ZEYTİNYAĞINDAKİ FE VE CU DÜZEYLERİNİN ATOMİK ABSORPSİYON SPEKTROMETRESİ İLE BELİRLENMESİ VE ÖNEMİ Semin Atılgan 1, Ümran Seven 2*, Şeref Güçer 3 1 Uludağ Üniversitesi n-edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü 4. Sınıf Öğrencisi 2, 3 Uludağ Üniversitesi n-edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü 1659 Görükle/Bursa * useven@uludag.edu.tr Zeytinin yetiştirilme proseslerinde kullanılan metal içerikli koruyucu kimyasallar (bakır bileşikleri, kalsiyum fosfat gibi), yetiştirildiği bölgedeki çevresel metal kirliliği ve toprak yoluyla alınmada oldukça etkili toprak karakteristiğine etki eden coğrafi konumu başta olmak üzere pek çok faktör metal düzeyini artırabilmektedir. Bu nedenle zeytinyağının eser element içeriği özellikle kaynağına göre değişmekte; bu içerik de jeolojik karakterizasyonda gündeme gelmektedir (1). Zeytinyağındaki eser element bileşenlerinin incelenmesi hem yağın oksidatif kararlılığı açısından hem de eser elementlerin metabolik işlevlerdeki rolleri ve toksikolojik etkileri göz önüne alındığında sağlık açısından önem teşkil etmektedir. Yağ örneklerinde bu tür metal düzeylerinin saptanmasında dedeksiyon limitlerine de bağlı olarak çoklu element analizleri için genellikle indüktif eşleşmiş plazma-atomik emisyon spektrometresi ön plana çıkarken; tekli element analizlerinde atomik absorpsiyon spektrometresi (AAS) yaygın olarak kullanılmaktadır. Çalışmamızın amacı, beslenme açısından önemli olan elementinin zeytinyağına geçiş düzeyinin belirlenmesi ve bu konu hakkında genel çalışmaların incelenmesi; bununla birlikte özellikle zeytin ağacının ilaçlanmasında kullanılabilen bu nedenle de kirlilik boyutunda yağa geçebilecek bakır düzeyinin tespiti ve değerlendirilmesidir. Bu düzeylerin belirlenmesinde örnek hazırlama teknikleri, duyarlık, selektiflik ve girişimler incelenirken için uyguladığımız fraksiyonlama modeli beslenme ve sağlık açısından yorumlanmaktadır. Anahtar Kelimeler: Zeytinyağı, bakır, demir, atomik absorpsiyon spektrometresi. Giriş Zeytinyağı, zeytin ağacının (Olea europea sativa) meyvesinden sağlanan, berrak, yeşilden sarıya değişen renkte, kendine özgü tat ve kokuda, tüm bitkisel yağlar arasında rafinasyona tabi tutulmaksızın yenebilen hemen hemen tek yağ özelliği gösterir (2,3). Olgun meyveler ortalama %3 oranında yağ ihtiva eder (4). Zeytinyağı, olgun meyveden presleme, santrifüjleme ve süzme ile mekanik olarak elde edilmektedir (2). Hasatta meyvelerin taşınması ve depolanması sırasında yaralanıp ezilmemesine özen gösterilmelidir. Aksi takdirde zeytinlerde saprofit bakteri ve küfler kolayca üreyerek yağın hızla hidrolize olmasına sebep olurlar. Bu da yağda istenmeyen ara ürünlerin oluşmasına ve asitliğin artmasına sebep olur (5). Zeytin tanesi bileşimindeki mevcut lipaz enzimi, bekleme sırasında serbest yağ asileri artışına sebep olmaktadır (2). Ayrıca zeytinyağının elde edilişi sırasında, geçiş metalleri; başlıca demir ve bakır zeytinyağına karışabilir. Bu metaller topraktan ve gübrelerden ya da zeytinyağının depolanmasında ve işlenmesinde kullanılan metaryallerden