PyroMark KRAS Kiti Elkitabı

Haziran 2009 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 24 Sürüm 1 CE-IVD işaretli PyroMark KRAS Kiti, insan KRAS geninin 12, 13 ve 61 kodonlarındaki mutasyonların miktarsal ölçümünün yapılmasını mümkün kılar. Anti-EGFR terapilerinden yarar sağlama olasılıkları daha yüksek olan kolorektal kanser hastalarının seçilmesinde yardım edecek bilgileri klinisyenlere sağlar. İn vitro tanı amaçlı kullanıma yöneliktir 971450 1056444TR QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D-40724 Hilden R2 1056444TR Sample & Assay Technologies

QIAGEN Sample and Assay Technologies QIAGEN, herhangi bir biyolojik örneğin içeriğinin izole edilmesine ve tespit edilmesine olanak sağlayan yenilikçi örnekleme ve tahlil teknolojilerinin önde gelen sağlayıcısıdır. İleri, yüksek kaliteli ürünlerimiz ve hizmetlerimiz, örnekten sonuca başarıyı garantiler. QIAGEN aşağıdaki konularda standartlar koyar: DNA, RNA ve proteinlerin saflaştırılması Nükleik asit ve protein analizleri microrna araştırması ve RNAi Örnekleme ve analiz teknolojilerinin otomasyonu Görevimiz, olağanüstü başarıya ve büyük ilerlemelere erişmeniz için olanak sağlamaktır. Daha fazla bilgi edinmek için, www.qiagen.com adresini ziyaret edin.

İçindekiler Kit İçeriği 4 Semboller 4 Sevk ve Depolama 5 Amaçlanan Kullanım 5 Ürün Kullanım Sınırlamaları 5 Teknik Destek 6 Kalite Kontrolü 6 Güvenlik Bilgileri 7 Giriş 8 İlkeler ve yöntem 8 Performans özellikleri 9 Kullanıcı Tarafından Sağlanacak Ekipman ve Ayıraçlar 14 Önemli Notlar 15 Genel önlemler 15 Örnek materyal 15 DNA izolasyonu 15 Kontroller 16 Protokol 1: PyroMark Q24 MDx için Çalışma Ayarı 17 Protokol 2: HotStarTaq Plus Master Mix Kiti ve PyroMark KRAS Kitini Kullanarak PCR 19 Protokol 3: PCR Ürünlerinin, Streptavidin Sepharose High Performance Boncuklarında Hareketsiz Hale Getirilmesi 22 Protokol 4: PyroMark Q24 MDx üzerinde Pyrosequencing Analizi Yapmadan Önce Örneklerin Hazırlanması 24 Protokol 5: PyroMark Q24 MDx i Çalıştırma 27 Protokol 6: Bir PyroMark Q24 MDx Çalışmasının Analizi 29 Sorun Giderme Kılavuzu 34 Ek A: PyroMark KRAS Tahlillerinin Ayarlanması 36 Ek B: Atık Kabını ve Yatakları Boşaltma 38 Referanslar 39 Sipariş Verme Bilgileri 40 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 3

Kit İçeriği PyroMark KRAS Kit (24) Katalog No. 971450 Reaksiyon sayısı 24 Seq Primer KRAS 12/13 24 μl Seq Primer KRAS 61 PCR Primer KRAS 12/13 PCR Primer KRAS 61 wt KRAS Control DNA Mutant KRAS Control DNA 24 μl 24 μl 24 μl 100 μl 100 μl Elkitabı 1 Semboller <N> <N> test için yeterli ayıraç içerir Son kullanma tarihi İn vitro tanı amaçlı tıbbi cihaz Katalog numarası Lot numarası Materyal numarası Bileşenler İçerik Numara 4 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

Sıcaklık sınırlamaları Yasal üretici Elkitabında verilen bilgilere başvurun Önemli not Sevk ve Depolama PyroMark KRAS Kiti, kuru buz üzerinde sevk edilir ve sevk yerine ulaştığında -20 C de depolanmalıdır. Tekrar tekrar erime ve donma (>5 x) durumlarından kaçınılmalıdır. PyroMark KRAS Kitinin, bu koşullarda depolanması halinde, kit son kullanma tarihine kadar sağlam kalacaktır. Amaçlanan Kullanım Avrupa Komisyonu nun, mutasyona uğramamış (doğal tip) KRAS geni bulunan metastazlı kolon kanseri hastalarının tedavisinde panitumumab ve cetuximaba şartlı pazarlama izni vermesi nedeniyle, KRAS mutasyon analizine yoğun bir ilgi oluşmuştur. Yani panitumumab ve cetuximab, yalnızca KRAS mutasyon durumu bakımından taranmış hastalara verilebilir. Buradaki kullanım amacı, panitumumab ve cetuximab gibi anti-egfr terapilerinden yarar sağlama olasılıkları daha yüksek olan kolorektal kanser hastalarının saptanmasında doktorlara yardım etmektir. Halen kullanılan diğer prognostik faktörlere ek olarak ve hastanın KRAS geninin 12, 13 ve 61 kodonlarındaki mutasyon durumuna dayanarak anti-egfr terapileriyle tedaviye uygun hastaların seçilmesine yardım etmeye yöneliktir. Hastanın mutasyon durumu, klinisyenin tedavi kararını vermesinden önce diğer hastalık faktörleriyle birlikte dikkate alınmalıdır. KRAS mutasyon durumu, kanser hastalarına yönelik tedavi kararlarının yegane temelini oluşturmamalıdır. Bu ürün, insan KRAS geninin 12, 13 ve 61 kodonlarındaki mutasyonların miktarsal ölçümünün yapılmasına yöneliktir. Ürün 2 tahlilden oluşmaktadır: Tahlillerden biri 12 ve 13, diğeri de 61 kodondaki mutasyonları saptar. Her iki tahlil de spesifik PCR primerleri ve bir sekanslama primeri içerir. Ürün Kullanım Sınırlamaları Üründen elde edilen sonuçlar, ilgili tüm klinik ve laboratuar bulguları bağlamında yorumlanmalıdır. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 5

