DERLEME (Review) Hacettepe Dişhekimliği Fakültesi Dergisi Cilt: 31, Sayı: 2, Sayfa: 54-63, 2007 Vital Tedavilerinde Protein ve Gen Terapileri The Protein and Gene Therapies for Vital Pulp Treatments *Doç.Dr. Sibel YILDIRIM, **Prof.Dr. Alev ALAÇAM *Selçuk Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Pedodonti Anabilim Dalı **Gazi Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Pedodonti Anabilim Dalı ÖZET ABSTRACT Vital pulpanın tamir edilmesinde ideal bir tedavi anti-inflamatuar ve antibakteriyel olmalı, pulpa kök hücrelerini uyarmalı ve iyileşme potansiyelinin arttırılması ve dentin formasyonunun hızlandırılması için bu hücrelerin odontoblastlara diferansiyasyonlarını indüklemelidir. Büyüme faktörlerini de içeren çeşitli biyoaktif moleküllerin tanımlanması dentin-pulpa kompleksinin tedavisinde heyecan verici alternatiflere yol açmıştır. Fakat proteinlerin yarı ömürleri sınırlı olduğundan ve doku rejenerasyonunun indüklenmesi için yüksek konsantrasyonlara ihtiyaç duyulduğundan, proteinin direkt olarak pulpaya uygulanmasından çok morfojenin pulpa dokusu tarafından üretilmesi çok daha avantajlı olabilecektir. In vivo gen terapisi ile gerçekleştirilebilecek böyle bir tedavi ile protein tedavilerinin bu kısıtlamalarının üstesinden gelinebilecektir. Transforming Growth Factor ß (TGFß) super-ailesi, hücre büyümesi, diferansiyasyonu ve fonksiyonunun düzenlenmesinde önemli rollere sahip bir büyüme faktörleri ailesidir. Bu ailenin üyelerinin diş gelişimi ve yaralanmadan sonra dental dokuların tamirinde yer aldıkları gösterilmiştir ve TGFß izoformlarının odontoblast diferansiyasyonu üzerinde farklı ve özgün etkilere sahip olabilecekleri düşünülmektedir. The ideal therapy for repairing vital pulp would be anti-inflammatory and antibacterial would stimulate proliferation of pulp stem cells and would induce their differentiation into odontoblasts to enhance healing potential and rapid dentin formation. The identification of various bio-active molecules, including growth factors has provided exciting possibilities for dentinpulp complex repair. However because the half-life of proteins is limiting and high concentrations are required to induce tissue regeneration, morphogen production from transduced tissues, rather than by direct application of the protein, may be advantageous. In vivo and ex vivo gene therapies are the alternative approaches to overcome the limitations of protein therapy. The Transforming Growth Factor ß (TGFß) superfamily is a large group of growth factors that have important roles in regulating cell growth, differentiation and function. Members of this superfamily have been implicated in aspects of tooth development and the repair of dental tissues after injury. Application of TGFß isoforms at the pulp-dentin interface of cultured tooth slices may imply specific differences in action of TGFß isoforms on odontoblast differentiation. ANAHTAR KELİMELER Vital pulpa tedavileri, Büyüme faktörleri, Gen terapi KEYWORDS Vital pulp therapies, Growth factors, Gene therapy
55 GİRİŞ Dentinojenik yeteneğini kaybetmemiş ve enfekte olmamış pulpanın travmayla veya kavite preperasyonu sırasında perfore edilmesi veya yaralanması halinde doku dostu olan bir kimyasal maddeyle örtülerek canlılığını korumasını sağlamak amacıyla yapılan tedavi direkt pulpa kuafajı olarak adlandırılmaktadır 1. Hess in 2 1929 da kalsiyum hidroksiti dişhekimliği kullanımına sunmasından bu yana bu materyal, pulpa kaplamalarında rakipsiz olarak kullanılmaktadır. Kalsiyum hidroksitle gerçekleştirilen pulpa kaplamalarından sonra verilen doku cevapları hücresel seviyelerde ayrıntılı olarak belirlenmiştir 3. Diğer taraftan, dentin-pulpa kompleksinin sahip olduğu güçlü iyileşme kapasitesi dental doku tamirinde yeni biyolojik yaklaşımların geliştirilmesi için alternatifler sunmaktadır. Günümüzde, dentin-pulpa tamirinde kullanılacak ideal bir tedavi, anti-inflamatuar ve antibakteriyal olması yanında pulpa kök hücrelerinin proliferasyonunu stimüle ederek odontoblastlara diferansiyasyonlarını indüklemelidir. Bu bakış açısıyla büyüme faktörleri gibi çeşitli biyo-aktif moleküllerin tanımlanması dentin-pulpa kompleksi tamirinde heyecan verici olasılıklara yol açmıştır. Bu noktada kalsiyum hidroksit gibi geleneksel ilaçların pulpa perforasyonunun çok büyük olduğu durumlarda reparatif cevapları indüklemede yetersiz kalmalarıyla karşılaşılan problemlerin çözülmesi umulmaktadır ve rekombinan protein (özellikle Bone Morphogenetic Protein BMP-) tedavileri bu sebeple gündemlerini korumaktadırlar. Bununla birlikte, büyüme faktörlerinin reparatif dentin formasyonun indüklenmesi amacıyla topikal olarak uygulamalarında, morfojenin yarılanma ömrünün sınırlı olması nedeniyle pek çok