T.C GIDA TARIM VE HAYVANCILIK BAKANLIĞI PENDİK VETERİNER KONTROL ENSTİTÜSÜ DNA Dizileme (Sekanslama) Dr. Eray ATIL Vet. Hekim, Mikrobiyolog Pendik Veteriner Kontrol Enstitüsü
Eğitim Bilgileri Eğitim süresi 3 ay Başlangıç Tarihi 08 Aralık 2013 Bitiş Tarihi 7 Mart 2014 Ülke Yer İngiltere Leicester University Bölüm Infection, Immunity and Inflammation Danışman Dr. Ahmet Yeşilkaya 2
PENDİK VETERİNER KONTROL ENSTİTÜSÜ Moleküler Genetik Laboratuvarı Kuruluş yılı : 2011 ABI Sistem ABI 3130 XL Genetik Analizör DNA Sekanslama 3
DNA Çeşitliliğinin Analiz Edilmesinde Kullanılan Metotlar Restriksiyon Enzimleri PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs) AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) VNTR (Variable Number Tandem Repeats) DNA Dizileme SNP (Single Nucletide Polymorphism) ACGTGACTGAGGACCGTG CGACTGAGACTGACTGGGT CTAGCTAGACTACGTTTTA TATATATATACGTCGTCGT ACTGATGACTAGATTACAG ACTGATTTAGATACCTGAC TGATTTTAAAAAAATATT 4
DNA Dizileme Metotları Sanger Metodu Maxam&Gilbert metodu True single molecule sequencing, Strand sequencing ve diğer metotlar - Metodun Prensibi - Enzimatik bir metod - ddntp lerin rastgele DNA zincirine bağlanmasına dayalıdır. - DNA polimeraz ve primer gerektirir. - Jel elktroforez ya da kapillar elektroforez gerektirir 1980 Nobel Ödülü 5
Standart Dizileme Prosedürü (Sanger) 1)DNA tek zincir olarak hazırlanır 2)Karışım 4 normal deoksinükleotid içerir (dgtp, datp, dttp, dctp) 3)Aynı karışım 4 dideoksinükleotid herbiri farklı floresan ile etiketlenmiş) (ddgtp, ddatp, ddttp, ddctp) 4) DNA polimeraz 5)Buffer 6
DNA Dizileme Tipleri Tek yönlü okuma Çift yönlü okuma Ters tek yönlü zincir okuma 7
Yeni Nesil DNA Dizileme Sistemleri 8
DNA Dizileme Kullanım Alanları Genom haritalarının çıkarılması Bireysel genotipin tanımlanması DNA Polimorfizminin tespit edilmesi Genetik çeşitlilik çalışmaları Filogenetik çalışmalar Ebeveyn ve akrabaların tespiti Kantitatif özellikteki gen lokuslarının saptanması Hastalık ve genetik bozuklukların teşhisi Adli tıp çalışmaları Moleküler arkeoloji 9
DNA Dizileme (Şimdiye kadar yapıalanlar) Viruslar 3222 (Bacteriophage phi X 174, 5386 nt 1977) Bakteriler 2289 (Haemophilus influenza, 1.8 x 10 6 nt 1995) Ökaryotlar 68 (S. cerevisiae 1.2 x 10 7 nt 1995; H. sapiens, 3 x 10 9 nt -2001) Archaea 152 (Methanococcus jannaschi, 1.7 x 10 6 nt 1996) 10
Moleküler Biyolojinin Temel Prensibi DNA James Watson a göre RNA Protein Elimizde genomik DNA varsa, dizinin ait olduğu tür hakkında bütün bilgiye sahip olmalı mıyız? 11
Filogenetik: Evrimsel geçmiş Evrimsel geçmiş Mutasyonlar Moleküler saat Kullanıldığı alanlar Genler arası etkileşim çalışmaları İlaçların dizaynı Aşı çalışmalarında suş değişilikliğinde Genetik ve bulaşıcı hastalıkların epidemiyolojisi Yeni genlerin tespiti 12
Filogenetik İlişki Ağaçları Root Bütün soy için ortak ata Branch Soy ve atasal ilişkiyi gösterir. Branch lenght Mevcut dalda meydana gelen değişiklikleri gösterir. Node Mevcut ya da kaybolmuş türü işaret eden birimdir. Clade Ortak ataları olan her iki soydan birisi. Distance scale Organizma ya da diziler arası farkları temsil eden birimdir. Topology Ağacın dallanma biçimi 50 44 50 79 64 AM911076 /Slovakia/06 62 EU443551/Czech Republic/06 52 A/chicken/Turkey/Enez ist929/2006 A/chicken/Turkey/Taflan ist15/2006 59 49 A/chicken/Turkey/Esetce ist986/2006 51 A/chicken/Turkey/Ipsala/563/2008 94 58 36 AM911090-Slovenia-06 AM911100/Slovenia/06 DQ407519/Turkey/05 99 EF619980/Turkey/05 A/chicken/Turkey/Sirapinar