Ürün yalnızca in vitro tanı prosedürlerinde ve PyroMark Q24 MDx Sisteminin kullanımında özel olarak bilgilendirilmiş ve eğitimli personel tarafından kullanılmalıdır. Doğrulama çalışmaları, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü tümör örneklerinden çıkarılan insan DNA sı kullanılarak yapılmıştır. DNA saflaştırma, PCR amplifikasyonu ve Pyrosequencing analizi için örnek hazırlamada kullanılacak ayıraçlar, ürüne dahil değildir. Ürün, QIAGEN in DNA saflaştırma ürünleri ve PCR ayıraçları kullanılarak doğrulanmıştır. Sayfa 14 ve 15 de önerilen şekilde PCR amplifikasyon ve DNA saflaştırma ürünlerini kullanın. Bu ürünün, yalnızca PyroMark Q24 MDx sisteminde kullanımı amaçlanmıştır. En uygun sonuçların elde edilebilmesi için kullanım kılavuzuna kesinlikle uyulmalıdır. Ayıraçların, bu elkitabında belirtilenler dışında seyreltilmesi önerilmez ve performans kaybına neden olur. Tüm bileşenlerin kutusuna ve etiketlerine basılmış olan son kullanma tarihlerine ve depolama koşullarına dikkat edilmelidir. Son kullanma tarihi geçmiş veya yanlış depolanmış bileşenleri kullanmayın. Teknik Destek QIAGEN de, sunduğumuz teknik desteğin kalitesi ve hazır bulunmasıyla gurur duyarız. Teknik Servis Bölümlerimizde örnek ve tahlil teknolojilerinde ve QIAGEN ürünlerinin kullanımında engin pratik ve teorik uzmanlığa sahip deneyimli bilim insanların çalışmaktadır. PyroMark KRAS Kiti veya genel olarak QIAGEN ürünleriyle ilgili sorularınız varsa veya herhangi bir zorluk yaşıyorsanız, lütfen bizimle irtibat kurmakta tereddüt etmeyin. QIAGEN müşterileri, ürünlerimizin gelişmiş veya özelleşmiş kullanımına ilişkin olarak başlıca bilgi kaynaklarından biridir. Bu bilgiler, diğer bilim insanlarının yanı sıra QIAGEN deki araştırmacılar için de yararlı olmaktadır. Bu nedenle, ürün performansına veya yeni uygulamalara ve tekniklere ilişkin önerilerinizi bize iletmenizi destekleriz. Teknik destek ve daha fazla bilgi için lütfen Teknik Destek Merkezi ne www.qiagen.com/support adresinden bakın veya QIAGEN Teknik Servis Bölümlerinden veya yerel distribütörlerimizden birini arayın (arka kapağa bakın veya www.qiagen.com adresini ziyaret edin). Kalite Kontrolü QIAGEN in ISO Sertifikalı Kalite Yönetim Sistemi ne göre, her PyroMark KRAS Kit lotu, tutarlı ürün kalitesi sağlamak amacıyla önceden belirlenmiş spesifikasyonlar doğrultusunda test edilmektedir. 6 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

Güvenlik Bilgileri Kimyasal maddelerle çalışırken her zaman uygun bir laboratuar önlüğü, tek kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. Daha fazla bilgi almak için lütfen uygun material safety data sheets (malzeme güvenlik veri formları) (MSDS) belgelerine başvurun. Her QIAGEN kitinin ve kit bileşeninin MSDS belgesini www.qiagen.com/support/msds.aspx adresinde çevrimiçi olarak rahat ve kompakt PDF dosyaları biçiminde bulabilir, görüntüleyebilir ve yazdırabilirsiniz. 24 saat ulaşılabilecek acil bilgi hattı İngilizce, Fransızca ve Almanca dillerinde acil tıbbi bilgiler günün 24 saati boyunca aşağıdaki adresten alınabilir: Die Beratungsstelle bei Vergiftungen (Zehir Bilgi Merkezi) Mainz, Almanya Tel: +49-6131-19240 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 7

Giriş CE-IVD işaretli PyroMark KRAS Kiti, insan KRAS geninin 12, 13 ve 61 kodonlarındaki mutasyonların miktarsal ölçümünün yapılmasına yöneliktir. Ürün 2 tahlilden oluşmaktadır: Tahlillerden biri 12 ve 13, diğeri de 61 kodondaki mutasyonları saptar. İki bölge, PCR ile ayrı ayrı büyütülür ve tanımlanmış bölge üzerinden sekanslanır. Tanımlanmış pozisyonları çevreleyen sekanslar, analizin miktarsal ölçümü ve kalite değerlendirmesi için normalleştirme ve referans piklerini oluşturur. Kodon 12 ve 13 Kodon 61 Şekil 1. KRAS tahlilinin gösterimi. Gösterilen sekans, normal bir örneğin analiz edilmiş sekansıdır. FP ve FPB: İleriye dönük PCR primerleri (B, biyotinlenmeyi belirtir); RP ve RPB: Geriye dönük PCR primerleri (B, biyotinlenmeyi belirtir); Seq: Sekanslama primerleri. Kodon 12 ve 13, ileriye dönük sekanslanırken, kodon 61 geriye dönük yönde sekanslanır. Ürün, her tahlil için bir PCR primer karışımından ve bir sekanslama primerinden oluşur. Primerler solüsyon içerisinde iletilir. Her şişe, her primerden veya primer karışımından 24 μl içerir. İlkeler ve yöntem Sayfa 9 daki iş akışı, tahlil prosedürünü göstermektedir. Kodon 12/13 ve kodon 61 i hedefleyen primerler kullanılarak yapılan PCR işleminden sonra, amplikonlar Streptavidin Sepharose High Performance boncukları üzerinde hareketsiz hale getirilirler. Tek sarmallı DNA hazırlanır ve denk düşen sekanslama primerleri DNA ya yapışır. Ardından örnekler bir run setup file (çalışma ayar dosyası) ve bir run file (çalışma dosyası) kullanılarak PyroMark Q24 MDx üzerinde analiz edilir. Sequence to Analyze [Analiz Edilecek Sekans] çalışma sonrasında nadir mutasyonları saptayacak şekilde ayarlanabilir (bkz. Protokol 6: PyroMark Q24 MDx Çalışmasının Analizi sayfa 29 ve Ek A, sayfa 36). 8 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

PyroMark KRAS prosedürünün iş akışı Tahlil ve çalışma ayarı Örnek hazırlanması Tahlil dosyası ayarı (Ek A) PCR (Protokol 2) Hareketsiz hale getirme (Protokol 3) Çalışma dosyası ayarı (Protokol 1) Örneklerin hazırlanması (Protokol 4) PyroMark Q24 MDx çalışması (Protokol 5) PyroMark Q24 MDx çalışmasının analizi (Protokol 6) Performans özellikleri Rapor Boş sınırı ve saptama sınırı Boş sınırı (LOB) ve saptama sınırı (LOD), kit ile birlikte verilenlere benzer plazmid karışımları kullanılarak bir dizi mutasyon için belirlenmiştir. Mutasyon türüne bağlı olarak iki yöntem kullanılmıştır. Aksi durumda boş olan bir pozisyonda bir pik görünümüyle sonuçlanan mutasyonlar: LOB ve LOD, NCCLS Guideline EP17-A Protocol for determination of limits of detection and limits of quantitation; approved guideline belgesindeki öneriler doğrultusunda belirlenmiştir. α- ve β- hataları (sırasıyla yanlış pozitif ve yanlış negatif) %5 e ayarlanmıştır. Kodon 12 deki GGT GTT mutasyonu: Bu mutasyon, tek ve çift pikler içeren değişikliklerle sonuçlanır ve düşük mutasyon düzeylerinde doğrusal bir yanıt vermez. Bu pozisyon tutarlı olarak %0 birim (n = 72) olan bir LOB vermiştir. Bu pozisyonda bir mutasyonun varlığını belirten en düşük sinyal, tutarlı baz çizgisi olan %0 ın açıkça üzerinde olan %1 birime ayarlanmıştır. %7 birim mutasyon içeren bir örnek analiz edildiğinde, sonuçların %95 i (n = 89) pozitif olarak düşünülebilecek bir sinyal ( %1 birim) vermiştir. Böylece, bu mutasyon için LOD, %7 birime ayarlanmıştır ve %1 birimin üzerinde bir sinyal veren tüm örnekler bu mutasyon için pozitif olarak değerlendirilmiştir. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 9

