891, C. Gou Tou, D. Tuzcu M2 Sitranjı, E.Tuzcu 891) 61 XI

GİRİŞ GİRİŞ Turunçgiller dünyada yetiştiriciliği yapılan en önemli meyve gruplarından biridir. Turunçgil grubunun sahip olduğu tür ve çeşit zenginliği, meyvelerinin olgunlaşmasının uzun bir döneme yayılması ve olgunlaşan meyvelerin ağaç üzerinde bekletilebilmesi turunçgillerin önemini artırmaktadır. Zengin bir C vitamini içeriğine sahip olan turunçgiller insan sağlığı için son derece önemlidir. Aynı zamanda insan beslenmesindeki önemi, kendine has renk ve kokusu, kozmetik sanayi hammaddeleri arasında yer alması dünya pazarlarında turunçgil yetiştiriciliği adına geniş bir talebin doğmasına neden olmuştur (Karahocagil, 2003). Dünyada turunçgil üretimi 35 Kuzey ve Güney paraleller arasındaki bölgelerde yapılmaktadır. Kuzey Yarıküre de, Kuzey ve Orta Amerika ile Akdeniz ülkeleri, Güney Yarıküre de ise Güney Amerika, Güney Afrika ve Okyanusya da ekonomik olarak üretilmektedir (Karahocagil, 2003). Dünyadaki en büyük turunçgil üreticisi ülkeler; Brezilya, ABD ve Çin dir. 2006 yılı itibari ile Brezilya 20.3 milyon ton üretimle birinci sırada, 18.4 milyon tonluk üretimle Çin ikinci, 11.5 milyon tonluk üretimle ABD ise üçüncü sırada yer alırken, Türkiye 3.220,450 tonla dünya turunçgil üretiminde 9. sırada yer almaktadır (Anonim, 2007). Türkiye de toplam turunçgil üretiminin %91 i Akdeniz, %8.5 i Ege, %0.5 i ise Doğu Karadeniz bölgelerinden elde edilmektedir (Yeşiloğlu ve ark., 2007). Dünyada ve Türkiye'de büyük öneme sahip turunçgiller genellikle tohum, çelik ve öteki vegetatif yöntemlerle kolaylıkla çoğaltılabilirse de, özellikle hastalıklardan korunma, iklim ve toprak koşullarına uyum sağlayabilme, verim ve kaliteyi arttırma, bitki büyümesini kontrol edebilme gibi nedenlerden dolayı anaç kullanma zorunluluğu ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, turunçgillerde çekirdeksiz çeşitlerin tohumla çoğaltılmalarının olanaksızlığı, çeşit muhafazasında mutasyon eğilimleri, monoembriyonik çeşitlerin çok heterojen bir genetik yapıya sahip olmaları sonucu açılımların meydana gelmesi, anaç kullanımını gerektiren diğer etmenlerdir. 1

GİRİŞ Dünyada kullanılan bazı anaçlar arasında, Amerika ve Arjantin de üç yapraklı ve melezleri, Florida ve Brezilya da Citrus jamphiri ve Citrus limonia, Güney Afrika da ise Kleopatra mandarini ve melezleri yer almaktadır. Ülkemizde ise, turunçgil meyveleri üretiminin büyük bir bölümünün sağlandığı Akdeniz Bölgesinde en yaygın anaç turunçtur. Kuzeydoğu Ege ve Doğu Karadeniz bölgelerinde ise üç yapraklı kullanılan tek anaç durumundadır. Geçit Ege bölgesi yani Büyük Menderes vadisinde ise turunç ve üç yapraklı karışık olarak kullanılmaktadır. Son yıllarda Ege ve Akdeniz Bölgesinde Carrizo sitranjının portakal, mandarin ve altıntop türlerine anaç olarak kullanımı hızlı bir artış göstermiştir (Tuzcu ve ark, 2001). Akdeniz bölgesinin baskın anacı olan turuncun (Citrus aurantium L.) önemli tür ve çeşitlerle uyuşma, verim ve kalite yönünden büyük bir sorunu bulunmasa da önemli bir hastalık olan Göçüren (Tristeza) virüs hastalığına duyarlı oluşu ve bu hastalığın ülkemizde bazı yerlerde ortaya çıkışı turunç anacı yerine kullanılabilecek dayanıklı anaçların seçimini zorunlu kılmaktadır. Ayrıca Akdeniz bölgesi özellikle dünya pazarlarında önemli ölçüde talep bulan limon yetiştiriciliğine yönelirken, anaç olarak kullanılan turunç, limon çeşitleriyle oransal uyuşmazlıklar nedeniyle bazı sorunların da ortaya çıkmasına neden olmuştur (Tuzcu, 1978). Türkiye de yer alan her bölgenin sahip olduğu farklı iklim, toprak ve yetiştiricilik koşulları, o bölgede kullanılacak çeşit ve çeşidin anaç ile uyumu, kullanılacak anacı belirlemede en önemli kriterlerdir. Bu kriterler göz önünde bulundurulduğunda bölgeye uyum sağlayan bir anacın kalem ile iyi uyuşması ve anacın özellikle verim ve meyve özellikleri bakımından çeşit üzerine olumlu etki yapması gerekmektedir. Anacın çeşit ile uyuşmazlık göstermesi, anacın bölgeye uygun olmaması yeni anaç geliştirme arayışı içerisine girmemize neden olmaktadır. Uygun ıslah programları kullanılarak yeni anaç eldesi mümkündür. Bu ıslah programları içerisinde; melezleme, seleksiyon, mutasyon vb. klasik ıslah yöntemlerinin yanı sıra modern ıslah yöntemleri olarak adlandırılan; in vitro kültür teknikleri ve moleküler yöntemler yer almaktadır. Bu yöntemlerin birlikte kullanılması ıslah programlarında başarıya ulaşmada çok önemlidir. Turunçgillerin dünyada kaydettikleri hızlı gelişmede klasik yöntemlerde karşılaşılan sorunların çözümünde kullanılan in vitro bitki doku kültürü teknikleri 2

GİRİŞ ve moleküler çalışmalar büyük rol oynamaktadır. Turunçgil ıslah çalışmaları ve genetik kaynakların muhafazasında in vitro doku kültürü teknikleri hızlı bir şekilde gelişmektedir. Modern ıslah ve muhafaza yöntemleri içerisinde; sürgün ucu kültürü, embriyogenik kallus eldesi, somatik embriyogenesis, somatik hibridizasyon, gen aktarma çalışmaları yer almaktadır. Bitki ıslahında kullanılan biyoteknolojik yöntemlerden birisi somatik embriyogenesistir. Vegetatif hücrelerden gelişen embriyolar somatik embriyo olarak adlandırılmaktadır. Somatik embriyolar, kültüre alınan eksplantın somatik hücrelerinden gelişirler ve eksplantın alındığı bitkinin genotipini muhafaza ettirdiklerinden dolayı klon oluştururlar. Somatik embriyogenesisin en önemli kullanım alanları; somatik hibridizasyon, partikül tabancası ve Agrobacterium tumefaciens aracılığı ile bitkilere gen aktarımıdır (Özcan ve ark, 2001). Somatik embriyogenesis, somatik hibridizasyon ve gen aktarma çalışmalarında ara ürün olarak embriyogenik kallusların elde edilmesi çok önemlidir. Embriyogenik kalluslar tek hücre kaynaklı olduğundan özellikle gen aktarma çalışmalarında amaca ulaşmada önemli rol oynar. Bunların yanında hücre süspansiyonu hazırlama ve protoplast füzyonunda kaynak olarak yine embriyogenik kalluslar kullanılır (Özcan ve ark, 2001). Somatik embriyogenesis direk olacağı gibi, embriyogenik kalluslardan da (indirek somatik embriyo oluşumu) elde edilebilir. Direkt somatik embriyogenesiste; embriyo kallus oluşumu olmadan direkt olarak somatik bir hücreden oluşur. Bu tip embriyogenesis için çok genç bitki doku ve hücreleri kullanılır. İndirekt somatik embriyogenesiste ise önce kallus oluşur. Daha sonra bu kallustan somatik embriyolar oluşur. Somatik embriyo oluşturan kallusa embriyogenik kallus adı verilir. Embriyogenik kallus; kompakt yapıda ve beyazdan açık sarı renge kadar değişen renklerdedir (Hatipoğlu, 1997). Yeni çeşit geliştirmede modern ıslah adı altında somatik melezleme çalışmaları son zamanlarda yoğun olarak kullanılmaya başlanmıştır. Somatik hibridizasyon çalışmaları ıslah programlarında özellikle hastalıklara ve abiyotik etmenlere dayanıklı genotip geliştirmede kullanılmaktadır. 3

GİRİŞ Somatik embriyogenesis hızlı çoğaltımda, sentetik tohum üretiminde ve gen aktarımında önemli bir potansiyele sahiptir. Ancak, eksplant kaynağı, genotip, bitki büyüme düzenleyicileri, azot kaynağı ve çevre şartları gibi etmenler somatik embriyogenesisi önemli ölçüde etkileyen faktörlerdir (Özcan ve ark, 2001). Farklı turunçgil genotiplerinden alınan farklı eksplantlerden (abortif, döllenmemiş, gelişmemiş ovüller, usare, stil, stigma, epikotil, kotiledon, kök parçaları, anter vb.) somatik embriyolar elde edilebilir. Genotip, ortam içeriği ve kullanılan eksplantın embriyogenik kallus ve somatik embriyo oluşumunda farklı etkileri olduğu bilinmektedir [Carimi ve ark. (1998), Carimi ve ark. (1999), Fiore ve ark. (2002)]. Bu çalışmada Çukurova Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Bölümü ne ait Tuzcu Turunçgiller Koleksiyonu içerisinde yer alan 10 turunçgil anacının pistil ve ovül eksplantlarından, farklı besi ortamlarında embriyogenik kallus ve somatik embriyo elde etme olanakları araştırılmıştır. 4

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 1920 li yıllardaki Tristeza (Göçüren) salgını ve Florida da meydana gelen don olayları sonunda dünyada turunçgil anaçları üzerine ciddi çalışmalar yapılmaya başlanmış ve değişik özellikte anaçlar ortaya çıkarılmıştır. Hastalık ve çevre şartlarına uyum yanında ağacı erken meyveye yatırmak, ağaç ömrünü uzatmak, verimi artırmak, sık dikim, meyve kalitesini yükseltmek gibi amaçlarla anaç kullanılmaktadır (Uzun, 2002). İdeal bir turunçgil anacında aranacak özellikler: Hastalık ve zararlılara dayanıklılık Yörenin toprak özelliklerine uyumluluk İklim koşullarına özellikle soğuklara dayanıklılık Çok çekirdeklilik Yüksek poliembriyoni oranı Kalemle iyi uyuşma (Uzun, 2002). Ticari turunçgil anaçları; genellikle spesifik bölgelerde hastalık, nematod, soğuk ve farklı toprak koşullarına dayanıklı, istenilen taç büyüklüğüne sahip, kalite ve verim gibi bir anaçta olması arzu edilen tüm özelliklere sahip değildir. Turunçgil anaç ıslahında en önemli stratejilerden biri allotetraploid somatik hibritlerin geliştirilmesidir (Grosser ve ark, 1998). Grosser ve ark (1998) Turunçgillerde anaç ıslahı programı çerçevesinde somatik hibridizasyon çalışmaları yaparak 12 farklı turunçgil ebeveyni kullanmış ve 11 yeni somatik hibrit turunçgil anacı geliştirmişlerdir. Tüm hibritler sitolojik ve PCR analizleri ile kontrol edilmiş, çoğaltılarak aşılanmış ve dış koşullardaki performanslarına bakılmıştır. Embriyonik kallus eldesi çoğu poliembriyonik çeşit ve türler için zordur. Bu tip kallusların eldesi için gelişmemiş ovül (Gmitter ve Moore, 1986) ya da olgun tohumlar kullanılmaktadır. Begum ve ark (2004) turunçgillerde kallus oluşumu, somatik embriyogenesis ve bitki rejenerasyonu gibi in vitro oluşumların sürgün ucu kültürü ve gelişmemiş ovullerden elde edilebileceğini bildirmişlerdir. 5

