EK-8 T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Proje Başlığı Koyun Karaciğer Kist Hidatik Sıvısından Hidatidosise Spesifik Proteinlerin Pürifikasyonu ve ELISA Yöntemine Aplikasyonu The Purification of Specific Proteins of Hydatid Cyst Fluids From Sheep Liver and the Application of These Purified Proteins to ELISA Procedure Proje Yürütücüsünün İsmi Prof.Dr.Ayşe Burgu Proje Numarası 2005 0810077 Başlama Tarihi 30.06.2005 Bitiş Tarihi 29.02.2007 Rapor Tarihi 26.06.2007 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " YIL "
KESİN RAPOR I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Koyun Karaciğer Kist Hidatik Sıvısından Hidatidosise Spesifik Proteinlerin Pürifikasyonu ve ELISA Yöntemine Aplikasyonu Son konağı köpekgiller olan Echinococcus granulosus larvasının meydana getirdiği hidatidosis Türkiye de yaygın olarak görülmekte gerek sağlık ve gerek ekonomik açıdan büyük problem oluşturmaktadır. Hidatik kistlerin ara konak gevişgetiren canlı hayvanlarda teşhisi için pratik bir yöntem bulunmamakta ancak nekropsi ve mezbaha kontrollerinde ortaya çıkartılabilmektedir. İnsanlarda şüpheli durumlarda teşhiste bazı görüntüleme yöntemlerinden yararlanılabilmekle birlikte özellikle yeni oluşan kistlerin teşhisinde büyük sıkıntılar yaşanmaktadır. İnsanlarda serolojik testler de kullanılabilmekte, özelikle yüksek fiyatlar ödenerek yurt dışından ithal edilen ELISA kitlerinden faydalanılmaktadır. Son yıllarda geliştirilen SDS-PAGE ve Western blotting yöntemleri teşhis amaçlı olarak helmintoloji alanında yaygın kullanım bulmuştur. Bu kullanımlar hidatidosis gibi insan ve hayvanlarda patojenik öneme sahip enfeksiyonlar üzerinde yoğunlaşmakta ve teşhis amaçlı kullanılabilecek antijenler geliştirilmeye çalışılmaktadır. Bu çalışmada antijen olarak daha önceki çalışmalarda hidatidosis için spesifik olduğu bilinen, koyun kökenli hidatik kist sıvılarından Rotofor kullanılarak izoelektrik noktalarına göre ayrıştırılan 8, 68, 116 kda luk immunoreaktif proteinler kullanılmıştır. Ayrıştırılan antijenler ELISA ya aplike edilerek hidatidosisli insan ve negatif insan serumlarıyla test edildikten sonra elde edilen sonuçlar ticari kitlerle karşılaştırılarak antijenlerin duyarlılığı belirlenmiş, aynı zamanda aynı antijenlerin sekonder hidatidosis oluşturulmuş fare serumları ve negatif fare serumları ile de karşılaştırılması yapılarak sekonder hidatidosisteki duyarlılıkları ortaya çıkarılmıştır. Sonuçlar değerlendirildiğinde hidatidosisli insan serumlarında, 8, 68 ve 116 kda luk proteinlerin kullanılan ticari kitlere eşdeğer duyarlılık gösterdikleri; sekonder hidatidosisli fare serumları kullanıldığında da özellikle 116 kda luk proteinin 8 ve 68 kda luk proteinlere göre biraz daha spesifik sonuçlar verdiği ortaya konmuştur.