Tablo 1. Spesifik mutasyonlar için belirlenen LOB ve LOD Mutasyon LOB (%) LOD (%) COSMIC ID* (V42) Kodon 12 (GGT) GAT 0,6 2,2 521 GTT geçerli değil 7,0 520 TGT 0,5 2,1 516 AGT 0,4 1,9 517 GCT 0,7 2,3 522 CGT 0,3 1,8 518 Kodon 13 (GGC) GAC 0,3 1,9 532 Kodon 61 (CAA), ters yönelimde tahlil edildiği şekliyle (TTG) GTG 0,8 2,8 554 TAG 1,2 3,1 553 TCG 1,6 3,5 552 ATG 0,7 2,6 555 TTC 1,2 3,1 550 * Sanger Institute un www.sanger.ac.uk/genetics/cgp/cosmic/ adresinde çevrimiçi olarak bulunan Catalogue of Somatic Mutations in Cancer dan alınmıştır. Bu değerler, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü dokudan izole edilen 10 ng DNA dan rutin olarak elde edildiği üzere, sinyalin 60 RLU nun üzerinde olduğu çalışmalara dayandırılmıştır. Bu yöntemin performansının laboratuarda doğrulanması önerilir. Doğrusallık Doğrusallık, Clinical and Laboratory Standards Institute un EP6-A Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures: a statistical approach; approved guideline başlıklı belgesi doğrultusunda ölçülmüştür. 10 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

Normal ve mutant sekanslar, aşağıdaki mutasyon düzeylerini verecek oranlarda karıştırılmıştır: % 0, 12,5, 25, 37,5 ve 50. Karışımların dört replikatı, rastgele biçimde bir plaka yerleştirilmiş ve analiz edilmiştir. Kodon 12 deki GGT TGT mutasyonu sonuçları, Analyse-it Yazılımı v2.04 (Analyse-it Software, Ltd., Birleşik Krallık) kullanılarak analiz edilmiştir ve Şekil 2 de gösterilmektedir. 60 50 40 Actual Gerçek (%) 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 Expected Beklenen (%) Şekil 2. Kodon 12 deki GGT TGT mutasyonu doğrusallığı. Genel tekrarlanabilirlik %1,64 birimdi ve sonuçlar, izin verilebilir %3 lük doğrusalolmama durumu dahilinde doğrusaldı. Benzer sonuçlar kodon 13 teki GGC GAC mutasyonu için de elde edildi. Ara kesin olmama Kodon 12 de GGT TGT mutasyonu doğrusallığının belirlenmesi, 3 operatör tarafından 3 ayrı günde, farklı PyroMark Q24 MDx alet ve PyroMark Gold Q24 Reagents kombinasyonları kullanılarak tekrarlandı. Bu 3 çalışmanın sonuçları Tablo 2 de sunulmuştur. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 11

Tablo 2. Ara kesin olmama Çalışma 1 Çalışma 2 Çalışma 3 Özet Beklenen Ortalama SS Ortalama SS Ortalama SS Ortalama SS 0,0 0,6 0,2 1,7 0,7 0,7 0,2 1,0 0,6 12,5 13,3 1,5 16,2 1,9 14,6 3,0 14,7 1,4 25,0 23,8 1,4 26,8 2,4 26,9 2,9 25,8 1,8 37,5 42,0 1,9 41,7 0,5 38,5 2,6 40,7 2,0 50,0 49,7 2,4 50,5 1,8 49,1 4,8 49,8 0,7 Tüm değerler % birim olarak verilmiştir. SS: standart sapma. Dolayısıyla ara kesin olmama durumu (SS) için değerler, ölçülen %0 50 aralığında %0,6 2,0 birim şeklindeydi. Tanısal hassasiyet ve özgünlük PyroMark KRAS Kiti bir çalışmada değerlendirildi. DxS Therascreen, K-RAS Mutation Kiti ile karşılaştırma için kolorektal kanser bulunan sonraki 100 tümör örneği, kodon 12 ve 13 te mutasyonlar bakımından analiz edildi. Test amaçlı DNA, EZ1 DNA Tissue Kit kullanılarak izole edildi ve analiz, PyroMark KRAS Kit kullanılarak PyroMark Q24 MDx üzerinde ve Therascreen: K-RAS Mutation Kiti kullanılarak ABI PRISM 7900HT SDS üzerinde yapıldı. Analiz edilen 100 örnekten, DxS analiziyle 91 örnekte mutasyon durumu belirlenebildi. Pyrosequencing analiziyle, kodonlar 12 ve 13 için 94 örneğin mutasyon durumu belirlenebildi. Kitlerden birinde veya her ikisinde başarısız olan örnekler hariç tutulduğunda, PyroMark KRAS Kit in, Therascreen: K-RAS Mutation Kiti ile %100 lük bir korelasyonu vardı. PyroMark KRAS Kit in tanısal hassasiyeti %100 dü ve tanısal özgünlüğü %100 dü (Tablo 3). Tablo 3. Kodon 12 ve 13 için analiz edilen prospektif kolorektal kanser tümör örneklerinin sonuçları Therascreen: K-RAS Mutation Kiti Mutant Doğal Tip Toplam PyroMark KRAS Kit Mutant 33 0 33 Doğal Tip 0 57 57 12 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

Kodon 61 analizi Aynı 100 örnek, kodon 61 deki mutasyonlar bakımından PyroMark KRAS Kiti kullanılarak analiz edildi. Kodon 61 tahlili için yalnızca tek bir örnekte başarısız kalite değerlendirmesi oldu. Bu başarısız örnek, kodon 12 ve 13 için PyroMark ve Therascreen tahlillerinin her ikisinde de başarısız oldu ve bu durum, DNA nın çok düşük kalitede olduğunu gösteriyordu. Kodon 61 tahlili için daha yüksek olan başarı oranı, bunun kodon 12 ve 13 için hem PyroMark, hem Therascreen tahlillerine göre DNA kalitesine daha az bağımlı olduğunu göstermektedir. Therascreen tahlili, kodon 61 deki mutasyonları test etmediği için, tahlillerin doğrudan karşılaştırılması mümkün değildir. Kodon 61 deki mutasyonlar, 99 örneğin 4 ünde saptandı. Bunların üçünde kodon 61 de sık görülen mutasyonlar (CAC, CAT, CTA) varken, dördüncü örnek hem kodon 60 (GGT GGA), hem de kodon 61 de (CAA AAA) mutasyonları içeriyordu. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 13