geçebilmektedir. Demir ve bakır ppm düzeylerinde olsa bile otooksidasyon reaksiyonlarını hızlandırarak yağların bozulmasına neden olmaktadırlar. Otooksidasyon yağlarda peroksit, aldehit, keton ve serbest yağ asitleri gibi bileşiklerin oluşumuna ve yağın kalite parametrelerinin düşmesine neden olmaktadır. Ayrıca bu bileşiklerin sindirim sisteminde hasarlara neden olduğu ve kanser oluşumunda da önem taşıdığı bildirilmektedir. Bu nedenle bazı metal iyonlarının bitkisel yağlardaki varlıklarının ve miktarlarının izlenerek kontrol edilmesi hem ürün kayıplarının azaltılması hem de insan sağlığındaki olumsuz sonuçların önlenmesi açısından son derece önem arz etmektedir (6). ICP-OES gibi tekniklerle metaller için çok düşük dedeksiyon limitlerine inilebildiği görülmektedir (kadmiyum için.5 μ/l, bakır için.25µg/l, çinko için,3 µg/l ve kurşun için 3.75µg/ L ) (7). 23
Yenilebilir yağdaki eser elementlerin belirlenmesi, metallerin metabolik rolü, saflığının bozulma olasılığının belirlenmesi, yağ karakterizasyonu açısından önemlidir (8). Günümüzde, gıda maddeleri için eser element düzeylerinin saptanması gıda kimyası açısından önemini sürdürmektedir. Bu açıdan mg/kg ve μg/kg düzeyinde elementlerin doğru ve kesin sonuçlarla belirlenmesi sağlık açısından önemlidir (9). Zeytinyağı, yaşam için gerekli enerjiyi vermesi yanında vücutta oluşan ve oksidasyona sebep olan serbest radikalleri bağlayarak antioksidan etki de gösterir. Ayrıca zeytinyağı, esansiyel yağ asitlerini ve A,D,E,K vitaminlerini en kolay emilebilir ve kullanılabilir tarzda içerir. Bununla birlikte, beraber tüketilen diğer gıdalardaki bazı maddelerin emilimini ve kullanımı da arttırır (1). Zeytinyağı, toplam ve LDL kolestrol seviyelerini, HDL seviyesini etkilemeden düşüren güçlü bir E vitamini ve mono-doymamış yağ asidi kaynağıdır. Son bulgular, düşük yoğunluktaki lipoproteinlerin oksidasyonunu önleyen zeytinyağında fenoliklerin bulunduğunu kanıtlar (8). Zeytinin coğrafi kaynağına bağlı eser element içeriği, onların yerel karakterizasyonu için kullanılabilir. Yağ örneklerindeki metal örneklerinin belirlenmesi için en sık kullanılan teknikler indüktif eşleşmiş plazma atomik emisyon spektrometresi (ICP-AES) ve atomik absorpsiyon spektrometresi (AAS) dir. Metal konsantrasyonunun zeytinin coğrafi kaynağına dayalı değişim gösterdiği belirtilmiştir. Bakırın belirlenmesi, bitkisel yağların üretiminde bu metallerin hidrojenleme katalizörü olarak kullanımından dolayı endüstride önemlidir. Bakır ve demir, üretim aygıtından elde edilen yağın potansiyel bulaşıcılarıdır. Kurşun ve bakır çevresel bulaşmalar sonucu yağda bulunabilirler. Çevre kirliliği ve doğal metal kaynaklar sebebiyle topraktan zeytin bitkisine ulaşır. Ayrıca, zeytin işçilerinin tarım alışkanlıkları (gübrenin, bitki koruyucu maddeler içeren metalin uygulanması) ürünlerin metal içeriklerinde önemli rol oynar. Bu nedenle, zeytinyağının kaynağına bağlı olarak eser element içeriğinin değiştiği varsayılmaktadır (8). Farklı tür zeytinyağlarında en çok bulunan demir ve bakır metallerinin miktarları sırası ile 3, ve,1 