ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAZI GEÇİŞ METALLERİNİN METİL LİNOLEAT IN YÜZEY OKSİDASYONU ÜZERİNE ETKİSİ Yasemin KÖPRÜCÜOĞLU GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANA BİLİM DALI ANKARA 2008 Her Hakkı Saklıdır

ÖZET Yüksek Lisans Tezi BAZI GEÇİŞ METALLERİNİN METİL LİNOLEATIN YÜZEY OKSİDASYONU ÜZERİNE ETKİSİ Yasemin KÖPRÜCÜOĞLU Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Aziz TEKİN Çalışmada farklı geçiş metallerinin metil linoleatın yüzey oksidasyonu üzerine etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla, %5 oranında iç standart (metil palmitat) içeren metil linoleat; 200 ile 400 ppm demir, 2 ile 4 ppm bakır, 200 ile 400 ppm titanyum ve 20 ile 40 ppm vanadyum yüklenmiş silika jel-h lara tek tabaka olarak yüklenmiş ve 25, 40 ve 60 o C da oksidasyona bırakılmıştır. Her mineral madde ve bunların farklı miktarlardaki uygulamaları için; düşük sıcaklıklarda daha yüksek peroksit sayısı ölçülürken, sıcaklık arttıkça en yüksek peroksit sayısına daha kısa zamanda ulaşıldığı görülmüştür. Bunun nedeni; düşük sıcaklıklarda metil linoleatın daha yavaş bir şekilde parçalanması, hidroperoksitlerin düşük sıcaklıklara daha dayanıklı olması ve en yüksek peroksit sayısına ulaştıktan sonra hidroperoksitlerin parçalanma hızının daha yavaş bir şekilde gerçekleşmesi olarak düşünülmektedir. Tüm sıcaklık ve mineral uygulamalarında; okside olmadan ortamda kalan metil linoleatın doğal logaritmik değerlerine karşılık çizilen grafiklerden, oksidasyonun; diğer çalışmalarda belirtildiği gibi birinci dereceden kinetik kurallarına uyduğu görülmüştür. Elde edilen grafiklerden hesaplanan hız sabitlerine göre; sıcaklık ve silika jel-h a ilave edilen mineral madde miktarı arttıkça genel olarak hız sabitlerinin de arttığı görülmüştür. Kloroform ekstraktından elde edilen metil linoleatın oksidasyon ürünleri gaz kromatografisinde incelenmiştir. Tanımlanan ürünler, gaz kromatografisindeki geliş sürelerine göre sırasıyla; epoksi (E-YAME), hidroksi (H-YAME), hidroksi-epoksi (HE-YAME) ve dihidroksi (DH-YAME) yağ asidi metil esterleridir. Farklı mineral madde ve sıcaklık uygulamalarına göre; peroksit sayısının yüksek olduğu noktalara yakın sürelerde toplam tanımlanan ürünlerin yüzdelerinde de yükselme gözlenmiştir. Ayrıca 25 o C da yüksek peroksit sayısının görüldüğü noktalarda toplam tanımlanan ürünleri H-YAME ve HE-YAME leri oluştururken, 60 o C da ise bu ürünler E-YAME ve HE-YAME olarak belirlenmiştir. Genel olarak; sıcaklığın düşmesiyle, oluşan H-YAME lerin yüzdelerinde artış saptanmış olup, her üç sıcaklıkta da en yüksek H-YAME yüzdelerine peroksit sayısının en yüksek olduğu noktalarda ulaşıldığı ve bu noktadan sonra da belirgin bir şekilde azaldığı görülmüştür. Mart 2008, 77 sayfa Anahtar Kelimeler: Yüzey oksidasyonu, geçiş metalleri, oksidasyon ürünleri i

ABSTRACT Master Thesis EFFECT OF SOME TRANSITION METALS ON THE MONOLAYER OXIDATION OF METIL LINOLEAT Yasemin KÖPRÜCÜOĞLU Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. Aziz TEKİN In this work, effects of various transition metals on surface oxidation of methyl linoleate. For his aim, methyl linoleat with 5% by weight of methyl palmitate as an internal standart was deposited as a monolayer on Silika jel-h that was charged with 200-400 ppm iron, 2-4 ppm copper, 20-40 ppm vanadium and 200-400 ppm titanium and oxidized at 25, 40 and 60 o C. For each minerals and their various quantites, the peroksit value (PV) reached their maximum values in shorter times as the temperature increased, but lower temperatures gave greater PV maxima. It was considered that methyl linoleat was decomposed slowly and the hydroperoxides survived better at the lower temperatures. Hydroperoxide decomposition after reaching the PV maxima was also slower at lower temperatures. For all the temperatures and minerals, oxidation of methyl linoleat followed first-order kinetics. Generally, rate constants increased as the temperature and mineral substances that added to silika jel-h increased. The oxidation products of metyhl linoleat recovered from the chloroform-acetic acid layer were analyzed by gas chromatografy. According to retention times, respectively, the chief non-scission products (NSP) of linoleat oxidation were hydroxy (H-FAME), hydroxyepoxy (HE-FAME) and dihydroxy (DH-FAME) fatty acid methyl esters. At all temperatures and for each minerals, the largest NSP concentrations occured near the time of the greatest PV. The main components at the greatest PV at 25 o C, 60 o C were H-FAME, HE-FAME and E-FAME, HE-YAME, respectively. Generally, concentration of H-FAME was increased as the temperature was decreased. At all temperatures, the largest H-FAME concentration occurred near the time of the greatest PV and then it was clearly declined. March 2008, 77 pages Key Words: Surface oxidation, transition metals, oxidation products ii

TEŞEKKÜR Bu tez konusunun belirlenmesinde ve çalışmalarım sırasında yardımlarını esirgemeyen danışmanım ve değerli hocam sayın Prof.Dr.Aziz TEKİN e, laboratuvar çalışmalarımda gerek hoca gerekse bir abla olarak her zaman desteğini gördüğüm Araş. Gör. Eda ÇİĞDEM ÇALIKOĞLU na, laboratuvarda çalışmalarımızı birlikte yürüttüğümüz arkadaşım Gıda Y. Müh. Aslı YORULMAZ a, bütün mesai arkadaşlarıma ve her zaman bana destek veren aileme teşekkürlerimi sunarım. Bu 20050745036 no.lu çalışma Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (BAP) tarafından desteklenmiştir. Yasemin KÖPRÜCÜOĞLU Ankara, Mart 2008 iii

İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR...iii SİMGELER DİZİNİ... vi ŞEKİLLER DİZİNİ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ...viii 1. GİRİŞ... 1 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1 Oksidasyon... 2 2.1.1 Oksidasyon mekanizması... 2 2.1.1.1 Serbest radikal oluşumu... 3 2.1.1.2 Hidroperoksit oluşumu... 4 2.1.1.3 Parçalanma ve oksidasyon ürünlerinin oluşumu... 5 2.1.2 Oksidasyon hızı... 7 2.1.3 Oksidasyonu etkileyen faktörler... 8 2.1.3.1 Yağ asidi bileşimi... 8 2.1.3.2 Oksijen konsantrasyonu ve sıcaklık... 9 2.1.3.3 Yüzey alanı... 10 2.1.3.4 Nem... 10 2.1.3.5 Radyan enerji... 10 2.1.3.6 Antioksidanlar... 11 2.1.3.7 Prooksidanlar... 12 2.2 Metallerin Katalizlediği Lipit Oksidasyonu... 13 2.2.1 Metaller tarafından katalizlenen oksidasyonun mekanizması... 13 2.2.2 Metaller tarafından katalizlenen oksidasyonun kinetiği... 18 2.2.3 Metal katalizini etkileyen faktörler... 20 2.2.3.1 Konsantrasyon... 21 2.2.3.2 Ortamın polarite ve ph sı... 21 2.2.3.3 Antioksidanlar ve prooksidanlar... 24 2.2.3.4 Yağ-su emülsiyonlarındaki metalin konumu... 29 2.2.3.5 Sıcaklık... 31 2.2.3.6 Anyonlar... 31 2.2.3.7 Metallerin sinerjitik etkisi... 32 2.2.4 Metal katalizi üzerine ligandların etkisi... 32 2.2.4.1 Gıdalarda kullanılan temel şelatlama ajanları... 33 2.2.4.2 Fenolik bileşikler... 35 2.2.4.3 Askorbik asit... 37 2.2.4.5 Fosfolipitler... 38 2.2.4.6 Aminoasitler ve peptitler... 39 2.2.5 Yemeklik yağların metaller tarafından katalizlenen otoksidasyonu... 39 2.3 Yağların Yüzey Oksidasyonu ve Oluşan Ürünler... 42 2.3.1 Yüzey oksidasyonunda destek maddelerinin yapısı... 42 2.3.2 Yüzey oksidasyon hızı ve yüzey oksidasyonunda oluşan ürünler... 44 3. MATERYAL VE YÖNTEMLER 3.1 Materyal... 47 iv