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bordon ve ark (2000) Dört tür ve bir hibrit turunçgilin epikotil eksplantını kullanarak eksplantın ortama yerleştirilme durumu, hormonlar ve ışığın etkilerini araştırmışlardır. Tüm denemelerde eksplant dikey olarak yerleştirildiğinde kallus oluşturmaksızın direk organogenesis yolu ile sürgünler elde edilmiş, fakat Troyer sitranjı nın epikotillerini yatay olarak kütüre aldıklarında kallus oluşumu gözlenmiştir. Direk organogenesis yolu ile sürgün oluşumu karanlık ortamda engellenmiş fakat bu engelleyici faktör sitokinin (BAP) kullanımıyla Troyer sitranjında tam olarak diğerlerinde kısmi olarak ortadan kalkmıştır. Troyer sitranjında organogenik kallus oluşumu sitokinin/oksin dengesi kurulduğunda meydana gelmiştir. C. macrophylla karanlık denemesinde kallus oluştururken aydınlıkta oluşturulmamıştır. Elde edilen sürgünler NAA ile birlikte düşük dozlarda BAP kullanılarak köklendirilmişlerdir. Bu çalışma her genotip için uygun regenerasyon koşullarının optimizasyonunun gerekliliğini ortaya koymuştur. Erner ve ark. (1975) portakalın (C. sinensis) doku kültüründe gelişimi için ortama portakala ait meyve suyu eklenmesinin gerekliliğini araştırmışlar. Meyve suyunun hücre büyümesi ve hücre bölünmesinde büyüme düzenleyici etkisinin olduğu görülmüştür. Ricci ve ark (2002) bazı turunçgillerden elde edilen kalluslardan somatik embriyo elde etmede farklı karbonhidratlar denemişler, kültür ortamı olarak MT ortamında sakkaroz, galaktoz, glukoz, maltoz ve laktoz un 18, 37, 75, 110 ve 150 mm konsantrasyonlarını kullanmışlardır. Elde edilen embriyolar olgunlaştırılma amacıyla 0.5 g/l aktif karbon bulunan ve 0, 15, 29, 44, 58, 73 mm sakkaroz içeren ortamda kültüre alınmıştır. Kullanılan turunçgil türleri için, kalluslardan embriyo elde etmede karbonhidrat kaynağı olarak galaktoz ve laktoz en iyi sonuçları vermiştir. Moiseeva ve ark (2005) Citrus sinensis cv. Tarocco da somatik embryo oluşumunu 4 aşamada belirlemişlerdir. Embriyogenik kültürlerin oluşumu için proembriyogenik hücre kültürlerinin elde edilmesi gerektiğini vurgulamışlardır. Elde ettikleri proembriyogenik hücre kültürlerinden sırasıyla globular somatik embryolar (% 64), kalp şekilli somatik embriyolar (% 40) ve kotiledon aşamasında (% 26) olan somatik embriyolar elde etmişlerdir. 6

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Nhut ve ark (2005) yaptıkları çalışmada Thin cell layer (TCL) teknolojisinin zor rejenere olan türlerde somatik embriyo üretiminin kontrolünde kolaylıklar sağladığını bildirmişlerdir. TCL farklı bitki organlarından eninetransversely (ttcl) veya boyuna-longitudinally (ltcl) kesilmiş küçük bitki parçalarıdır. TCL teknolojisinin kısa zaman diliminde organogenesis ve embriyogenesis etkinliğini artırdığı görülmüştür. Avenido ve ark (2005) Şadok ta somatik embriyolar olgunlaşmamış tohumların albedo dokularından MS (Murashige ve Skoog, 1962) ve BP ortamlarında (1mg/l BAP + 1mg/l 2,4-D) meydana gelmiştir. B5, MS, BP ortamlarında 0,5mg/l 2,4-D kullanılarak kallus oluşumu teşvik edilmiştir. Bu regenerasyon sistemlerinin virüsten ari fidan üretimi, genetik transformasyon, yavaş büyütme ve karyoprezervasyonda yararlı olacağını bildirmişlerdir. Kochba ve ark (1978) embriyogenesis ile ilgili yaptıkları çalışmada Shamouti portakalının nüseller dokularını ve döllenmemiş ovüllerden elde ettikleri kallusları kullanmışlar ve alt kültürler boyunca kallusların oksin ve sitokininlere bağlı olarak gelişimlerini devam ettirdiklerini bildirmişlerdir. Mendes-da-Gloria ve ark. (1999) yedi farklı turunçgil çeşidinin nüseller dokularından embriyogenik kallus üretmek için 3 farklı büyüme ortamı kullanmışlar. Ortamlar; EME [MT + 500mg/l malt ekstrakt]; ½ EME (1/2 MT makro elementleri + ½ BH3 makro elementleri + 500 mg/l malt ekstrakt + 1.55 g/l gulutamin) ; ve EBA (EME + 0.44 µm BAP + 0.04 µm 2,4-D). 120 gün sonunda Crova ve Ponkan mandarini, Murcott tangoru, Serra d agua ve Valencia portakallarında yumuşak kırılgan kalluslar elde ederken Natal ve Pera portakallarında kompakt ve kırılgan olmayan kalluslar elde etmişlerdir. EME ve ½ EME ortamları Crova ve Ponkan mandarini, Serra d agua portakalında en iyi sonucu verirken, Murcott ve Valencia dan EBA ortamında yumuşak kırılgan kalluslar elde edilmiştir. Sekiz turunçgil akrabalarının olgunlaşmamış tohumlarından elde edilen somatik embriyolardan bitki rejenerasyonu başarı ile gerçekleştirilmiştir. Embriyonik kallus hatlarının yalnızca genetik kaynakların in vitro koşullarda saklanması değil aynı zamanda Citrus ve Citrus akrabaları arasında somatik 7

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR hibridizasyon çalışmalarında yararlı olacağı vurgulanmıştır (Ling ve Iwamasa, 1997). Citrus reticulata Blanca Local Sangtra çeşidinin in vitro da geliştirilen nüseller fidanlarının kök segmentleri, kotiledon, epikotil ve yaprak eksplantlarından kallus kültürleri oluşturulmuştur. Kültürlerin 10. gününde kesim uçlarında kallus oluşumları başlamış ve epikotil segmentleri kallus oluşumunda en iyi eksplant olarak bulunmuştur. En iyi kallus oluşumu NAA (10 mg/l) ve kinetin (0.5 mg/l) büyüme düzenleyici içeren MS ortamından elde edilmiştir. En iyi somatik embriyogenesis oluşum ortamı MS ortamına NAA (10mg/l), kinetin (1mg/l) ve MS vitaminleri (x10) eklenmesiyle bulunmuştur. Epikotillerden elde edilen kalluslar diğer eksplantlardan elde edilenlere göre istatiksel olarak daha fazla bulunmuştur (% 83). Somatik embriyoların çoğu normal embriyo gibi çimlenmiş fakat bazıları yanlızca sürgün oluşturmuştur. Sürgünlerden kök oluşumu 7-10 gün sürmüş, her sürgün için elde edilen kök sayısı ve uzunluğu kullanılan besi ortamına göre değişmiştir (Gill ve ark, 1995). Turunç (AA12, AA30, AA31), Citrus deliciosa Tenore (Avana, Tardivo dicialli), Citrus paradisi (Marsh seedless ve Star Ruby), C. sinensis (Bonanza, Brasiliano 92, Sanguinello ve Valencia) türlerinde somatik embryogenesis oluşumu için stil eksplantleri MS (1962) basal ortamına ek olarak 146 mm sukroz, 500mg/l Malt Ekstract ve ± 3µM BAP içeren ortamda kültüre alınmıştır. Dört hafta sonra stillerde kallus oluşumu gözlenmiş ve embriyogenesis 2-3 ay sonra meydana gelmiştir. Avana ve Star Ruby dışındaki tüm genotiplerde stillerden embryogenesis teşvik edilmiştir. Kallus oluşumu ve embryo regenerasyonunda en iyi sonuç Brasiliana 92 çeşidi ile BAP içeren ortamlardan elde edilmiştir. Kallustan izole edilen somatik embriyolar 146 mm sukroz, 500mg/l ME ve 0.27 µm NAA içeren MS ortamda kültüre alınmış ve bitkicik elde edilmiştir. Bitkicikler iki ay içinde başarılı bir şekilde toprağa aktarılmıştır (Carimi ve ark, 1995). Koç ve ark (1997) limonda (C. limon (L.) Burm. f.) protoplast füzyonu ile uçkurutan hastalığına (Phoma tracheiphila Kanc. et Ghik.) dayanıklı bitkiler elde etme olanaklarını embriyogenik ovüler kalluslardan elde edilmiş hücre süspansiyon kültürlerinden izole edilen protoplastları kullanarak araştırmışlardır. 8

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Kütdiken limon çeşidi hücre süspansiyon kültürlerinden izole edilen protoplastlara Zagara Bianca limonu yapraklarından izole edilen protoplastlar PEG aracılığı ile fuzyona uğratılmış, füzyon sonucu 0.6 M sakaroz içeren MT ortamında kültüre alınan fuzyon ürünü protoplastlardan oluşan globüler embriyolardan bitki regenerasyonu gerçekleşmiştir. Fuzyon sonucu elde edilen bireylerde RAPD ve flow sitometri analizleri yapılmıştır. Carimi ve ark (1998) 3 farklı ortamda (MS + ME, MS + ME + 4.6 M Kinetin, MS + ME + 13.3 M BAP) Navel grubuna ait 11 farklı genotipte stigma, stil ve ovül eksplantlarını somatik embriyogenesis ve bitki regenerasyonu oluşumunda kullanmışlardır. En yüksek somatik embriyo oluşumu BAP içeren ortamda stigma, stil ve ovül eksplantlarından elde edilmiştir. Carimi ve ark (1999) turunçgillerde somatik embriyogenesis ve bitki regenerasyonu çalışmalarında 6 farklı turunçgil çeşidinin pistillerini 3 farklı ortamda (MS, MS + 500 mg/l ME, MS+ 500 mg/l ME + 13.3 μm BAP) kültüre almışlardır. Yaptıkları çalışmada kullanılan genotipin, eksplantın ve besi ortamın bitki regenerasyonu, somatik embriyo ve kallus oluşumu üzerinde farklı etkileri olduğunu belirtmişlerdir. Embriyonik kallus elde etmeye yönelik turunçgillerde (Citrus acida) yapılan çalışmalarda 2,4-D (1mg/l) ve BAP (0.5 mg/l) kombinasyonlarında en yüksek kallus oranı gözlenmiştir. 2,4-D nin bulunmadığı BAP ve kinetin bulunan ortamlarda kallustan sürgün oluşumu sağlanmıştır. BAP kullanımı ile kalluslar yeşil ve kompakt hale gelmekte 20-25 gün içinde sürgün oluşumu başlamaktadır. Sürgün oluşumu sitokinin konsantrasyonunun 0.5 mg/l den 1 mg/l ye arttırılması ile artmakta fakat yüksek sitokinin konsantrasyonu sürgün oluşumunu engellemektedir. Sitokinlerden kinetinin sürgün oluşturmada BAP a göre daha düşük bir oran sergilediği belirtilse de bazı Citrus türlerinde sürgün oluşumunda kinetinin BAP a göre daha olumlu sonuçlar verdiği bildirilmiştir (Chakravarty ve Goswami, 1999). Turunçgil genetik kaynaklarının güvenli bir şekilde değişimi ve korunması amacıyla D Onghia ve Djelouah (2000) yaptıkları çalışmada, stigma ve stillerin kültüre alınması ile bitki rejenerasyonu sağlamıştır. Elde edilen bitkiler turunç üzerine aşılanmış ve herhangi bir şekilde gençlik kısırlığı gözlenmemiştir. 9

