Lise Öğretmenleri Fizik, Kimya, Biyoloji, Matematik Proje Danışmanlığı Eğitimi Çalıştayı LİSE-2 (Çalıştay 2012) GENOTOKSİK MADDELERİN BİTKİLER ÜZERİNE ETKİLERİ Doç. Dr. Cüneyt AKI ÇOMÜ FEN EDEBİYAT FAKÜLTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ MOLEKÜLER BİYOLOJİ ANA BİLİM DALI cuneytaki@comu.edu.tr
1. Giriş İÇERİK 2. Genotoksik Maddeler ve Genotoksisite 3. Bitkisel Organizmalarda Genotoksisiteyi Belirlemede Kullanılan Bazı Testler 3.1. Kök ucu hücreleri testi 3.1.1. Mitotik Analiz 3.1.2. Mitotik Aktivitenin Hesaplanması 3.2. Mikronükleus oluşumu ve analizi 3.3. Stamen tüyü analizi 4. Sonuçlar 5. Kaynaklar
1. GİRİŞ Yeryüzünde yaşayan bütün canlılar, yaşamsal ihtiyaçlarının karşılandığı çevre ile sürekli etkileşim halindedir. Bunun bir gereği olarak da, canlılar ile çevre arasında ekolojik bir dengenin olması kaçınılmazdır. Yeryüzünde bulunan tüm canlıların hayatta kalabilmesi; temel ihtiyaçlarının karşılanabilmesi için yaşadığı çevre ile uyum halinde olması gerekir.
İnsan da dahil olmak üzere birçok canlı türüne ev sahipliği yapan çevrede, canlılığı etkileyen olumlu faktörlerin yanı sıra pek çok olumsuz faktörün de varlığından söz etmek mümkündür. Çağımızın en önemli sorunlarından biri hiç kuşkusuz, tüm canlıları, özellikle de insanı olumsuz yönde etkileyen çevresel tehlikelerin her geçen gün artmasıdır.
Günümüzde artan insan nüfusu ile birlikte sanayileşme, endüstriyel faaliyetler, tarımsal faaliyetlerde kullanılan kimyasallar, yakıt ve benzeri amaçlarla kullanılan zehirli gazlar, gıda ürünlerinde kullanılan her türlü katkı maddeleri ve doğaya bırakılan atık maddelerinin gittikçe artması, başta insan sağlığı olmak üzere her türlü organizmanın doğal dengesinin bozulmasına neden olmaktadır. İnsan ın ön plana çıktığı ve aktif olarak yer aldığı bir çevrede ise, bu etmenlerden etkilenmesi kaçınılmazdır.
Yapılan araştırmalar, doğal çevremize bulaştırdığımız birçok kimyasal maddenin, kanserojenik, mutajenik ve teratojenik etkiye sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Tüm bu nedenlerden dolayı, çevremizde bulunan ve biyolojik etkileri henüz bilinmeyen birçok sentetik ve doğal maddenin insan sağlığı açısından kanser oluşturma potansiyellerinin de test edilmesi gerekmektedir.
Bu maddelerin kullanım amaçları, etki yolları ve süreleri göz önüne alınarak toksisite testleri dizayn edilmektedir. Muhtemel toksik etkiler ise; in vivo koşullarda deney hayvanlarında veya in vitro koşullarda hücre kültürlerinde araştırılmaktadır (Saygı, 2003).
Fakat, laboratuvar hayvanlarıyla yapılan kanser oluşturmaya yönelik deneylerin çok zaman almaları ve çok pahalı olmaları nedeniyle uygulaması zordur. Bu nedenle, kimyasal maddelerin kanserojenik potansiyellerini ölçebilmek için bazı in vitro test sistemleri geliştirilmiştir. Genotoksik etkiler için kısa zamanlı testler olarak bilinen bu testlerle kimyasal maddelerin belirli genetik sistemlerde belirli sonuçlar verip vermedikleri ölçülmekte ve elde edilen sonuçlarla maddelerin kanserojenik potansiyelleri arasında ilişki kurulmaktadır.
2. GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE Sözcük anlamı zehir bilimi olan toksikoloji, kimyasallarla biyolojik sistem arasındaki etkileşimleri zararlı sonuçları yönünden incelemektedir (Başaran, 2004 ). Toksikoloji: Kimyasalların zararsızlık limitlerini (sınırlarını) inceleyen bilim dalıdır ve inceleme alanlarına göre çeşitli alt dallara ayrılmaktadır. Bizim toksikoloji bilimi içinde ilgilendiğimiz alt dal ise; genotoksikolojidir.
GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE Genotoksikoloji; çeşitli hücre genetiği teknikleriyle elde edilen kromozomlar üzerine kimyasalların etkilerini inceleyen bilim dalıdır. DNA ile toksik ajanların etkileşmesi sonucu genlerde ortaya çıkan ve gelecek nesillere taşınan toksisite genotoksisite olarak adlandırılmaktadır (Başaran,2004 ). Genotoksisiteye neden olan tüm maddeler ise genotoksik maddeler dir.
GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE Toksik potansiyele sahip olan maddeler: tüm ilaçlar, temizlik ve kozmetik maddeleri, pestisitler, besin katkı maddeleri ve sanayide kullanıldığında insanların maruz kalabileceği kimyasal maddeler olarak sıralanabilir.
GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE Bir maddenin potansiyel mutajen olup olmadığının belirlenmesi için, kromozomal anormalliklere (anomali) neden olup olmadığına bakılmaktadır. Genotoksisite çalışmalarında; etkisi araştırılan kimyasal için çok sayıda kromozom preparatlarının hazırlanması, anormallik oranlarının farklı doz ve süreler için belirlenmesi, bu aşamada yüzlerce hücrenin mikroskopta sayılması, incelenmesi ve istatistiksel hesaplamalarla sonuca gidilmesi gerekmektedir.
GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE Genotoksik potansiyel durumu kısa zamanlı testlerle ; mutasyon, kardeş kromatid değişimleri, kromozom anomalileri frekansları gibi değerlerle ölçülebilmektedir. Genotoksik potansiyeli belirlemek amacıyla kullanılan testler arasında, özellikle gen mutasyonlarının belirlenmesinde: bakteriler, funguslar, Drosophila sp., memeli hücreleri, bitkiler ve memelilerin kullanıldığı testler yer almaktadır (Akı ve Karabay, 2004).
GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE Son dönemde, çeşitli bitkiler iyi birer monitör sistem olmaları nedeni ile genotoksik potansiyellerinin saptanması için sıkça kullanılmaktadır. Bitki biyoanalizlerinde; moleküler sitogenetik yaklaşımlar ile bitki genotoksisitesi araştırmaları gerçekleştirilmektedir. DNA zararlarının ve onların moleküler şekillerinin biyolojik sonuçlarını anlamak için, çevrenin neden olduğu DNA değişikliklerini önlemek oldukça önemlidir.
3. BİTKİSEL ORGANİZMALARDA GENOTOKSİSİTEYİ BELİRLEMEDE KULLANILAN BAZI TESTLER 3.1. Kök ucu hücreleri testi 3.2. Mikronükleus oluşumu ve analizi 3.3. Stamen tüyü analizi
3.1. Kök ucu hücreleri testi Soğan veya bakla gibi bitkisel organizmaların kök ucu hücreleri testinde kromozom anormalliklerinin ve mitotik aktivitenin belirlenmesi gerekmektedir. Bu nedenle, mitotik analiz yöntemi uygulanmaktadır. Kök ucu hücreleri testinin avantajları şunlardır; 1. Kök uçları ile uğraşmak kolaydır. 2. Kök meristemi bölünen bir çok hücre içerir. 3. Kök uçları, konsantrasyonu kimyasallarla doğrudan etkileştirilebilir. ayarlanabilen 4. Soğan, bütün sene kolay ve ucuz elde edilebilir. 5. Soğanın kromozomları bakımından büyüktür. sayıca az; fakat yapı
3.1.1. Mitotik Analiz Mitoz bölünme, bitkinin tüm yaşamı boyunca bölünebilme yeteneğinde olan meristematik dokularda incelenebilir. Bitkilerde mitoz bölünme incelemesi için en çok; kök ucundan, genç yapraklardan, küçük çiçek tomurcuklarının petal yapraklarından yararlanılmaktadır.