3.2 Yöntem 3.2.1 Silika jel-h ın yakılması... 47 3.2.2 Silika jel-h a mineral maddelerin yüklenmesi... 48 3.2.3 Örnek hazırlanması... 51 3.2.4 Peroksit sayısı... 52 3.2.5 Oksidasyon ürünlerinin belirlenmesi... 52 4. BULGULAR VE TARTIŞMA... 53 5. SONUÇ... 72 KAYNAKLAR... 75 ÖZGEÇMİŞ... 77 v

SİMGELER DİZİNİ a w su aktivitesi 3,4- DHPEA 3,4-dihidroksifeniletanol ceps cis-9,10-epoksi stearik asit p-hpea p-hidroksifenil etanol AsAH 2 askorbik asit BHA bütillenmiş hidroksi anizol BHT bütillenmiş hidroksi toluen DH-YAME dihidroksi yağ asidi metil esteri DPPH 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil DTAB dodesiltrimetilamonyum bromür EDTA etilendiamintetraasetikasit EPHS cis-9,10-epoksi-12-hidroksi stearat E-YAME epoksi yağ asidi metil esteri FRAP demir-indirgeyici antioksidan potansiyel H-YAME hidroksi yağ asidi metil esteri HE-YAME hidroksi- epoksi yağ asidi metil esteri ML metil linoleat NDGA nordihidroguayenet asidi PG propil gallat PUFA polyunsaturated fatty acid (çoklu doymamış yağ asidi) PÜ parçalanma ürünü PV peroksit sayısı RH lipit ROOH lipit hidroperoksiti SDS sodyum dodesil sülfat SPI soya proteini izolatı STPP sodyumtripolifosfat TBHQ tersiyer bütil hidrokinon TO. tokoferoksil radikali TTAB tetradesiltrimetilamonyum bromür TTÜ toplam tanımlanan ürünler TÜ toplam ürün WPI peynir altı suyu protein izolatı vi

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Oksidasyon sırasında oleik, linoleik ve linolenik asitteki aktif radikal oluşum olasılıkları... 3 Şekil 2.2 Aktif oksit ve peroksit radikallerinin yeni aktif radikal oluşturması... 5 Şekil 2.3 Çok değerlikli metaller etkisinde aktif oksit ve peroksit radikallerinin oluşması... 5 Şekil 2.4 Hidroperoksitlerin parçalanması sonucu oluşan ürünler... 6 Şekil 2.5 Mono ve bi-moleküler parçalanma... 6 Şekil 2.6 Epoksitlerin Oluşumu... 7 Şekil 2.7 Dimer oluşumu... 7 Şekil 2.8 Daha yüksek yükteki metal iyonunun serbest radikal ve hidrojen iyonu üretmesi... 14 Şekil 2.9 Hidroksi radikali ile lipit hidroperoksit ve serbest radikal oluşumu... 16 Şekil 2.10 H 2 O 2 ve hidroksil radikallerinin yer aldığı yan reaksiyonlar... 17 Şekil 2.11 Haber-Weiss reaksiyonu... 17 Şekil 2.12 Fe +2 ve Fe +3 ile hidroperoksit dekompozisyonu... 17 Şekil 2.13 Lipit peroksidasyonunda demirin rolü ve ph, oksidasyon ve indirgenmenin etkileri... 22 Şekil 2.14 Alkali çözeltilerde büyük polinüklear demir(iii) iyonlarının oluşumu... 23 Şekil 2.15 Tokoferollerin antioksidan aktiviteleri ve tokoferoksil radikalinin dimer oluşturması... 27 Şekil 2.16 Tokoferoller ve tokoferoksil radikallerinin metal iyonlarını indirgemeleri... 28 Şekil 2.17 Fenol/ demir >1 için, ph 3.5 ve 5.5 da oluşması beklenen ana şelatlar... 36 Şekil 2.18 SDS misellar çözeltisindeki ML oksidasyonu için önerilen mekanizma... 38 Şekil 4.1 Yüzey oksidasyonunda ve farklı bakır ile demir uygulamalarında sıcaklığın linoleik asidin peroksit değeri üzerine etkisi... 53 Şekil 4.2 Yüzey oksidasyonunda ve farklı vanadyum ile titanyum uygulamalarında sıcaklığın linoleik asidin peroksit değeri üzerine etkisi... 54 Şekil 4.3 Yüzey oksidasyonunda ve farklı bakır ve demir uygulamalarında sıcaklığın metil linoleatın oksidasyonu üzerine etkisi... 55 Şekil 4.4 Yüzey oksidasyonunda ve farklı titanyum ve vanadyum uygulamalarında sıcaklığın metil linoleatın oksidasyonu üzerine etkisi... 57 Şekil 4.5 Yüzey oksidasyonunda ve farklı sıcaklıklarda bakır ve demir miktarının linoleik asidin peroksit değerleri üzerine etkileri... 58 Şekil 4.6 Yüzey oksidasyonunda ve farklı sıcaklıklarda titanyum ve vanadyum miktarının linoleik asidin peroksit değerleri üzerine etkileri... 60 Şekil 4.7 Metil linoleatın gaz kromatografisinde analizi sonucu oluşan oksidasyon ürünlerini gösteren kromatogram örneği... 61 vii

ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Serbest radikaller... 2 Çizelge 2.2 C 18 serisi yağ asitlerinin 250 o C da saptanan indüksiyon periyodu ve rölatif oksidasyon hızı... 9 Çizelge 2.3 SDS misellar çözeltisindeasah 2 /Fe(II) kombinasyonu varlığında okside olan ML nin yüzdesi ve oksidasyon hız sabitleri... 27 Çizelge 2.4 Hekzandan adsorbe olan farklı yağ asitlerinin miktarı/silika jel (gram)... 43 Çizelge 2.5 Jel-Doymamış ester oranının etkisi... 44 Çizelge 3.1 Silika Jel-H ın yapısındaki mevcut ve yüklenmesi istenen mineral madde miktarları... 51 Çizelge 4.1 Yüzey oksidasyonunda farklı mineral madde ve sıcaklık uygulamalarına göre metal linoleatın azalma hızının elde edilen hız sabitleri... 56 Çizelge 4.2 Farklı mineral düzeylerinin 25 o C daki linoleik asit metil esterinin yüzey oksidasyon ürünleri üzerine etkisi... 66 Çizelge 4.3 Farklı mineral düzeylerinin 40 o C daki linoleik asit metil esterinin yüzey oksidasyon ürünleri üzerine etkisi... 68 Çizelge 4.4 Farklı mineral düzeylerinin 60 o C daki linoleik asit metil esterinin yüzey oksidasyon ürünleri üzerine etkisi... 70 viii

1. GİRİŞ Yüzey oksidasyonu, ağartma toprağı veya silika jel gibi destek maddeleri üzerine tek tabaka halinde yüklenen yağ veya diğer doymamış yapıdaki bileşiklerin oksidasyonuna verilen isimdir. Yapılan çalışmalarda tek tabaka halinde bulunduğunda yağların oksidasyon hızının maksimum seviyeye ulaştığı (Honn et al. 1951, Slawson et al. 1973) ve normal oksidasyon hızından 10 kat fazla olduğu belirlenmiştir. Ayrıca yüzey oksidasyonu ile oluşan bir kısım ürünler normal oksidasyon ürünlerinden farklıdır. Bu nedenle, yüzey oksidasyonundan sanayi için gerekli bazı ürünlerin daha ucuz maliyetlerle üretilebileceği belirtilmiştir. Wu et al. da (1977) yaptıkları çalışmada, linoleik asitten yüzey oksidasyonuyla önemli oranlarda epoksi asitler üretilebileceğini tespit etmişlerdir. Diğer taraftan titanyum ve vanadyum komplekslerinin epoksidasyon katalizleri olarak kullanılabileceği ifade edilmiştir (Mercier and Agoh 1974, Katsuki and Sharpless 1980). Ancak bu katalizörler yüzey oksidasyonunda henüz denenmemiştir. Bakır ve demirin ise oksidasyonda özellikle hidroperoksitlerin parçalanma hızlarını artırdıkları bilinmektedir. Yapılan çalışmada, farklı geçiş metallerinin (Ti, V, Fe, Cu) silika jel-h üzerine yüklenmiş metil linoleatın oksidasyon hızına ve oluşan ürünler üzerine etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla, söz konusu geçiş elementleri ile birlikte metil linoleat tek tabaka halinde silika jel-h üzerine yüklenmiş ve laboratuvar koşullarında oksidasyona tabi tutulmuştur. Oksidasyon süresince alınan örneklerle, reaksiyon hızı ve oluşan ürünler izlenmiştir. 1