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Embriyogenetik olaydan 3 yıl sonra meyve alınmaya başlanmıştır. Somatik embriyogenesisin bazı virüslerin eliminasyonunda etkili bir yöntem olduğu belirtilmiştir. Calovic ve ark (2000) yapmış oldukları çalışmada 5 farklı limon çeşidinden aldıkları stilleri kallus oluşumu için MT ortamına aktarmışlar ve elde ettikleri kalluslardan da 2-3 ay sonunda somatik embriyo oluşumunu gözlemlemişlerdir. Embriyonik potansiyele sahip kallusları MS (1962) ortamında kültüre almışlar ve somatik embriyolardan bitkicikler elde etmişlerdir. Tomaz ve ark (2001) yaptıkları çalışmada 5 farklı turunçgilde somatik embriyogenesiste farklı karbonhidrat kaynaklarının (galaktoz, laktoz, maltoz, glikoz ve sakkaroz) etkilerini araştırmışlardır. Galaktoz, maltoz ve laktoz da 3 genotipte yüksek embriyogenesis oluşumu gözlemlenmiştir. Fiore ve ark (2002) kallus oluşumu, somatik embriyogenesis ve bitki regenerasyonu araştırmalarında, limon (Citrus limon (L.) Burm. cv Feminello ) ve portakalın (Citrus sinensis (L) Osb. cv Washington Navel GS ) stil ve stigmalarını kullanmışlardır. Denemede 2,4-D ve 4-CPPU nun dört farklı konsantrasyonlarından (0, 0.4, 4, 12 μm) oluşan 16 farklı ortamı denemişlerdir. Limonda stigma eksplantının kullanıldığı 4 μm 4-CPPU içeren besi ortamının en iyi sonucu verdiğini bildirmişlerdir. Perez ve ark (1999) yapmış oldukları çalışmada, 9 mandarin ve mandarin hibritlerinin 6 haftalık gelişmemiş ovullerden embriyonik kallusları in vitro kültür koşullarda elde etmişlerdir. Kültüre alınmış ovullerden kallus oluşumu taze ortama periyodik olarak altkültürlerin uygun bir şekilde tekrarlanmasının gerektiği bildirilmiş, sonrasında elde edilen embriyonik kallus kültürleri yavaş bir şekilde soğutulmuş ve daha sonra sıvı azot içerisinde saklanarak hızlıca ısıtmayla eritilmiştir. Muhafaza edilmiş kalluslardan bitkiler embriyogenesis yolu ile elde edilmiş, 8-12 hafta sonunda bitkicik oluşumu gerçekleşmiştir. Duan ve ark (2007) Bingtang portakalının embriyogenik kalluslarından transgenik bitki regenerasyonunun etkinliğini artırma ve transformasyon çalışmaları yapmışlardır. Embriyogenik kalluslar Agrobacterium tumefaciens in prok II Ti plasmidini, NPT II genini, GUS genini ve AP I genini içeren EHA 105 ırkı ile inoküle etmişlerdir. 30 dk inokülasyondan sonra 23 o C de 3 gün 10

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR boyunca 2 mg/l acetosyringone içeren ko-kültüre almışlardır. Yaptıkları çalışmada 50 mg/l Kanamycinin non-transformant kallusların eleminasyonunda etkili olduğunu bulmuşlardır. Çalışma sonunda GUS etkinliği, PCR ile AP I geninin belirlenmesi ve southern blot hibridizasyonu elde edilen transformantlar belirlenmiştir. Calixto ve ark (2004) Citrus sinensis (L.) Osbeck ve Citrus grandis (L.) Osbeck (Hamlin+Indian Red ve Hamlin+Singapura) arasında somatik hibridizasyon ile Tristeza virüsü ve Phytophthora hastalığına tolerans anaçlar elde etmişlerdir. Morfolojik gözlemler, kromozom sayımları ve moleküler analizleri gerçekleştirmişlerdir. 11

3.MATERYAL ve YÖNTEM 3. MATERYAL ve YÖNTEM Çalışmada Tuzcu Turunçgiller Koleksiyonu içerisinde yer alan ve Çizelge 3.1. de belirtilen 10 turunçgil anacı bitkisel materyal olarak kullanılmış, denemeler Çukurova Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Bölümü Bitki Biyoteknolojisi Laboratuvarı ile Toros Agripark Biyoteknoloji Laboratuvarlarında yürütülmüştür. 3.1. Bitkisel Materyal Tuzcu 31-31 (Citrus aurantium L.) : Prof. Dr. Önder Tuzcu tarafından 1974 yılında Doğu Akdeniz Bölgesi nden selekte edilmiştir (Yeşiloğlu, 1982). Küçük yapılı, dik habitüs formlu, soğuğa dayanıklı bir turunçtur (Demirkeser, 1993). Tuzcu 891 (Citrus aurantium L.) : Prof. Dr. Önder Tuzcu tarafından Avustralian SRA turuncundan aşı gözü seleksiyonu yoluyla elde edilmiştir. Uçkurutana dayanıklıdır. Gou Tou Turuncu (Citrus aurantium L.) : Çin kökenli bir anaç olup Tristeza hastalığına tolerant olması dışında toprak isteği veya diğer hastalıklara dayanımı konusunda bir bilgi yoktur. Florida da Gou Tou anacı üzerine aşılı bitkiler diğer turunçlar üzerine aşılı olanlara göre daha büyük bir habitüse sahip olmuşlardır (Saunt, 2000). Alanya Dilimli portakalı (Citrus sinensis Osb.) : Kökeni üzerinde kesin bir bilgi bulunmayan Alanya ve yakın çevresinin ekolojisi dışında özelliklerini kaybeden yöresel yerli portakal çeşididir. Türkiye de sadece Alanya ve çevresinde yetiştirilmekte, günümüzde giderek önemini yitirmekte ve yeni dikim alanlarında yer almamaktadır. En önemli özelliği, kabuk üzerinde sap tarafından stil ucuna doğru 4 8 arasında değişen sayıda olukların bulunmasıdır. Verimlidir ancak, mutlak periyodisite göstermektedir. Bilinen portakal çeşitleri içerisinde kirece en dayanıklısıdır (Tuzcu, 1990). 12

3.MATERYAL ve YÖNTEM Kleopatra Antalya (Citrus reshni Tan. var Kleopatra Antalya) : Kleopatra mandarini dünyada yaygın kullanılan bir anaç değildir. Ancak anaç olarak kullanımını arttıracak önemli özellikleri gözlemlenmiştir (Davies ve Albrigo, 1994). Florida'da hala yaygın olarak kullanılan anaçlardan biridir. Kleopatra üzerine aşılı altıntop çeşitlerinin meyve kalitesi mükemmel olmakta ancak, ağaçlarda düşük verimlilik ve küçük meyve oluşumuna neden olmaktadır. Kleopatra mandarini değişik toprak koşullarına kolayca uyum sağlayabilmektedir. Hafif tuzlu topraklardan ağır killi topraklara kadar geniş uyum yeteneğine sahiptir. Kumlu - ağır killi topraklarda iyi gelişmektedir. Yüksek tuzluluk ve ph'ya dayanıklıdır (Davies ve Albrigo, 1994; Saunt, 2000), (Şekil 3.1a.). Kleopatra mandarininin en önemli avantajı, temel bazı turunçgil virüs ve viroid hastalıklarına karşı diğer anaçlardan daha tolerant olmalarıdır. Tristeza (Göçüren - CTV), Exocortis (Cüceleşme - CEV) ile Xyloporosis (Gözenekleşme) virüs ve viroid hastalıklarına karşı toleranttır. Nematodlara duyarlı, Phytophthora citrophthora'ya orta derecede duyarlıdır. Soğuklara dayanıklıdır (Davies ve Albrigo, 1994; Saunt, 2000). M2 Sitranjı (Citrus sinensis (L) Osb. x Poncirus trifoliata (L) Raf.): Kirece dayanıklı sitranj bulmak amacıyla yapılmış Alanya dilimli portakalı x yerli üç yapraklı melezlenmesi ile elde edilmiştir (Şekil 3.1b.). Volkameriana (Citrus volkameriana Tan. ve Pasq. var Volkameriana ) : Volkameriana anacının İtalyan kökenli ve limon x turunç melezi olduğu kabul edilmektedir (Şekil 3.1c.). Çok yaygın olarak kullanılan bir anaç değildir ve gelecek yıllarda da yaygın kullanılan anaçlar içerisinde yer alamayacağı varsayılmaktadır. Kaba limona benzer şekilde farklı toprak koşullarına adaptasyon yeteneği yüksektir. Ancak sıcak bölgelerde çok kuvvetli ve verimli ağaçlar oluşturmaktadır. Kireçli topraklarda iyi gelişme göstermektedir. Tuzluluğa dayanımı zayıftır (Davies ve Albrigo, 1994; Saunt, 2000). Volkameriana anacı nematodlara duyarlı olmasına rağmen, Cüceleşme (Exocortis - CEV), Tristeza (CTV) ve Xyloporosis (Gözenekleşme) virüs ve viroid hastalıklarına toleranttır. Uçkurutan hastalığına dayanıklıdır. Düşük sıcaklıklara ve kış dinlenme döneminde Phytophthora citrophthora' ya çok duyarlı bir anaçtır. 13

3.MATERYAL ve YÖNTEM Tüm turunçgil tür ve çeşitleri ile çok iyi uyuşmaktadır (Tuzcu, 1978; Tuzcu ve Göksedef, 1983; Özcan ve Ulubelde, 1984; Sakovich, 1986 ve Saunt, 2000). Carrizo Sitranjı (Poncirus trifoliata Raf. x Citrus sinensis Osb. var Carrizo ) : 1894-1895 donlarından sonra üç yapraklının soğuklara dayanıklılık özelliğinden yararlanarak yeni anaç elde edilmesi amaçlanmış ve Swingle tarafından 1897 yılında Carrizo sitranjı, Washington Navel portakalı x Üç yapraklı melezlemesi ile elde edilmiştir (Davies ve Albrigo, 1994), (Şekil 3.1d.). Birçok nedenlerden dolayı portakal ve altıntoplar için anaç olarak çok yaygın şekilde kullanılmaktadır. Carrizo sitranjı meyveleri çekirdekli ve yüksek oranda nüseller embriyoni göstermektedir ve anaç olarak kolaylıkla çoğaltılabilmektedir. Tohumla çoğaltımı ve aşılanması kolaydır. Üzerine aşılı ağaçlar kumlu, kumlu - tınlı topraklarda iyi gelişmektedir. Kireçli topraklarda zayıf gelişmektedir. Ancak, kireçli topraklara adaptasyon bakımından üç yapraklı anacından daha avantajlı görünmektedir (Davies ve Albrigo, 1994). Kaliforniya da ve Akdeniz Ülkelerinde anaç olarak başarı ile kullanılmaktadır. Troyer sitranjına göre daha hızlı gelişmekte ve meyve kalitesine daha olumlu etki yapmaktadır. Verimliliği yüksek, meyveye yatması erkendir. Kök nematoduna (Radopholus similis Cob.) toleranttır. Uçkurutan hastalığına dayanıklıdır. Troyer sitranjına göre kuraklığa daha dayanıklıdır (Gardner ve Horanic, 1961a; Gardner ve Horanic 1961b; Ford 1966; Blondel 1967; Tuzcu, 1978; Özcan ve Ulubelde, 1984; Castle, 1984; Jackson, 1985 ve Tuzcu, 1994). Exocortis (Cüceleşme - CEV) virüs hastalığına çok duyarlıdır. Ancak, Tristeza (Göçüren - CTV) ve Xyloporosis (Gözenekleşme) virüs hastalığına dayanıklıdır. Pytophthora citrophthora'ya orta derecede duyarlıdır. Tristeza ve Pytophthora citrophthora'ya toleransları nedeniyle anaç olarak kullanımları yaygındır (Davies ve Albrigo, 1994; Saunt, 2000). İspanya da portakal, mandarin ve mandarin melezlerinin % 80'ni Carrizo sitranjı üzerine aşılanmaktadır. Güney Afrika 'da da en çok kullanılan anaçlar arasında bulunmaktadır (Saunt, 2000). 14