mg/kg civarında verilmiştir (11). Demir Eksikliği ve Biyoyararlılık Günlük demir ihtiyacı 8 mg kadardır. İnsanlarda demir zehirlenmesinin başlangıç değeri; vücut ağırlığının kilogramı başına alınacak 2 miligram demirdir. Vücudun dayanabileceği günlük demir üst sınırı yetişkinlerde 45 miligram, 14 yaş altı çocuklarda ise 4 miligramdır. Kilogram başına 6 miligram demir, öldürücü dozdur. Demir, etlerde porfirin sisteminde kompleks halde, sebzelerde anorganik demir halinde, hayvan ve insanlarda iyonlaşan demir halinde bulunur. Toprak açısından; eğer toprak suyla doluysa ve ph çok yüksekse veya fosforla fazla gübrelendiyse demir bulunmayabilir. Demir eksikliği mangan eksikliğiyle karıştırılabilir. Yeni çıkan yaprakların soluk görünmesi, yaprakta yeşil kalan damarlar arasındaki bölgenin sarı ya da kahverengiye dönmesi belirtilerdir. Meyveler yeterli kalitede ve bollukta olmaz. Kireçli topraklarda asit miktarı fazla olan bitkiler yetiştirmekten kaçınarak ya da iyi üretilmiş gübre eklenerek demir eksikliği engellenebilir (12). Demir Yetersizliğine Neden Olan Beslenme Davranışları Nelerdir? Çay ve kahve tüketimi demir emilimini azalttığı için tüketilmemelidir. Eğer tüketilmek isteniyorsa yemeklerden 45 dakika sonra açık olarak tüketilebilir. Diyetle fazla miktarda kalsiyum alınması (özellikle süt ve ürünlerinin tüketilmesi ), etlerin kavrularak ve fırında fazla pişirilmesi, nitrat ve nitritin kullanıldığı sosis, salam ve birçok hazır besinin tüketimi alınan demirin biyoyararlılığını azaltır. Demirin fazlası toksik etki yapar, çünkü aşırı miktarda alınan iki değerli demir vücuttaki peroksitlerle reaksiyona girerek serbest radikaller yapar. 231
Beslenmemizde Nelere Dikkat Edersek Daha Çok Demir Emilimini Arttırmış Oluruz? İnsan vücudu demirin emilimini çok sıkı kontrol eden bir mekanizmaya sahipse de vücuttan atılmasına ilişkin fizyolojik bir yetisi yoktur. Dolayısıyla, alınan aşırı mikardaki demir, sindirim sisteminin tüm bölgelerindeki hücrelere zarar verebilir ve kan dolaşım sistemine girebilir. C vitamini demir emilimini arttırdığı için demirden zengin olan besinlerle C vitamini birlikte tüketilmelidir. Posa miktarı yüksek olan besinlerin fazla miktarda tüketimi demirin vücuttan atımını hızlandırdığı için posayla birlikte C vitamini alındığında posanın etkisini azaltır. Lif içeriği yüksek olan sebze, meyve ve tahıllardaki demir emilimi % 4-5 civarındadır. Askorbik asit ve sitrik asit demir emilimini arttırıcı etki yapar. Önemli olan absorbsiyonun diğer etkileri azaltarak maksimum düzeyde olması ve demir emiliminin artmasını sağlamaktadır (13). Bakır Bakır genelde plazma proteinleri üzerinde kan yoluyla taşınır. İlk olarak albümine bağlı olarak karaciğere alınır. Bakır çok çeşitli enzimler halinde bulunur. Enzimatik rolune ek olarak, biyolojik elektron taşıyıcısı olarak da kullanılır. Bakır ve çinko minerallerinden birisinin bir yiyecekte aşırı bulunması durumunda, bir diğerinin eksik olduğu durumu tamamlamak için sindirim sisteminde emilmek için yarışır. Recommended Dietary Allowance (RDA) bakır için yetişkin insanda.9 mg/gün dır. Diğer taraftan bu konudaki araştırmalar günde 3. mg değerini tavsiye etmektedir (14). Demirin yükseltilmesini kolaylaştıran görevi sebebiyle, bakır eksikliği anemi belirtilerine yol açabilir. İnsanlarda, Wilson hastalığı belirtilerine vücut dokusundaki bakır birikimi sebep olmaktadır. Tüm bakır bileşikleri, aksi bilinmedikçe, zehirli olarak kabul edilmelidir. 