Kullanıcı Tarafından Sağlanacak Ekipman ve Ayıraçlar Kimyasal maddelerle çalışırken her zaman uygun bir laboratuar önlüğü, tek kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. Daha fazla bilgi almak için ürün tedarikçisinden edinilebilen uygun material safety data sheets (malzeme güvenlik veri formları) (MSDS) belgelerine başvurun. DNA izolasyon kiti (bkz. DNA izolasyonu, sayfa 15) Pipetler (ayarlanabilir)* Filtreli steril pipet uçları Tezgah üstü mikro santrifüj* PCR ayıraçları (PyroMark KRAS Kiti, HotStarTaq Plus Master Mix Kit, kat. no. 203643, 203645 veya 203646 kullanılarak doğrulanmıştır) Termal çevrim cihazı* ve uygun PCR tüpleri Streptavidin Sepharose High Performance (GE Healthcare, kat. no. 17-5113-01; www.gelifesciences.com) PyroMark Q24 MDx (kat. no. 9001513)* PyroMark Q24 MDx Software (kat. no. 9019063) PyroMark Q24 Plate (kat. no. 979301) PyroMark Q24 Cartridge (kat. no. 979302) PyroMark Q24 MDx Vacuum Workstation (kat. no. 9001515 veya 9001517)* PyroMark Gold Reagents (kat. no. 971802) PyroMark Binding Buffer (kat. no. 979306) PyroMark Denaturation Solution (kat. no. 979307) PyroMark Wash Buffer, konsantresi (kat. no. 979308) PyroMark Annealing Buffer (kat. no. 979309) Plaka mikseri,* boncuklarda hareketsiz hale getirme amaçlı Isıtma bloğu,* 80 C ye ulaşabilen kapasitede 24 kuyulu PCR plaka veya stripler Başlık stripleri Yüksek saflıkta su (Milli-Q 18,2 MΩ x cm veya eşdeğeri) Etanol (%70) * Aletlerin kontrol ve kalibrasyonunun üreticinin önerileri doğrultusunda yapıldığından emin olun. AB Direktifi 98/79/AT doğrultusunda CE-IVD işaretlidir. Listelenen diğer ürünler, AB Direktifi 98/79/AT doğrultusunda CE-IVD işaretli değildir. 14 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

Önemli Notlar Genel önlemler Kullanıcı aşağıdaki hususlara her zaman dikkat etmelidir: Filtreli steril pipet uçları kullanın. Pozitif materyallerin depolama ve çıkarılmasını (örnekler, pozitif kontroller ve amplikonlar), diğer tüm ayıraçlardan ayrı olarak yapın ve bunları reaksiyon karışımına mekansal olarak ayrılmış bir tesiste ekleyin. Bir tahlile başlamadan önce tüm bileşenleri oda sıcaklığında (15 25 C) tamamen çözün. Çözüldüğünde, bileşenleri karıştırın (yukarı-aşağı tekrar tekrar pipetleyerek veya darbeli vorteks kullanarak) ve kısa süre santrifüjleyin. Örnek materyal Tüm örnekler, potansiyel olarak enfeksiyöz materyal olarak işlem görmelidir. Örnek materyal, kandan veya formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü örneklerden alınan insan DNA sıdır. Heparin tedavisi gören insanlardan alınan örnekler kullanılmamalıdır. Antikoagülan olarak heparin içeren tüplerle toplanmış kan örnekleri kullanılmamalıdır. Heparin, PCR işlemini etkiler. DNA izolasyonu Tablo 4 te gösterilen QIAGEN kitleri, PyroMark KRAS Kiti ile birlikte kullanılmak üzere belirtilen insan örneği tiplerinden DNA saflaştırması için önerilir. DNA saflaştırmasını, kit elkitaplarında verilen talimat doğrultusunda gerçekleştirin. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 15

Tablo 4. PyroMark KRAS Kiti ile birlikte kullanılmak üzere önerilen DNA saflaştırma kitleri Örnek materyal Nükleik asit izolasyon kiti Katalog numarası (QIAGEN) Parafine gömülü QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50) 56404 doku EZ1 DNA Tissue Kit (48)* 953034 Kan QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 61104 * Parafine gömülü doku ile birlikte kullanma protokolü doğrultusunda. EZ1 DNA Tissue Kit, EZ1 Advanced (kat. no. 9001410 veya 9001411) ile birlikte ve EZ1 Advanced DNA Paraffin Section Card (kat. no. 9018298), EZ1 Advanced XL (kat. no. 9001492 veya 9001493) ve EZ1 Advanced XL DNA Paraffin Section Card (kat. no. 9018700) veya BioRobot EZ1 (kat. no. 9000705; artık mevcut değildir) ve EZ1 DNA Paraffin Section Card (kat. no. 9015862) ile birlikte kullanılmalıdır. AB Direktifi 98/79/AT doğrultusunda CE-IVD işaretlidir. Kontroller İki pozitif kontrol, ürünle birlikte verilmektedir. Bunlar, PCR ve sekanslama reaksiyonlarında kontrol olarak kullanılır. wt KRAS Control DNA sı, normal KRAS sekansını ve Mutant KRAS Control DNA sı her 3 kodondaki mutasyonları içerir. Her iki kontrol, kodon 15 ve kodon 59 da, bunları genomik DNA dan ayırt etmeye yönelik bir baz takasına sahiptir. Kontroller analize ayrı olarak eklenebileceği gibi, tercih edilen oranlarda karıştırılabilir. Kontrollerin sekansları Tablo 5 te gösterilmiştir. Mutant KRAS Control DNA yı analiz etmek için, Sequence to Analyze ı (Analiz Edilecek Sekans) NGTGRCGTAGGYA şeklinde ayarlayarak, kodon 12 nin ilk bazını hedefleyin (bkz. Ek A, sayfa 36). Tablo 5. Kontrollerin sekansları Kontrol Kodon 12 Kodon 13 Kodon 15 Kodon 59 Kodon 61 Normal GGT GGC GGT GTA CAA Mutasyonlu TGT GAC GGT GTA CAC Ayrıca, bir negatif kontrol (şablon DNA olmadan) her zaman dahil edilmelidir. 16 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