3.MATERYAL ve YÖNTEM AREC Swingle sitrumelo (Citrus paradisi Macf. var. Duncan x Poncirus trifoliata (L.) Raf.) : Duncan altıntopu ile Üç Yapraklı nın melezlenmesi ile elde edilmiştir. Üzerine aşılı çeşitler iyi kalitede ve verimli olmaktadır. Bu anaç üzerindeki çeşitlerin meyve kaliteleri Turunç, Carrizo ve Troyer sitranjı üzerine aşılı ağaçların meyve kalitesine yakın olmaktadır. Yüksek ph lı topraklar için uygun değildir. Kök çürüklüğüne, nematodlara olduğu kadar dayanıklıdır. Tristeza virüs hastalığına dayanıklıdır. Aynı zamanda exocortis ve xyloporosis virüs hastalıklarına dayanıklıdır (Saunt, 2000). Pomeroy Üç Yapraklısı (Poncirus trifoliata var.) : Soğuklara en dayanıklı anaçlardan birisidir. Bol, kaliteli ve erken verim sağlar. Bir örnek çöğür verir ancak, aşılı iken kireçli topraklara daha duyarlıdır (Şekil 3.1e.). Exocortise çok duyarlı, Uçkurutana duyarlı, Nematodlara ve Tristezaya dayanıklıdır (Saunt, 2000). Çizelge 3.1. Denemede Kullanılan Bitkisel Materyale ait detaylar No Tanım Isim Latince İsmi Orijin 1. TCC - 597 Tuzcu 31 31 Turuncu Citrus aurantium L. TR 2. TCC - 614 Tuzcu 891 Turuncu Citrus aurantium L. TR 3. TCC - 566 Gou Tou Turuncu Citrus aurantium L. TR Tuzcu 03 N Alanya Dilimli 4. TCC - 161 Port. Citrus sinensis Osb. TR 5. TCC - 373 Kıbrıs Kleopatra mandarin Citrus reshni Hort. ex.tan. KKTC(Kuzey Kıbrıs Türk Cumhuriyeti) 6. TCC - 658 Pomeroy Trifoliata Poncirus trifoliata (L) Raf ABD 7. TCC - 689 Tuzcu M2 Citrange Citrus sinensis (L) Osb. x Poncirus trifoliata (L) Raf. 8. TCC - 677 Carrizo Citrange Citrus sinensis (L) Osb. x Poncirus trifoliata (L) Raf. 9. TCC - 693 AREC Swingle Citrumelo Citrus paradisi Macf. x Poncirus trifoliata (L) Raf. 10. TCC - 754 CRC 01Volkameriana Citrus volkameriana Tan.& Pasg. TR ABD ABD ABD 15

3.MATERYAL ve YÖNTEM a) Kleopatra Mandarini b) M2 Sitrajı c) Volkameriana d) Carizo Sitranjı e) Pomeroy Üç Yapraklısı Şekil 3.1. Denemede kullanılan bitkisel materyalin bazılarının morfolojik olarak görünüşleri 16

3.MATERYAL ve YÖNTEM 3.2. YÖNTEM 3.2.1. Doku Kültürü Çalışmaları 3.2.1.1. Çiçek ve Meyve Örneklerinin Alınması Tez kapsamında Çizelge 3.1. de detayları verilen turunçgil anaçlarına ait stil-stigma ve ovüller eksplant olarak kullanılmıştır. Stil-stigmalar ağaçların çiçeklenme döneminde henüz açmamış çiçeklerinden alınmıştır (Şekil 3.2.). Ovüller ise tam çiçeklenmeden 2-8 hafta sonra olgunlaşmamış meyvelerden alınmıştır (Şekil 3.3). Alınan eksplantlar laboratuvara getirilmiş ve kültür öncesi sterilizasyonları gerçekleştirilmiştir. Alanya Dilimli AREC Sitrumelo Carizo Sitranj M2 Sitranj Tuzcu 891 Volkameriana Pomeroy Üç yapraklısı Şekil 3.2. Denemede kullanılan stil-stigmaların izole edildiği çiçekler 17

3.MATERYAL ve YÖNTEM AREC Sitrumelo Tuzcu 31-31 Alanya Dilimli Carizo Sitranjı Gou Tou M2 Sitranjı Pomeroy Üç Yapraklısı Tuzcu 891 Volkameriana Şekil 3.3. Denemede kullanılan ovüllerin izole edildiği meyveler 3.2.1.2. Kültüre Alınacak Bitki Parçacığının Sterilizasyonu ve Kültür Ortamlarının Hazırlanması Turunçgil anaçlarına ait çiçek ve meyve örneklerinin kültür öncesi yüzey sterilizasyonları gerçekleştirilmiştir. Birinci yıl denemelerinde açmamış tomurcukların taç yaprakları, çanak yaprakları ve erkek organları el ile temizlenmiş, sadece dişi organ kalacak şekilde sterilizasyon gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.4). Sterilizasyon aşamasında dişi organlar 3 dk % 70 lik EtilAlkol (EtOH) içerisinde bekletilmiş ve arkasından 5 dk % 2 lik Hypo + 1-2 damla tween 20 içeren solüsyonda bekletilip steril kabin içerisinde sterilant maddelerin uzaklaştırılması için 3 kez steril saf su ile çalkalanmıştır (Şekil 3.5). İkinci yıl denemelerinde ise 1. yıl denemesinden farklı olarak tüm çiçek tomurcuğuna sterilizasyon uygulanmıştır 18

3.MATERYAL ve YÖNTEM Sterilizasyon aşamasında 3 dk % 70 lik EtilAlkol (EtOH) içerisinde bekletilmiş ve arkasından 10 dk % 2 lik Hypo + 1-2 damla tween 20 içeren solüsyonda bekletilip steril kabin içerisinde sterilant maddelerin uzaklaştırılması için 3 kez steril saf su ile çalkalanmıştır (Şekil 3.6). Sterilizasyonu gerçekleştirilen eksplantlardan embriyogenik kallus eldesi için eksplantlar, birinci yıl denemelerinde Marin ve Duran (1992) in kullandıkları MS (1962) tuzları + MT vitamin + 1 mg/l 2,4-D + BAP (0 mg/l, 0.5 mg/l, 1 mg/l) + 50 g/l Sakkaroz + 500mg/l Malt Ekstrakt ve 10g/l Agar içeren besi ortamında (Çizelge 3.2) petri içerisinde kültüre alınmıştır. Kültürler 27 o C ± 25 o C sıcaklık ve 16/8 saat aydınlık/karanlık koşullarda tutulmuştur. Kültür sonunda beklenen sonuç elde edilemediği için ikinci yıl denemelerinde birinci yıl denemelerinden farklı olarak MS (1962) tuzları + MS vitamin + BAP (0 mg/l, 1 mg/l, 2 mg/l, 3 mg/l) + 50 g/l Sakkaroz + 500mg/l Malt Ekstrakt ve 10g/l Agar (Carimi, 2005) ortamında (Çizelge 3.3) karanlık koşullarda inkübe edilmişlerdir. Ovül kültüründe, meyveler kültür öncesi yüzey sterilizasyonuna tabi tutulmuş (% 70 lik EtOH içerisinde 3dk + % 10 hypo içerisinde 10 dk) (Şekil 3.7) ve steril kabin içerisinde mikroskop altında ovülleri izole edilmiştir. İzole edilen ovüllerden embriyogenik kallus eldesi için Marin ve Duran (1992) in izledikleri yöntem kullanılmıştır. Bu yönteme göre eksplantlar, MS tuzları + 1 mg/l 2,4-D + BAP (0 mg/l, 0.5 mg/l, 1 mg/l) + MT vit + 50 g/l Sakaroz + 500mg/l Malt Ekstrakt ve 10g/l Agar ortamında (Çizelge 3.2) petri içerisinde kültüre alınmıştır. Kültürler 27 o C ± 25 o C sıcaklık ve 16/8 saat aydınlık/karanlık koşullarda tutulmuştur. İkinci yıl denemelerinde ise MS tuzları + 1 mg/l 2,4-D + BAP (0 mg/l, 0.5 mg/l, 1 mg/l) + MT vit. +50 g/l Sakaroz + 500 mg/l Malt Ekstrakt ve 10g/l Agar ortamlarının yanısıra aynı içerikli büyüme düzenleyicileri içermeyen (2,4-D, BAP) kontrol ortamı kullanılmıştır (Çizelge 3.4). Stil-stigma ve ovül çalışmalarında kültüre alma öncesi ortamların ph sı 5.7 ye ayarlanmış ve katılaştırıcı olarak 10 g/l agar kullanılmıştır. Ortamlar 121 o C de 1.05 atm basınç altında 15 dk sterilizasyon amacı ile otoklav edilmiştir. Otoklav sonrası ortamlar petri kaplarına dökülmüştür. 19

3.MATERYAL ve YÖNTEM Şekil 3.4. Çiçek tomurcuklarının temizlenmesi Şekil 3.5. Çiçeklerin sterilizasyonu Şekil 3.6. Tüm çiçek tomurcuklarının sterilizasyonu Şekil 3.7. Meyvelerin sterilizasyonu 20

3.MATERYAL ve YÖNTEM Çizelge 3.2. Çalışmada stil, stigma ve ovüllerden kallus oluşumu için 1. deneme yılında kullanılan ortam içerikleri Ortam içeriği Uygulamalar I. Uygulama II. Uygulama III. Uygulama MS tuzları 4.3 g/l 4.3 g/l 4.3 g/l MT vitaminleri 1 ml/l 1 ml/l 1 ml/l Malt Ekstrakt 500 mg/l 500 mg/l 500 mg/l Sakkaroz 50 g/l 50 g/l 50 g/l 2,4-D 1 mg/l 1 mg/l 1 mg/l BAP 0 mg/l 0.5 mg/l 1 mg/l ph 5.7 5.7 5.7 Agar 10 g/l 10 g/l 10 g/l Çizelge 3.3. Çalışmada stil ve stigmalardan kallus oluşumu için 2. deneme yılında kullanılan ortam içerikleri Ortam içeriği Uygulamalar I. Uygulama II. Uygulama III. Uygulama IV. Uygulama MS tuzları 4.3 g/l 4.3 g/l 4.3 g/l 4.3 g/l MS vitaminleri 1 ml/l 1 ml/l 1 ml/l 1 ml/l Malt Ekstrakt 500 mg/l 500 mg/l 500 mg/l 500 mg/l Sakkaroz 50 g/l 50 g/l 50 g/l 50 g/l BAP 0 mg/l 1 mg/l 2 mg/l 3 mg/l Myo-inositol 100 mg/l 100 mg/l 100 mg/l 100 mg/l ph 5.7 5.7 5.7 5.7 Agar 10 g/l 10 g/l 10 g/l 10 g/l Çizelge 3.4. Çalışmada ovüllerden kallus oluşumu için 2. deneme yılında kullanılan ortam içerikleri Ortam içeriği Uygulamalar I. Uygulama II. Uygulama III. Uygulama IV. Uygulama MS tuzları 4.3 g/l 4.3 g/l 4.3 g/l 4.3 g/l MT vitaminleri 1 ml/l 1 ml/l 1 ml/l 1 ml/l Malt Ekstrakt 500 mg/l 500 mg/l 500 mg/l 500 mg/l Sakkaroz 50 g/l 50 g/l 50 g/l 50 g/l 2,4-D 0 mg/l 1 mg/l 1 mg/l 1 mg/l BAP 0 mg/l 0 mg/l 0.5 mg/l 1 mg/l ph 5.7 5.7 5.7 5.7 Agar 10 g/l 10 g/l 10 g/l 10 g/l 21

3.MATERYAL ve YÖNTEM Çizelge 3.5. Çalışmada kullanılan, MS vitaminden modifiye edilmiş MT vitamin içeriği Vitamin MS (1962) ortamı mg/l MT (1969)ortamı mg/l Moleküler ağırlık (g) Glycine 2 2 75,05 Myo-inositol 100 100 180,2 Nicotinamide 0,5 5 123,1 Pyridoxine HCl 0,5 10 205,6 Thiamine HCl 0,1 10 337,3 Çizelge 3.6. Çalışmada kullanılan, MS ortamı (Murashige ve Skoog, 1962) makro ve mikro elementleri ve miktarları Bileşik Konsantrasyon (mg/l) Makro Elementler (MS, 1962) MgSO 4.7H 2 O 370 KH 2 PO 4 170 KNO 3 1900 NH 4 NO 3 1650 CaCl 2.2H 2 O 440 Mikro Elementler (MS, 1962) H 3 BO 3 6,2 MnSO 4.H 2 O 15,6 ZnSO 4.7H 2 O 8,6 Na 2 MoO 4.2H 2 O 0,25 CuSO 4.5H 2 O 0,025 CoCl 2.6H 2 O 0,025 KI 0,83 FeSO 4.7H 2 O 27,8 Na 2 EDTA 37,3 3.2.1.3. Stil - Stigmaların Kültüre Alınması Sterilizasyonu tamamlanan çiçeklerden steril kabin içerisinde steril pens ve bistüri yardımı ile stil ve stigmalar izole edilerek kültüre alınmıştır (Şekil 3.8). 25 ml ortam içeren her petride 10 eksplant kültüre alınmıştır. 1. yıl denemelerinde stilstigmalar, 27 o C ve 16 saat aydınlık 8 saat karanlık fotoperiyotta kültüre alınmıştır. 2. yıl aydınlık ve karanlık ön denemeleri yapılmıştır. Ön denemeler sonucunda karanlık uygulamaları daha başarılı bulunduğundan, denemeler karanlık ortamda kültüre alınmıştır. 22