optimal özelliği bünyesinde barındırabilecek bir taşıyıcı ile birlikte oldukça yüksek konsantrasyonlarda kullanılmaları gerekmektedir. İdeal bir taşıyıcının henüz bulunamamış olması ve yüksek protein konsantrasyonlarının yol açtığı oldukça yüksek maliyetler bu faktörlerin protein formlarıyla kullanılmalarında önemli engeller olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu durumda böyle bir proteinin dentin-pulpa kompleksine direkt olarak uygulanması yerine, dokunun kendisinin bu morfojenleri üretmesine yol açan bir gen terapisinin indüklenmesi arzu edilen bir tedavi yaklaşımı olarak araştırmacıları cezbetmektedir 4. VİTAL PULPA TEDAVİLERİ Embriyonik dönemde primer dentin yapımında gözlenen olaylar (primer dentinogenezis), olgun dişte pulpa ortamındaki tamir mekanizmalarının ortaya çıkmasını sağlayan sekonder dentinogenezis şeklinde bir kez daha başlatılabilmektedir 5. Bu tür bir kronolojik yaklaşım içerisinde tersiyer dentin; genelde çevresel uyarana cevaben pulpa-dentin ara yüzünün spesifik bir odağında depolanan dentin matrisini temsil eden tabaka olarak tanımlanmaktadır. Bu dokunun oluşmasına yol açan bir stimulus nispeten ılımlı derecedeyse etkilenen, ancak yaşamaya devam eden mevcut odontoblastlar tarafından oluşturulan dentin matrisinin sekresyon ya da depolanma hızında bir artışa yol açar. Böylece uygun bir uyarana cevaben, sağ kalan post-mitotik odontoblast hücreleri tarafından salgılanan tersiyer dentin matrisi reaksiyoner dentin adını alır. Oysa daha kuvvetli bir uyaran, var olan odontoblastların ölümüne yol açacak ve bu durumda eğer dentin-pulpa kompleksindeki şartlar elverişli ise, reparatif dentin matrisini salgılayan odontoblast-benzeri hücrelerin yeni bir jenerasyonu diferansiye olacaktır. Primer ve fizyolojik sekonder dentin sekresyonundan sorumlu olan orijinal post-mitotik odontoblastların ölümünden sonra, uygun bir uyarana cevaben odontoblastbenzeri hücrelerin yeni bir jenerasyonu tarafından salgılanan bu tersiyer dentin matrisi ise reparatif dentin olarak adlandırılacaktır 6. vitalitesini koruyarak tedavi etme yönündeki araştırmaların çoğu pulpa dokusunun tamir ve rejenerasyonunu dentinogenezisle kombine şekilde düşünmektedir. Bu alanda bugüne kadar yapılan deneylerde başarı, tersiyer dentin matrisinin şekillenmesinin sağlanması olarak değerlendirilmiştir. Hızlı sertleşen kalsiyum hidroksit gibi materyaller, pulpa dokusunu kullanarak veya harcayarak dentin formasyonuna yol açan materyallerdir. Bu durumda böyle bir tamir dentini, pulpanın kaplanmasında kullanılan terapötik materyalin pulpayla temas eden kısmından başlayarak pulpa odasının derinlerine doğru yayılarak, pulpa
56 odasının boyutlarını azaltan bir tamir dentinidir 7. Tersiyer Dentin Matrislerini Stimüle Etmede Kullanılan Materyal veya Ajanlar Tersiyer dentin matrislerini stimüle etmede kullanılan materyal veya ajanlar, kullanılan ya da uygulanan materyalin doğasına göre biyolojik olmayanlar ve biyolojik olanlar şeklinde sınıflandırılabilmektedir. Buna göre biyolojik olmayanlar kalsiyum hidroksit preperatları, siyanoakrilatlar, çeşitli simanlar (çinko oksit veya çinko fosfat) ve benzerleridir. Biyolojik olanlar ise biyolojik sistemlerle sentezlenen bileşiklerdir 7. Kalsiyum hidroksitin etkilerinin birçok araştırma grubu tarafından ayrıntılı olarak bildirilmiş olmasına rağmen, kimyasal hasar şeklinde öne sürülen etki mekanizması henüz tam olarak açıklığa kavuşturulmamıştır. Ekspoze bir pulpaya kalsiyum hidroksit uygulandığı zaman pulpa dokusunda hafif bir irritasyon oluşmakta ve böylece pulpada savunmaya ve sonuçta tamir mekanizmalarının aktivasyonuna sebep olunduğu öne sürülmektedir. Araştırmacılar kalsiyum hidroksit uygulamasını takiben pulpa dokusunda birçok olay olduğunu ve bunlar arasında hangilerinin yararlı, hangilerinin etkisiz olduğunun belirlenmesinin oldukça zor olduğunu belirtmektedirler. Kalsiyum hidroksitin pulpa üzerine olan biyolojik etkisinin herhangi bir biyolojik yarar sağlamaksızın bir nekrozu indükleyip indüklemediği veya yüksek ph sının direkt etkisiyle, odontoblast diferansiyasyonuna yol açacak şekilde, dentinden bir takım büyüme faktörlerinin çözünmesine yol açıp açmadığının bilinmemektedir 8. Diğer taraftan dentin köprüsü oluşumunun sadece kalsiyum hidroksite atfedilemeyeceği, silikat simanlar, rezin kompozitler gibi dokuda toksik etki yarattığı düşünülen diğer bazı materyallere cevaben de dentin köprüsünün şekillenebildiği gösterilmiştir 9. Tersiyer dentinogenezisi indüklemek açısından araştırılan biyolojik dentinojenik moleküller ise kollajen ve fibronektin gibi diffüze olmayan ekstrasellüler matris proteinleri ve büyüme faktörlerinden oluşan diffüze olabilen ekstrasellüler matris molekülleridir 7. Vital Tedavilerinde