Protokol 1: PyroMark Q24 MDx için Çalışma Ayarı Başlamadan önce önemli bir husus Gerekirse, LOB, normal bir örnek kullanılarak veya sağlanmış wt KRAS Control DNA sı kullanılarak tam bir sonuç plakası üretilerek doğrulanabilir. Ayrıntılar için NCCLS Guideline EP17-A Protocol for determination of limits of detection and limits of quantitation; approved guideline başlıklı belgeye başvurun. Başlamadan önce yapılması gerekenler Ek A da anlatıldığı gibi bir Tahlil Ayarı oluşturun. Bunun yalnızca bir kez, PyroMark KRAS tahlili ilk kez çalıştırılmadan önce yapılması gerekir (bkz. Ek A, sayfa 36). Yöntem 1. Araç çubuğunda simgesine basın. Yeni bir çalışma dosyası oluşturulur. 2. Çalışma parametreleri bilgilerini girin (aşağıda bkz. Çalışma parametreleri ). 3. Hem kodon 12/13, hem de kodon 61 için tahlilleri, analiz edilecek örneklere denk düşen kuyulara ekleyerek plakayı ayarlayın. Bir negatif örneğin (DNA sız) ve sağlanan wt KRAS Control DNA sı ve Mutant KRAS Control DNA sının kontrol olarak kullanılmaları önerilir. 4. Çalışma ayarlandığında ve PyroMark Q24 MDx üzerinde çalışmaya hazır olduğunda: Gereken enzim karışımı, substrat karışımı ve nükleotid hacimlerinin ve plaka ayarının bir listesini yazdırın. Tools [Araçlar] menüsünden Pre Run Information ı [Çalışma Öncesi Bilgiler] seçin ve rapor göründüğünde simgesine tıklayın. Çalışma dosyasını kapatın ve bir USB belleğe (sistemle birlikte verilmiştir) Windows Explorer ı (Windows Gezgini) kullanarak kopyalayın. Yazdırılan Çalışma Öncesi Bilgiler, örnek ayarı için bir şablon olarak kullanılabilir (bkz. Protokol 3: PCR Ürünlerinin, Streptavidin Sepharose High Performance Boncuklarında Hareketsiz Hale Getirilmesi, sayfa 22). Plakayı PyroMark Q24 MDx üzerinde çalıştırmak için, bkz. Protokol 5: PyroMark Q24 MDx i Çalıştırma, sayfa 27. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 17

Çalışma parametreleri Run name (Çalışma adı): Çalışmanın adı dosya kaydedildiğinde verilir. Bu dosyanın yeniden adlandırılması çalışmanın adını da değiştirir. Instrument method (Alet yöntemi): Plate ID (Plaka Kimliği): Bar code (Barkod): Reagent ID (Ayıraç Kimliği): Alet yöntemini, çalışma için kullanılacak ayıraçlar ve kartuşa göre seçin; ürünlerle birlikte verilen talimata bakın. İsteğe Bağlı: PyroMark Q24 Plate ının kimliğini girin. İsteğe Bağlı: Plaka için bir barkod numarası girin veya bilgisayarınıza bağlı olan bir barkod okuyucunuz varsa bunu bilgisayarınıza bağlayın, fareyi Barcode [Barkod] metin kutusuna getirin (kutuya tıklayarak) ve barkodu tarayın. İsteğe Bağlı: Kullanılacak PyroMark Gold Q24 Reagents lot numarasını girin. Lot numarası, ürün etiketinde belirtilmiştir. Ayıraçlarla ilgili beklenmedik sorunların izlenebilmesi için ayıraç kimliğinin girilmesini öneririz. Run note (Çalışma notu): İsteğe Bağlı: Çalışmanın içeriğine veya amacına ilişkin bir not girin. Tahlil dosyalarını ekleme Bir kuyuya bir tahlili eklemek için aşağıdakilerden birini yapın: Kuyuya sağ tıklayın ve bağlam menüsünden Load Assay i [Tahlili Yükle] seçin. Tahlili kısayol tarayıcısında seçin ve tahlile tıklayıp kuyuya sürükleyip bırakın. Kuyular, kuyuya yüklenen tahlile göre renkle kodlanır. Örnek kimliklerini ve notları girme Bir örnek kimliği veya notu girmek için, hücreyi seçin ve metni yazın. Bir örnek kimliğini veya notunu düzenlemek için ya hücreyi seçin (mevcut içerik seçilir) veya hücreye çift tıklayın. 18 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

Protokol 2: HotStarTaq Plus Master Mix Kiti ve PyroMark KRAS Kitini Kullanarak PCR Bu protokol, PyroMark KRAS Kiti kullanılarak kodon 12 ve kodon 13 içeren bir bölgenin PCR amplifikasyonları ve kodon 61 i içeren bir bölgenin de ayrı bir PCR amplifikasyonunun yapılmasına yöneliktir. Başlamadan önce önemli hususlar HotStarTaq Plus DNA Polymerase, 95 C de 5 dakikalık bir aktivasyon adımı gerektirir (bkz. HotStarTaq Plus PCR Elkitabı). Pyrosequencing analizinden önce, tüm reaksiyon karışımlarını, DNA saflaştırması, şablon DNA yı PCR üzerine ekleme, PCR ürün analizi veya örneklerin hazırlanması için kullanılandan ayrı bir alanda ayarlayın. Çapraz kontaminasyonu minimuma indirmek için hidrofobik filtreler içeren tek kullanımlık uçlar kullanın. Başlamadan önce yapılması gerekenler PCR primerleri bulunan tüpleri açmadan önce, içerikleri tüplerin dibine toplamak için kısa süreyle santrifüj uygulayın. Gerekirse örnek DNA nın konsantrasyonunu 0,4 2 ng/μl olarak ayarlayın. Yöntem 1. Primer solüsyonlarını ve şablon nükleik asidi çözün. Kullanmadan önce iyice karıştırın. 2. Her PCR primer seti için, Tablo 6 doğrultusunda bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Reaksiyon karışımı normalde örnek haricinde PCR için gereken tüm bileşenleri içerir. Yapılacak toplam PCR tahlili sayısı için gerekenden daha büyük bir reaksiyon karışımı hacmi hazırlayın. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 19

Tablo 6. Her PCR primer karışımı için reaksiyon karışımının hazırlanması Bileşen HotStarTaq Plus Master Mix, 2x PCR Primer KRAS 12/13 veya PCR Primer KRAS 61 Yüksek saflıkta su Toplam hacim Hacim/reaksiyon 12,5 μl 1 μl 6,5 μl 20 μl 3. Reaksiyon karışımını iyice karıştırın ve her bir PCR tüpüne 20 μl dağıtın. PCR tüplerini buz üzerinde tutmak gerekmez çünkü HotStarTaq Plus DNA Polymerase oda sıcaklığında etkin değildir. 4. Her bir PCR tüpüne 5 μl şablon DNA (2 10 ng genomik DNA) ekleyin (bkz. Tablo 7) ve iyice karıştırın. Bir negatif kontrol (şablon DNA olmadan) her zaman dahil edilmelidir. wt KRAS Control DNA sı ve Mutant KRAS Control DNA sı içeren reaksiyonları pozitif kontroller olarak ekleyin (bkz. Kontroller, sayfa 16). Tablo 7. PCR hazırlanması Bileşen Reaksiyon karışımı Örnek DNA Toplam hacim Hacim/reaksiyon 20 μl 5 μl 25 μl 20 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