The Purification of Specific Proteins of Hydatid Cyst Fluids From Sheep Liver and the Application of These Purified Proteins to ELISA Procedure Hydatidosis caused by infection with larval form of Echinococcus granulosus found in dogs. It is widespread and considered as one of the important health and economic problem in animals and human in Turkey. There is not any practical procedure for detection of this disease in living animals except that necropsy and slaughterhouse examination. However some serological and visualization methods are hopeful in humans. After all, it is very difficult to diagnose newly formed cysts by radiography and ultrasound. Some ELISA Kits using for serological diagnosis can give fine results but it is very expensive to import them. In recent years, SDS-PAGE and Western blotting have been widely used in the serologic studies of helminths. Generally, these investigations mostly concentrated on helminths which are harmful to humans and domestic animals such as hydatidosis. The diagnostic sensitivity and specificity of the tests vary according to the nature and quality of the antigen. In this study, immunoreactive proteins (8, 68 and 116 kda), found specific for hydatidosis in previous study which were partially purified using isoelectrical focusing by a Rotofor cell device and applicated ELISA. Sera from positive and negative samples for hydatidosis from human and secondary hydatidosis from mice were tested both this immunoreactive proteins and commercial ELISA Kits and the results were compared. According to the results, 8, 68, 116 kda purified proteins gave as good results as commercial ELISA Kits by ELISA, when the human sera were used. It was detected that 116 kda purified protein was more specific than 8 and 68 kda proteins when the positive and negative sera from mice were used. II. Amaç ve Kapsam Bilim dalımızda yapılan çalışmalarla, koyun karaciğer kist hidatik sıvısı proteinlerinden 8 ve 68 kda insanlar için, 116 kda koyunlar için spesifik antijen olarak belirlenmiştir. Türkiye ve dünyada yapılan diğer çalışmalarda da spesifik olduğu bildirilen bu 3 protein, kist sıvısı total antijeni içerisinden ayrılmış ve ELISA testi kullanılarak sonuçlar değerlendirilmiştir. Kendi hazırladığımız antijenlerle yapılan ELISA nın yanında, farklı ticari kitlerin de aynı insan serumları ile çalışılması ile elde edilen sonuçlar karşılaştırılmıştır. Bunun sonucunda laboratuarımızda hazırlanan antijenden elde edilen spesifik proteinlerin hangisinin veya hangilerinin ELISA sonuçlarının ticari kitlerinkine yakın veya üstün olduğu belirlenmiştir. Bu sonuçların hidatidosisin serolojik tanısı için kit
üretilmesine katkı sağlayacak boyutu bulunmaktadır. Daha önceki çalışmalarda kist hidatik sıvısı antijeninin, hidatidosisin tanısı için iyi bir antijen kaynağı olduğu bildirilmiştir. Bu projeli çalışmada, koyun karaciğer kist hidatik sıvısı kullanılarak iki yönlü pürifikasyon yöntemi ile 8, 68 ve 116 kda luk antijenler pürifiye edilmiştir. Pürifikasyon işlemi Rotofor cell kullanılarak proteinlerin pi (İzoelektrik nokta) değerlerinin farklılığı temeline dayanan parsiyel pürifikasyon yöntemi ile yapılmıştır. Daha sonra elde edilen bu antijenik proteinler ve total kist hidatik sıvısı antijeni ELISA yöntemi ile serumlarla karşılaştırılarak sonuçlar değerlendirilmiştir. Aynı insan serumlarının hazır ticari ELISA kist hidatik kitleri ile de çalışılmasından sonra çıkan sonuçlar karşılaştırılarak kit yapımı için bir ön çalışma oluşturulmuştur. III. Materyal ve Yöntem Antijen hazırlanması: Koyun karaciğer kist hidatik sıvısı 10 000Xg de 30 dk. santrifüj edilmiş, protoskoleksler çöktürülerek elde edilen süpernatant 0.45µm lik membran filtreden geçirilmiştir. Filtreden geçirilen solüsyon diyaliz torbasına konularak distile suya karşı +4 C de diyaliz edilerek total antijen hazır hale