Başarı Kriterleri vitalitesini koruyarak tedavi etme yönündeki araştırmaların çoğu, diş sisteminde gerçekleşen biyolojik olayların bir kopyası şeklinde tersiyer dentin matrisinin stimülasyonunun sağlanması için uğraşmaktadır. Bu araştırmalarda pulpa dokusunun tamir ve rejenerasyonu dentinogenezisle kombine şekilde düşünülmektedir. Rutherford ve Fitzgerald a 7 göre bu alanda bugüne kadar yapılan deneylerde başarı, tersiyer dentin matrisinin şekillenmesinin sağlanması olarak değerlendirilmiştir. Hızlı sertleşen kalsiyum hidroksit gibi materyaller, pulpa dokusunu kullanarak veya harcayarak dentin formasyonuna yol açan materyallerdir. Araştırmacılar, bu durumda böyle bir tamir dentinin, pulpanın kaplanmasında kullanılan terapötik materyalin pulpayla temas eden kısmından başlayarak pulpa odasının derinlerine doğru yayılarak, pulpa odasının boyutlarını azaltan bir tamir dentini olduğunu bildirmektedirler. Son yıllarda rekombinan insan proteinlerinin kullanılmasıyla gerçekleştirilen pulpa çalışmalarının ise bunun aksine bir model sunduğu bildirilmektedir 10-15. nda kullanılan rekombinan insan proteinleri, immatür pulpa dokusunu andıran fibröz bir bağ dokusuyla yer değiştirmektedir. Bu bağ dokusu ise daha sonra mineralize olmaktadır. Oluşan bu reparatif dentinin, pulpa dokusuna yüzeyel olarak şekillendiği ve derin pulpa dokusunu harcamaksızın pulpanın sağlıklı bir şekilde korunmasına yol açtığı bildirilmektedir 7. PULPA TEDAVİLERİNDE PROTEİNLER Birçok deneysel havyan çalışmasında biyolojik olarak aktif büyüme ve morfogenetik faktörlerinin pulpa kaplama materyali olarak uygulanmasıyla pulpa ekspozunu kapatan sert doku formasyonu elde edilebilmiştir. Tablo 1 de bu araştırmalar, kullanılan denek, oluşturulan pulpa yarası, tetkik yöntemleri ve elde edilen sonuçlara göre tarihsel sıra içinde verilmiştir. Dentindeki birtakım moleküllerin dentinogenezisi başlattığını gösterilmesini, hücre büyümesi, diferansiyasyonu ve fonksiyonunun düzenlenmesinde önemli rollere sahip bir büyüme faktörleri ailesi olan Transforming Growth Factor ß (TGFß) süper-
57 TABLO I Biyolojik olarak aktif olan büyüme faktörlerinin pulpa kaplama materyali olarak uygulanması Araştırmacı Kullanılan biyolojik materyal Yapılan pulpa tedavisi Kullanılan denek Yapılan analizler Sonuç Allojenik Bang ve ark., demineralize ve 1972 16 liyofilize dentin Java maymunu Sert doku bariyer formasyonu Otolize allojenik Nakashima köpek dentini 1989 17 matrisi Amputasyon, radyolojik Tübüler dentin, osteodentin Otolize allojenik Nakashima köpek dentini 1990 18 matrisi Amputasyon TEM histopatolojik Nakashima Ham BMP 1990 11 fraksiyonu Parsiyel amputasyon Tziafas ve Kolokuris, 1990 19 Demineralize dentin ve kemik tozu içine implantasyon, radyolojik Sekonder dentinogenezis Smith ve ark. 1990 20 EDTA da çözünebilir dentin matrisi Kemirgen Lianjia ve ark. 1990 21 Sığır BMP i Parsiyel amputasyon Osteodentin/Tübüler dentin formunda reparatif dentin Tziafas ve ark. Demineralize ve 1992 22 doğal dentin içine implantasyon IM, TEM, SEM histopatolojik Sekonder dentinogenezis Smith ve ark. 1994 23 EDTA da çözünebilir dentin matrisi İndirekt kuafaj Kemirgen Nakashima 1994a 12 rhbmp-2 ve -4 Parsiyel amputasyon Nakashima 1994b 24 rhbmp-2, -4 ve TGFβ1 Parsiyel amputasyon Histomorfometri Rutherford ve ark. 1993 14 rhop-1 Pulpotomi Maymun Histomorfometri Rutherford ve ark. 1994 15 rhop-1 İndirekt kuafaj Maymun Histomorfometri Reaksiyoner dentin
58 Jepsen ve ark. 1997 10 rhop-1 Minyatür domuz Histomorfometri Tziafas ve Papadimitrious 1998 25 Demineralize dentin/anti-tgfβ Doğal dentin/ antitgfβ TGFβ1 emdirilmiş membran filtreler Hu ve ark. 1998 26 EGF rhfgf rhigf-ii rhpdgf-bb rhtgfβ1 Rat TGFβ1 ile reparatif dentin Sloan ve ark. 1999 27 TGFβ1-3 İndirekt pulpa Rat IM Histopatolojik Reaksiyoner dentin Decup ve ark. 2000 28 Kemik sialoproteini Rat IM Histopatolojik Rutherford ve Gu, 2000 29 rhbmp-7 Amputasyon Kemirgen IM Histopatolojik nda başarısız Rutherford BMP-7 gen 2001 30 transferi İmplantasyon Kemirgen IM Histopatolojik Lovschall ve ark. 2001 31 rhigf-i Rat IM Histopatolojik Nakamura ve ark. Mine matris 2001 32 proteinleri Rat IM Histopatolojik Nakashima ve GDF-11 gen ark. 2003 ve terapisi 2004 33, 34 İmplantasyon IM Histopatolojik Kısaltmalar : IM : Işık Mikroskop TEM : Transmission Electron Microscopy SEM: Scanning Electron Microscopy rh: Recombinant Human BMP: Bone Morphogenetic Protein EGF: Epidermal Growth Factor FGF: Fibroblast Growth Factor IGF-II: Insulin-like Growth Factor-II PDGF-BB: Platelet Derived Growth Factor-BB TGFβ1: Transforming Growth Factor β1 GDF-11: Growth and Differentiation Factor 11