3 gr bakır sülfat insanda öldürücü etki yapar. Dayanılabilir en üst bakır alım seviyesi yetişkinler için 1mg/gün dır. Bakır zehirlenmesinin önemli kısmı, yükseltgenme basamağı değişirken ki elektron alışverişinden gelir. Bu, hidroksil radikali gibi reaktif radikal iyonların üretimini katalizler. Bakırın bu katalitik aktivitesi, ilişkili olduğu enzimler tarafından kompleks oluşmadığı ve reaksiyona yatkın olmadığı durumlarda zehirli olduğunda kullanılır. İnaktif radikallardeki artış genellikle yükseltici gerilim olarak adlandırılır ve bakırın rol aldığı önemli rahatsızlık çeşitliliğinde aktif bir araştırma alanıdır (15). Zeytinyağında, demir, bakır, krom, mangan ya da kurşun bulunur fakat demir en fazla bulunandır (,5 ile 3 μg/g arasında) (16). Bakır ve demirin zeytinyağına olan etkisi ile ilgili yapılan bir çalışmada, zeytinyağı oksidasyonunda sırayla (II)- ve (III)-iyonları tarafından indüklenen katalitik etkinin testi için Rancimat tekniği uygulanmıştır. Farklı miktarlardaki (II)- ve (III)-iyonları rafine zeytinyağına eklenmiştir. Bakırın demire göre daha aktif bir katalizör olduğu görülmüştür. Saf zeytinyağında, işlenmiş ya da işlenmemiş metallerden türeyen çeşitli ağır metaller mevcuttur. Demir en yüksek miktarda (7-36 ng/g)bulunan elementtir. Diğer metaller ve miktarları da şöyle verilmektedir: Bakır (birkaç ng/g mertebesinde), nikel (2-5 ng/g), krom (2-5 ng/g), civa (2 ng/g), kadmiyum (<1 ng/g), kurşun (<4ng/g) ve kalay (3-15 ng/g). Rafine zeytinyağındaki metal bileşenleri, sızma zeytinyağında bulunan metallerden, arıtma işlemleri nedeniyle daha düşüktür (17). Ayrıca, zeytinyağının termal kararlılığı üzerine katı metallerin katalitik etkisiyle ilgili yapılan diğer bir çalışmada, bir dizi metalin (demir, bakır, kalay, kurşun gibi) farklı bölgelerden ve farklı rafine derecesine sahip zeytinyağlarının termal kararlılığa olan etkisi, termal analiz teknikleri: Termogravimetrik (TG) ve türev termogravimetrik (DTG) analizi yapılarak çalışılmıştır. Termogravimetrik verilerden demir ve kalayın, bozunma hızı arttığından dolayı, yağ oksidasyonu üzerine en büyük etkiye sahip olduğu sonucuna varılmıştır. Bakır ve kurşun gibi metallerin varlığında bozunma hızında önemli değişmeler gözlenmiştir. Her iki parametre için sağlanan sonuçlar, test edilen yağ çeşidine bakılmaksızın yağ oksidasyon süreci üzerine demir ve kalayın negatif etkisini onaylamıştır (18). Zeytinyağındaki bakırın belirlenmesi için sıklıkla kullanılan teknikler, zeytinyağı örneğinin ön işlem olarak sulu asidik çözeltilerdeki ekstraksiyon işlemi ya da örneğin yakılmasının gerekli olduğu atomik absorpsiyon spektrometresi ve örneğin sadece uygun bir çözücü içinde seyreltildiği indüktif eşleşmiş 232