getirilmiştir. Pürifiye antijenin hazırlanması için ise aşağıdaki işlemler yapılmıştır. İmmunreaktif proteinlerin pürifikasyonu: Yukarıdaki prosedür takip edilerek koyun karaciğer kist sıvısından hazırlanan total antijenin polyacrilamide jel kullanılarak, protein seperasyonu yapılmış, Silver Stain Tekniği ile boyanan jeldeki protein bantlarının molekül ağırlıkları, protein standartı ile karşılaştırılarak belirlenmiştir. Elektroforez işlemi, Protean II Vertical Elektroforesis cell cihazı ile yapılmıştır. Elektroforez işleminden sonra total antijen, belirli aralık ph lı (3-10) amphoylite ile Rotofor cell cihazına yüklenmiştir. Rotofor cell işlemi sonunda proteinlerin ph derecelerine göre ayrı ayrı tüplere toplanmaları sağlanmıştır. Pürifikasyonu hedeflenen 8, 68 ve 116 kda luk proteinlerin ürün tüplerden hangisinde olduğunu belirlemek için bu tüplerin tekrar elektroforezleri yapılarak hedef proteinlerin bulunduğu tüpler ayrılmıştır. Bu tüplerde proteinlerle birlikte bulunan, Rotofor işlemi öncesinde total antijene ilave edilen amphoylite daha sonra uygulanacak serolojik testte sonucu etkilememesi için uzaklaştırılmıştır. Tüm bu işlemler sonrasında pürifiye edilmiş ve ayrı ayrı tüplerde toplanmış olan 8, 68 ve 116 kda luk immunreaktif proteinlerin her biri ayrı ayrı ELISA ile 25 pozitif, 25 negatif fare serumu, 10 pozitif, 10 negatif ve 6 diğer paraziter hastalıklı (toxocariosis, trichinellosis, fasciolosis) insan serumu ve non-enfekte hazır piyasa serumu kullanılarak işlenmiş ve sonuçlar değerlendirilmiştir. Ayrıca, insan serumları farklı iki ticari ELISA
kiti ile de çalışılarak, sonuçların doğrulanması ve karşılaştırmaları yapılmıştır. Serumların elde edilmesi: Deney grubu olarak oluşturulan toplam 25 fare her birine 3000 protoskoleks intraperitonal olarak verilerek enfekte edilmiştir. Aynı sayıda fare kontrol grubu olarak ayrılmıştır. Farelerden enfeksiyondan 10 ay sonra kan alınarak, serumları çıkartılmıştır. Kist hidatikli, diğer paraziter hastalıklı (toxocariosis, trichinellosis, fasciolosis) ve kontrol insan serumları, Gülhane Tıp Akademisi nden radyolojik bulgularla kist hidatikli olduğu teşhis edilen preoperatif hastalardan sağlanmıştır. Çalışılacak serum sayısı, 25 pozitif, 25 negatif fare serumu, 10 pozitif, 10 negatif ve 6 diğer paraziter hastalıklı insan serumu ve non-enfekte hazır piyasa serumu olarak planlanmış ve çalışılmıştır. IV. Analiz ve Bulgular Koyun karaciğer kist hidatik sıvısından hazırlanan antijenlerin SDS-PAGE (%15 separating+ %5 stacking jel 2mm kalınlığında 20X20 cm lik cam kullanılarak yapılmıştır) ile analizleri sonucunda, farklı molekül büyüklüğünde 23 protein bandı sayılmış ve pürifikasyonu hedeflenen yeterli yoğunluğa sahip 3 spesifik proteinin (8, 68 ve 116 kda) total antijen içinde varlığı tespit edilmiştir. Pürifikasyonu hedeflenen proteinlerin jel üzerindeki bant kalınlıklarına bakılarak kist sıvısı antijeni içindeki yoğunluklarının pürifikasyon yapılabilecek yoğunlukta olduğuna karar verilmiş ve bu proteinlerin saflaştırılması işlemine geçilmiştir. Proteinlerin saflaştırılması için Rotofor cell cihazında 50 ml antijen kapasiteli ve içinde proteinlerin bölmelerde izoelektrik noktalarına (pi) göre çökmesini sağlayan membran bulunduran hazne kullanılmıştır. 50 ml total antijene ph aralığı 3-10 olan ampholyte (Bio-rad cat no:163-1112) %2 oranında ilave edilerek rotofor çalıştırılmıştır. Rotofor cell cihazının çalıştırılmasında başlangıçta 15 W akım verilmiş, başlangıç Volt ve ma değerleri kaydedilmiştir. Volt un sabitlendiği noktada da rotofor işlemine son verilmiştir. Genelde rotofor işlemi yaklaşık 5-6 saat sürmüştür. Daha sonra 20 bölmede toplanan proteinler vakum pompası yardımı ile 20 ayrı tüpe toplanmıştır. Rotofor ürünü 20 ayrı tüpten alınan 40 µl miktarlarındaki örneklerle SDS-PAGE yapılmış ve hangi tüplerde hangi molekül ağırlığında proteinlerin olduğu belirlenmiştir. Gerekli miktarda protein toplanması amacıyla çalışma süresince 10 kez Rotofor cell cihazına total antijen yüklenerek her tüpün ayrı ayrı elektroforezleri yapılmıştır. Bu işlem sonucunda 8, 68 ve 116 kda luk hedef 3 proteinin başka bir proteinle birlikte olmaksızın ayrı ayrı tüplere toplandığı belirlenmiş ve 2. aşama pürifikasyon işlemi olan Gel Eluter ile yapılacak uygulamalara