5. Termal çevrim cihazını, Tablo 8 de ana hatları verilen koşulları kullanarak üreticinin talimatına göre programlayın. Tablo 8. Optimize çevrim protokolü Notlar İlk etkinleştirme adımı: 5 dakika 95 C HotStarTaq Plus DNA Polymerase, bu ısıtma adımıyla etkinleşir. 3 adımlı çevrim: Denatürasyon 20 sn. 95 C Yapıştırma 30 sn. 53 C Uzatma 20 sn. 72 C Çevrim sayısı 40 Son uzatma: 5 dakika 72 C 6. PCR tüplerini termal çevrim cihazına yerleştirin ve çevrim programını başlatın. 7. Amplifikasyon sonrasında, işleme Protokol 3: PCR Ürünlerinin, Streptavidin Sepharose High Performance Boncukları Üzerinde Hareketsiz Hale Getirilmesi ile devam edin. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 21

Protokol 3: PCR Ürünlerinin, Streptavidin Sepharose High Performance Boncuklarında Hareketsiz Hale Getirilmesi Bu protokol, PyroMark Q24 MDx üzerinde analize başlamadan önce şablon DNA nın Streptavidin Sepharose High Performance (GE Healthcare) boncukları üzerinde hareketsiz hale getirilmesine yöneliktir. Başlamadan önce yapılması gerekenler Başlamadan önce gereken tüm ayıraçların ve solüsyonların oda sıcaklığına (15 25 C) ulaşmasını bekleyin. Yöntem 1. Streptavidin Sepharose High Performance ı içeren şişeyi, homojen bir solüsyon oluşana kadar nazikçe çalkalayın. 2. DNA yı hareketsiz hale getirme için Tablo 9 doğrultusunda bir ana karışım hazırlayın. Gerçekleştirilecek toplam reaksiyon sayısı için gerekenden %10 daha büyük bir hacim hazırlayın. Tablo 9. DNA yı hareketsiz hale getirme için ana karışım Bileşen Streptavidin Sepharose High Performance PyroMark Binding Buffer Yüksek saflıkta su Toplam hacim Hacim/örnek 2 μl 40 μl 28 μl 70 μl 3. 24 kuyulu bir PCR plakasının kuyularına veya striplerine 70 μl ana karışımdan, run setup [çalışma ayarı] içinde önceden tanımlandığı üzere ekleyin (bkz. Protokol 1: PyroMark Q24 MDx İçin Çalışma Ayarı, sayfa 17). 4. Protokol 2 deki biyotinlenmiş PCR ürününden 10 μl yi ana karışımı içeren her bir kuyuya, run setup [çalışma ayarı] içinde önceden tanımlandığı üzere ekleyin (bkz. Protokol 1: PyroMark Q24 MDx İçin Çalışma Ayarı, sayfa 17). Kuyu başına toplam hacim, ana karışım ve PCR ürünü eklendikten sonra 80 μl olmalıdır. 22 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

5. PCR plakasını (veya striplerini) başlık striplerini kullanarak kapatın. Kuyular arasında sızıntı olasılığı bulunmadığından emin olun. 6. PCR plakasını oda sıcaklığında (15 25 C) 1400 devir/dakika hızında 5 10 dakika boyunca çalkalayın. Bu adım sırasında, PyroMark Q24 MDx Vacuum Workstation u PyroMark Q24 Kullanım Kılavuzu nda açıklandığı gibi örnek hazırlama için hazırlayın. 7. Hemen Protokol 4: PyroMark Q24 MDx Üzerinde Pyrosequencing Analizi Yapmadan Önce Örneklerin Hazırlanması adımına geçin. Sefaroz boncuklar hızla çökelir. Boncukların yakalanması, çalkalama işleminden hemen sonra yapılmalıdır. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 23

Protokol 4: PyroMark Q24 MDx üzerinde Pyrosequencing Analizi Yapmadan Önce Örneklerin Hazırlanması Bu protokol, tek sarmallı DNA hazırlanmasına ve sekanslama primerinin PyroMark Q24 MDx üzerinde Pyrosequencing analizinden önce şablona yapışmasına yöneliktir. Başlamadan önce önemli hususlar Sekanslama primerleri bulunan tüpleri açmadan önce, içerikleri tüplerin dibine toplamak için kısa süreyle santrifüj uygulayın. Aynı desendeki 2 farklı sekanslama primerini plaka için run setup (çalışma ayarı) içinde önceden tanımlandığı üzere (bkz. Protokol 1: PyroMark Q24 MDx için Çalışma Ayarı, sayfa 17) ve analiz bölgesine (kodon 12 ve 13 veya kodon 61) bağlı olarak ekleyin. Başlamadan önce yapılması gerekenler PyroMark Q24 Plate Holder'ı, 17. adımda kullanılmak üzere 80 C de bir ısıtma bloğuna yerleştirin. Yöntem 1. Her bir sekanslama primerinden yani Seq Primer KRAS 12/13 ve Seq Primer KRAS 61 den yeterli bir miktarı Tablo 10 da gösterildiği gibi PyroMark Annealing Buffer da seyreltin. Sekanslanacak toplam örnek sayısı için gerekenden daha fazla bir miktarda seyreltilmiş sekanslama primeri hacmi hazırlayın (örnek sayısı + bir ekstra). Tablo 10. Sekanslama primerlerinin örnek seyreltilmesi Bileşen Hacim/örnek 9 + 1 reaksiyon için hacim Seq Primer KRAS 12/13 veya Seq Primer KRAS 61 0,8 μl 8 μl PyroMark Annealing Buffer 24,2 μl 242 μl Toplam hacim 25 μl 250 μl 24 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

2. 25 μl seyreltilmiş sekanslama primerini, çalışma ayarına göre her bir PyroMark Q24 Plate kuyusuna ekleyin (bkz. Protokol 1: PyroMark Q24 MDx için Çalışma Ayarı, sayfa 17). PyroMark Q24 Plate Holder lardan birini (PyroMark Q24 MDx Vacuum Workstation u ile birlikte verilir) oda sıcaklığında (15 25 C) tutun ve plaka hazırlandığında ve taşındığında destek olarak kullanın. 3. Protokol 3 ten PCR plakasını (veya striplerini) ve PyroMark Q24 Plate ını çalışma masasına yerleştirin (bkz. Şekil 3). Plakanın örnekler doldurulduğu zamanki yönde bulunduğundan emin olun. Şekil 3. PCR plakasının (veya striplerin) ve PyroMark Q24 Plate ının vakum iş istasyonuna yerleştirilmesi. 4. Vakum anahtarını açarak alete vakum uygulayın. 5. Filtre problarını PCR plakasına (veya striplerine) dikkatle indirerek, hareketsiz hale getirilmiş şablonu içeren boncukları yakalayın. Probları 15 sn. boyunca yerlerinde tutun. Aleti kaldırırken dikkatli olun. Sefaroz boncuklar hızla çökelir. Plaka (veya stripler) karıştırıldığından beri 1 dakikadan fazla zaman geçmişse, boncukları yakalamadan önce yeniden 1 dakika boyunca çalkalayın. 6. Aleti %70 etanol içeren yatağa (yatak 1) aktarın. Filtre problarını 5 sn. boyunca yıkayın. 7. Aleti Denatürasyon Solüsyonunu içeren yatağa (yatak 2) aktarın. Filtre problarını 5 sn. boyunca yıkayın. 8. Aleti Yıkama Tamponunu içeren yatağa (yatak 3) aktarın. Filtre problarını 10 sn. boyunca yıkayın. 9. Aleti yukarıya ve geriye, dikey yönde 90 den fazla kaldırıp, filtre problarından sıvıların akmasını sağlamak için 5 sn. boyunca bekletin (bkz. Şekil 4). PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 25