plazma-atomik emisyon spektrometresidir. Seyrek başvurulanlar ise voltametrik ve potansiyometrik tekniklerdir (16). Materyal ve Yöntem Pazarımızdan alınan sızma zeytinyağı örneğinden, yaklaşık 2 gram tartım alınarak HNO 3 /H 2 O 2 karışımı ile yaş yakma işlemine tabi tutulmuş ve 25 ml ye tamamlanarak,45μm PVDF filtreden süzülmüştür. Standart çözeltileri(1-2 mg/l)ve standart çözeltileri(1-2mg/l) 1M HNO 3 te hazırlanmıştır. ATI UNICAM 929 Atomik Absorpsiyon Spektrometresi (AAS) ile alevli modda, sulu kalibrasyon ve standart katma yöntemleri ile çalışılmıştır. AAS parametreleri çizelge 1 de belirtilmiştir. Çizelge 1. Alevli AAS için optimum çalışma şartları için optimum çalışma şartları Dalga boyu 324,8 nm Lamba akımı 4 ma Slit aralığı,5 nm için optimum çalışma şartları Dalga boyu 248,3 nm Lamba akımı 13 ma Slit aralığı,2 nm Bulgular ve Tartışma Zeytinyağında alevli AAS ile elde edilen metal düzeyleri ve analize ait analitik parametreler çizelge 2, çizelge 3, çizelge 4 te ve kalibrasyon eğrileri şekil 1, şekil 2, şekil 3 ve şekil 4 te verilmiştir. Çizelge 2. Sulu kalibrasyonda elde edilen analitik parametreler Sulu Kalibrasyon Kalibrasyon Eğrisi y=,55x+,12 R 2 =,9864 y=,116x+,164 R 2 =,997 LOD LOQ,315 1,5,395 1,317,14,12,1,8,6,4,2 y =,55x +,122 R 2 =,9864 5 1 15 2 25,3,25,2,15,1,5 y =,116x +,164 R 2 =,997 5 1 15 2 25 Şekil 1. Kalibrasyon eğrisi (sulu kalibrasyon) 233
Çizelge 3. Standart katmada elde edilen analitik parametreler Standart Katma Kalibrasyon Eğrisi LOD LOQ y=,36x-,1 R 2 =,9986,833 2,778 y=,12x-,3 R 2 =,9957,25,833,8,7 y =,36x -,1 R 2 =,9986,6,5,4,3,2,1 -,1 5 1 15 2 25,3,25 y =,12x -,3 R 2 =,9957,2,15,1,5 5 1 15 2 25 -,5 Şekil 2. Kalibrasyon eğrileri (standart katma) Çizelge 4. Zeytinyağı örneklerinde Alevli AAS ile belirlenen ve düzeyleri Metal düzeyleri (mg/kg) Sulu kalibrasyon 3,24±1,43 3,88±,11 Standart Katma 3,47±,85 3,12±,39 TS 341 Nisan 24 sayılı yemeklik zeytinyağı standardına göre zeytinyağındaki ve düzeyleri sırası ile 3, ve,1 mg/kg olarak sınırlandırılmıştır. Çalışmamızda zeytinyağında elde ettiğimiz düzeyleri standarda uygun görülmektedir. düzeylerinin standarda oranla yüksek olması, örneğin üretim (kullanılan teçhizat veya kimyasal)-halka arz arası tüm aşamalarındaki olası kirlenmeler boyutunda değerlendirilebileceği gibi zeytin üretimi sırasında tuzları ile yapılabilecek ilaçlamalar da gündeme gelebilir. Sonuç Çalışmamızda zeytinyağında örnek hazırlama sırasında kullanılan yağ miktarının önemli bir sınırlama olduğu tespit edilmiştir. Uygun sıvı-sıvı ekstraksiyon gibi deriştirme tekniklerinden yararlanabileceği gibi; grafit fırınlı AAS veya indüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometre (ICP-MS) gibi duyarlığı yüksek analiz tekniklerinden de yararlanılabilir. Zeytinyağındaki metal seviyeleri beslenme-biyoyararlılık-sağlık boyutlarında incelendiğinde metal tayini önemli bir uygulama alanı olarak göz önüne alınmalıdır. 234