ist706/2006 EF446771/Hungary/07 96 EF446779/Hungary/07 DQ323672/Russia/05 DQ449632/Russia/05 EF619990/Turkey/06 95 65 A/chicken/Turkey/Misinli ist582/2006 A/chicken/Turkey/Hilvan ist271/2005 47 56 92 DQ434889/Russia/05 DQ449640/Russia/05 A/chicken/Turkey/Goncaaydin ist982/2006 43 83 A/chicken/Turkey/B.Cekmece ist980/2006 A/chicken/Turkey/Silivri ist962/2006 92 DQ358746/Russia/05 AM492165/Germany/06 DQ095617/Qinghai/05 A/bird/Turkey/Unye ist06/2006 78 A/seagull/Turkey/Cayeli ist04/2006 96 62 50 38 EF362418/India/06 EF362426/India/06 DQ864715/Russia/06 82 76 A/chicken/Turkey/Baklali ist955/2006 DQ864720/Russia/06 0.001 13
Filogenetik Network Analizi Filogenetik ağaçlar evrimsel model için uygun olmadığında, Kompleks evrimsel biçimlerin görsel hale getirilmesinde Verilerin derinlemesine incelenmesinde kullanılır. A phylogenetic network. The network was generated by Neighbor-Net for a sequence-based data set comprising of Salmonella isolates. Bryant et al. Algorithms for Molecular Biology 2007 2:8 doi:10.1186/1748-7188-2-8 14
Filogenetik Analiz Yaparken Kabul Edilen Varsayımlar Nükleotid dizisi hata içermemektedir. Analizde kullanılan diziler homologdur. Ortak evrimsel ilişkiye sahiptir. Nükleotid dizileri arasındaki farklılıklar daha büyük bir grubun temsilcisidir. Her bir nükleotid için 4 olasılık vardır, Bir nükleotidin diğer 3 nükleotide değişme olasılığı eşittir(jukes Cantor) 15
Dizi Analizi Gerekli Araçlar Bioedit Dizilerin hizalanması, BLAST araştırması, plasmid çizimi, RE site haritalandırması, ABI ve Beckman chromatogram dosyalarının görselleştirilmesi için kullanılır. http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html ChromasPro ABI ve Beckman kromatogram dosyalarının görselleştirilmesi, çoklu kromatogram dosyalarının açılması hizalanması, enzim kesimi haritalandırılması, ABI Genescan dosyalarının gösterilmesi için kullanılabilir. http://technelysium.com.au/?page_id=27 ClustalW2 Çoklu dizilerin hizalanması için kullanılır. http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/ 16
Moleküler evrim ve filogenetik analiz için gerekli araçlar DnaSP Populasyon içi ve dışı dizi farklılaşması ve diğer populasyon istatistiklerinin hesaplanmasında kullanılır. http://www.ub.edu/dnasp/ MEGA Otomatik veya manuel dizi hizalaması, filogenetik ağaçlardan sonuç çıkarılması, web tabanlı veritabanlarında araştırma yapmak, moleküler evrim ve evrimsel hipotezleri test etmek için kullanılır. http://www.megasoftware.net/ NETWORK DNA dizisi, STR, RFLP ve aminoasit verileri ile filogenetik ilişki örgüsü (median-joining network) yapabilmek için kullanılır http://www.fluxus-engineering.com/sharenet.htm SplitsTree4 Dizi verilerinden evrimsel ilişki örgüsü yapar. (Alignment, distance ve ağaç setleri giriş değeri olarak kullanılarak, split decomposition, neighbor-net, consensus network metotları ile çalışılabilir. http://www.splitstree.org/ 17
Yardımcı Programlar BLAST Dizileri arasındaki benzer bölgeleri tespit etmek, benzerlikleri istatistiksel olarak hesaplamak, elde edilen DNA veya protein dizilerini başka kaynaklarla araştırmak için kullanılır. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi TreeView Yeniden Yapılandırılan filogenetik ağaçları görselleştirmek için kullanılır. http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html 18
Teşekkür Ederim İletişim: Batı Mahallesi Erol Kaya Cad. No:1 34890, Pendik/İSTANBUL Telefon: 0 216 390 12 80, Fax: 0 216 354 76 92 E-posta : eray.atil@gthb.gov.tr 19