Kromozom sayımı yapabilmek için kullanılan materyalde mitotik indeks yüksek olmalıdır. Yani, bölünmekte olan hücrelerin oranı yüksek olmalıdır. Bazı bitkilerde, mitozun periyodik değişim gösterdiği saptanmıştır. Bu bitkilerde, günün belirli saatlerinde mitotik indeksin daha yüksek olduğu bulunmuştur.
3.1.2. Mitotik Aktivite (indeks)nin Hesaplanması Meristematik hücrelerdeki mitotik safhaların sitolojik olarak gözlenmesi ile mitotik aktivite (indeks) hesaplanabilmektedir. Mitotik aktivite, bölünen hücrelerin bölünmeyen meristematik hücrelere göre oranıdır. Genellikle kromozom sayımı çalışmalarında ve toksikolojik çalışmalarda kullanılmaktadır. Eğer, bir kimyasal madde ile uygulama varsa, maddenin bölünme oranı üzerinde ne şekilde etkili olduğu konusunda bilgi vermektedir.
Mitotik indeks % olarak şu formül ile hesaplanmaktadır; Mitotik indeks (%) Bölünen HücreSayisi ToplamHücre Sayisi x100
Mitotik indeks dışında ayrıca, M/T+A oranı da hesaplanmaktadır. Bu katsayının yüksek değerde olması (yani 1 den büyük olması) ve anafaz + telofaz frekansının azalması, karyokinetik iğ ipliklerinin inaktive olduğunu göstermektedir.
Allium cepa L. Mitoz Bölünme Kontrol Fotoğrafları; a. mitotik profaz safhası (kontrol grubu) b. mitotik profaz safhası (kontrol grubu) c. mitotik profaz ve metafaz safhası (kontrol grubu) d. mitotik metafaz ve telofaz safhası (kontrol grubu)
Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006). Kutup Kayması Anafazda Kutup kayması Anafazda kutup kayması Telofazda kutup kayması
Metafazda tabla kayması Metafazda tabla kayması Metafazda tabla kayması Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).
Multipolar kutup oluşumu Anafazda tripolar oluşumu Anafazda tetrapolar oluşumu Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).
Kalgın Kromozom Anafazda kalgın kromozom Anafazda kalgın kromozom ve kutup kayması Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan çekimleri aşağıda verilmiştir (Çördük, 2006).
Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006). Anafazda köprü oluşumu Anafazda köprü oluşumu Anafazda köprü oluşumu Anafazda kalgın kromozom, Kutup kayması ve köprü oluşumu
Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006). Kromozom Kırıkları Anafazda Kromozom kırıkları Anafazda kromozom kırıkları Düzensiz kromozom ve kromozom kırıkları
Telofazda Enine Bölünme Telofazda enine bölünme Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).
Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006). Anafazda kromozom kırığı ve metafazda halka kromozom oluşumu Poliploidi Allium cepa L. türünün kromozom sayısı 2n=16 dır.
3.2. Mikronükleus oluşumu ve analizi Mikronükleuslar (MN): hücrenin mitoz bölünmesi sırasında metafaz safhasından anafaz safhasına geçiş aşamasında oluşmaktadır. Esas çekirdeğe dahil olmayan, tam kromozom ya da asentrik kromozom parçacıklarından köken alan oluşumlardır. Mikronükleus, oluşumu için hücre bölünmesine gereksinim duymaktadır.
Mikronükleus tekniğinin uygulanabilmesi için sitokinezi blok metodu kullanılmaktadır. Sitokinezi blok metodu: Cytochalasin-B (Cyt-B) ile, mitoz geçiren hücrelerde sitokinezi durdurma esasına dayanmaktadır. Heddle ve Countryman in (1976) kriterlerine göre: 1. Mikronükleusun çapının, esas çekirdeğin 1/3 ünden küçük olması; 2. Boya alma yoğunluğunun, esas çekirdek ile aynı olması gerekmektedir.