3.MATERYAL ve YÖNTEM a b c d Şekil 3.8. a. Dişi organın temizlenmesi b. Stil eksplantının kesilmesi c. Yumurtalıktan ayrılmış stil eksplantı d. Stigma, stil ve ovaryum e. Stil eksplantlarının ortam içerisine yerleştirilmesi f. Ortam içerisine yerleştirilmiş stil eksplantı 3.2.1.4. Ovüllerin Kültüre Alınması e f A Sterilizasyonu tamamlanan meyvelerden mikroskop altında, steril kabin içerisinde, steril pens ve bistüri yardımı ile ovüller izole edilerek kültüre alınmıştır (Şekil 3.9). 25 ml ortam içeren her petride 10 eksplant kültüre alınmıştır. 1. yıl denemelerinde ovüller, 27 o C ve 16 saat aydınlık 8 saat karanlık fotoperiyotta kültüre alınmıştır. Kültüre alınmış eksplantlardan 2-4 hafta sonunda kallus oluşumları gözlenmiştir. İkinci yıl aydınlık ve karanlık ön denemeleri yapılmıştır. Bu denemeler sonucunda karanlık uygulamaları daha başarılı bulunduğundan, denemeler karanlık ortamda kültüre alınmıştır. 23

3.MATERYAL ve YÖNTEM A B C D Şekil 3.9. A. Steril edilen meyvenin kabin içerisinde kesilmesi B. Meyveden ovüllerin izole edilmesi C-D. İzole edilen ovüller E. Ovül eksplantının ortam içerisine yerleştirilmesi 3.2.1.5. Elde Edilen Kalluslardan Embriyogenik Kallus ve Somatik Embriyo Elde Edilmesi E Stil kültürlerinden elde edilen kalluslar MS ve sakkaroz içeren ortamlarda, Ovül kültürlerinden elde edilen kalluslar ise MT ve sakkaroz içeren ortamlarda embriyogenik kallus ve somatik embriyo elde edilmesi için alt kültüre alınmıştır. Kültürler beşinci alt kültüre kadar devam ettirilmiştir. 24

3.MATERYAL ve YÖNTEM 3.2.1.6. Elde Edilen Somatik Embriyoların Çimlendirilmesi Kültür sonunda elde edilen somatik embriyolar Carimi (2005) izledikleri yöntem kullanılarak çimlendirilmiştir. Bu yönteme göre somatik embriyolar iki farklı ortamda kültüre alınmıştır. Birinci çimlendirme ortamı olarak; MS tuzları, MT vitaminleri, Malt ekstrakt (500 mg/l), Sakkaroz (50 g/l) ve Agar (10 g/l) kullanılmıştır. İkinci çimlendirme ortamı olarak ise birinci çimlendirme ortamına ek olarak NAA (0.02 mg/l) ve GA3 (1 mg/l) kullanılmıştır. 3.2.1.7. Somatik Embriyolardan Elde Edilen Bitkiciklerin Dış Koşullara Aktarılması Çimlendirme ortamında tutulan somatik embriyolar 4-5 hafta sonunda tam bir bitkiciğe dönüşmüştür. Laboratuvarda ön alıştırmaları tamamlanan bitkicikler, seralarda torf-perlit karışımı harç içeren viyollerde dış koşullara aktarılmıştır. 25

3.MATERYAL ve YÖNTEM 3.2.2. Çalışmada Yapılan Sayım ve Gözlemler Çalışmada tesadüf blokları deneme deseni uygulanmış, birinci yıl denemelerinde her çeşit için 10 eksplant/petri olacak şekilde toplam 10 petri, 3 kallus ortamı böylece her ortam için 10 tekerrür kullanılmıştır. İkinci yıl denemelerinde her çeşit için 10 eksplant/petri olacak şekilde toplam 10 petri, 4 kallus ortamı böylece her ortam için 10 tekerrür kullanılmıştır. Kallus gelişimleri gözlemlenmiş, embriyogenik kalluslar morfolojik olarak (parlak ve kırılgan) ayırt edilmiştir. Her ortam ve eksplant için embriyogenik kallus ve somatik embriyo oluşum oranları % de olarak hesaplanmıştır. İstatistiksel analizler SAS programı kullanılarak yapılmıştır. Denemede değerlendirilen değişkenler için varyans analiz tabloları GLM prosedürü kullanılarak oluşturulmuştur. Denemedeki ana faktörler (uygulamalar ve genotipler) için ortalama karşılaştırmaları LSD metodu ile % 5 önem seviyesinde yapılmıştır. Denemedeki tüm faktörler için ortalama ve Standard sapmalar ise TABULATE prosedürü ile saptanmış; ilgili grafikler Microsoft Excel programı ile yapılmıştır. Denemedeki verilerin yüzde değerler olması sebebiyle varyans analiz tablosu oluşumunda ve ortalama karşılaştırmalarında bu değerlerin transforme edilerek (arcsin transferi) kullanılmışlardır. Ancak ortalamalar orijinal verilerle sunulmuştur. 26

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA 4.1. Ovül Kültürü Deneme Sonuçları 4.1.1. Ovüllerde Canlılık Oranlarının Saptanması Materyal ve Yöntem kısmında da belirtildiği gibi ovüller genotipe göre değişmekle birlikte tam çiçeklenmeden 2-8 hafta sonra oluşan meyvelerden izole edilerek kültüre alınmışlardır. Birinci yıl denemelerinde Antalya Kleopatra mandarini ve Alanya Dilimli portakalı genotiplerinden meyve alım döneminde uygun kriterlerde meyve bulunamamıştır. İkinci yıl denemelerinde ise Alanya Dilimli portakalı genotipinden istenilen sayıda ovül izole edilemediği için değerlendirmeye alınamamıştır. Birinci deneme yılında ovül kültüründe üç farklı ortam (herhangi bir büyüme düzenleyici içermeyen kontrol ortamı; 2,4-D 1mg/l + BAP 0 mg/l, 0.5 BAP; 2,4-D 1mg/l + BAP 0.5 mg/l, 1 BAP; 2,4-D 1mg/l + BAP 1 mg/l) kullanılmıştır. Kültürde tutulan ovüllerin canlılık oranları incelendiğinde; birinci yıl denemesinin kontrol uygulamasında, Carrizo sitranjı (% 99) en yüksek canlılık oranına sahip olduğu bulunmuştur. Tuzcu 891 turuncu (% 94) ve Volkameriana (% 92), Carrizo sitranjı ndan sonra yüksek bulunan genotipler olarak belirlenmiştir. Pomeroy üç yapraklısı da % 45 ile en düşük canlılık oranı saptanmıştır. 0.5 BAP uygulamasında; Tuzcu 891 turuncu % 100, Gou Tou turuncu % 96, Volkameriana % 93 ile en iyi sonuçları vermişlerdir. Carrizo sitranjı % 62 ile en düşük canlılık oranına sahip genotip olarak belirlenmiştir. 1 BAP uygulamasında; Tuzcu 891 turuncu % 100, Gou Tou turuncu % 99 ve Tuzcu 31-31 turuncu % 90 ile en iyi sonuçları vermişlerdir. Önceki uygulamada olduğu gibi Carrizo sitranjı en düşük canlık oranına sahip (% 49) genotip olarak bulunmuştur Genel ortalama değerlendirildiğinde I.yıl ovül kültürüne en iyi tepki veren en yüksek canlılık oranına sahip olan genotip Tuzcu 891 turuncu, en düşük yaşama oranına sahip olan genotip ise Pomeroy üç yapraklısı olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.1.; Şekil 4.1.). 27

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Çizelge 4.1. Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik BA uygulamaları içeren ortamlarındaki ovül kültürlerinin canlılık yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları. Genotip Kontrol 0,5 mg / l BA 1mg / l BA Ortalama AREC Swingle Citrumelo 82 ± 0.3 75 ± 28 63 ± 17 73 ± 28 bc Carrizo Citrange 99 ± 0.3 62 ± 47 49 ± 26 70 ± 43 cd Gou Tou Turuncu 79 ± 0.3 96 ± 7 99 ± 9 91 ± 12 a Pomeroy Trifoliata 45 ± 0.3 66 ± 39 73 ± 12 61 ± 43 d Tuzcu 31-31 Turuncu 89 ± 0.3 89 ± 12 90 ± 14 89 ± 13 ab Tuzcu 891 Turuncu 94 ± 0.3 100 ± 0 100 ± 19 98 ± 6 a Volkameriana 92 ± 0.3 93 ± 8 86 ± 17 90 ± 11 ab Ortalama 83 ± 29 83 ± 28 80 ± 3.1 82 ± 29 LSD 0,05 uygulama LSD 0,05 genotip 12 ö.d. önemli değil. ö.d. 28

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Şekil 4.1. Turunçgil genotiplerinin değişik BA uygulamaları içeren ortamlarındaki ovül kültürlerinin canlılık yüzdelerine ait ortalamalar. Hata çubukları ve standart sapma değerlerini göstermektedir. 29

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA İkinci yıl denemelerinde, birinci yıldan farklı olarak herhangi bir büyüme düzenleyici içermeyen kontrol ortamı eklenmiştir. İkinci yıl denemesinde kontrol uygulamasında, Tuzcu 891 turuncu (% 91) en yüksek bulunmuştur. Antalya Cleopatra mandarini (% 90) Tuzcu 891 turuncu ndan sonra yüksek bulunan genotip olarak belirlenmiştir. Pomeroy üç yapraklısı % 33 ile en düşük canlılık oranı saptanmıştır. BA içermeyen fakat 1mg/l 2,4D içeren besi ortamından; Gou Tou turuncu % 93, Volkameriana % 90 ile en yüksek sonuçları verirken Pomeroy üç yapraklısı % 47 ile en düşük sonuç elde edilmiştir. 0.5 BAP uygulamasında; Tuzcu 891 turuncu % 95, Volkameriana % 91 ile en iyi sonuçları vermişlerdir. Carrizo sitranjı % 52 ile en düşük canlılık oranına sahip genotip olarak belirlenmiştir. 1 BAP uygulamasında; Gou Tou turuncu % 95, Tuzcu 891 turuncu % 92 ile en iyi sonuçları vermişlerdir. Pomeroy üç yapraklısı % 47 ile en düşük sonuç alınmıştır. Genel ortalamalar değerlendirildiğinde sırasıyla Gou Tou turuncu, Tuzcu 891 turuncu, Volkameriana, Tuzcu 31-31 turuncundan en yüksek canlılık oranları elde edilmiş ve aralarında istatistiksel anlamada farklılık gözlenmemiştir (Çizelge 4.2.); (Şekil 4.2.). Çizelge 4.2. İkinci deneme yılında ovül kültürlerinin canlılık yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları Genotip AREC Swingle Citrumelo Kontrol 0 mg / l BA 0,5 mg / l BA 1 mg / l BA Ortalama 76 ± 22 50 ± 36 77 ± 17 51 ± 35 64 ± 31 c Carrizo Citrange 87 ± 12 68 ± 10 52 ± 47 56 ± 44 66 ± 35 bc CRC 01Volkameriana 86 ± 10 90 ± 8 91 ± 9 84 ± 13 88 ± 10 a Gou Tou Turuncu 87 ± 12 93 ± 8 90 ± 13 95 ± 7 91 ± 10 a Antalya Kleopatra mandarin 90 ± 8 75 ± 12 62 ± 26 83 ± 8 78 ± 18 b Pomeroy Trifoliata 33 ± 37 47 ± 35 63 ± 37 46 ± 42 47 ± 38 d Tuzcu 31-31 Turuncu 87 ± 11 86 ± 20 84 ± 12 90 ± 13 87 ± 14 a Tuzcu 891 Turuncu 91 ± 12 81 ± 12 95 ± 11 92 ± 9 90 ± 12 a Tuzcu M2 Citrange 57 ± 40 57 ± 23 64 ± 31 54 ± 15 58 ± 28 c Ortalama 77 ± 28 72 ± 26 75 ± 29 72 ± 31 74 ± 28 LSD 0,05 uygulama LSD 0,05 genotip 9 ö.d. 30