59 gen-ailesi üyelerinin dentinden saflaştırılması izlemiştir 11, 16-21. Bu ailenin üyelerinden TGFß lar ve BMP lerin diş gelişimi ve yaralanmadan sonra dental dokuların tamirinde yer aldıkları gösterilmiştir. BMP-2, BMP-4 ve BMP-7 (OP-1) gibi proteinlerin osteodentin ve ardından tübüler reparatif dentin formasyonunu indüklediği bildirilmiştir 10, 12, 14, 24. Bir başka büyüme faktörleri ailesi Insulin-like Growth Factor (IGF) üyelerinden IGF-I ile gerçekleştirilen pulpa deneylerinde ise pulpa ekspozunu tam olarak kapatan bir dentin köprüsü ve arada tübüler reparatif dentin formasyonunun oluştuğu gösterilmiştir 31. Sert doku organik matrisinin önemli protein bileşenlerinden biri olan kemik sialoproteini ile gerçekleştirilen bir başka pulpa deneyinde ise osteodentin ile birlikte görülen mineralize atübüler reparatif dentin oluşumu gözlenmiştir 28. Ekspoze pulpada mine matris derivelerinin etkisini test eden bir başka çalışmada ise sert doku formasyonunun oluştuğu gösterilmiştir 32. EDTA da çözünebilen dentin bileşenleri veya rekombinan insan TGFß1 i emdirilmiş filtrelerin pulpa içine implantasyonu ile, odontoblast-benzeri hücrelerin diferansiyasyonu ve reparatif dentin formasyonu ile spesifik dentinojenik olaylar indüklenmiştir. Filtrelere bazik fibroblast büyüme faktörü veya IGF-II emdirildiğinde ise implantlardan uzak kesimlerde dentinojenik etkinin arttığı gözlenmiştir 25. Yalın haliyle odontoblast diferansiyasyonunu başlatan EDTA da çözünebilen dentin bileşenleri fraksiyonunun, TGF-β etkisini nötralize eden antikorla muameleden sonra diferansiyasyon üzerinde etkisiz olduğu görülmüştür 35-37. Böylece TGFß1 in pulpa içinde odontoblast differansiyasyonu için etkili bir sinyal olmakla birlikte, yara yüzeyinde bu etkisinin oldukça sınırlı olduğu görülmüştür. Periferal pulpa alanlarında TGFß1 reparatif dentinogenezis üzerinde değişkenlikler göstermekle beraber 26, 31, 38 santral pulpa alanlarına implante edildiğinde düzenli tübüler reparatif dentin formasyonunu indüklemektedir 25. Nakashima 24 kollajen ile taşıdığı TGFß1 ile reparatif dentin inhibisyonundan bahsederken, TGFß1 filtrelerle, hidroksiapatit granülleri ile, saf titanyum ile taşındığında da köpek dişlerinde dentinojenik etki yarattığı gözlenmiştir 38, 39. Bununla birlikte daha önce sertleşmiş olan kalsiyum hidroksitin TGFß1 solüsyonuna daldırılarak pulpa yarasına uygulanması ile reparatif dentin stimülasyonunun elde edildiği bildirilmiştir 39. TGFß in doza bağımlı etkiler sergilediğini gösteren araştırmalar kısıtlı sayıdadır. Yıldırım ve arkadaşları 38 saf hidroksiapatit ile taşıdıkları rekombinan insan TGFß1 ile köpek dişlerinde doza bağımlı etki sergileyen, inflamasyonu sınırlayıcı ılımlı dentinojenik etki elde ettiklerini bildirmişlerdir. Hu ve arkadaşları 26 rat dişlerinde 25 ng doz ile gerçekleştirilen pulpa nda TGF-β 1 in reparatif dentinogenezisi indüklediğini bildirmişlerdir. Sonuç olarak implantasyon alanı, taşıyıcı materyal ve pulpa hasarının büyüklüğünün pulpal cevabı etkilediği görülmektedir. Diğer taraftan farklı TGFß izoformları ile farklı sonuçlar elde edilmiştir; TGFß1 ve ß3 izoformları ile dental papilla kültürlerinde odontoblastdiferansiyasyonunun indüklendiği gösterilmekle birlikte 36, sağlıklı dişten elde edilen dentin-pulpa kesitlerinin kültürlerinde agaroza emdirilmiş izoformlardan TGFß3 ün sadece sınırlı sayıda kültürde odontoblast-benzeri hücre diferansiyasyonunu başlattığı bildirilmiştir 27. Bununla birlikte odontoblast diferansiyasyonu sırasındaki olaylar üzerinde izoformlara özgü etkilerin incelenebilmesi için daha ileri çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. IN VIVO VE EX VIVO GEN TERAPİLERİ Protein ve Gen Terapilerin Olası Kullanım Alanları Doku mühendisliği, organ ve dokuların hastalara nakledilmek üzere laboratuar koşullarında oluşturulmasıyla uğraşan bir bilim dalıdır. Geleneksel olarak klinik dişhekimliğinde hasar görmüş diş fonksiyonunun restorasyonu, çoğu doğal dişin fiziksel ve kimyasal karakteristiklerini taşımayan restoratif materyallere bağlıdır. Bu gerçek, neden diş restorasyonlarının çoğunun mekanik başarısızlık gösterdiğini açıklayabilir. Diş ve restorasyon arayüzündeki mikrosızıntı bakterilerin pulpaya infiltre olmasına yol açmaktadır. Reparatif/rejeneratif dentinin bariyer özelliği pulpa dokusunu için herhangi suni restoratif materyalden çok daha iyi bir şekilde korumasına yol açmak-