gerek duyulmamıştır. Elde edilen proteinlerin ml deki yoğunlukları ölçülerek pleytlere kaplanmıştır. Çalışmada kontrol ve deneysel enfekte fare serumlarının ELISA yöntemine aplike edilen pürifiye immunreaktif proteinlerle karşılaştırılması ile elde edilen sonuçlar şu şekilde olmuştur: İmmunreaktif proteinlerden 8 kda luk protein ELISA yöntemine aplike edilerek kist hidatik pozitif 25 fare serumu ile çalışılması sonucu 24 pozitif, 1 şüpheli sonuç alınmıştır. 68 kda luk pürifiye proteinin antijen olarak kullanılarak aynı serumların ELISA yöntemi ile çalışılması sonucu 24 pozitif ve 1 negatif, 116 kda ile yapılan değerlendirmelerde ise 25 pozitif sonuç alınmıştır. Kist sıvısı antijenin total olarak kullanıldığı, ELISA yöntemi ile aynı serumların çalışıldığı uygulamalarda 24 pozitif ve 1 negatif sonuç elde edilmiştir (Tablo 1). Negatif kontrol olarak ayrılan 25 fare serumunun aynı pürifiye immunreaktif proteinlerin ELISA ya aplikasyonu ile çalışılması sonuçunda da aşağıdaki sonuçlar alınmıştır: Kontrol grubu 25 kist hidatik negatif fare serumunun 8 kda luk immunreaktif pürifiye protein antijen olarak kaplandığı ELISA yöntemi ile çalışılması sonrasında 20 negatif, 4 yalancı pozitif ve 1 şüpheli sonuç alınmıştır. 68 kda luk pürifiye protein ile aynı serumların ELISA yöntemi ile çalışılması sonucu 19 negatif, 4 yalancı pozitif ve 2 şüpheli, 116 kda ile yapılan değerlendirmelerde ise 20 negatif, 4 yalancı pozitif ve 1 şüpheli sonuç elde edilmiştir. Negatif 25 farede total kist sıvısı antijeni ile yapılan ELISA larda %68 negatif, %8 şüpheli ve %24 yalancı pozitif sonuç alınmıştır (Tablo 2). Çalışmanın Kist hidatik pozitif ve kontrol insan serumlarının ELISA yöntemine aplike 8, 68 ve 116 kda luk pürifiye immunreaktif proteinler ile total kist sıvısı antijeni kullanılarak yapılan bölümünde aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir: İnsan serumlarından pürifiye protein ve total kist sıvısı antijenleri ile ELISA çalışmaları sonrasında elde edilen sonuçlar aynı serumların iki hazır ticari kist hidatik kitleri ile çalışılmasından elde edilen sonuçlarla karşılaştırılmıştır. Bunun yanında insan serumu ile yapılan çalışmalarda kontrol grubu olarak çalışılan negatif insan serumları ile birlikte 2 trichinellosis, 2 toxocariosis ve 2 fasciolosis enfeksiyonlu hasta serumları da aynı pürifiye protein antijenleri ile çalışılmış ve crossreaksiyon ihtimali de değerlendirilmiştir. Hazır ticari kitlerle yapılan çalışmalarda ise, diğer paraziter hastalıklı insan serumları ile çalışılması sonrasında kit 1 de 2 şüpheli, 4 negatif, kit 2 de 1 pozitif, 5 negatif sonuç alınmıştır. Kist hidatik pozitif ve negatif insan serumları da yine bu 2 ayrı üretici firmaya ait ELISA kitlerle çalışılmıştır. Bu çalışma sonuçunda; negatif kontrollerde kit 1 de 2 şüpheli, 2 yalancı pozitif ve 6
negatif sonuç alınırken, kist hidatik enfekte insan serumlarından 6 pozitif, 2 şüpheli ve 2 negatif sonuç alınmıştır. İkinci kit ile (kit 2) yapılan ELISA çalışmalarında ise, diğer enfeksiyonlu hasta serumlarında 1 pozitif (toxocariosis) 5 negatif sonuç alınırken negatif kontrollerin tamamından negatif sonuç alınmıştır. Kist hidatik enfekte serumlarının kit 2 ile çalışılmasında ise, 1 negatif, 1 şüpheli ve 8 pozitif sonuç alınmıştır(tablo 3). 