Şekil 4. Dikey yönde 90 den fazla kaldırılmış vakum aletinin resmi. 10. Alet PyroMark Q24 Plate ının üzerinde tutulurken, aletteki vakum anahtarını (Off) [Kapalı] konumuna getirerek kapatın. 11. Seq Primerleri içeren plakadaki boncukları, aleti yanlara doğru nazikçe çalkalayarak serbest bırakın. Filtre problarını kuyuların dibine yaslanmış olarak bırakın. 12. Aleti nükleaz içermeyen su bulunan yatağa (yatak 4) aktarın ve aleti 10 sn. boyunca çalkalayın. 13. Filtre problarını, probları nükleaz içermeyen suya (yatak 5) indirerek ve vakum uygulayarak yıkayın. Probları 70 ml nükleaz içermeyen suyla yıkayın. 14. Aleti yukarıya ve geriye, dikey yönde 90 den fazla kaldırıp, filtre problarından sıvıların akmasını sağlamak için 5 sn. boyunca bekletin (bkz. Şekil 4). 15. Aletteki vakum anahtarını (Off) [Kapalı] konuma getirin ve aleti Parking (P) [Park] konumuna alın. 16. Vakum pompasını kapatın. Her işgününün sonunda sıvı atıklar ve kalan solüsyonlar atılmalıdır ve PyroMark Q24 MDx Vacuum Workstation toz ve döküntü açısından kontrol edilmelidir, bkz. Ek B, sayfa 38. 17. Önceden ısıtılmış PyroMark Q24 Plate Holder ı kullanarak, PyroMark Q24 Plate ını örneklerle birlikte 80 C de 2 dakika boyunca ısıtın. 18. PyroMark Q24 Plate ı plaka tutucudan çıkarın ve en az 5 dakika boyunca örneklerin oda sıcaklığına (15 25 C) soğumasını bekleyin. 19. İşleme, Protokol 5: PyroMark Q24 MDx i Çalıştırma ile devam edin. 26 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

Protokol 5: PyroMark Q24 MDx i Çalıştırma Bu protokol, PyroMark Gold Q24 Reagents, PyroMark Q24 Cartridge a yüklenmesini ve PyroMark Q24 MDx üzerinde bir run (çalışma) işleminin başlatılması ve bitirilmesini açıklamaktadır. Bir çalışma işleminin nasıl ayarlanacağına ilişkin ayrıntılı açıklamalar için, bkz. PyroMark Q24 Kullanım Kılavuzu. Başlamadan önce önemli bir husus Çalışma ayarı kısmında, Tools [Araçlar] menüsünde bulunan Pre Run information [Çalışma Öncesi Bilgiler] raporu, (bkz. Protokol 1: PyroMark Q24 MDx için Çalışma Ayarı, sayfa 17), belirli bir tahlil için gereken nükleotid, enzim ve substrat tampon hacimlerine ilişkin bilgi sağlar. Yöntem 1. PyroMark Q24 Cartridge ını, uygun nükleotid, enzim ve substrat tampon hacimleriyle yükleyin. 2. Kartuş kapısını açın ve doldurulmuş ayıraç kartuşunu etiketi dışarıya bakacak şekilde yerleştirin. Kartuşu tam olarak içeriye yerleştirin ve aşağıya itin. 3. Çizginin kartuş önünde görünür olduğunu kontrol edin ve kapıyı kapatın. 4. Plaka tutucu çerçeveyi açın ve plakayı ısıtma bloğuna yerleştirin. 5. Plaka tutucu çerçeveyi ve alet kapağını kapatın. 6. USB belleği (çalışma dosyasını içerir) aletin önündeki USB bağlantı noktasına takın. USB belleğini çalışma bitmeden önce çıkarmayın. 7. Ana menüden Run [Çalışma] seçin ve ekran düğmelerini kullanarak) ve OK [Tamam] düğmesine basın. 8. Çalışma dosyası belgesini ve ekran düğmelerini kullanarak seçin. Bir klasörün içeriğini görüntülemek için klasörü seçin ve Select e [Seç] basın. Önceki görünüme dönmek için Back e [Geri] basın. 9. Çalışma dosyası seçildiğinde, çalışmayı başlatmak için Select e [Seç] basın. 10. Çalışma bittiğinde ve alet, çalışma dosyasının USB belleğe kaydedildiğini doğruladığında Close a [Kapat] basın. 11. USB belleği çıkartın. 12. Alet kapağını açın. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 27

13. Kartuş kapısını açın ve ayıraç kartuşunu yukarı kaldırıp dışarı çekerek çıkartın. 14. Kapıyı kapatın. 15. Plaka tutucu çerçeveyi açın ve plakayı ısıtma bloğundan çıkartın. 16. Plaka tutucu çerçeveyi ve alet kapağını kapatın. 17. Plakayı atın ve kartuşu temizleyin. 18. Çalışmayı Protokol 6: Bir PyroMark Q24 MDx Çalışmasının Analizi doğrultusunda analiz edin. 28 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