60 tadır. Doku mühendisliği ve rejeneratif tıp, doku için morfogenetik sinyaller, buna cevap veren kök/projenitör hücreler ve mikroçevreyi sağlayan ve koruyan bir çatı şeklindeki akılcı yaklaşımların kullanılmasına olanak vermektedir. Bu üçlü hem doku mühendisliği hem de dişin rejenerasyonu için kritiktir 4, 41. İltihaplı ve/veya yaralı pulpanın sağlığının idamesinde ideal bir tedavi, anti-inflamatuar ve antibakteriyel etkiler taşımalı, pulpa kök hücrelerinin proliferasyonunu stimüle etmeli ve iyileşme potansiyelini artırmak ve dentin formasyonunu hızlandırmak için bu hücrelerin odontoblastlara diferansiyasyonunu indüklemelidir 4. Geleneksel olarak büyüme faktörlerinin reparatif dentin formasyonunu indüklenmesi amacıyla topikal olarak uygulanmalarında, morfojenin yarılanma ömrünün sınırlı olması ve optimal bir taşıyıcı ile birlikte oldukça yüksek konsantrasyonlara ihtiyaç duyulmaktadır 41. Bu durumda proteinin direkt olarak kullanılması yerine dokunun kendisinin bu morfojeni üretmesini sağlayacak şekilde bir gen terapisi uygulanmasının avantajları oldukça açıktır. Ayrıca, ağız boşluğuna kolayca ulaşılabilmesi ve çalışılacak alan olan dişin kolayca görülmesi gen terapileri açısından ağız-diş dokularını iç organlara göre çok daha avantajlı bir duruma sokmaktadır 4. Gen terapisinde çözülmesi gereken başlıca sorunlar ise yeterli hücresel transdüksiyon oranı, transgenin yeterli ve uzun süreli ekspresyonu ve immün red problemleridir 41. BMP ailesi üyelerinden Bmp2, 4, 7 ve 9 viral vektörlerle gerçekleştirilen kemik formasyonunun amaçlandığı gen terapilerinde başarıyla kullanılmıştır 42, 43. dokusunda da gen ekspresyonunu sağlayıp endojen BMP lerin üretilmesi için viral ve viral olmayan gen transferi yapılmıştır. BMP7 protein terapisi ile reparatif/rejeneratif dentin formasyonunun nda başarılı sonuçlar bildirilmiş olmakla birlikte, deneysel olarak iltihap yaratıldığında bu başarı elde edilememiştir 29. Benzer sonuçlar Bmp7 gen terapisi ile de tekrarlanmıştır. Deneysel olarak iltihap yaratılmış olan rat pulpa dokusuna Bmp7 genini taşıyan adenovirus direkt olarak enjekte edildiğinde zayıf şekilde organize olmuş ve küçük miktarda bir mineralize bir doku indüklenmiştir. Diğer taraftan iltihaplı pulpalara ex vivo olarak Bmp7 geni ile dönüştürümüş otolog dermal fibroblastlar implante edildiğinde ise reparatif dentinogenezisin ve dentin-pulpa kompleksinin rejenerasyonunun indüklendiği gösterilmiştir 30. formasyonunun stimüle edilmesi amacıyla ampute edilmiş sağlıklı pulpalara BMP11 i kodlayan Gdf11 geni transferi için elektroporasyon ve sonoporasyon gibi metotlar da denenmiştir 33. Bir diğer alternatif yaklaşım olarak pulpadan izole edilmiş projenitör/kök hücrelerinin Bmp ile transfekte edilmeleri için elektroporasyon veya sonoporasyonun ardından bu hücrelerin uygun bir iskele üzerinde kültüre edilip yaralanmış pulpaya implante edilmeleridir 34. Çok yakın zamanda elde edilen gelişmelerle diş dokusunda biyo-mühendislik uygulamaları artık bilim kurgu olmaktan çıkmaktadır. Kültüre diş germlerinin eriyebilen üç boyutlu bir iskelede yetiştirilmeleri ve dental olmayan mezenşimden diş dokularının oluşturulması 2004 yılında elde edilen ve diş dokusu biyo-mühendisliğini kanıtlayan çalışmalardır 44, 45. Diş dokusunun sırlarının çözülmeye başlandığı bu heyecan verici çağda dentin pulpa kompleksinin, vücudun diğer dokularında eşi bulunmayan rejeneratif kapasitesi dental doku tamirinde yeni biyolojik yaklaşımları olası kılmaktadır. Bu olasılıkların değerlendirilmesinde in vitro şartlarda dental hücre kültürleri büyük önem taşısa da çalışmaların nihai sonuçlarının in vivo şartlarda kanıtlanması gerekmektedir. İLTİHAPLI DİŞ PULPASINDA TEDAVİ Sağlam ve iltihaplı dişlerin uygulanan tedavilere verdikleri cevaplar arasındaki farklılıklar açıktır. Diğer taraftan reparatif dentinogenezis ve protein terapisi üzerine gerçekleştirilen araştırmaların tamamı, klinik olarak normal yetişkin dişleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte terapötik dentinogenezis adayı olan hastaların çoğu, var olan veya yakın zamandaki bir pulpitis hikayesine sahip canlı dişlere sahip hastalardır. Bu sebeple Rutherford ve Gu 29, kemirgen dişlerinde oluşturdukları deneysel pulpitis üzerinde BMP-7 etkisini araştırmışlardır. Çalışma sonunda sağlıklı pulpada gösterdiği reparatif
61 etkisinin çok üstünde dozda kullanılmasına rağmen rekombinan BMP ile başarı elde edilememiştir 29. Bununla birlikte Rutherford 30 Bmp 7 yi rekombinan virus ile in vivo veya otolog dermal fibroblastları transduse ederek ex vivo şartlarda yine deneysel olarak inflame edilmiş kemirgen pulpalarına vermiş ve ex-vivo gen transferinin geri-dönüşümlü pulpitis ortamında dahi dentin rejenerasyonunu indüklemede etkili bir metot olabileceğini bildirmiştir. Benzer şekilde Nakashima ve arkadaşları 33, 46 da Gdf 11 (Growth and differentiation factor11) cdna plasmid ile pulpa hücrelerine elektropolasyon ile pulpa hücrelerini etkin bir şekilde transduse ettiklerini ve odontoblastlar için bir diferansiyasyon belirleyicisi olan dentin sialoproteinini indüklediklerini ve reparatif dentin formasyonunun sağlandığını göstermişlerdir. Şiddetli inflamasyon