2. KURAMSAL TEMELLER 2.1 Oksidasyon Trigliserit moleküllerinde veya serbest doymamış yağ asitleri ile oksijen arasında meydana gelen kimyasal reaksiyona oksidasyon denir. Oksidasyon ürünleri, hoş olmayan ve istenmeyen tat-kokuya neden olmakta ve yağın beslenme değerini olumsuz bir şekilde etkilemektedirler. Linoleik ve linolenik gibi esansiyel yağ asitleri oksidasyonla parçalanmakta ve yağda çözünür vitaminler kaybolmaktadırlar (Kiritsakis 1998). 2.1.1 Oksidasyonun mekanizması Lipitlerin oksidasyonu, aşağıdaki reaksiyonların meydana geldiği bir serbest radikal zincir reaksiyonudur (Kiritsakis 1998): -Serbest radikallerin oluşumu (initiation) -Hidroperoksitlerin oluşumu (propogation) -Parçalanma ürünlerinin oluşumu, radikal olmayan ürünlerin oluşumu (termination) Çizelge 2.1 Serbest radikaller (Yanishlieva-Maslarova 2001) HO 2 hidroperoksil radikali R lipid radikali (alkil radikali) OH hidroksil radikali ROO lipid peroksil radikali (aktif peroksit) O 2 - süperoksit RO lipid alkoksil radikali (aktif oksit) 2

2.1.1.1 Serbest radikal oluşumu Aralarında allil bağın yer aldığı karbon atomlarındaki hidrojen atomları, bu karbon atomlarına komşu olan karbon atomlarına bağlı olanlardan daha stabildir. Çünkü normal olarak bir metil (-CH 3 ) grubundan bir hidrojenin çözünürlüğü için molekül başına 422 kj luk bir enerji gerekirken, bu değer zincirdeki diğer doymuş bağlarda (-CH 2 -) 410 kj, allil gruba komşu olan karbon atomundan ayrılacak hidrojen için 322 kj ve iki allil grup arasında kalan karbon atomundan ayrılacak hidrojen atomu için 272 kj lük bir enerji olarak saptanmıştır (Kayahan 2003). Oleik asit: -CH 2 -CH=CH-CH 2 - - 8 9 10 11. CH-CH=CH-CH 2 - veya -CH 2 -CH=CH-CH. - -CH=CH-. CH-CH 2 - -CH 2 -. CH-CH=CH- Linoleik asit: -CH=CH-CH 2 -CH=CH- 9 10 11 12 13 [O] -CH=CH-. CH-CH=CH- -. CH-CH=CH-CH=CH- -CH=CH-CH=CH-CH. - Linolenik asit: -CH=CH-CH 2 -CH=CH-CH 2 -CH=CH- 9 10 11 12 13 14 15 16 [O] -CH=CH-. CH-CH=CH-CH 2 -CH=CH- -CH=CH-CH 2 -CH=CH-. CH-CH=CH- -. CH-CH=CH-CH=CH-CH 2 -CH=CH- -CH=CH-CH 2 -CH=CH-CH=CH-. CH- -CH=CH-CH=CH-. CH-CH 2 -CH=CH- -CH=CH-CH 2 -. CH-CH=CH-CH=CH- Şekil 2.1 Oksidasyon sırasında oleik, linoleik ve linolenik asitteki aktif radikal oluşum olasılıkları (Lin 1991) 3

Ortamda oksidasyonu başlatabilecek etkenlerden biri bulunması durumunda doymamış yağ asitlerinde allil grubun sağından veya solundan komşu olan karbon atomlarındaki hidrojenlerden biri iyonlaşarak ve ayrıldığı radikal aktivite kazanır. Ayrıca, allil gruptaki çift bağ yerinde sabit kalabildiği gibi, aktif duruma gelen karbon atomu bu gruba komşu olması nedeniyle labilite kazanarak sağa veya sola kayabilir (Şekil 2.1) (Kayahan 2003). Çoklu doymamış yağ asitlerindeki çift bağlar eğer konjuge yapıda (tung yağı gibi) ise metilen grubunun aktivitesi izolen yapıdaki çift bağların olduğu yağ asidine göre daha yüksektir. Bu nedenle serbest radikal oluşumu daha kolay olmakta ve daha hızlı oksidasyon meydana gelmektedir. Ayrıca çoklu doymamış yağ asitlerindeki çift bağların kayması sonucu izolen yapı konjuge yapıya dönüşmektedir (Şekil 2.1 deki linoleik ve linolenik yağ asitleri). Yağ asitlerinde doğal olarak bulunan çift bağlar normalde cis konfigürasyonundadır. Serbest radikal oluşumu boyunca çift bağların pozisyonundaki değişim ise, daha stabil olan trans konfigürasyonu şeklinde olmaktadır (Lin 1991). 2.1.1.2 Hidroperoksit oluşumu Aktif radikallerin oluşumundan sonra oksidasyon tepkimesi aktif radikallere oksijenin moleküler formda bağlanması ve aktif peroksit radikallerinin oluşması şeklinde gelişmektedir. Aktif peroksit radikalleri, nötr duruma gelebilmek için aynı zincir üzerindeki veya başka bir yağ asidi molekülünün zincirinden labil olan hidrojenlerden birini kendine çekerek bağlarken, hava oksijeninin moleküler halde ve peroksit formunda bağlanabileceği yeni bir aktif radikal oluştuğu için tepkime otokatalitik bir karakter kazanmaktadır (Kayahan 2003). 4

R. + O 2 R-OO. R-OO. + R 1 H R-OOH + R. 1 R-O.. + R 1 H R-OH + R 1 Şekil 2.2 Aktif oksit ve peroksit radikallerinin yeni aktif radikal oluşturması Ayrıca ortamda demir veya bakır gibi çok değerlikli metal iyonlarının bulunması durumunda, meydana gelen hidroperoksitler, bu metal iyonlarının değerliklerinde oluşan indirgenme veya yükseltgenme tepkimelerine bağlı değişim etkisinde kolaylıkla aktif oksit ve peroksit radikallerine dönüşmektedir (Kayahan 2003). M +1 + ROOH RO. + OH - + M +2 M +2 + ROOH ROO. + H + + M + 2ROOH RO. + ROO. + H 2 O Şekil 2.3 Çok değerlikli metaller etkisinde aktif oksit ve peroksit radikallerinin oluşması (Kiritsakis 1998) 2.1.1.3 Parçalanma ve oksidasyon ürünlerinin oluşması Oksidasyonun ilerlemesi ile peroksit sayısı belirli bir değere ulaştığında hidroperoksitler, stabil olmadıkları için kolayca parçalanırlar (Lin 1991, Kiritsakis 1998). Hidroperoksitlerin parçalanması sonucu oluşan ve yağlarda tat ve koku değişimine bağlı olarak kalite düşmesinin göstergesi olan uçucu ikincil ürünler genelde aktif kokulu karbonilli bileşikler (aldehitler ve ketonlar), alkoller ile asitler, alkan ve alken yapısındaki hidrokarbonlar şeklinde üç ana grupta toplanabilirler (Kayahan 2003). 5