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Şekil 4.2. Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik BA uygulamaları içeren ortamlarındaki ovül kültürlerinin canlılık yüzdelerine ait ortalamalar. Hata çubukları ve standart sapma değerlerini göstermektedir 31

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Her iki yıl verileri incelendiğinde Tuzcu 891 turuncu ve Gou Tou turuncu genotiplerinin tüm uygulamalarda yüksek canlık oranlarına sahip olduğu görülmektedir. Carrizo sitranjı da birinci yıl verilerine göre BAP oranı artıkça canlılık oranının azaldığı görülmektedir. Her iki deneme yılında da Pomeroy üç yapraklısı ve Carrizo sitranjı na ait canlılık oranları diğer genotiplere göre düşük bulunmuştur. 4.1.2. Ovüllerden Elde Edilen Kallus Ağırlık Ortalamalarının Saptanması Ovüller kültüre alındıktan 30-60 gün sonra ilk alt kültürleri gerçekleştirilmiştir. Kültüre alma öncesi elde edilen kallusların ağırlıkları alınmıştır. Birinci yıl denemelerinde; kontrol uygulamasında, Gou Tou turuncu 0.57 g, Tuzcu 891 turuncu 0.51 g ile en yüksek kallus ağırlıklarının saptandığı genotipler olarak belirlenmiştir. Volkameriana anacına ait kallus ağırlığı 0.19 g olarak bulunmuştur. 0.5 BAP uygulamasında; Volkameriana 0.55 g, Tuzcu 31-31 turuncu 0.42 g ile en yüksek, Gou Tou turuncu ise 0.22 g ile en düşük değeri vermiştir. 1 BAP uygulamasında; Pomeroy üç yapraklısı 0.49 g, Tuzcu 31-31 turuncu 0.41 g ile en yüksek, Gou Tou turuncu ise 0.28 ile en düşük kallus ağırlık ortalamalarına sahip genotipler olarak bulunmuşlardır (Çizelge 4.3.; Şekil 4.3.). Çizelge 4.3. Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik BA uygulamaları içeren ortamlarındaki ovül kültürlerinin kallus ağırlıklarına ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları. Genotip Kontrol 0,5 mg / l BA 1mg / l BA Ortalama AREC Swingle Citrumelo 0,30 ± 0,23 0,33 ± 27,41 0,36 ± 21,19 0,33 ± 0,24 Carrizo Citrange 0,41 ± 0,27 0,31 ± 3,16 0,32 ± 14,18 0,35 ± 0,36 Gou Tou Turuncu 0,57 ± 0,25 0,22 ± ± 11,97 0,28 ± 14,76 0,36 ± 0,27 Pomeroy Trifoliata 0,27 ± 0,34 0,38 ± 47,90 0,49 ± 10,59 0,38 ± 0,45 Tuzcu 31-31 Turuncu 0,39 ± 0,19 0,42 ± 14,49 0,41 ± 17,80 0,37 ± 0,23 Tuzcu 891 Turuncu 0,51 ± 0,21 0,28 ± 9,66 0,31 ± 13,50 0,37 ± 0,27 Volkameriana 0,19 ± 0,17 0,55 ± 11,35 0,37 ± 14,94 0,41 ± 0,24 Ortalama 0,37 ± 0,37 0,38 ± 0,26 0,36 ± 0,27 0,37 ± 0,30 LSD 0,05 uygulama ö.d. LSD 0,05 genotip ö.d. 32

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Şekil 4.3. Turunçgil genotiplerinin değişik BA uygulamaları içeren ortamlarındaki ovül kültürlerinin kallus ağırlıklarına ait ortalamalar. Hata çubukları ve standart sapma değerlerini göstermektedir. Birinci deneme yılında alınan kallus ağırlıkları, uygulamalar ve genotipler arasında istatistiksel olarak önemsiz bulunmuştur. İkinci deneme yılında kallus ağırlıkları alınmamıştır. 33

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA 4.1.3. Ovüllerden Elde Edilen Kallus Oluşum Oranlarının Saptanması Birinci yıl denemelerinde ovüllerden elde edilen kallus oluşum oranları incelendiğinde; kontrol uygulamasında; Volkameriana % 53, Tuzcu 31-31 turuncu % 45 ile en yüksek kallus oluşum oranlarını vermişlerdir. En düşük kallus oluşum oranı Pomeroy üç yapraklısı % 7 olarak bulunmuştur. 0.5 BAP uygulamasında; Tuzcu 31-31 turuncu % 57, Gou Tou turuncu % 52 ile en yüksek, Pomeroy üç yapraklısı % 18 ile en düşük değerlere sahip genotipler olarak belirlenmiştir. 1 BAP uygulamasında; Tuzcu 31-31 turuncu % 53, Volkameriana % 52 ile en yüksek, Pomeroy üç yapraklısı % 21 ile en düşük kallus oluşum oranlarını vermişlerdir. Genel ortalamalar ovül kültüründen kallus oluşum oranları değerlendirildiğinde sırasıyla Volkameriana, Gou Tou turuncu ve Tuzcu 31-31 turuncu en yüksek kallus oluşturma yüzdelerine sahip olmuş ve aralarında istatistiksel olarak farklılık bulunmamıştır (Çizelge 4.4.; Şekil 4.4.). Çizelge 4.4. Ovül kültürlerinin kallus oluşum yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları. Genotip Kontrol 0,5 mg / l BA 1mg / l BA Ortalama AREC Swingle Citrumelo 34 ± 1 29 ± 29 26 ± 13 30 ± 17 b Carrizo Citrange 33 ± 1 29 ± 47 27 ± 28 30 ± 23 b Gou Tou Turuncu 38 ± 1 52 ± 3 45 ± 28 45 ± 19 a Pomeroy Trifoliata 7 ± 1 18 ± 41 21 ± 15 15 ± 14 c Tuzcu 31-31 Turuncu 45 ± 1 57 ± 12 53 ± 19 30 ± 16 a Tuzcu 891 Turuncu 34 ± 1 24 ± 0 30 ± 13 51 ± 19 b Volkameriana 53 ± 7 49 ± 12 52 ± 25 52 ± 17 a Ortalama 36 ± 24 35 ± 20 37 ± 22 36 ± 22 LSD 0,05 uygulama LSD 0,05 genotip 7 ö.d. önemli değil. ö.d. 34

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Şekil 4.4. Birinci deneme yılı ovül kültürlerinin kallus oluşum yüzdelerine ait ortalamalar. Hata çubukları ve standart sapma değerlerini göstermektedir. 35

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA İkinci yıl verileri incelendiğinde; kontrol uygulamasında; Volkameriana ve Antalya Cleopatra mandarini % 70 ile en yüksek, Pomeroy üç yapraklısı % 25 ile en düşük değerleri vermişlerdir. BAP eklenmeyen besi ortamında; Volkameriana % 88, Gou Tou turuncu % 85 ile en yüksek, AREC Swingle sitrumelo ise % 21 ile en düşük kallus oluşum oranlarına sahip oldukları belirlenmiştir. 0.5 BAP uygulamasında; Tuzcu 891 turuncu % 94, Volkameriana % 78 ile en yüksek, Carrizo sitranjı ise % 28 ile en düşük değerleri vermiştir. 1 BAP uygulamasında; Antalya Kleopatra mandarini % 72, Tuzcu 31-31 turuncu ise % 66 ile en yüksek, AREC Swingle sitrumelo % 26 ile en düşük kallus oluşum oranlarına sahip oldukları bulunmuştur. Genel ortalamalar değerlendirildiğinde en iyi kallus oluşum yüzdesi 0.5 mg/l BA içeren besi ortamında gözlenirken en yüksek kallus olşumu Volkameriana anacında gerçekleşmiş ve bu genotipi Tuzcu 891 turuncu izlemiştir (Çizelge 4.5.; Şekil 4.5.). Çizelge 4.5. İkinci deneme yılı ovül kültürlerinin kallus oluşum yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları. Genotip Kontrol 0 mg / l BA 0,5 mg / l BA 1 mg / l BA Ortalama AREC Swingle Citrumelo 32 ± 14 21 ± 16 37 ± 13 26 ± 22 29 ± 17 e Carrizo Citrange 36 ± 13 32 ± 9 28 ± 32 30 ± 27 32 ± 22 e CRC 01Volkameriana 70 ± 12 88 ± 8 78 ± 22 56 ± 16 73 ± 19 a Gou Tou Turuncu 63 ± 19 85 ± 11 48 ± 23 56 ± 21 63 ± 23 bc A. Kleopatra mandarin 70 ± 20 49 ± 20 41 ± 23 72 ± 11 58 ± 23 c Pomeroy Trifoliata 25 ± 28 37 ± 27 50 ± 31 34 ± 32 37 ± 30 e Tuzcu 31-31 Turuncu 57 ± 13 28 ± 20 69 ± 19 66 ± 17 55 ± 23 c Tuzcu 891 Turuncu 67 ± 17 67 ± 13 84 ± 13 54 ± 16 68 ± 18 ab Tuzcu M2 Citrange 50 ± 37 47 ± 24 48 ± 30 36 ± 17 45 ± 27 d Ortalama 52 ± 26 50 ± 29 54 ± 29 48 ± 25 51 ± 27 LSD 0,05 uygulama ö.d. LSD 0,05 genotip 7 ö.d. önemli değil. 36

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Şekil 4.5. İkinci deneme yılı ovül kültürlerinin kallus oluşumlarına ait ortalama grafikleri 37

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Birinci ve ikinci yıl denemelerinde birbirine paralel olarak Volkameriana, Gou Tou turuncu ve Tuzcu 891 turuncu en yüksek kallus oluşum oranlarına sahip olduğu görülmektedir. Pomeroy üç yapraklısı ise her iki deneme yılında da en düşük kallus oluşum oranına sahip olmuştur. Pomeroy üç yapraklısı nda gözlenen bu düşük kallus oluşum oranının genotipe bağlı olabileceği düşünülmekle beraber bundan sonra yapılacak çalışmalarda bu genotipte daha yüksek kallus oluşumunun sağlanması amacıyla farklı besi ortamları farklı oksin ve sitokinin konsantrasyonları ve kombinasyonları denenmelidir. Ovül kültüründe çalışılan tüm turunçgil anaçlarına ait kallusların görüntüleri Şekil 4.6 ve Şekil 4.7 de verilmiştir. Carrizo sitranjı ile AREC Swingle sitrumelo anaçları ise birinci deneme yılında yüksek kallus oluşum oranına sahip iken ikinci deneme yılında daha düşük oranlarla kallus oluşturmuştur. 38

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA A B C D E F Şekil 4.6. Ovül kültürlerinden elde edilen kalluslar (A.Tuzcu 891 turuncu, B. Tuzcu 31-31 turuncu, C. AREC Swingle sitrumelo, D.Carrizo sitranjı, E. Gou Tou turuncu, F. M2 sitranjı) 39

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA A B C Şekil 4.7. Ovül kültürlerinden elde edilen kalluslar (A. Antalya Kleopatra mandarini, B. Pomeroy üç yapraklısı, C. Volkameriana) 4.1.4. Ovüllerden Elde Edilen Embriyogenik Kallus Oluşum Oranlarının Saptanması Birinci yıl denemelerinde, ovüllerden 30-60 gün sonra elde edilen kalluslar stereo mikroskop altında incelenerek oluşan embriyogenik kalluslar saptanmaya çalışılmıştır. Embriyogenik kalluslar (EK); parlak, kırılgan, kolay dağılabilen, dolgun yuvarlak yapılarıyla diğer kalluslardan ayırt edilmişlerdir. Tuzcu 891 turuncu na ait kontrol ve 0.5 BAP uygulamalarında embriyogenik kallus oluşumları gözlenmiştir. Kontrol uygulamasında % 8.8 oranında, 0.5 BAP uygulamasında ise % 12.5 oranında EK elde edilmiştir. 1mg/l BAP içeren ortamdan gelen kalluslarda istenilen özellikte embriyogenik kallus elde edilememiştir. İkinci yıl denemelerinde, Tuzcu 891 turuncu anacından kontrol uygulamasında %8.9 ve Kıbrıs Kleopatra mandarininden ise aynı şekilde kontrol uygulamasından %31.4 embriyogenik kallus elde edilebilmiştir (Şekil 4.8.). Her iki 40