durumlarında pulpa hücreleri üzerinde anlatılan şekilde in vivo gen terapilerinin etkisiz olması nedeniyle, Nakashima ve arkadaşları 34 Bmp ile transfekte edilmiş hücrelerin otogen transplantasyonu yoluna gitmişler ve osteodentin ve tübüler dentin formasyonu ile sonuçlanan reparatif dentinogenezis nu elde etmişlerdir. Diş sında Kritik Yara Boyutu Deneysel olarak reparatif dentinogenezisin stimulasyonu için uğraşan çalışmalarda klinik endikasyonların tersine oldukça farklı perforasyon boyutları kullanılmaktadır. Rutherford ve arkadaşları 14, 15 rekombinan insan osteojenik protein- 1 i kullanarak yaptıkları araştırmalarında 2x2x1 mm boyutlarında standart perforasyon alanları kullanmışlardır. Hu ve arkadaşları 26 sond ucu ekspozlar üzerinde çeşitli büyüme faktörlerinin etkilerini test ederlerken, Nakashima 11, 12 kemik morfogenetik proteininin etkilerini araştırdığı çalışmalarında pulpaları perfore etme işlemini parsiyel pulpa amputasyonu olarak tanımlamıştır. Kemik rejenerasyonu üzerinde yapılan çalışmalarda iyileşme ve rejenerasyon, spontan iyileşmeyi imkansız kılacak kadar büyük olan bir kemik defekti modelinde değerlendirilmektedir. Deneysel olarak oluşturulan bu tarz kemik defektlerine kritik büyüklüğe sahip defektler adı verilmektedir ve bu defektler deneğin hayatı boyunca spontan olarak kemik dokusu ile rejenere olmayacak boyutlara sahiptirler 47. Örneğin tavşanlarda kafatasında kritik yara boyutu 12 mm olarak belirlenmiştir. Benzer şekilde uzun kemiklerde ve tam kalınlık yumuşak doku defektlerinde de kritik yara boyutları mevcuttur 48, 49. Böylelikle, bu tür dokularda terapötik amaçla kullanılacak bir materyalin iyileşme üzerindeki etkileri deneğin kendi iyileşme potansiyeline değil, kullanılan terapötik materyalin doğasına ve işleyiş mekanizmasına dayandırılabilmektedir. Dentin-pulpa kompleksinde cereyan eden olayların araştırılmasında kullanılacak deneysel modellerden birini pulpa perforasyonları üzerine uygulanan çeşitli faktörlere karşı verilen cevapların değerlendirilmesi oluşturmaktadır. Dentinpulpa kompleksinin kendisinde var olan yüksek rejenerasyon yeteneği de göz önüne alındığında, tersiyer dentinogenezisin indüklenmeye çalışıldığı bu araştırmalarda, diş pulpasında kendiliğinden iyileşmeyen bir kritik perforasyon yara- boyutu üzerinde çalışılması elde edilecek sonuçların daha net yorumlanmasını sağlayacaktır. dokusunda, kemik dokusunda yada bazı yumuşak dokularda olduğu gibi kritik yara boyutu olarak adlandırılan ve herhangi bir tedavi uygulanmadığında kendiliğinden iyileşmeyen bir yara yüzey alanı belirlenmemiştir. Rat dişlerinde negatif kontrol olarak kullanılabilecek bir perforasyon bulunmamakta dolayısıyla yüksek yalancı pozitif cevaplarla karşılaşılmaktadır. Bununla birlikte insan diş fizyonomisini ile pek çok ortak noktaya sahip köpek dişlerinde 2x2x2 mm çaptaki bir perforasyon kritik yara boyutu olarak hizmet edebilir 50. SONUÇ Her yıl yapılan milyonlarca yeni restorasyon göz önüne alındığında pulpa canlılığının korunması restoratif dişhekimliği ve kısmen endodontinin en sorunlu konuları arasında yer almaya devam etmektedir. Altmış beş yaş ve üstü popülasyonun önümüzdeki 20 yılda iki katı artacağı beklenmektedir. Bu durum insanların daha uzun süreler dental tedavilere ihtiyaç duyacakları anlamına gelmektedir 51. Bu durum ise komplikasyonların önlenmesi ve tedavi başarısının/süresinin arttırılmasında dişin vitalitesinin korunmasını
62 geçmiş yıllardan daha önemli kılmaktadır. Erken yaşta kaybedilen dişlerin yol açtığı yüksek maliyetteki protetik veya ortodontik yaklaşımlarla dental/oral sağlığın devam ettirilmeye çalışılması ise ciddiyetini halen korumaktadır. vitalitesini koruyan restorasyonların başarısı ile pulpa vitalitesine zarar veren yaklaşımların başarısı arasındaki belirgin farklılık tedaviyi takiben pulpa vitalitesinin korunmasının ne kadar değerli bir konu olduğunu açıkça ortaya koymaktadır. ekspozunu takiben kısa süreli başarı oranları %44-97 iken pulpa ekspozu olmayan tedavilerin başarı oranı %100 e ulaşmaktadır 51. Ülkemize ait kesin rakamlar bilinmemekle birlikte, Amerika da her yıl 90 milyon yeni dolgu yapılmakta ve 200 milyon dolgu değiştirilmektedir 52. Bu rakamlar göz önüne alındığında pulpa canlılığının korunarak bir dişin etkin ve kolay yöntemlerle tedavisi dişhekimliğinin hedefleri arasında yer alan en önemli konulardan biridir. Rejeneratif pulpa tedavilerinde doku mühendisliği yaklaşımlarındaki çarpıcı ilerlemelere rağmen halen birçok konu çözüm beklemektedir. Özellikle iltihaplı dişte uygulanacak, iltihaplı dokuyu tedavi edip reparatif dentinogenezisi indükleyecek bir tedavi ihtiyacı büyüktür. Bu durumda yüksek kalitede tekrarlanabilir deneyler için iyi karakterize edilmiş hayvanların kullanılacağı araştırmalarla dentin-pulpa kompleksi rejenerasyonunun indüklenmesi için yeni yaklaşımların geliştirilmesi gerekmektedir. Restoratif dişhekimliği ve endodonti alanında rejeneratif tedavilere yönelik elde edilecek bu gelişmelerin dişhekimliğinin cerrahi ve periodontoloji gibi çene kemiklerindeki rejenerasyonun öne çıktığı diğer alanlarındaki uygulamaları kaçınılmazdır. KAYNAKLAR 1. Alacam T. Dentin ve Tedavileri: Endodonti,1.edisyon, Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi, Ankara, 2000, p. 128. 