MN sayısındaki artış, çeşitli ajanların hücrelerde oluşturduğu sayısal ve yapısal kromozom düzensizliklerinin indirekt göstergesi olarak değerlendirilmektedir. Anöploidiyi uyaran ajanlar, sentromer bölünme hatalarına ve iğ iplikçiklerinde fonksiyon bozukluklarına yol açarak; klastojenler ise, kromozom kırıkları oluşturarak MN oluşumuna katkıda bulunmaktadırlar.
Bu tür belirlemeler aynı şekilde bitkilerde polen ana hücrelerinde de kolaylıkla yapılabilmektedir. Mikronukleuslar, Tradescantia bitkisinde de polen ana hücrelerinde mayoz bölünmenin erken tetrad safhasında görülmektedir. Analizi için, farklı uygulama metodları kullanılarak çeşitli kimyasalların ya da zararlı ışınların genotoksik potansiyelleri hakkında bilgiler elde edilebilmektedir.
Tradescantia da mayoz bölünmenin tetrad safhasındaki mikronukleuslar (Ma ve diğ., 1994b).
Mikronükleus testi sitogenetik hasarın tespitinde kromozom analizine göre; kolay uygulanabilmesi, daha fazla sayıda hücre sayılması ve istatistiksel yönden daha anlamlı sonuçlar elde edilmesi gibi avantajları sağlamasıyla yaygın kullanım alanı bulan bir teknik olmuştur.
Tradescantia pallida H. bitkisinde gerçekleştirilen mikronükleus analizinde Brilliant Black maddesinin dört farklı konsantrasyonu uygulanmıştır (İlhan ve Akı, 2009). Mikronükleusların, mayoz bölünmenin erken tetrad safhasında oluştuğu görülmüştür. Uygulanan maddelerin konsantrasyon artışlarına bağlı olarak mikronükleusların artış gösterme eğilimine sahip olduğu belirlenmiştir.
3.3. Stamen Tüyü Analizi Kimyasalların genotoksisitesini test etmede kullanılan, bitkilerde özel lokus mutasyon analizleri bulunmaktadır. Bunlar bir ya da iki lokusta heterozigot olan özel oluşturulmuş test strainleri veya klonlar üzerine temellenir. Bu durum, test bileşiklerinin uygulanmasından kısa bir süre sonra somatik mutasyonların ortaya çıkmasına neden olur. Somatik mutasyonlar; yapraklar (soya fasülyesi, tütün, yonca, mısır), çiçek petalleri, stamen tüyleri (Tradescantia) üzerindeki farklı renklerdeki doku bölgeleri olarak ifade edilir (Akı ve Karabay, 2004).
Stamen tüyü analizinde somatik resesif mutasyonların varlığı, pembe renkli mitotik hücrelerin oluşumu ile ortaya çıkmaktadır. Stamen tüyü hücrelerinde mutasyon (Ma ve diğ., 1994a). Tradescantia pallida H.
Kontrol gruplarını ve Sunset Yellow boya maddesinin dört farklı konsantrasyonunun uygulandığı uygulama gruplarını içeren Tradescantia pallida H. bitkisinin stamen tüyü analizi sonuçlarına bakıldığında, stamen tüyü hücrelerinde pembe renkli somatik mutasyonların oluştuğu gözlenmiştir (İlhan ve Akı, 2009). Mutasyonların oluşma frekansı ise, uygulanan boya maddesinin konsantrasyonuna bağlı olarak artış göstermiştir.
Tradescantia pallida H. stamen tüyü kontrol grubu fotoğrafları (İlhan ve Akı,2009). a. b. c.