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA deneme yılında kontrol uygulamasının embriyogenik kallus oluşumuna etkisi daha yüksek olmuştur. Tez çalışması kapsamında söz konusu iki anaca ait kalluslardan dışarıdan eklenen bitki büyüme düzenleyiciler olmaksızın embriyogenik kalluslar elde edilmiştir. Aynı şekilde Starrantino and Russo (1980) turunçgillerde yapmış oldukları ovül kültürü çalışmalarında MS (1962) ve Malt Ekstrakt kullanarak başarılı bir şekilde embriyogenik kalluslar ve bunlardan da somatik embriyolar elde etmişlerdir. A B C D Şekil 4.8. Antalya Kleopatra mandarini (A, B, C) ve Tuzcu 891 turuncu genotiplerine ait (D) ovül kültüründen gelen embriyogenik kalluslar 41

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA 4.1.5. Ovüllerden Elde Edilen Somatik Embriyo Oluşum Oranlarının Saptanması Birinci yıl denemelerinde; Tuzcu 891 turuncu, Tuzcu 31-31 turuncu ve Gou Tou turuncu genotiplerinden somatik embriyolar elde edilmiştir. Tuzcu 891 turuncu indirekt yani embryogenik kallus ve kallustan somatik embriyolar oluştururken, Tuzcu 31-31 turuncu ve Gou Tou turuncu ndan direkt somatik embriyo gelişimleri gözlenmiştir. Elde edilen veriler incelendiğinde, Tuzcu 891 turuncu kontrol uygulaması ile 0.5 mg/l BAP içeren ortamdan gelen embryogenik kalluslardan tümünde somatik embriyo oluşumu gözlenmiştir. Bu durumun tam tersine yine bir turunç olan Tuzcu 31-31 turuncunda ise kontrol uygulaması ile 0.5 mg/l BAP içeren ortamdan gelen kalluslarda somatik embriyo elde edilememesine karşın 1 mg/l BAP içeren ortamdan gelen kalluslarda %18.8 oranında somatik embriyo elde edilmiştir. Gou Tou turuncu ise denemede kullanılan tüm ortamlarda değişen oranlarda somatik embriyolar oluşturmuştur. Bu genotipe ait kontrol uygulamasından % 34 oranında somatik embriyo, 0,5 BAP uygulamasından % 28,8 oranında somatik embriyo, 1 BAP uygulamasından ise % 51 oranında somatik embriyo oluşumu gözlenmiştir. İkinci yıl verileri incelendiğinde somatik embriyo oluşumu; Tuzcu 891 turuncu, Tuzcu 31-31 turuncu, Gou Tou turuncu, Volkameriana, Pomeroy üç yapraklısı, M2 sitranjı ve Antalya Kleopatra mandarini genotiplerinde gözlenmiştir. Tuzcu 891 turuncu ve Antalya Kleopatra mandarini indirekt olarak somatik embriyolar oluştururken, Tuzcu 31-31 turuncu, Gou Tou turuncu, Volkameriana, Pomeroy üç yapraklısı ve M2 sitranj da direkt somatik embriyo gelişimleri gözlenmiştir. Elde edilen verilere göre, Tuzcu 891 turuncu kontrol uygulamasından elde edilen embryogenik kalluslardan çok yüksek oranda somatik embriyo oluşumu gözlenmiştir. Elde edilen somatik embriyolar sayılamayacak miktarda olduğu için olarak nitelendirilmiştir. 42

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Yine Tuzcu 891 turuncu genotipine ait 1 BAP içeren ortamdan direkt olarak % 5.5 oranında somatik embriyo elde edilmiştir. Antalya Kleopatra mandarini kontrol uygulamasından elde edilen embriyogenik kalluslardan sayıda somatik embriyo elde edilmiştir. Tuzcu 31-31 turuncu kontrol uygulamasından % 29.8, 1 BAP uygulamasında ise % 16.6, Gou Tou turuncu genotipinin kontrol uygulamasından % 19, 0 BAP uygulamasından % 7, 0.5 BAP uygulamasından % 22.9 oranında somatik embriyo elde edilmiştir. Volkameriana genotipinin kontrol uygulasından % 7, Pomeroy üç yapraklısı genotipinin kontrol uygulamasından % 44, M2 sitranjına ait kontrol uygulamasından % 22 oranında somatik embriyo oluşumu gözlenmiştir (Çizelge 4.6). Çizelge 4.6 dan da izleneceği üzere en fazla somatik embriyo oluşumu herhangi bir büyümeyi düzenleyici içermeyen kontrol ortamından elde edilmiştir. Kontrol ortamına tüm genotipler somatik embriyo oluşturma anlamında olumlu tepki verirken yalnızca 2.4 D içeren ve herhangi bir sitokinin içermeyen ortamda denemede kullanılan genotiplerden yalnızca Gou Tou Turuncundan somatik embriyo elde edilmiştir. Bunun yanı sıra somatik embriyo oluşturmak amacıyla kullanılan ve 1 mg/l BAP içeren besi ortamına Tuzcu 891 turuncu ve Tuzcu 31-31 turuncu genotipleri somatik embriyo oluşturma anlamında tepki vermiş fakat her iki genotip için kontrol ortamı daha yüksek somatik embriyo oluşturduğu için bu genotipler için kontrol ortamı önerilmiştir. Aynı şekilde pek araştırıcı tarafından somatik embriyogenesis bazı poliembriyonik Citrus türünde bitki büyümeyi düzenleyici kullanılmadan başarı ile sonuçlandırılmıştır (Perez, 2000; Duran Vila, 1995;.Carimi ve De Pasqueale, 2003). Bazı mandarin çeşitleri ovül eksplanti kullanılarak MS ortamına ilave olarak sukroz ve Malt içeren ortamda kültüre alınmıştır. Araştırıcılar maltın turunçgillerde somatik embriyogenesisin teşvikinde önemli olduğunu vurgulanmıştır (Perez ve ark., 1998). Bununla beraber bazı embryogenik protokol, araştırıcılar tarafından ABA, BA, cazein hidrolizat, gliserol, laktoz ve maltoz kullanılarak ta uygulanmıştır (Beloualy, 1991; Ben-Hayyim ve Neumann, 1983; Carimi ve ark., 1998ab; Kochba ve ark., 1978; Gmitter ve ark., 1990; Hao ve ark., 2004; Tomaz ve ark., 2001 ). 43

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Tez kapsamında ovül kültüründen elde edilen somatik embriyolara ait resimler Şekil 4.9., Şekil 4.10., Şekil 4.11., Şekil 4.12., Şekil 4.13. de verilmiştir. Somatik embriyo aşamaları olan globüler, kalp, torpedo, ve kotiledon aşamalarını içeren resimler Tuzcu 891 turuncu, Gou Tou turuncu ve Antalya Kleopatra mandarini genotiplerinde sırasıyla Şekil 4.14., Şekil 4.15., Şekil 4.16. da sunulmuştur. 44

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Çizelge 4.6. İkinci deneme yılında elde edilen somatik embriyo oluşum oranları GENOTİP Somatik Embriyo Oluşum (%) Kontrol 0 BAP 0,5 BAP 1 BAP Tuzcu 891 Turuncu 100 0 0 5,5 Tuzcu 31-31 Turuncu 29,8 0 0 16,6 Gou Tou Turuncu 19 7 22,9 0 Volkameriana 7 0 0 0 Pomeroy Üç Yapraklısı 44 0 0 0 M2 Sitranjı 22 0 0 0 Antalya Kleopatra mandarin 100 0 0 0 Şekil 4.9. Tuzcu 891 turuncuna ait somatik embriyolar Şekil 4.10. Antalya Kleopatra mandarini ne ait somatik embriyolar Şekil 4.11. M2 sitranjına ait somatik embriyolar 45

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA A B Şekil 4.12. A. Gou Tou turuncu B. Pomeroy üç yapraklısına ait somatik embriyolar A B Şekil 4.13. A. Tuzcu 31-31 turuncu B. Volkameriana anacına ait somatik embriyolar 46

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Şekil 4.14. Tuzcu 891 turuncuna ait somatik embriyogenesis aşamaları A) globüler, B) kalp, C) torpedo, D) kotiledon 47

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA a b c Şekil 4.15. Gou Tou turuncuna ait somatik embriyogenesis aşamaları a) globüler, b) kalp, c) torpedo-kotiledon Şekil 4.16. Antalya Kleopatra mandarinine ait somatik embriyogenesis aşamaları a) globüler, b) kalp, c) torpedo 48

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA 4.1.6. Ovüllerden Elde Edilen Somatik Embriyoların Bitkiye Dönüşüm Oranlarının Saptanması Birinci yıl denemeleri sonunda elde edilen somatik embriyolardan sırasıyla Tuzcu 891 turuncu % 85, Tuzcu 31-31 turuncu % 80, Gou Tou turuncundan ise % 88 oranında bitki elde edilmiştir. İkinci yıl denemelerinden elde edilen veriler incelendiğinde; Tuzcu 891 turuncu genotipine ait 1 mg/l BAP uygulamasından elde edilen tüm somatik embriyolar bitkiye dönüşmüştür. Antalya Kleopatra mandarini kontrol uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan %4 oranında bitki elde edilmiştir. Gou Tou turuncuna ait kontrol uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan %66.6, 0 BAP uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan %33.3, 0.5 BAP uygulamasından ise %90 oranında bitkiye dönüşüm gerçekleşmiştir. Tuzcu 31-31 turuncu kontrol uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan %76.4, 1 BAP uygulamasından elde edilen somatik embriyodan %81.8 bitki elde edilmiştir. Volkameriana anacına ait kontrol uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan %60 oranında bitki elde edilmiştir. Pomeroy üç yapraklısı kontrol uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan %90 oranında, M2 sitranjına ait kontrol uygulamasından elde edilen somatik embriyodan %72.7 bitki elde edilmiştir (Çizelge 4.7.; Şekil 4.17.). Çizelge 4.7. İkinci deneme yılında elde edilen bitki oluşum oranları Somatik Embriyolardan elde edilen bitki (%) GENOTİP Kontrol 0 BAP 0,5 BAP 1 BAP Tuzcu 891 0.0 0 0 100 Tuzcu 31-31 76.,4 0 0 81.8 Gou Tou 66.6 33.3 9 0 Volkameriana 60.0 0 0 0 Pomeroy 90.9 0 0 0 M2 Sitranj 72.7 0 0 0 Kleopatra 4.0 0 0 0 49

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Şekil 4.17. Ovül kültürlerinde elde edilen bitkicikler 4.1.7. Ovüllerden Elde Edilen Bitkilerin Sera Koşullarına Aktarılması Deneme sonunda elde edilen bitkiler aklimitizasyon aşamalarından geçirilerek sera koşullarına aktarılmıştır. Birinci yıl denemeleri sonunda Tuzcu 891 turuncuna ait bitkilerin tümü (% 100) seraya aktarılmıştır. Tuzcu 31-31 turuncuna ait bitkilerden %62.5 i Gou Tou turuncuna ait in vitro daki bitkilerden %66.6 sı seraya aktarılmıştır. 50