H parçalanma R C R R - C - R + H. OH OOH Hidroperoksit O. R O. R. H O O R C=O R C R R C R Aldehit Keton Keton + + + R. R OH R H Serbest Radikal Alkol Yağ Asidi Şekil 2.4 Hidroperoksitlerin parçalanması sonucu oluşan ürünler (Kiritsakis 1998) Ortamda bulunan hidroperoksitlerin konsantrasyonları düşük olduğunda parçalanma mono-moleküler düzeyde gerçekleşirken hidroperoksit konsantrasyonu arttığında parçalanma bi-moleküler düzeyde gerçekleşmektedir (Kiritsakis 1998). ROOH RO. +. OH (mono-moleküler) 2ROOH RO. + ROO. + H 2 O (bi-moleküler) Şekil 2.5 Mono ve bi-moleküler parçalanma Hidroperoksit gruplarının lipitlerde neden olduğu bozulma tepkimelerinden bir kısmının oluşumunda, hidroperoksitteki oksijenlerden birinin daha labil karakter göstermesi rol oynar. Önce yapıdaki labil karakter gösteren oksijen molekülden ayrılarak, onu yine aktif bir radikale dönüştürürken iyonlaşmış olan bu oksijen epoksitleri oluşturur (Kayahan 2003). 6

R-CH 2 -CH-CH=CH-R 1 R-CH 2 -CH-CH=CH-R 1 + O. OOH OH R-CH 2 -CH=CH-CH 2 -R 1 + O. R-CH 2 -CH-CH-CH 2 -R 1 Şekil 2.6 Epoksitlerin oluşumu (Kayahan 2003) O Ayrıca bu aşamada molekül parçalanması görülmeksizin polimerler de oluşabilmektedir: R. + R. RR R. + ROO. ROOR (peroksidimer) ROO. + ROO. ROOR (peroksidimer) + O 2 nadiren Şekil 2.7 Dimer oluşumu (Tekin 2005). ROOOOR (tetraoksidimer) 2.1.2 Oksidasyon hızı Lipitlerin oksidasyonu belirgin bir şekilde iki fazda gerçekleşmektedir, başlangıç fazı ve üssel faz. Başlangıç fazını normal olarak yavaş bir hızda geçtikten sonra oksidasyon, üssel bir şekilde yayılmaktadır (Lin 1991). Başlangıç fazı normalde indüksiyon fazı olarak bilinmekte ve yağların oksidatif stabilitesi veya raf ömrünün başlıca indikatörü olmaktadır. Doğal olarak bulunan veya sonradan ilave edilen antioksidanlar indüksiyon periyodunu uzatmaktadırlar. Ancak tamamen oksidasyonu durduramamaktadırlar. Lipit içeren gıdalarda ilk oksidasyon ürünleri, genellikle belirli bir depolama süresi geçtikten sonra ortaya çıkmaktadır. Oksidasyon üssel faza geçtiğinde yağ hızlı bir şekilde bozulmakta ve oksidasyon durdurulamaz hale gelmektedir (Lin 1991, Kayahan 2003). 7

Oksidasyonun derecesi yağ tarafından adsorbe edilen oksijen miktarı ile ölçüldüğü zaman bu değer başlangıç fazında yavaş bir şekilde artarken, daha sonra oksijen mevcut olduğu müddetçe üssel olarak artmaktadır. Fakat oksidasyonun derecesi peroksit sayısı ile ölçüldüğü zaman başlangıçta, adsorbe edilen oksijen miktarı ile benzerlik gösterirken üssel fazın belirli bir aşamasında hidroperoksitler parçalanmaya başlayacağı için peroksit sayısı düşmektedir (Lin 1991). 2.1.3 Oksidasyonu etkileyen faktörler Oksidasyonda temel faktör olan doymamış yağ asidi dışında ortamdaki ışık, dalga boyu, çok değerlikli metallerin kontaminasyonu, kısmi oksijen basıncı, sıcaklık ve nem gibi depolama koşulları, lipidin oksijenle temas ettiği yüzey genişliği, içerdiği pro- ve antioksidanların etkinlik ve miktarı tepkimelerin başlamasını ve hızlanmasını etkileyen diğer faktörlerdir (Kayahan 2003). Ayrıca ortamda bulunan serbest yağ asitleri de prooksidatif etki göstermektedirler. Oksidasyon sırasında oluşan hidroperoksitler ile yağ asitlerinin karboksil grupları arasındaki kompleks oluşumu hidroperoksitlerin serbest radikallere parçalanmasını hızlandırmaktadır (Yanishlieva-Maslarova 2001). Farklı trigliseritlerin oksidasyon hızı toplam doymamışlık derecesinden çok, her bir trigliseridin yağ asidi bileşimine bağlı olmaktadır. Bir trigliseridin rölatif oksidasyon hızı, yapısında bulunan yağ asitlerinin ayrı ayrı rölatif oksidasyon hızları toplamına eşit olduğu kabul edilmektedir (Lin 1991). 2.1.3.1 Yağ asidi bileşimi Farklı yağ asitlerinin oksidasyon hızını doymamışlığın derecesi ve çoklu doymamış yağ asitlerindeki çift bağların yeri etkilemektedir. Doymamışlığın derecesi arttıkça indüksiyon periyodu azalacağından oksidasyonun hızı da artmaktadır (Çizelge 2.2). 8

Konjuge çift bağlara sahip olan çoklu doymamış yağ asitleri izolen yapıda çift bağa sahip olanlara göre daha hızlı okside olmaktadır (Lin 1991). Ayrıca çift bağların geometrisi de oksidasyon hızını etkilemektedir. Cis asitler trans izomerlerine göre daha kolay okside olmaktadırlar (Nawar 1996). Çizelge 2.2 C 18 serisi yağ asitlerinin 250 o C da saptanan indüksiyon periyodu ve rölatif oksidasyon hızı (Lin 1991) Yağ asidi Allil grup adedi İndüks. periyodu (saat) Rölatif hız Stearik asit 0-1 Oleik asit 1 82,00 100 Linoleik asit 2 19,00 1200 Linolenik asit 3 1,34 2500 2.1.3.2 Oksijen konsantrasyonu ve sıcaklık Oksijen miktarının çok fazla olduğu durumlarda oksidasyon hızı, oksijen konsantrasyonundan bağımsızdır ama, çok düşük oksijen konsantrasyonlarında hız, yaklaşık olarak oksijen konsantrasyonu ile orantılı olmaktadır. Fakat oksijen konsantrasyonunun hız üzerine etkisi ayrıca sıcaklık, yüzey alanı gibi diğer faktörler tarafından da etkilenmektedir. Genelde oksidasyon hızı sıcaklık ile artmaktadır. Ayrıca sıcaklık, hız ile oksijen kısmi basıncı arasındaki ilişkiyi de etkilemektedir. Sıcaklık artarken oksijen kısmi basıncındaki değişme hız üzerine çok az etki göstermektedir. Çünkü sıcaklık artarken oksijen, lipit ve suda daha az çözünür hale gelmektedir (Nawar 1996). 9

2.1.3.3 Yüzey alanı Oksidasyon hızı havayla temas eden lipitin yüzey alanındaki artış ile artmaktadır. Hatta yüzey-hacim oranı artarken, oksijen kısmi basıncındaki azalma oksidasyon hızını azaltmada daha az etkili hale gelmektedir (Nawar 1996). Bulk faz oksidasyonunun mekanizması ve kinetiği tek tabaka oksidasyonundan farklılık göstermektedir. Silika jel yüzeyine tek tabaka halinde yüklenen linoleatın oksidasyon hızı, bulk faz halindekine göre daha yüksek ve aktivasyon enerjisi ise daha düşüktür. Ayrıca bulk fazdaki oksidasyon otokatalitik bir karaktere sahipken, tek tabaka oksidasyonu sürekli bir şekilde azalan hızda ilerlemektedir (Yanishlieva-Maslarova 2001). 2.1.3.4 Nem Model lipit sistemlerde ve farklı yağ içeren gıdalarda oksidasyon hızı güçlü bir şekilde su aktivitesine bağlıdır. Çok düşük nem içerikli kurutulmuş gıdalarda (a w değeri 0.1 den daha az) oksidasyon çok hızlı bir şekilde ilerlemektedir. a w değerinin yaklaşık 0.3 e kadar artması lipit oksidasyonunu geciktirmekte ve en düşük hızda ilerlemesini sağlamaktadır. Az miktardaki suyun bu koruyucu etkisi metal katalistlerinin katalitik aktivitesini indirgeyerek, serbest radikalleri gidererek ve/veya oksijenin yağa girişini engelleyerek sağladığına inanılmaktadır. Su aktivitesinin bir dereceye kadar artması (a w =0.55-0.85), katalistlerin ve oksijenin hareketliliğindeki artış nedeniyle oksidasyon hızının tekrar arttığı varsayılmaktadır (Nawar 1996). 2.1.3.5 Radyan enerji Görünür, ultraviyole ve γ-radyasyon oksidasyonu hızlandırmaktadırlar (Nawar 1996). 10