Tradescantia pallida H. stamen tüyü Sunset Yellow uygulama grubu fotoğrafları (İlhan ve Akı,2009). a. b. a. 10 ppm lik uygulama b. 200 ppm lik uygulama
Tradescantia pallida H. stamen tüyü Sunset Yellow uygulama grubu fotoğrafları (İlhan ve Akı,2009). c. d. c. 1000 ppm lik uygulama d. 2000 ppm lik uygulama
SONUÇLAR İnsanların da bulunduğu canlılar içerisinde, doğal ya da insan kaynaklı olarak bulunan ve ekolojik dengeler üzerinde potansiyel tehlike niteliğindeki tüm genotoksik maddeler üzerinde gerçekleştirilen ve gerçekleştirilecek olan araştırmalar sayesinde; bu maddelerin genotoksik potansiyelleri ve canlı sistemlerde meydana getirmiş olduğu genetik hasarların bazıları saptanmış, bazılarının etkileri ise halen saptanmayı beklemektedir.
Bilimsel araştırmalarda model organizma olarak genellikle bitkisel ya da hayvansal organizmalar kullanılmaktadır. Günümüze kadar yapılan çalışmalar sonucunda bitkisel ve hayvansal organizmalardan elde edilen veriler göz önüne alınarak insan sağlığı ile ilgili bağlantılı çalışmaların yapılması konuyu daha anlamlı hale getirecektir.
Bu doğrultuda, kullanılan genotoksik potansiyele sahip olan maddelerin; Diğer ülkelerde olduğu gibi insanları doğrudan etkileyen gıda ve gıda bağlantılı sektörlerde kontrollerinin daha iyi şekilde yapılması, İnsan sağlığını tehdit etmeyecek düzeyde uygun miktarlarda kullanılabilmesi, Canlı sistemleri üzerinde genotoksik ve kanserojenik etkileri ispatlanmış olanların tamamen yasaklanması yönünde girişimlerde bulunulması düşünülmektedir.
KAYNAKLAR Akı C., Güneysu E., Acar O. 2009. Effects of Industrial Wastewater on Total Protein and the Peroxidase Activity in Plants.African Journal of Biotechnology. Vol. 8 (20), pp. 5545-5548. Akı,C., Karabay Ü. 2004. Genetik Laboratuvarı Uygulama Kitabı. Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi Yayınları, No.38, Çanakkale. Başaran, A. A. 2004. Farmakognozide tek hücre jel elektroforezi uygulamaları. 14. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı, Bildiriler, 29-31 Mayıs 2002, Eskişehir, Eds.K.H.C.Başer ve N.Kırımer, ISBN 975-94077-2-8. Çördük. N., Akı C., 2006. Çanakkale Kanyak Fabrikası Atık Suyunun Vicia faba L. Kök Ucu Mitozu Üzerine Etkisi ve Total Protein Değişimleri. 26-30 Haziran 2006 XVIII. Ulusal Biyoloji Kongresi Kuşadası-AYDIN.(Poster bildiri). Gönüz A., Kesercioğlu T., Akı C. 2009. Sitotaksonomide Temel İlkeler Çanakkale Onsekiz Mart Üniv. Yayınları No:93,ISBN 978-975-8100-99-6. Ilhan D., Aki C. 2010. Mutagenicity of Sunset Yellow and Brilliant Black in Vicia faba L. and Allium cepa L. Fresenius Environmental Bulletin, Vol.19, No:5, pp 769-772. İlhan D., 2006, Bazı Genotoksik Bileşiklerin Bitkilerde Genetiksel Etkilerinin Belirlenmesi, Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi. İlhan D., Akı C. Evaluation of Genetic Effects of Some Genotoxic Compounds in Tradescantia pallida H. With Micronucleus and Stamen-Hair Mutation Test. Fresenius Environmental Bulletin, Vol.18, No:10, pp. 1828-1831. Kırımlı R., Akı C. Bazı Fungusit ve İnsektisitlerin Vicia faba L. ve Capsicum Annuum L. türlerinin kök ucu mitozu üzerine etkileri Sık L, Acar O, Akı C. 2009 Genotoxic Effects of Industrial Wastewater on Allium cepa L. African Journal of Biotechnology, Vol. 8 (9), pp. 1919-1923, Topaktaş M, Rencüzoğulları E, 2010. Sitogenetik. Genişletilmiş ve Düzeltilmiş 2. Baskı. Nobel Bilim ve Araştırma Merkezi Yayınları, No: 99, 176 s.