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA İkinci yıl denemelerinden elde edilen verilerine göre; Tuzcu 891 turuncu 1 BAP uygulamasından elde edilen bitkilerin % 66.6 sı seraya aktarılmıştır. Antalya Kleopatra mandarini kontrol uygulaması, Gou Tou turuncu kontrol uygulaması, 0 BAP uygulaması, 0.5 BAP uygulaması, Tuzcu 31-31 kontrol uygulaması ve 1 BAP uygulamasından elde edilen tüm bitkiler seraya aktarılmıştır. M2 kontrol uygulamasından elde edilen bitkilerin ise % 37.5 i seraya aktarılmıştır. Çizelge 4.8. İkinci deneme yılında seraya aktarılan bitki oranları Seraya Çıkan Bitki (%) GENOTİP kontrol 0 BAP 0,5 BAP 1 BAP Tuzcu 891 Turuncu 0 0 0 66,6 Tuzcu 31-31 Turuncu 100 0 0 100 Gou Tou Turuncu 100 100 100 0 M2 Sitranj 37,5 0 0 0 Kleopatra Mandarin 100 0 0 0 Şekil 4.18. Ovül kültürlerinden elde edilen bitkicikler (A. Tuzcu 31-31 turuncu, B. M2 sitranj, C. Tuzcu 891 turuncu, D. Gou Tou turuncu) 51

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA 4.2. Stil Kültürü Deneme Sonuçları 4.2.1. Stillerden Elde Edilen Kallus Oluşum Oranları Birinci yıl denemelerinde kullanılan stiller ve stigmalar ağaçların çiçeklenme döneminde açmamış çiçeklerden alınmıştır. Eksplantlar üç farklı ortamda (kontrol ortamı; 2,4-D 1mg/l + BAP 0 mg/l, 0.5 BAP ortamı; 2,4-D 1mg/l + BAP 0.5 mg/l, 1 BAP ortamı; 2,4-D 1mg/l + BAP 1 mg/l) kültüre alınmıştır. Stiller ve stigmalar ayrı ayrı kültüre alınmışlardır. Kültüre alınan stigmaların tamamında bakteri kökenli infeksiyon problemi ile karşılaşılmıştır. Stiller kültüre alındıktan 1-2 hafta sonra kurumaya başlamışlardır. Yaşanan problemlerden dolayı birinci deneme yılında stil ve stigmalardan sonuç elde edilememiştir. İkinci yıl denemelerinde, birinci yıldan farklı olarak eksplantlar dört farklı ortamda (kontrol ortamı; 2,4-D 0mg/l + BAP 0 mg/l, 1 BAP ortamı; 2,4-D 0mg/l + BAP 1 mg/l, 2 BAP ortamı; 2,4-D 0mg/l + BAP 2 mg/l, 3 BAP ortamı; 2,4-D 0mg/l + BAP 3 mg/l) kültüre alınmıştır. Birinci yılda olduğu gibi; stigmalar, yaşanan infeksiyon ve ölüm problemlerinden dolayı değerlendirmeye alınmamışlardır. İkinci yılda stillerden elde edilen kallus oluşum oranları incelendiğinde; Kontrol uygulamasında, M2 sitranj % 92, AREC Swingle sitrumelo % 88 ile en yüksek kallus oluşum oranlarına sahip genotipler olarak bulunmuşlardır. Gou Tou turuncu % 12 ile en düşük kallus oluşum oranına sahip genotip olarak belirlenmiştir. 1 BAP uygulamasında, AREC Swingle sitrumelo % 98, M2 sitranj % 96 ile en iyi sonuçları verirken Tuzcu 31-31 turuncu % 14 kallus oluşum oranı ile en düşük bulunmuştur. 2 BAP uygulamasında, M2 sitranj % 100, Volkameriana % 92 ile en yüksek, Tuzcu 31-31 turuncu ise % 4 ile en düşük sonucu vermiştir. 3 BAP uygulamasında, en yüksek kallus oluşum oranları % 100 ile M2 sitranj ve Gou Tou turuncundan elde edilirken, Pomeroy üç yapraklısı ve Tuzcu 31-31 turuncu % 10 ile en düşük değerler olarak bulunmuştur. 52

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Carimi ve ark. (1998 ab), yapmış oldukları somatik embriyogenesis çalışmalarında sitokininlerin (BAP), özellikle stil eksplantlarından oluşacak somatik embriyogenesisi teşvik ettiğini bildirilmiştir. Bununla birlikte Citrus garrawayi genotipi ve Tahiti laymı kullanılarak yapılan çalışmalarda besi ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki BAP, daha düşük oranda kallus oluşumuna neden olmuştur (Hamilton ve ark., 2007). Bu durum besi ortamında kullanılan büyümeyi düzenleyicilerin ve diğer kimyasalların ya da kullanılan eksplat tipinin genotipe bağımlı olarak etki ettiğini göstermektedir 53

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Çizelge 4.9. Stil kültürlerinin kallus oluşum yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları Genotip Kontrol 1 mg / l BA 2 mg / l BA 3 mg / l BA Ortalama Alanya dilimli portakalı 40 ± 38 66 ± 38 40 ± 27 30 ± 26 44 ± 34 e AREC Swingle sitrumelo 88 ± 10 98 ± 6 70 ± 27 92 ± 17 87 ± 20 b Carrizo Sitrange 32 ± 32 64 ± 31 48 ± 39 56 ± 34 50 ± 35 de Volkameriana 62 ± 46 20 ± 22 92 ± 14 44 ± 50 55 ± 44 cd Gou Tou Turuncu 12 ± 32 48 ± 45 78 ± 42 100 ± 0 60 ± 47 c Antalya Kleopatra mandarin 84 ± 11 82 ± 16 81 ± 7 88 ± 6 84 ± 11 b Pomeroy Trifoliata 14 ± 19 40 ± 39 44 ± 35 10 ± 19 27 ± 32 f Tuzcu 31-31 Turuncu 34 ± 23 14 ± 19 4 ± 8 10 ± 19 16 ± 21 f Tuzcu 891 Turuncu 29 ± 29 26 ± 40 12 ± 16 22 ± 18 22 ± 27 f Tuzcu M2 Sitrange 92 ± 10 96 ± 8 100 ± 0 100 ± 0 97 ± 7 a Ortalama 49 ± 39 55 ± 41 57 ± 40 55 ± 42 54 ± 40 LSD 0,05 uygulama ö.d. LSD 0,05 genotip 10 ö.d. önemli değil. 54

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Şekil 4.19. İkinci deneme yılı stil kültürlerinin kallus oluşumlarına ait ortalama grafikleri 55

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Her iki yıl verileri incelendiğinde M2 sitranjı ve AREC Swingle sitrumelo genotiplerinin tüm uygulamalarda yüksek kallus oluşum oranlarına sahip olduğu görülmektedir. Tuzcu 31-31 turuncu, Tuzcu 891 turuncu ve Pomeroy üç yapraklısı genotiplerinde istatistiksel olarak fark bulunamamış ve en düşük kallus oluşum oranları bu genotiplerden elde edilmiştir. A B C D E F Şekil 4.20. Stil eksplantından elde edilen kalluslar (A. Tuzcu 31-31 turuncu, B. Tuzcu 891 turuncu, C. Alanya Dilimli portakalı, D. AREC Swingle sitrumelo, E. Carrizo sitranj, F. Gou Tou turuncu) 56

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA A B C D Şekil 4.21. Stil eksplantından elde edilen kalluslar (A.Antalya Cleopatra mandarini, B. M2 sitranj, C.Pomeroy üç yapraklısı, D. Volkameriana) 4.2.2. Stillerden Elde Edilen Somatik Embriyo Oluşum Oranlarının Saptanması İkinci yıl verileri incelendiğinde somatik embriyo oluşumu; Tuzcu 891, Tuzcu 31-31, Gou Tou, Kleopatra, Alanya Dilimli ve Carizo genotiplerinde gözlenmiştir. Elde edilen veriler incelendiğinde, Tuzcu 891 in 1 BAP uygulamasından % 80.7 oranında somatik embriyo, 3 BAP uygulamasından % 18 oranında somatik embriyo elde edilmiştir. Tuzcu 31-31 in kontrol uygulamasından % 26.4 oranında somatik embriyo, 1 BAP uygulamasından % 85.7 oranında somatik embriyo, 3 BAP uygulamsından ise % 30 oranında somatik embriyo, Gou Tou genotipinin kontrol uygulamasından % 100 oranında somatik embriyo, 1 BAP uygulamasından % 70.8 oranında somatik embriyo, 2 BAP uygulamasından % 62 oranında somatik embriyo, 3 BAP uygulamasından % 32 oranında somatik embriyo, Carizo genotipinin kontrol uygulasından % 3 oranında somatik embriyo, Kleopatra genotipinin kontrol uygulamasından % 7 oranında somatik embriyo, Alanya Dilimli 57

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA genotipinin kontrol uygulamasından % 18 oranında somatik embriyo, 1 BAP uygulamasından % 15 oranında somatik embriyo oluşumu gözlenmiştir (Çizelge 4.10.). Çizelge 4.10. Stillerden elde edilen somatik embriyo oluşum oranları Somatik Embriyo Oluşum (%) GENOTİP kontrol 1 BAP 2 BAP 3 BAP Tuzcu 891 Turuncu 0 80,7 0 18 Tuzcu 31-31 Turuncu 26,4 85,7 0 30 Gou Tou Turuncu 108 70,8 62 32 Carizo Sitranjı 3.0 0 0 0 A. Kleopatra Mandarini 7.0 0 0 0 Alanya Dilimli Portakal 18.0 15.0 0 0 A B C D Şekil 4.22. Stil eksplantlarından elde edilen somatik embriyolar (A-B. Tuzcu 31-31 turuncu, C- D. Tuzcu 891 turuncu) 58

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA A B C D Şekil 4.23. Stil eksplantlarından elde edilen somatik embriyolar(a. Alanya Dilimli portakalı, B. Carrizo sitranj, C.Gou Tou turuncu, D.Antalya Kleopatra mandarini) 4.2.3. Stillerden Elde Edilen Somatik Embriyoların Bitkiye Dönüşüm Oranlarının Saptanması İkinci yıl denemelerinden elde edilen veriler incelendiğinde; Tuzcu 891 turuncu, 1 BAP uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan %38, 3 BAP uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan %75 oranında bitki elde edilmiştir. Tuzcu 31-31 turuncu 1 BAP uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan % 41.6, 3 BAP uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan % 33.3 oranında bitki elde edilmiştir. Gou Tou turuncu kontrol uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan bitkiye dönüşüm oranı % 100 bulunurken, 1 BAP uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan yalnızca % 50 si, 2 BAP uygulamasından somatik embriyodan ise % 27.6, 3 BAP uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan 59

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA % 28 oranında bitki elde edilmiştir. Besi ortamında kullanılan sitokinin miktarının artmasıyla somatik embriyolardan bitkiye dönüşüm oranı düşmüştür. Antalya Kleopatra mandarini kontrol uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan % 50 si bitkiye dönüşmüştür. Alanya Dilimli portakalı kontrol uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan %66.6, 1 BAP uygulamasından elde edilen somatik embriyolardan ise %83.3 oranında bitki elde edilmiştir (Çizelge 4.11.). Çizelge 4.11. Stillerden elde edilen bitki oluşum oranları Somatik Embriyolardan elde edilen bitki (%) GENOTİP kontrol 1 BAP 2 BAP 3 BAP Tuzcu 891 0 38.0 0 75.0 Tuzcu 31-31 0 41.6 0 33.3 Gou Tou 100 32.0 27.6 28.0 Kleopatra 50.0 0 0 0 Alanya Dilimli 66.6 83.3 0 0 4.2.4. Stillerden Elde Edilen Bitkilerin Sera Koşullarına Aktarılması İkinci yıl denemelerinden elde edilen veriler incelendiğinde; Tuzcu 891 turuncu, 3 BAP uygulamasından elde edilen bitkiler, Tuzcu 31-31 turuncu 1 BAP uygulamasından elde edilen bitkiler ile 3 BAP uygulamasından elde edilen bitkilerin tümü dış koşullara aktarılmıştır. Aynı şekilde Gou Tou turuncu kontrol uygulamasından elde edilen bitkiler, 1 BAP uygulamasından elde edilen bitkiler, 2 BAP uygulamasından elde edilen bitkiler, 3 BAP uygulamasından elde edilen bitkilerin tümü seraya aktarılmıştır (Şekil 4.24.). 60

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Şekil 4.24. Stillerden elde edilen bitkicikler (A. Tuzcu 31-31 turuncu, B. Tuzcu 891 turuncu, C. Gou Tou turuncu, D. M2 sitranjı, E.Tuzcu 891 turuncu) 61