2.1.3.6 Antioksidanlar Antioksidanlar; Lokalize olmuş O 2 konsantrasyonunu azaltarak Oksidasyon reaksiyonunu başlatan radikalleri (. OHgibi) yakalayarak Metal iyonlarını bağlayarak (şelatlama) Peroksitleri radikal olmayan (alkol gibi) ürünlere dönüştürerek Ara radikalleri (RO. 2 ve RO. ) yakalayarak oksidasyonu yavaşlatırlar (Aruoma 1996). Antioksidanlar kaynaklarına göre doğal ve yapay olmak üzere 2 ye ayrılır. Doğal antioksidanlar içinde tokoferoller, askorbik asit ve türevleri, nordihidroguayenet asidi (NDGA) yer almaktadır. Doğal antioksidanların en iyi bilineni tokoferollerdir (α, β, γ, δ izomerleridir). Antioksidan aktiviteleri deltadan alfaya doğru azalmaktadır. Yapay antioksidanlardan en bilinenleri de bütillenmiş hidroksi anizol (BHA), bütillenmiş hidroksi toluen (BHT) ve propil gallat (PG) dır. BHA ve BHT birlikte kullanıldığında sinerjetik etkiye sahiptir (Saldamlı ve Uygun 1998). BHA, BHT ve tersiyer bütil hidrokinon (TBHQ) prosesin son basamağında yağ ürünlerine ticari olarak ilave edilmektedir. Bu maddelerin antioksidan mekanizması tokoferollerin antioksidan mekanizmalarına (fenolik grupları ile serbest radikaller absorbe edilmektedir) benzemektedir (Lin 1991). Antioksidanların aktivitesi, çoğu kez su fazının varlığıyla azalmaktadır. Çünkü antioksidan ile su arasında hidrojen bağı ile meydana gelen kompleksler lipit radikallerini yakalamada etkisizdirler (Paiva-Martins and Gordon 2002). 11

2.1.3.7 Prooksidanlar Belirli olarak 2 veya daha fazla yük durumuna ve uygun yükseltgenme-indirgenme potansiyeline sahip olan geçiş metalleri ( bakır, demir, mangan, kobalt ve nikel gibi) etkili birer prooksidandırlar. 0.1 ppm gibi düşük konsantrasyonlarda bile indüksiyon periyodunu azaltarak oksidasyon hızını artırabilmektedirler. İz miktardaki ağır metaller yaygın olarak yemeklik yağlarda karşılaşılmaktadır. Bu metaller bitkisel yağlarda topraktan, proses sırasında (hidrojenasyondan sonra nikel katalistinin tamamen uzaklaştırılamaması sonucu) ve depolamada kullanılan metalik ekipmandan (tank, boru gibi) kaynaklanmaktadır (Nawar 1996). 12

2.2 Metallerin Katalizlediği Lipit Oksidasyonu Belirli 2 veya daha fazla yük durumuna ve uygun yükseltgenme-indirgenme potansiyeline sahip olan ağır metaller ( bakır, demir, mangan, kobalt ve nikel gibi) en güçlü lipit oksidasyon katalistleri arasındadırlar (Pokorny 1987, Gordon 2001). Geçiş metalleri, hem otoksidasyonun hızını hem de hidroperoksitlerin uçucu bileşiklere parçalanma yönünü etkilemektedir (Kiritsakis 1998, Gordon 2001). Ayrıca geçiş metalleri oksidasyon zincir reaksiyonlarını da başlatmaktadırlar (Pokorny 1987). Ağır metallerin katalitik etkisi sadece iyon türlerine ve redoks potansiyeline bağlı değildir, ayrıca metallere bağlanan ligandlara, çözücü sistemlere, metal iyonlarını daha düşük yükte tutan askorbat, sistein gibi elektron vericilere ve ph a da bağlıdır (Gordon 2001). 2.2.1 Metaller tarafından katalizlenen oksidasyonun mekanizması Ağır metallerin başlıca etkisi, sistemdeki serbest radikallerin oluşma hızını artırmaktır. Ağır metaller okside olmayan lipitler (Pokorny 1987, Nawar 1996) veya benzer hidrofobik maddelerle doğrudan reaksiyonu sonucunda, lipit hidroperoksitleri veya alkol, aldehit gibi lipit hidroperoksitlerin ikincil reaksiyon ürünlerini parçalayarak (Pokorny 1987) ya da moleküler oksijeni aktive ederek singlet oksijeni ( 1 O 2 ) ve hidroperoksil radikali (HO. 2 ) oluşumuna neden olarak serbest radikalleri üretirler (Nawar 1996). Serbest radikal oluşumu (initiation), oksijenin yokluğunda veya düşük basıncında önemli hale gelebilmektir (Pokorny 1987): 13

Şekil 2.8 Daha yüksek yükteki metal iyonunun serbest radikal ve hidrojen iyonu üretmesi (Pokorny 1987) Oluşan daha düşük yükteki metal iyonu oksijen ile kolayca reaksiyona girmektedir. Bu arada da süperoksit anyonu radikali oluşmakta (1b) ve bu radikal, zincir reaksiyonunu. başlatan HO 2 radikalini üretmek için bir proton ile reaksiyona girmektedir (1c). Oksijenin tamamen yokluğunda 1a reaksiyonu tersinir olarak düşünülmesi gerektiği için, reaksiyon daha düşük yük durumundaki metal iyonu tarafından yavaşlatılmaktadır. Çok düşük oksijen kısmi basıncında (konserve gıdalarda veya azot altında paketlenmiş ürünlerdeki gibi), düşük oksijen basıncının hız düşürücü etkisine metal tuzlarının (özellikle bakır tuzları) varlığı da katkıda bulunur. Pokorny nin (1987) bildirdiğine göre ph 5-7 de göreceli olarak yüksek konsantrasyonlu metal iyonlarının (yaklaşık 50 mg l -1 ) varlığında, su ile emülsifiye edilmiş linoleik asidin otoksidasyonu incelendiğinde %1 oksijenin varlığında, bakırın çok güçlü antioksidan etki gösterdiği gözlenmekte iken, normal kısmi oksijen basıncında (%21) prooksidatif etki gözlenmiştir. Süperoksit anyonu hidrojen peroksit oluşturmak için veya demir(iii) iyonlarını demir(ii) forma indirgemek için protonlar ile reaksiyona girmektedir (Şekil 2.8) (Miller 1996): 14

2H + + 2. O 2 - Fe +3 +. O 2 - H 2 O 2 + O 2 Fe +2 + O 2 (1) Demir(II) iyonları, hidrojen peroksidin hidroksil radikallerine parçalanmasını Fentontip reaksiyonları ile desteklemektedir (Miller 1996): Fe +2 + H 2 O 2 Fe +3 + OH - +. OH (2) Oluşan hidroksi radikali (. OH ) oldukça reaktif bir tür olup, doymamış yağ asitlerinden hidrojen atomları alarak hızlı bir şekilde lipit radikallerini oluşturmakta ve lipit oksidasyonu zincir reaksiyonlarını başlatmaktadır (Şekil 2.9) (Miller 1996). Bu nedenle H 2 O 2 /Fe(II) kombinasyonu lipit oksidasyonunun güçlü bir katalisti olarak bilinmektedir (Micciche et al. 2005). Ancak; ayrıca (2) nolu reaksiyonunun reaktif ürünü olarak hidroksi radikalinin değil de oksi-demir (FeO 2+ ) veya demir(iv) türlerinin [Fe(IV)=O] olduğu da ileri sürülmektedir. Fe 2+ ve H 2 O 2 arasında oluşan reaksiyon, 2 elektronun transferi ile sonuçlanmaktadır (Carlsen et al. 2005): Fe 2+ + H 2 O 2 FeO 2+ + H 2 O (3) Peroksitler ayrıca Fe(III) türleri ile de parçalanır: Fe 3+ + H 2 O 2 FeO 2+ +. OH + H + (4) Buna benzer şekilde iki elektronun transfer edildiği ve ürün olarak oksi-demir türlerinin oluştuğu (demir(v) türleri) reaksiyon ile parçalanmaktadır: Fe 3+ + H 2 O 2 FeO 3+ + H 2 O (5) Micciche et al. (2005) yaptıkları çalışmada H 2 O 2 /Fe(II) kombinasyonu, ML (metil linoleat) nin oksidasyonuna özellikle TTAB (tetradesiltrimetilamonyum bromür) misella çözeltisinde (ph 5.5) neden olabilmektedir. Buna ek olarak, demir(ii) 15