2. Hess W. Pulp amputation as a method of treating root canals. D Items Int 1929; 51:596. 3. Schröder U. Effects of calcium hydroxide containing agent on pulp cell migration, proliferation, and differentiation. J Dent Res 1985; 64:541-8. 4. Nakashima M, Reddi AH. The application of bone morphogenetic proteins to dental tissue engineering. Nat Biotech 2003; 21:1025 32. 5. Tziafas D.: Mechanisms controlling secondary initiation of dentinogenesis: A Review. Int End J 1994; 27: 61-74. 6. Smith AJ, Cassidy N, Perry H.: Reactionary Dentinogenesis. Int J Dev Biol 1995; 39: 273-280. 7. Rutherford RB, Fitzgerald M.: A new biological approach to vital pulp therapy. Crit Rev Oral Biol Med 1995; 6: 218-229, 1995. 8. Lesot H., Smith AJ, Tziafas D.: Biologically Active Molecules And Dental Tissue Repair: A Comparative Review Of Reactionary And Reparative Dentinogenesis With The Induction Of Odontoblast Differentiation In Vitro, Cells and Materials 1994; 4:199-218. 9. Heys DR., Cox CF, Heys RJ, Avery JK.: Histological Considerations Of Direct Pulp Capping Agents, J Dent Res 1981; 60: 1371-1379. 10. Jepsen S.: Transforming Growth Factor-β1 mrna in neonatal ovine molars visualized by in situ hybridization: Potential role for stratum intermedium. Archs Oral Biol 1992; 37: 645-653. 11. Nakashima M.: The induction of reparative dentin in the amputated pulp of the dog by bone morphogenetic protein. Archs Oral Biol 1990; 35: 493-497. 12. Nakashima M.: Induction of dentin formation on canine amputated pulp by recombinant bone morphogenetic proteins. BMP-2 and -4. J Dent Res 1994a; 73: 1515-1522. 13. Rutherford RB.: Role Of Osteogenic Protein In Reparative And Reactionary Dentin, Proc. Int. Conference on Dentin/ Pulp Complex 1995 and the International Meeting on Clinical Topics of Dentin/Pulp Complex. Quintessence 1996; (S1-3): 112-115. 14. Rutherford, B. R., Wahle, J., Tucker, M., Rueger, D., Charatte, M.: Induction of reparative dentin formation ın monkeys by recombinant human osteogenic protein-1. Archs Oral Biol 1993; 38: 571-576. 15. Rutherford, R. B., Spangberg, L., Tucker, M., Rueger, D., Charatte, M.: Time course of the induction of reparative dentin formation in monkeys by recombinant human osteogenic protein-1. Archs Oral Biol 1994; 39: 833-838. 16. Bang G, Nordenram A, Anneroth G: Allogenic Demineralized Dentin Implants In Jaw Defects Of Java Monkeys. Int J Oral Surg 1972; 1:126-136. 17. Nakashima M.: Dentin Induction By Implants Of Autolyzed Antigen-Extracted Allogeneic Dentin On Amputated Pulps Of Dogs, Endod Dent Traumatol 1989; 5: 279-286. 18. Nakashima M.: An Ultrastructural Study Of The Differentiation Of Mesenchymal Cells In Implants Of Allogeneic Dentine Matrix On The Amputated Dental Pulp Of The Dog, Arch Oral Biol 1990; 35: 277-281. 19. Tziafas D, Kolokuris I.: Inductive Influences Of Demineralized Dentin And Bone Matrix On Pulp Cells: An Approach Of Secondary Dentinogenesis, J Dent Res, 1990; 69: 75-81. 20. Smith AJ, Tobias RS, Plant CG.: In Vivo Morphogenetic Activity Of Dentin Matrix Proteins, J Biol Buccale 1990; 18: l23-129. 21. Lianjia Y, Yuhao G, White FH.: Bovine Bone Morphogenetic Protein Induced Dentinogenesis, Clin Orthop 1993; 295: 305-315. 22. Tziafas D, Kolokuris A, Alvanou A, Kaidoglou K.: Short- Term Dentinogenic Response Of Dog Dental Pulp Tissue
63 After Its Induction By Demineralized Or Native Dentine, Or Predentine, Arch Oral Biol 1992; 37: 119-128. 23. Smith AJ, Tobias RS, Cassidy N.: Odontoblast Stimulation In Ferrets By Dentine Matrix Components, Arch Oral Biol 1994; 39: 13-22. (1994). 24. Nakashima M.: induction of dentin in amputated pulp of dogs by recombinant human bone morphogenetic protein- 2 and -4 with collagen matrix. Arch Oral Biol 1994b; 39: 1085-1089. 25. Tziafas D., Papadimitriou S: Role of exogenous TGFβ in induction of reparative dentinogenesis in vivo. Eur J Oral Sci 1998; 106 (Suppl 1): 192-196. 26. Hu CC, Zhang C, Qian Q, Tatum NB: Reparative dentin formation ın rat molars after direct pulp capping with growth factors J Endod 1998; 24: 744-751. 27. Sloan AJ, Smith AJ: Stimulation of the dentine-pulp complex of rat incisor teeth by TGFbeta isoforms 1 3 in vitro. Arch Oral Biol 1999; 44:149 156. 