8 kda luk immunreaktif pürifiye proteinin pleytlere kaplanarak ELISA uygulamasında diğer hastalıklarla enfekte insan serumlarından sadece 1 serum ile (toxocariosis ile enfekte) pozitif sonuç alınmış, kist hidatik negatif hasta serumlarından 1 serumda da sonuç şüpheli olmuş, geri kalan 9 negatif serum negatif sonuç vermiştir. Aynı proteinin antijen olarak kullanıldığı kist hidatik enfekte hasta serumlarının ELISA çalışmaları sonrasında 1 negatif, 9 pozitif sonuç elde edilmiştir (Tablo 3). 68 kda luk immunreaktif pürifiye proteinin antijen olarak kullanıldığı ELISA da, diğer hastalıklarla enfekte insan serumlarından 2 pozitif sonuç alınmıştır. Bu pozitiflerden birinin trichinellosis, diğerinin toxocariosis ile enfekte hasta serumları olduğu gözlemlenmiştir. Aynı proteinin antijen olarak kullanıldığı ve kist hidatik negatif insan serumları ile yapılan ELISA çalışmalarında 2 yalancı pozitif ve 8 negatif sonuç alınmış, kist hidatik pozitif hasta insan serumlarının tamamında ise sonuçlar pozitif olmuştur. 116 kda luk pürifiye proteinin antijen olarak kullanıldığı ELISA çalışmalarında, diğer hastalıklarla enfekte insan serumlarından 2 pozitif (1 trichinellosisli, 1 toxocariosisli) ve 4 negatif sonuç alınmıştır. Diğer hastalıklarla enfekte serumlardan alınan pozitif sonuçların 68 kda luk proteinin antijen olarak kullanıldığı ELISA çalışmalarında da pozitif sonuç veren aynı hasta serumları olduğu dikkat çekmiştir. 116 kda luk pürifiye proteinin antijen olarak kullanıldığı kist hidatik negatif hasta serumlarının çalışıldığı ELISA da 1 yalancı pozitif, 9 negatif sonuç alınırken, kist hidatik pozitif 10 hasta serumu ile yapılan çalışmalardan 1 negatif, 9 pozitif sonuç alınmıştır (Tablo 3). Total kist hidatik sıvısı antijeninin kullanıldığı ELISA çalışmalarında ise şu sonuçlar alınmıştır; Diğer hastalıklarla enfekte hasta insan serumlarından, 68 ve 116 kda da pozitif sonuç veren 1 toxocariosis ve 1 trichinellosisli hasta serumları total kist sıvısı antijeni ile de pozitif sonuç verirken diğer 4 serumla negatif sonuçlar alınmıştır. Aynı şekilde yine total kist sıvısı antijeni kullanılarak negatif hasta serumları ile yapılan ELISA çalışmalarında 2 yalancı pozitif ve 8 negatif sonuç alınmıştır. Kist hidatik pozitif insan serumlarının aynı antijen ile ELISA da çalışmaları sonucu 1 negatif, 9 pozitif sonuç alınmıştır (Tablo 3).
Tablo 1. Kist hidatik pozitif fare serumları ELISA sonuçları Serum No 8 kda 68 kda 116 kda Total kist sıvısı Pozitif 1 + + + + Pozitif 2 + + + + Pozitif 3 + + + + Pozitif 4 + + + + Pozitif 5 + + + + Pozitif 6 + + + + Pozitif 7 + + + + Pozitif 8 + + + + Pozitif 9 + + + + Pozitif 10 + + + + Pozitif 11 + + + + Pozitif 12 + + + + Pozitif 13 + - + - Pozitif 14 + + + + Pozitif 15 + + + + Pozitif 16 + + + + Pozitif 17 + + + + Pozitif 18 + + + + Pozitif 19 + + + + Pozitif 20 -/+ + + + Pozitif 21 + + + + Pozitif 22 + + + + Pozitif 23 + + + + Pozitif 24 + + + + Pozitif 25 + + + +
Tablo 2. Kist hidatik negatif kontrol fare serumları ELISA sonuçları Serum No 8 kda 68 kda 116 kda Total kist sıvısı Negatif 1 - - - - Negatif 2 - - - - Negatif 3 - - - - Negatif 4 - - - + Negatif 5 - - - - Negatif 6 - - - - Negatif 7 - - - - Negatif 8 - - - - Negatif 9 - - - - Negatif 10 - - - -/+ Negatif 11 + + + + Negatif 12 - - - - Negatif 13 - - - - Negatif 14 + + + + Negatif 15 + + + + Negatif 16 -/+ -/+ -/+ + Negatif 17 + + + + Negatif 18 - -/+ - -/+ Negatif 19 - - - - Negatif 20 - - - - Negatif 21 - - - - Negatif 22 - - - - Negatif 23 - - - - Negatif 24 - - - - Negatif 25 - - - -
Tablo 3. Kist hidatik pozitif, negatif ve bazı paraziter hastalıklı enfekte insan serumları ELISA sonuçları Serum No Kit 1 Kit 2 8 kda 68 kda 116 kda Total kist sıvısı Trichinellosis1 -/+ - - + + + Trichinellosis2 - - - - - - Toxocariosis 1 -/+ + + + + + Toxocariosis 2 - - - - - - Fasciolosis 1 - - - - - - Fasciolosis 2 - - - - - - Hidatidosis Poazitif 1 + + + + + + Poazitif 2 + + + + + + Poazitif 3 + + + + + + Poazitif 4 -/+ + + + + + Poazitif 5 -/+ -/+ + + + + Poazitif 6 - - + + + + Poazitif 7 + + - + - - Poazitif 8 + + + + + + Poazitif 9 + + + + + + Poazitif 10 - + + + + + Negatif 1 + - - - - - Negatif 2 -/+ - - + - - Negatif 3 - - - - - - Negatif 4 - - - - - + Negatif 5 - - - - - - Negatif 6 - - - - - - Negatif 7 - - -/+ + + + Negatif 8 - - - - - - Negatif 9 + - - - - - Negatif 10 -/+ - - - - -