iyonlarının oksidasyon hızı H 2 O 2 /Fe(II) mol oranına bağlı olmakta ve daha fazla mol oranı daha hızlı Fe(II) oksidasyonla sonuçlanmaktadır. Bu durum, aktif olmayan Fe(III) iyonlarının ortamda bulunmasına neden olur ve reaksiyonu yavaşlatır. Fe +2 + H 2 O 2 Fe +3 + OH - +. OH (2) Şekil 2.9 Hidroksi radikali ile lipit hidroperoksit ve serbest radikal oluşumu (Micciche et al. 2005) H 2 O 2 /Fe(II) kombinasyonunun ilavesi ile hidroksi radikali (. OH) oluşmakta (2 reaksiyonu) ve hemen ML oksidasyonu başlamaktadır. Bu hızlı başlangıca daha fazla hidroksi radikalinin oluşumunu zamanında önleyen Fe(II) nin Fe(III) e hızlı oksidasyonu da eşlik etmektedir. Çünkü Fe(III), hidrojenperoksiti parçalaması bakımından Fe(II) ye göre daha inaktiftir. Bu hızlı serbest radikal oluşum basamağından sonra ML, H 2 O 2 /Fe(II) mol oranına doğrudan bağlı olmayan bir hızda okside edilmektedir. [ML] deki bu yavaş fakat sabit azalma kendiliğinden olan- oksijenin neden olduğu yayılma (propagation) reaksiyonları ile ilişkilendirilmesi olasıdır. H 2 O 2 / Fe (II) mol oranının 2/1 den 6/1 e artırılması reaksiyonun ilk basamaklarında ML nin oksidasyonunu (b) biraz azaltmaktadır. Tamamen anlaşılmamasına rağmen bu 16

etkinin H 2 O 2 ve hidroksil radikallerinin yer aldığı yan reaksiyonların sonucu olduğuna inanılmaktadır (Şekil 2.10). Şekil 2.10 H 2 O 2 ve. OH radikallerinin yer aldığı yan reaksiyonlar (Micciche et al. 2005) Süperoksit anyonu (. O - 2 ), Fe +2 katalizörlüğünde H 2 O ile reaksiyona girdiği zaman zararlı hidroksi (. OH) radikallerini oluşturan Haber-Weiss reaksiyonu meydana gelir (Koca ve Karadeniz 2003): Fe+2. O 2 - + H 2 O O 2 + OH - +. OH. OH + RH R. + H 2 O Şekil 2.11 Haber-Weiss reaksiyonu Demir ayrıca gıdalarda oluşan lipit hidroperoksitlerin parçalanmasını hızlandırarak lipit oksidasyonunu katalizleyebilmektedir (Carlsen et al. 2005) : Fe +2 + ROOH Fe +3 + RO. + OH - Fe +2 + ROOH FeO 2+ + ROH Fe +3 + ROOH FeO +2 + RO. + H + Fe +3 + ROOH FeO 3+ + ROH Şekil 2.12 Fe +2 ve Fe +3 ile hidroperoksitlerin parçalanması (Carlsen et al. 2005) 17

Lipit alkoksil radikali (RO. ) reaktiftir ve başka bir lipit kaynağından hidrojen atomu alarak lipit oksidasyonunun hızlanmasına neden olmaktadır (Carlsen et al. 2005). RO. + RH ROH + R. (6) Ağır metaller, hidroperoksitlerin parçalanması ile oluşan alkol veya aldehit gibi ikincil reaksiyon ürünlerinin daha ileri oksidasyon reaksiyonlarına da katılmaktadırlar. Birincil alkoller aldehitlere veya karbosilik asitlere, ikincil alkoller de ketonlara okside edilmektedirler. Kurşun(IV), talyum(iii), civa(ii) veya paladyum(ii) gibi iki değerlikli metal iyon oksidanları serbest radikal üretmezler fakat, farklı serbest radikal veya radikal olmayan oksidasyon ürünlerine dönüştürülen π-kompleksleri oluşumu ile olefinik bağlardan elektronları kabul edebilirler (Pokorny 1987). 2.2.2 Metaller tarafından katalizlenen oksidasyonun kinetiği Lipit oksidasyonunun ilk basamaklarında hidroperoksit dekompozisyon hızının oluşum hızı ile karşılaştırıldığında ihmal edilebildiği fakat yine de zincir reaksiyonunun başlıca kaynağı haline geldiği (ve ağır metal içeriği [M] çok düşük olduğu) zaman serbest radikal oluşum hızı (initiation) r i, ağır metal içeriği ile orantılıdır (Pokorny 1987): r i = k [ROOH] [M], (7) ve oksidasyonun toplam hızı r = k [RH] r i 0.5 = k [RH] [ROOH] 0.5 [M] 0.5 ile verilmektedir. (8) Bu yüzden şayet metal katalistin aktif formu dimerik veya polimerik değilse oksidasyon hızı (r), [M] 0.5 ile orantılı olmalıdır. Yukarıdaki ilişki sadece metal katalistinin ılımlı 18

konsantrasyonunda görülmektedir. Çok düşük metal konsantrasyonunda katalist, çok geçmeden deaktive olmakta ve inaktif hidratlanmış oksitler formunda kısmi olarak presipite hale gelmektedir. Yüksek metal katalisti konsantrasyonlarında reaksiyon hızı 8 no.lu eşitliği izlememektedir. Fakat en yüksek reaksiyon hızı aşağıdaki eşitlik ile gösterilmektedir: a [M] r max = (9) b + c [M] a,b,c sabittir. Eşitlik, yüksek metal konsantrasyonlarında reaksiyon hızının hemen hemen metal miktarından bağımsız hale geldiğini belirtmektedir. Bu olgu için üç olası açıklama verilmektedir: (i) metal katalisti reaksiyon zincirini hem başlattığı hem de parçaladığı için hızkonsantrasyon ilişkisi; (a + b[m]) 0.5 r = k [RH] ile açıklanmaktadır. (10) (c + d [M]) 0.5 Havanın serbest girişi ile metil oleatın 60 o C daki otoksidasyonu boyunca hem hidroperoksit oluşumu hem de dekompozisyonunun hız sabitleri; a + b[m] k = (11) c + [M] b hidroperoksit oluşumu= 3.2* 10-5, hidroperoksit parçalanması = 6.9* 10-6 19

(ii) oksidasyon hızının sınırlanması katalist çözünürlüğünün azalması nedeniyle olabilmektedir. Çünkü daha polar ortamda metal tuzları misella oluşturmaktadır ( düşük metal konsantrasyon durumunda hariç). Misella oluşumu için kritik metal konsantrasyonu aşıldığı zaman gerçek çözeltide katalistin miktarındaki artıştan çok misellaların sayısında ve/veya boyutunda artış görülmektedir. (iii) hidroperoksit konsantrasyonu arttığı için hidroperoksit dekompozisyon hızı da dengeye ulaşana kadar artmaktadır. Bu yatışkın (steady-state) hidroperoksit konsantrasyonu; [ROOH] = k [RH] 2 [M] -1 (12) ile verilmekte ve (8) no.lu eşitlikte yerine konulduğunda aşağıdaki toplam oksidasyon hızı elde edilmektedir: R = k [RH] 2 (13) Bu eşitlikten yatışkın reaksiyon hızının metal miktarından etkilenmediği görülmektedir. 2.2.3 Metal katalizini etkileyen faktörler Prooksidan aktivite değişken yüklü metallerle sınırlandırılmamaktadır. Pokorny nin (1987) bildirdiğine göre 50 veya 80 o C da depolanan metil oleat üzerine birçok metalin klorür ve stearatlarının etkisi karşılaştırıldığında, yük değişiminin meydana gelmediği magnezyum, kalsiyum, stronyum, baryum ve alüminyum metallerinin de prooksidatif aktivite gösterdikleri gözlenmiştir. 20