28. Decup F, Six N, Palmier B, Buch D, Lasfargues JJ, Salih E, Goldberg M: Bone sialoprotein-induced reparative dentinogenesis in the pulp of rat s molar. Clin Oral Investig 2000; 4:110 119. 29. Rutherford RB, Gu K: Treatment of inflamed ferret dental pulps with recombinant bone morphogenetic protein-7. Eur J Oral Sci 2000; 108:202-6. 30. Rutherford RB: BMP-7 gene transfer to inflamed ferret dental pulps. Eur J Oral Sci 2001; 109: 422-424. 31. Lovschall H, Fejerskov O, Flyvbjerg A: Pulp capping with recombinant human insulin growth factor-i (rhigf-i) in rat molars. Adv Dent Res 2001; 15:108 112. 32. Nakamura Y, Hammarström L, Lundberg E, Ekdahl H, Matsumoto K, Gestrelius S, Lyngstadaas SP: Enamel matrix derivative promotes reparative processes in the dental pulp. Adv Dent Res 2001; 15:105 107. 33. Nakashima M, Tachibana K, Iohara K, Ito M, Ishikawa M, Akamine A: Induction of reparative dentin formation by ultrasound-mediated gene delivery of growth/differentiation factor 11. Human Gene Ther 2003; 14: 591-7. 34. Nakashima M, Iohara K, Ishikawa M: Stimulation of reparative dentin formation by ex vivo gene therapy using dental stem cells electrotransfected with delivery of growth/differentiation factor 11 (Gdf11). Human Gene Ther 2004; 15: 1045-53. 35. Begue-Kirn C, Smith AJ, Loriot M: Comparative analysis of TGFβs, BMPs, IGF1, Msxs, fibronectin, osteonectin and bone sialoprotein gene expression during normal and in vitro induced odontoblast differentiaition. Int J Dev Biol 1994; 38: 405-420. 36. Begue-Kirn C, Smith AJ, Ruch JV: Effects of dentin proteins transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and bone morphogenetic protein 2 (bmp2) on the differentiation of odontoblast in vitro. Int J Dev Biol 1992; 36: 491-503. 37. Lesot H, Smith AJ, Meyer JM, Staubli A, Ruch JV: Cellmatrix ınteractions: ınfluence of noncollagenous proteins from dentin on cultured dental cells. J Embryol Exp Morp 1986; 96:195-209. 38. Yıldırım S, Alaçam A, Sarıtaş ZK, Oygür T: Transforming Growth Factor-ß1 in pulpa tedavilerinde kullanılabilirliğinin histopatolojik olarak araştırılması. GÜ Dişhek Fak Derg 2001; 18: 123-132. 39. Tziafas D, Belibasakis G, Veis A, Papadimitriou S: Dentin regeneration in vital pulp therapy: Design principles. Adv Dent Res 2001; 15: 96-100. 40. Yıldırım S, Alaçam A, Sarıtaş ZK, Oygür T: The histopathological research of the calcium phosphate biomaterials as biologic delivery system for TGF-β1, Biomed Merit Lymra, Kemer Antalya, 19-22 Eylül 2002. 41. Nakashima M. Bone morphogenetic proteins in dentin regeneration for potential use in endodontic therapy, Cytokine & Growth Factor Reviews 2005; 16: 369 376. 42. Franceschi RT, Yang S, Rutherford RB, Krebsbach PH, Zhao M, Wang D. Gene therapy approaches for bone regeneration. Cells Tissues 2004; 176: 95-108. 43. Rutherford RB, Gu K, Racenis P, Krebsbach PH. Early events: the in vitro conversion of BMP transduced fibroblasts to chondroblasts. Connect Tissue Res 2003; 44 Suppl 1:117-23. 44. Duailibi MT, Duailibi SE, Young CS, Bartlett JD, Vacanti JP, Yelick PC. Bioengineered teeth from cultured rat tooth bud cells. J Dent Res 2004; 83: 523 8. 45. Ohazama A, Modino SAC, Miletich I, Sharpe PT. Stemcell-based tissue engineering of murine teeth. J Dent Res 2004; 83: 518 22. 46. Nakashima, M., Mizunuma, K, Murakami T, Akamine A.: Induction of dental pulp stem cell differentiation into odontoblasts by electroporation-mediated gene delivery of growth/differentiation factor 11 (Gdf11). Gene Ther 2002; 9: 814-8. 47. Schmitz JP, Hollinger JO. The critical size defect as an experimental mo del for craniomandibulofacial nonunions. Clin Orthop Rel Res 1986; 205: 299 308. 48. Beck LS, Amento EP, Xu Y: TGF-β1 induces bone closure of skull defects: temporal dynamics of bone formation in defects exposed to rhtgfβ1. J Bone Miner Res 1993; 8: 753-761. 49. Bonewald LF, Dallas SL: Role of active and latent transforming growth factor-β in bone formation. J Cell Biochem 1994; 55: 350-357. 50. Yıldırım S, Arıcan M, Aydınbelge M, Çelik İ. diş pulpasında kritik defekt söz konusu mu? EÜ Dişhekimliği Fakültesi Uluslararası Dişhekimliği Kongresi, EÜ Atatürk Kültür Merkezi İzmir, 29 Eylül-1 Ekim 2005. 51. Smith AJ, Murray PE, Lumley PJ: Preserving the Vital Pulp in Operative Dentistry: I. A Biological Approach. Dent Update 2002; 29: 64-69. 52. Murray PE, About I, Franquin J-C, Remusat M, Smith AJ. Restorative pulpal and repair response. J. Am. Dent. Assoc. 2001; 132: 482-491. İLETİŞİM ADRESİ Doç. Dr. Gülay UZUN Hacettepe Üniversitesi Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksekokulu Sıhhıye 06100, Ankara Tel: 0312 305 15 87 Fax: 0312 311 37 41 e-mail: vuzun@hacettepe.edu.tr