V. Sonuç ve Öneriler Koyun karaciğer kist hidatik sıvısından pürifiye edilen 8, 68 ve 116 kda luk immunreaktif proteinler ile total kist sıvısının antijen olarak kullanıldığı ELISA çalışmalarında, farelerde 116 kda protein ile kist hidatik pozitif serumlarda %100 sonuç alınırken, 8 kda, 68 kda ve total antijenlerin üçünden de %96 başarılı, 8 kda ile %4 şüpheli, 68 kda ve total antijen ile %4 yanlış negatif sonuç alınmıştır. Negatif fare serumları ile yapılan ELISA çalışmalarından da en başarılı sonuç alınan iki antijenden birisinin pozitif serumlarda %100 başarılı çalışan 116 kda luk protein olduğu diğerinin de 8 kda luk protein olduğu belirlenmiştir. Negatif serumlardan ise bu iki protein ile yapılan ELISA testlerden %80 beklenen negatif sonuç alınmıştır. 8 ve 116 kda luk antijenlerle negatif serumlardan ayrıca %4 şüpheli ve %16 yalancı pozitif sonuç alınmıştır. Pürifiye 68 kda protein ile negatif serumların ELISA çalışmasında %76 beklenen negatif sonuç alınırken, şüpheli %8, pozitif %16 sonuç kaydedilmiştir. Total antijenle çalışılan negatif serumlardan ise, %68 negatif, %8 şüpheli, %24 pozitif sonuç alınmıştır. Aynı antijenlerle insan kist hidatik pozitif ve negatif serumlarla yapılan ELISA çalışmalarında kist hidatik negatif ancak bazı paraziter hastalıkları olan insan serumlarının 1.ticari kit ile 2. ticari kitin her ikisinden de %66.6 beklenen negatif sonuç alınırken 1.ticari kit %33.3 şüpheli sonuç, 2.ticari kit %33.3 yalancı pozitif sonuç vermiştir. Hazır kitlere benzer şekilde tüm pürifiye proteinler (8, 68 ve 116 kda) ve total kist sıvısının antijen olarak kullanıldığı kist hidatik negatif ancak bazı paraziter hastalıkları olan insan serumlarının ELISA çalışmalarında %66.6 beklenen negatif sonuçlar alınırken, tümünden %33.3 yalancı pozitif sonuç alınmıştır. Pozitif insan serumları ile yapılan test sonuçlarında ise %100 pozitif sonuçlu 68 kda luk proteinin en iyi çalışan protein olduğu gözlenmiştir. Aynı proteinle çalışılan negatif serumlarda ise %80 beklenen negatif sonuç alınırken %20 yalancı pozitif sonuç alınmıştır. Pozitif insan serumlarında total sıvı antijeni, 8 kda ve 116 kda pürifiye proteinlerin antijen olarak kullanıldığı ELISA çalışmalarının hepsinden %90 beklenen pozitif %10 negatif sonuçlar alınmıştır. Negatif insan serumları ile yapılan ELISA test çalışmalarında total antijende %80 beklenen negatif, %20 yalancı pozitif sonuç alınırken 8 ve 116 kda proteinlerle %90 beklenen negatif ve %10 pozitif sonuç alınmıştır. Hazır ticari kitler ile pozitif ve negatif kist hidatik insan serumlarının ELISA çalışmaları sonucunda, pozitif serumlarda 1.kit ile %60 pozitif, %20 şüpheli, %20 negatif sonuç alınmıştır. Aynı kitin negatif serumlardaki oranları %60 negatif, %20
şüpheli, %20 yalancı pozitif olarak belirlenmiştir. 2.kit ile pozitif serumların çalışılması sonucunda %80 beklenen pozitif, %10 şüpheli, %10 negatif sonuçlar alınmıştır. Aynı kit ile çalışılan negatif serumlarda ise %100 beklenen negatif sonuç alınmıştır. Çalışma sonuçlarından anlaşılacağı üzere insanlarda özellikle pürifiye proteinlerle yapılan ELISA testlerinden, bazen ticari kitlerden daha değerli, gerçek sonuçlar alınmıştır. Farelerde yapılan çalışmalarda da yüksek oranlarda beklenen sonuçlar alınmış ancak 116 kda proteinin diğer antijenlere göre biraz daha doğru sonuçlar verdiği gözlenmiştir. VI. Kaynaklar 1. Altıntaş, A. (1991). SDS-Polyacrylamide gel elektroforezi ile proteinlerin separasyonu. T. Parazitol. Derg., 2:119-129. 2. Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. (1998). Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Appl. Biochem. Biotechnol., 69: 11-6. 3. Aykol, F. (1986). Tabii Enfekte Koyunlarda Kist Hidatiğin Counterimmuno-electrophoresis (CIEP) ve Çift Diffüzyon Testlerle Karşılaştırmalı Teşhisi. Ankara Üniv. Sağlık Bilim. Enst. Yüksek Lisans Tezi, Ankara. 4. Barış, İ., Şahin, A., Bilir, N., Kalyoncu, A.F., Emri, A.S., Akhan, O., Barış, B., Çopur, A.S., Selçuk, Z.T. (1989). Hidatik Kist Hastalığı ve Türkiye' deki Konumu. Türkiye Akçiğer Hastalıkları Vakfı Yayını No:1, Ankara. 5. Bono, J.L., Legendre, A.M., Scalarone, G.M. (1995). Detection of antibodies and delayed hypersensitivity with Rotofor preparative IEF fractions of Blastomyces dermatitidis yeast phase lysate antigen. J. Med. Vet. Mycol., 33:209-14. 6. Chamekh, M., Facon, B., Dissous, C., Haque, A., Capron, A. (1990). Use of a monoclonal antibody specific for a protein epitope of Echinococcus granulosus antigen 5 in a competitive antibody radioimmunoassay for diagnosis of hydatid disease. J. İmmunol. Methods, 134:129-137. 7. Doğanay, A., Burgu, A., Gönenç, B., Sarımehmetoğlu, O. (2000 ). Koyun kist hidatik protoskolekslerinin protein yapısının analizi ve spesifik antijenlerinin saptanması. Ankara Univ. Vet. Fak. Derg., 47: 67-75. 8. Facon, B., Chamekh, M., Dissous, C., Capron, A. (1991). Molecular cloning of an Echinococcus granulosus protein expressing an immunogenic epitope of antigen 5. Mol. Biochem. Parasitol., 45:233-240. 9. Fadwa, M.A., Knobloch, J. (1989). Isolation and partial characterization of species-spesific and cross-reaktive antigens of Echinoccoccus granulosus cyst fluid. Mol. Biochem. Parasitol.,
37:101-108. 10. Furster, C., Zhang, J., Toll, A. (1996). Purification of a 3beta-hydroxy-delta5-C27-steroid dehydrogenase from pig liver microsomes active in major and alternative pathways of bile acid biosynthesis. J. Biol. Chem., 271: 20903-7. 11. Genç, S. (1976). İnsan hidatidozu tanısında pasif hemaglutinasyon ve Weinberg reaksiyonlarının değeri. Mikrobiyoloji Bülteni., 10:215-231. 12. Güralp, N. (1981). Helmintoloji. Ankara Üniv. Vet. Fak.Yayınları 368. İkinci baskı. 13. Heath, D.D., Lawrence, S.B. (1996). Antigenic polypeptides of Echinococcus granulosus oncospheres and definition of proctetive molecules.parasite İmmunol., 18:347-357. 14. Hira, P.R., Hahr, G.M., Shweiki, H.M., Behbehani, K. (1990). An enzyme-linked immunosorbent assay using an are 5 antigen for the diagnosis of cystic hidatid disease. Ann. Trop. Med. and Parasitol., 2:157-162. 15. Iacovoni, J.S., Russell, P., Gaits, F., Berthelsen, J., Kilstrup-Nielsen, C., Blasi, F., Mavilio, F., Zappavigna, V. (1999). The subcellular localization of PBX1 and EXD proteins depends on nuclear import and export signals and is modulated by association with PREP1 and HTH. Genes Dev., 15;13:946-53. 16. Kanwar, J.R., Kaushık, S.P., Sawhney, I.M.S., Kamboj, M.S., Mehta, S.K., Vınayak, V.K. (1992). Specific antibodies in serum of patients with hydatidosis recognised by immunoblotting. J. Med. Microbiol., 36:46-51. 17. Köksal, F., Serin, M.S., Kekeç,Y., Sadr, Y.E. (1995). İnsan ve hayvan kökenli kist hidatik sıvılarının SDS-PAGE metoduyla analizi ve Westernblot metodunun klinik önemi. T. Parazitol. Derg., 19:221-229. 18. Leggatt, G.R., McManus, D.P. (1994). Identification and diagnostic value of a major antibody epitope on the 12 kda antigen from Echinococcus granulosus (hydatid disease) cyst fluid. Parasite Immunol., 16:87-96. 19. Macey, M.G., McCarthy, D.A., Davies, C., Newland, A.C. (1997). The Q-Prep system: effects on the apparent expression of leucocyte cell surface antigens. Cytometry, 30:67-71. 20. Maddıson, S.E., Slemenda, S.B., Schantz, PM., Fried, J.A., Wilson, M., Tsang, V. (1989). A specific dıoagnostic antigen of Echinococcus granulosus with an apparent molecular weight of 8 kda. Am. J. Med. Hyg., 40:377-383. 21. March, F., Enrıch, C., Mercader, M., Sanchez, F., Munoz, C., Coll, P., Prats, G. (1991). Echinococcus granulosus: Antigen characterization by chemical treatment and enzymatic deglycosylation. Exp. Parasitol., 73:433-439. 22. Morris, D.L., Richards, K.S. (1992). Hydatid Disease.Butterworth-Heinemann Ltd.Linacre