2.2.3.1 Konsantrasyon Metallerin lipit oksidasyonunu kataliz etme yetenekleri birçok faktöre bağlıdır. Bunların içinde de konsantrasyon önemli bir yer tutmaktadır. Pokorny nin (1987) bildirdiğine göre domuz yağının muhafaza zamanını yarıya indiren metallerin konsantrasyonları (mg kg -1 ): bakır 0.05; mangan 0.6; demir 0.6; krom 1.2; nikel 2.2; vanadyum 3.0; çinko 19.6; alüminyum 50. Özellikle bakır (II) iyonlarının çok yüksek metal konsantrasyonlarında, hidroperoksit parçalanma ürünlerinin oluştuğu reaksiyonlar (termination) üzerine etkisi çok büyüktür. Sonuçta hidroperoksit içeriği düşük hale gelmektedir. Toplam oksidasyon hızı düşmekte ve ağır metallerin prooksidan aktivitesi bu nedenle antioksidan aktiviteye dönüşebilmektedir. Yapılan bir çalışmada, ayçiçek yağının en yüksek peroksit sayısı bakırın yokluğunda, 75 o C da, 700 mval/kg dan daha fazla iken 2 mg/kg ve 14-16 mg/kg bakırın varlığında ise sırasıyla 350 mval/kg ve 100 mval/kg dan daha az bulunmuştur (Pokorny 1987). Ayrıca geçiş metalleri arasında demir bakırdan daha yüksek konsantrasyona sahip olması durumunda lipit oksidasyonu için en önemli prooksidan olabilirken, eşit konsantrasyonlarda bakırın daha etkili prooksidan olduğu görülmektedir (Paiva-Martins and Gordon 2002). 2.2.3.2 Ortamın polarite ve ph sı Ağır metallerin prooksidan aktivitesi hem metal-hidroperoksit stabilitesi hem de misella oluşumu üzerine etkisi nedeniyle reaksiyon ortamının polaritesinden etkilenmektedir (Pokorny 1987). Düşük su aktivitelerinde metal hidratasyonu nedeniyle antioksidan etki söz konusudur. Ayrıca su metallerle görülmeyen hidroksitleri de oluşturmaktadır. Nem miktarı arttıkça, su çözgen aktivitesini artırarak, katalizörleri çözmekte ve oksidasyonu teşvik etmektedir. Kapiler bölgede ise metallerin çözünürlüğü; hidratasyonu gölgeleyecek düzeydedir. Yüksek nemde katalitik etkinin önlenmesi (1) şelat yapıcı 21

veya hidroksit yapıcı maddelerle veya (2) oksijenin bir yolla dışarı çıkarılması ile sağlanabilir (Özçelik ve Evranuz 1998). Emülsiyon sistemlerinde demir konsantrasyonunu artırmak su fazındaki demir konsantrasyonunu da artırmaktadır. Demir, ph 7.0 ile karşılaştırıldığında ph 3.0 da daha fazla çözünmekte ve damla yüzeyine daha yakın olmaktadır. Bu durum düşük ph lı sistemlerde, yüksek demir konsantrasyonunun prooksidan aktivitesini açıklamaktadır (Osborn and Akoh 2003). Minotti and Aust (1987), Fe(II) ya da Fe(III) ün tek başına çoklu doymamış lipitlerin oksidasyonunu hızlandıramadığını rapor etmektedirler. Ayrıca Fe(II)/Fe(III) oranının önemli olduğunu ve en yüksek aktiviteyi de oranın 1/1 iken elde edildiğini bildirmektedirler (Şekil 2.13). Fe +3 (inaktif) Fe +2 (inaktif) Oksidasyon İndirgenme Oksidasyon Fe +2 : Fe +3 Lipit peroksidasyonun başlaması Şekil 2.13 Lipit peroksidasyonunda demirin rolü ve ph, oksidasyon ve indirgenmenin etkileri (Minotti and Aust 1987) Micciche et al. (2005) un yaptıkları çalışmada demir(ii) iyonları metil linoleatın (ML) oksidatif katalisti olarak kullanılırken kullanılan sulu misellar çözeltileri [TTAB (tetradesiltrimetilamonyum bromür) ve SDS (sodyum dodesil sülfat)] demir(ii) iyon oksidasyonunun hızını önemli bir şekilde etkilemektedir. TTAB ve SDS (tamponlanmamış) misellar çözeltileri arasındaki belirgin fark, ph larının sırasıyla 5.5 ve 10.1 olmasıdır. Alkali SDS misellar çözeltisinde Fe(II) in Fe(III) e hızlı ve tamamen 22

dönüşümü fark edilebilir ML oksidasyonunu engellediği görülmektedir. Diğer taraftan TTAB misellar çözeltisi gibi hafif asidik koşullarda Fe(II) nin Fe(III) e kademeli oksidasyonu, gözlemlenen zaman boyunca Fe(II)/Fe(III) çiftinin birlikte var olmasını garanti etmektedir. Bu nedenle bu deney şartları altında ph, Fe(II) nin oksidasyonunda önemli bir rol oynamaktadır. AsAH 2, Fe(II) ile kombinlendiği zaman misellar çözeltisinin ph sı ML oksidasyonu üzerine güçlü bir etkiye sahip olmaktadır. TTAB misella çözeltisi (ph 5.5) gibi hafif asidik ph da, Fe(II) nin oksidasyonu AsAH 2 nin eklenmesi ile tamamen inhibe olmaktadır. Bu durum Fe(II) ve Fe(III) ün birlikte bulunmasının ML oksidasyonu için ön koşul olduğunu doğrulamaktadır (Micciche et al. 2005) Alkali çözeltilerde büyük polinüklear demir(iii) iyonlarının oluşumu nedeniyle etkili demir(iii) iyonları/fenol oranı azalmaktadır. Demir(III) iyonlarının pk a larına göre seyreltik çözeltilerde farklı hidroksi kompleksleri oluşmakta ve bu komplekslerin çözeltideki oranları da ph ya bağlı olmaktadır. Fe +3 + H 2 O [Fe(H 2 O) 6 ] 3+ [Fe(H 2 O) 6 ] 3+ + H 2 O [Fe(H 2 O) 5 (OH)] 2+ + H 3 O + (pk a1 =2.9) [Fe(H 2 O) 5 (OH)] 2+ + H 2 O [Fe(H 2 O) 4 (OH) 2 ] + + H 3 O + (pk a2 =3.9) [Fe(H 2 O) 4 (OH) 2 ] + + H 2 O [Fe(H 2 O) 3 (OH) 3 ] + H 3 O + (pk a3 =6.5) Şekil 2.14 Alkali çözeltilerde büyük polinüklear demir(iii) iyonlarının oluşumu (Paiva-Martins and Gordon 2005) Bu reaksiyonlara ilaveten binüklear katyonların oluşumu oleatyon olarak bilinen reaksiyon ile meydana gelmektedir: 2[Fe(H 2 O) 6 ] 3+ + H 2 O 2[Fe(H 2 O) 4 (OH) 2 ] 4+ + 2H 3 O + (pk a = 2.9) (14) 23

Baz varlığında bu iyon tarafından daha fazla protonun verilmesi daha büyük agregatların oluşumuna neden olmaktadır (Paiva-Martins and Gordon 2005). 2.2.3.3 Antioksidan ve Prooksidanlar Yağ içeren gıdalara antioksidanların katılması, metaller tarafından katalizlenen lipit oksidasyonunu yavaşlatmaya yardımcı olmaktadır. Fenolik bileşiklerin antioksidan aktiviteleri gıda sistemine bağlı olarak büyük oranda değişmekte ve ayrıca bu bileşikler lipit oksidasyon hızını farklı mekanizmalar ile etkilemektedirler. Örneğin gallik asiti içeren hidroksibenzoik asitler metallerle kompleks oluşturan fenolik bileşikler iken kuersetin, hidroksi radikali ve süper oksit anyonunu yakalama yeteneğine sahiptir. Ancak kuersetin, hidroksi radikali artışına neden olduğu belli koşullar altında otokside olmaktadır. Ayrıca kuersetin ve gallik asit Fe +3 ü daha aktif olan Fe +2 ye indirgeyebilmekte ve böylece lipit oksidasyonunu hızlandırmaktadırlar (Osborn and Akoh 2003). Sızma zeytinyağı yüksek miktarda fenolik bileşik içermektedir. Bunlar, fenil alkoller yani 3,4-dihidroksifeniletanol (3,4- DHPEA veya hidroksitirozol), p-hidroksifenil etanol (p-hpea veya tirozol) ve fenil asitlerdir. 3,4- DHPEA nın türevleri; 3,4- DHPEA ya bağlanmış elenolik asidin dialdehidik formu (3,4- DHPEA-EDA), oleuropein aglikonunun izomeri (3,4- DHPEA-EA), p-hpea ya bağlanmış elenolik asidin dialdehidik formu sızma zeytinyağının başlıca terpenoit bileşikleri olarak tanımlanmaktadırlar. Polifenol içeriği sızma zeytinyağının kalitesi açısından önemlidir ve yağın oksidatif stabilitesine katkı sağlamaktadırlar. Zeytinyağının fenolik bileşikleri ph 3,5-7,4 aralığında yüksek antioksidan kapasitesi göstermektedir fakat, bu bileşiklerin aktiviteleri demir(iii) iyonlarının varlığında indirgenmekte veya bu bileşikler prooksidan bile olabilmektedirler (Paiva-Martins and Gordon 2002). Aynı araştırmacılar tarafından 60 o C, ph 3.5, 5.5 ve 7.4 de demir(iii) klorürün varlığı ve yokluğunda zeytinyağı/su emülsiyonunun oksidatif stabilitesi üzerine 24