Kaynaklar 1. Zeiner M, Steffan I, Cindric I. J.25. Determination of trace elements in olive oil by ICP-AES and ETA-AAS:A pilot study on the geographical characterization. Microchemical Journal, 81:171-176. 2. Nas S, Gökalp HY ve Ünsal M, 21. Bitkisel Yağ Teknolojisi, Pamukkale Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Ders Kitapları Yayınları No: 5, 5, 157-165, 29 s, Denizli. 3. Türk Gıda Kodeksi(TGK),1998. Yemeklik zeytinyağı ve Yemeklik Prina Yağı Hakkında Tebliğ(Tebliğ No:98/7),Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, Ankara. 4. Canözer Ö, 1992. Türkiye de Sofralık ve Yağlık Önemli Zeytin Çeşitleri, Standart, Ekonomik ve Teknik Dergi, 31(372), 53-58. 5. Başer N, 1991. Memecik ve Ayvalık Yağlık Zeytin Çeşitlerinde Hasat ve Hasat Sonrası Koşulların Meyve Metabolizması ve Yağ Kalitesine Etkileri (Yüksek Lisans Tezi), Ege Üniversitesi n Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, 9-12 s, İzmir. 6. Şahan Y, Çetinoğlu A, Başoğlu F, Gücer Ş. 24. Zeytinyağlarında Atomik Absorbsiyon Spektofotometresi ile Yapılan Bazı Metal Analizleri ve Sorunlar. Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü-Uludağ Üniversitesi n-edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü projesi, Yayınlandığı Yer: Gıda, 29 (6); 437-441, 24. 7. Angioni, Cabitza M, Russo MT, Caboni P. 26. Influence of olive cultivars and period of harvest on the contents of, Cd, Pb, and Zn in virgin olive oils. Food Chemistry, 99:525 529. 8. Zeiner M, Steffan I, Cindric IJ. 25. Determination of trace elements in olive oil by ICP-AES and ETA-AAS: A pilot study on the geographical characterization. Microchemical Journal, 81:171 176. 9. Şahan Y, Çelik G, Başoğlu F, Gücer Ş. 25. Atomik Absopsiyon Spektrofotometresi ile Zeytin Örneklerinde Demir, Bakır, Çinko ve Civa Analizleri Örnek Hazırlama Basamağının Optimizasyonu. Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü-Uludağ Üniversitesi n-edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü projesi, Yayınlandığı Yer: Gıda, 3(2), 89 95, 25. 1. Draman, H., 26 Zeytinyağı Kalitesini Nasıl İyileştirebiliriz? Akademik Gıda, 4(23), 39,4 İzmir. 11.http://29.85.135.14/search?q=cache:5nCF27L3SXUJ:www.dtm.gov.tr/dtmadmin/upload/DTS/Mevz uatdb/teblig/yemeklik%252zeytinya%c4%9f%c4%b1.doc+zeytinya%c4%9f%c4%b1ndaki+bak% C4%B1r+ve+demir&hl=tr&ct=clnk&cd=9&gl=tr 12. Baker MD. Major trauma in children. Rudolph's Pediatrics, 21st Ed. McGraw-Hill. 23. 13. sakur.uludag.edu.tr/dosya/fr-hye-4-719-4.pdf 14. National Research Council. Copper. In: Recommended Dietary Allowances. Washington, D.C.: Food Nutrition Board, NRC/NAS, 198: 151-154. 15. http://en.wikipedia.org/wiki/copper 16. Galeano Diaz T, Guiberteau A, Lo pez Soto MD, Ortiz JM. 26. Determination of copper with 5,5- dimethylcyclohexane-1,2,3-trione 1,2-dioxime 3-thiosemicarbazone in olive oils by adsorptive stripping square wave voltammetry. Food Chemistry, 96: 156 162. 17. Leonardis AD, Macciola V. 22. Catalytic effect of the (II)- and (III)-cyclohexanebutyrates on olive oil oxidation measured by Rancimat. Eur. J. Lipid Sci. Technol., 14:156 16. 18. Paz I, Mariano Molero M. 2. Catalytic Effect of Solid Metals on Thermal Stability of Olive Oils. JAOCS, 77: 127 13. 235