House, Jordan Hill, Oxford OX2 8DP. 23. Njeruh, F.M., Okela, G.B.A., Gathuma, J.M. (1989). Usefulness of ındırect haemoglutination (IHA) and enzyme-linked ımmonosorbent assay (ELISA) in the diagnosis of human hydatidosis. E. Afr. med. J., 66:310-314. 24. Nore, B.F., Harrison, M.A., Keen, J.N., Allen, J.F. (1994). Partial purification of a cyanobacterial membrane protein with amino terminal sequence similarity to the N- methylphenylalanine pilins. Acta Chem. Scand., 48: 578-81. 25. Orti, B.L., Diez, S., Uran, M.E., Rivas, J.M., Romero, M., Caicedo, V., Restrepo, A., McEwen, J.G. (1998). Use of the 27-kilodalton recombinant protein from Paracoccidioides brasiliensis in serodiagnosis of paracoccidioidomycosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 5:826-30. 26. Park, Y.H., Lee, S.S. (1994). Identification and characterization of capsaicin-hydrolyzing enzymes purified from rat liver microsomes. Biochem. Mol. Biol. Int., 34: 351-60. 27. Pelegri, C., Rodriguez-Palmero, M., Morante, M.P., Comas, J., Castell, M., Franch, A. (1995). Comparison of four lymphocyte isolation methods applied to rodent T cell subpopulations and B cells. J. Immunol. Methods, 187: 265-71. 28. Peritt, D., Flechner, I., Okunev, E., Yanai, P., Halperin, T., Treves, A.J., Barak, V. (1992). The M20 IL-1 inhibitor. I. Purification by preparative isoelectric focusing in free solution. J. Immunol. Methods, 155: 159-65. 29. Profumo, E., Ortona, E., Rıgano, R., Gıoıa, I., Notargıacomo, S., Ioppolo,S., Sıracusano, A. (1994). Cellular and humoral responses to antigenic subunits of Echinoccocus granulosus cyst fluıd in hydatid patients. Parasite Immunol., 16:393-398. 30. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Manniatis, T. (1989). Molecular Coloning: A Loboratory Manual,15.section, p.18.47-18.76. Cold. Spring Harbor, NewYork. 31. Sanchez, F., March, F., Mercader, M., Coll, P., Munoz, C., Prats, G. (1991). İmmunochemical localization of major hydatid fluid antigens in protoscoloces and cyst of Echinococcus granulosus from human origin. Parasite Immunol., 13: 583-592. 32. Sarımehmetoğlu, H.O., Kubar, A., Tanyüksel, M., Gün, H. (1998). Koyun karaciğer kist sıvısından 8 k Da luk antijenin purifikasyonu. T. Parazitol. Derg., 22: 137-141. 33. Sharma, S.D., Mullenax, J., Araujo, F.G. (1987). Westernblott analysis of the antigens of T. gondii recognized by human IgM antibodies. J. Immunol., 131:977-978. 34. Su, X., Prestwood, A.K. (1991). Dot Elisa minicry westernblott test for the detection of swine trichinellosis. J. Parasitol., 77:76-82. 35. Şaşmaz, E., Hashenpoor, G.R., Bahiar, İ.H., Yuluğ, N. (1995). Echinococcus granulosus un karşılaştırmalı antijenik analizi. T. Parazitol. Derg., 19: 83-87.
36. Şenlik, B. (1998). Bursa Yöresi Koyunlarda Indirekt Floresan Antikor (IFA) ve Indirekt Hemaglutinasyon (IHA) Testleriyle Hidatidoz un Sero-Prevalansı Üzerine Araştırmalar. Uludağ Üniv. Sağlık Bilim. Enst., Doktora Tezi, Bursa. 37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordan, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350. 38. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Zaccolo, M., Neri, D., Bjorck, L., Mariani, M. (1994). Recombinant proteins L and LG. Two new tools for purification of murine antibody fragments. Cell Biophys., 24-25:27-36. 39. Yalçıntaş, İ., Çolakoğlu, S. (1973). Kist hidatik teşhisinde indirekt hemaglutinasyon testinin değeri. Çukurova Üniv. Tıp. Fak. Derg., 3:152-155. 40. Yazıcıoğlu, A., Dinçer, H. (1971). Kist hidatik ve Weinberg reaksiyonu. Mikrobiyoloji Bülteni, 5:273-281.