zeytinyağındaki 4 fenolik maddenin (oleuropein, hidroksitirozol, 3,4-DHPEA-EA ve 3,4-DHPEA-EDA) etkileri incelenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre demir(iii) iyonun yokluğunda, bütün ph larda 4 bileşiğin konsantrasyonlarındaki artış ile antioksidan aktivitelerinde de belirgin bir artış gözlenmektedir. Fakat hidroksitirozol ve oleuropein ph 3.5 ve 5.5 de demir(iii) iyonlarının varlığında, fenolik konsantrasyonlarındaki artışın etkisi ile belirgin bir prooksidan etki göstermektedirler. Fakat ph 7.4 de her iki bileşik için antioksidan etki gözlenebilmektedir. Demir(III) iyon çözünürlüğü, demir(iii) hidroksit formuna sahip olduğu alkali ph da çok düşük olmaktadır. Bu nedenle antioksidanların aktivitesi ph 7.4 de demir(iii) iyonların varlığında çok belirgin bir şekilde indirgenmemektedir. 3,4-DHPEA-EDA yüksek konsantrasyonlarda, demir(iii) iyonlarının varlığıyla sadece ph 3.5 da prooksidan etki göstermekte iken 3,4- DHPEA-EA üç ph değerinde de antioksidan aktivite göstermektedir (demir(iii) klorürün prooksidan etkisini azaltarak). Ayrıca FRAP (demir III-indirgeme antioksidan potansiyeli) testi ph 7.4 de herhangi bir demir(iii) indirgeme aktivitesi göstermemekte iken ph 3.5 ve 5.5 de demir(iii) indirgeme yetenekleri: hidroksitirozol, α-tokoferol> oleuropein> 3,4-DHPEA-EA> 3,4- DHPEA-EDA şeklinde sıralanmaktadır. Ayrıca DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) radikali yakalama aktivitesi 3,4-DHPEA-EA >>hidroksitirozol> oleuropein> α-tokoferol> 3,4-DHPEA-EDA şeklinde sıralanmaktadır. Bu sonuçlara göre demir(iii) iyonunun varlığında hem en yüksek radikal yakalama aktivitesine sahip olmasından hem de göreceli olarak düşük demir indirgeme kapasitesinden dolayı 3,4-DHPEA-EA nın yüksek antioksidan aktivitesine sahip olduğu açıklanabilmektedir. Yağ-su emülsiyonlarında non-polar fenolikler lipit damlalarıyla etkileşimde oldukları için polar fenoliklere göre daha etkilili antioksidanlardır. Ayrıca polar antioksidanlar (kuersetin ve gallik asit) su fazındaki demir ile daha etkili interaksiyona girer ve fenoliklerin metal indirgeme güçleri oksidasyon hızını artırdığı için bu durum polar fenoliklerin artan prooksidan aktivitelerini açıklayabilmektedir (Osborn and Akoh 25

2003). Zeytinyağı polifenollerinin polarite sırası ise; hidroksitirozol> oleuropein> 3,4- DHPEA-EDA> 3,4- DHPEA-EA> α-tokoferol şeklinde sıralanmaktadır (Paiva-Martins and Gordon 2002). Osborn and Akoh (2003) tarafından yapılandırılmış lipit bazlı emülsiyonların demir tarafından katalizlenen lipit oksidasyonu üzerine ph 3.0 ve 7.0 da doğal antioksidanların (α-tokoferol, gallik asit ve kuersetin) etkisi incelenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre kuersetin ve gallik asit, ph 3.0 emülsiyonlarında toplam oksidasyon üzerine önemli bir şekilde prooksidan etki göstermektedirler. Kuersetin ve gallik asidin ph 3.0 da prooksidan aktivitelerinin artmasının nedeni demiri indirgeme yeteneklerinin artması şeklinde açıklanabilir. α-tokoferol ise ph 3.0 de ph 7.0 ye göre daha stabildir. Yüksek demir konsantrasyonlarında (100 µm) bu üç bileşik de prooksidan aktivite göstermektedir. ph 7.0 deki emülsiyonlar depolama boyunca göreceli olarak oksidasyona karşı stabilite göstermektedirler. AsAH 2 (askorbik asit) ve α-tokoferol gibi indirgen ajanlar, kullanılan deneysel koşullara bağlı olarak belli kritik konsantrasyonunun altı veya üzerinde prooksidan veya antioksidan olarak davranabilmektedirler. AsAH 2 'ın prooksidan davranışı demir redoks çemberi olarak adlandırılan demir(iii) iyonlarının demir(ii) iyonlarına indirgemesinden meydana gelmektedir. Kritik konsantrasyonun üzerindeki değerlerde ise AsAH 2, radikal tutucu olarak (antioksidan etki) davranmaktadır (Micciche et al. 2005). Micciche et al. (2005) yaptıkları çalışmaya göre AsAH 2 /Fe(II) kombinasyonu SDS misellar çözeltisinde (ph 10.1) katalist olarak kullanıldığı zaman, Çizelge 2.3 de de görüldüğü gibi düşük AsAH 2 /Fe(II) mol oranında (1/1 ve 2/1) herhangi bir zaman aralığından sonra ML oksidasyonu başlamakta ve AsAH 2 /Fe(II) katalistinin en yüksek aktivitesi, 5/1 mol oranında elde edilmektedir. Bu oranın altındaki değerlerde okside edilen ML yüzdesi AsAH 2 /Fe(II) oranının artması ile kademeli olarak artmakta iken üstündeki değerlerde ortamdaki yüksek (hatta 8/1 oranının üzerindeki değerlerde) [AsAH 2 ], ML oksidasyon reaksiyonunun tam olarak inhibisyonuna neden olmaktadır. 26

Çizelge 2.3 SDS misellar çözeltisindeasah 2 /Fe(II) kombinasyonu varlığında okside olan ML nin yüzdesi ve oksidasyon hız sabitleri (Micciche et al. 2005) AsAH 2 /Fe(II) Oranı Lag zamanı (dakika) %ML (4saat sonra okside olan) 0/1 0 a 0 a 1/1 120 4,0 0,1 2/1 90 5,2 0,1 3/1 0 11,7 0,4 4/1 0 13,0 0,5 5/1 0 13,7 0,5 6/1 0 12,1 0,4 7/1 0 10,8 0,3 8/1 0 a 0 a 10/1 0 a 0 a Hız sabiti (*10-3 dakika -1 ) a ML oksidasyonu gözlenmedi Literatürde askorbatın etkisinin ya Fe(III) ü Fe(II) e indirgeme yeteneğinden ya da doğrudan süperoksit radikalini indirgeyerek kendisinin okside olmasından meydana geldiği varsayılmaktadır. Başka bir olasılık ise askorbatın lipit oksidasyon reaksiyonunu başlatan alkoksi radikali üretmek için hidroperoksitlerle reaksiyona girmesidir (Micciche et al. 2005). Tokoferol ve tokotrienollerin antioksidan aktiviteleri, lipit serbest radikallere fenolik hidrojenlerini verebilme yetenekleri ile açıklanmaktadır. TO. (tokoferoksil radikali) kendi çifti ile dimer ve/veya trimer oluşturmak için reaksiyona girmektedir (Kamal- Eldin and Appelqvist 1996). RO. + TOH TO. + ROH TO. + TO. TO-TO Şekil 2.15 Tokoferollerin antioksidan aktiviteleri ve tokoferoksil radikalinin dimer oluşturması (Kamal-Eldin and Appelqvist 1996) 27