Protokol 6: Bir PyroMark Q24 MDx Çalışmasının Analizi Bu protokol, PyroMark Q24 MDx Software kullanılarak bitmiş bir KRAS çalışmasının mutasyon analizini açıklamaktadır. Yöntem 1. USB belleği (işlenmiş çalışma dosyasını içerir) bilgisayarın USB bağlantı noktasına takın. 2. Çalışma dosyasını USB bellekten, bilgisayarın istediğiniz bir konumuna Windows Explorer ı (Windows Gezgini) kullanarak taşıyın. 3. File [Dosya] menüsünden Open ı [Aç] seçerek ya da kısayol tarayıcısında dosyaya ( ) çift tıklayarak çalışma dosyasını PyroMark Q24 MDx Software ının AQ modunda açın. 4. Çalışmayı analiz etmek ve sonuçların genel görünümünü almak için, Analyze [Analiz Et] düğmelerinden birine tıklayın. Tüm kuyuları analiz et. Seçilen kuyuyu analiz et. Analiz sonuçları (alel sıklıkları) ve kalite değerlendirmesi, Pyrogram izinde değişken konumunun üstünde görüntülenir. Bir çalışmanın nasıl analiz edileceğine ilişkin ayrıntılı bilgi için, bkz. PyroMark Q24 Kullanım Kılavuzu. 5. Bir rapor oluşturmak için, menüde Reports for AQ runs tan [AQ çalışmaları için raporlar] Full Report u [Tam Rapor] seçin. KRAS mutasyonları en sık nükleotid 35 te (kodon 12 nin ikinci bazı) bulunmaktadır. Bu nedenle, Analysis Setup ta [Analiz Ayarı] tanımlanan Sequence to Analyze [Analiz Edilecek Sekans] bu pozisyondaki mutasyonlara yöneliktir (bkz. Ek A, sayfa 36). Bir örnekte nükleotid 34 te (kodon 12 nin ilk bazı) bir mutasyon varsa, Sequence to Analyze [Analiz Edilecek Sekans] bu pozisyondaki mutasyon durumunu da analiz etmek üzere, Ek A da açıklandığı gibi değiştirilebilir. İnsan KRAS geninde, kodon 12/13 ve kodon 61 deki mutasyonların güncelleştirilmiş sıklıkları, Sanger Institute tarafından www.sanger.ac.uk/genetics/cgp/cosmic/ adresinde çevrimiçi olarak sağlanmaktadır. Güvenilir sonuçlar için, 30 RLU nun üzerinde tek pik yüksekliklerini öneririz. Tahlil ayarında required peak height for passed quality [geçer kalite için gereken pik yüksekliği] olarak 30 RLU ayarlanmalıdır (bkz. Ek A ve PyroMark Q24 Kullanım Kılavuzu). PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 29

Alel miktarsal ölçümünün belgelendirilmesi için AQ Analysis [AQ Analizi] sonuç raporu kullanılmalıdır. Pyrogram da gösterilen sayılar yuvarlanmıştır ve kesin miktar ölçümünü göstermezler. Nükleotid 35 te mutasyon saptanmayan veya Check [Kontrol Et] veya Failed [Başarısız] kalite değerlendirmelerine sahip örneklerin yeniden analizi Nükleotid 35 te mutasyon saptanmayan ve Check [Kontrol Et] veya Failed [Başarısız] kalite değerlendirmelerine sahip, nükleotid 34 ü hedefleyen Sequence to Analyze [Analiz Edilecek Sekans] bulunan örneklerin yeniden analiz edilmesini kuvvetle öneririz. Check [Kontrol Et] veya Failed [Başarısız] kalite değerlendirmeleri, bir nükleotid 35 mutasyonu için beklenmeyen bir pozisyonda referans pik oluşmasını gösteriyor olabilir. İlk 3 dağıtımın herhangi birindeki bir pik, nükleotid 34 te bir mutasyon bulunduğunu gösterir. Nükleotid 34 teki mutasyonları yeniden analiz etmek ve hedeflemek için, Analysis Setup a [Analiz Ayarı] gidin ve Sequence to Analyze i [Analiz Edilecek Sekans] GNTGRCGTAGGYA şeklinden, NGTGRCGTAGGYA şekline değiştirin. Apply [Uygula] düğmesine basın ve Apply Analysis Setup [Analiz Ayarını Uygula] penceresi göründüğünde To All a [Tümüne] basın. Düşük düzeyli mutasyonları saptamak için örnekleri yeniden çalışma Karşılaştırma amacıyla her çalışmaya normal bir örneğin eklenmesi kuvvetle önerilir. Normal örnekte denk düşen pozisyondan daha yüksek bir mutasyon sıklığı gösteren herhangi bir örneğin, saptama sınırını gösteren tabloya bakılarak incelenmesi gerekir (bkz. Tablo 11, sayfa 31). Bu örnekler, olağandışı yüksek mutasyon sıklıklarını açığa çıkarmak için birbirleriyle de karşılaştırılabilirler. Bir kılavuz olarak, LOD (Tablo 11) ila LOD + %3 birim aralığında bir kuşkulu mutasyon bulunan örneklerin, çift halinde normal bir örnekle birlikte çift olarak yeniden analiz edilmeleri gerekir. Her iki çift de orijinal analizle aynı sonucu verirse ve normal kontrolden görünür şekilde farklıysa örnek, mutasyon açısından pozitif olarak değerlendirilebilir. Kanser hastalarına yönelik tedavi kararlarının yalnızca KRAS mutasyon durumuna dayandırılmaması gerektiğini unutmayın. Şüphelenilen bir GGT GTT mutasyonu varsa, %1 den daha büyük bir sonuç pozitif olarak değerlendirilebilir. Bu düzey, replikatlar arasında büyük ölçüde değişkenlik gösterebilir (bkz. Boş sınırı ve saptama sınırı, sayfa 9). 30 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

Tablo 11. Spesifik mutasyonlar için belirlenen LOB ve LOD Mutasyon LOB (%) LOD (%) COSMIC ID* (V42) Kodon 12 (GGT) GAT 0,6 2,2 521 GTT geçerli değil 7,0 520 TGT 0,5 2,1 516 AGT 0,4 1,9 517 GCT 0,7 2,3 522 CGT 0,3 1,8 518 Kodon 13 (GGC) GAC 0,3 1,9 532 Kodon 61 (CAA), ters yönelimde tahlil edildiği şekliyle (TTG) GTG 0,8 2,8 554 TAG 1,2 3,1 553 TCG 1,6 3,5 552 ATG 0,7 2,6 555 TTC 1,2 3,1 550 * Sanger Institute un www.sanger.ac.uk/genetics/cgp/cosmic/ adresinde çevrimiçi olarak bulunan Catalogue of Somatic Mutations in Cancer dan alınmıştır. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 31

Temsili sonuçlar Temsili Pyrogram sonuçları Şekil 5 10 da gösterilmektedir. Şekil 5. Kodon 12 ve 13 te normal bir genotip bulunan bir örneğin analizinden sonra elde edilen Pyrogram izi. Şekil 6. Kodon 61 de normal bir genotip bulunan bir örneğin analizinden sonra elde edilen Pyrogram izi. Şekil 7. Kodon 12 baz 2 de (bir okla belirtilen nükleotid 35) GGT GAT mutasyonu bulunan örneklerin analizinden sonra elde edilen Pyrogram izi. 32 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

Şekil 8. Kodon 12 baz 1 de (bir okla belirtilen nükleotid 34) GGT AGT mutasyonu bulunan örneklerin analizinden sonra elde edilen Pyrogram izi; Sequence to Analyze [Analiz Edilecek Sekans] ayarı GNTGRCGTAGGYA şeklinde ve kodon 12 baz 2 yi (nükleotid 35) hedefleyecek şekilde ayarlanmıştır. Sarı renk, bu sekansın beklenmediğini ve kontrol edilmesi gerektiğini belirtir. Şekil 9. Şekil 8 deki örneğin yeniden analiz edilmesinden sonra elde edilen Pyrogram izi ve sonuç. GGT AGT mutasyonu, Sequence to Analyze [Analiz Edilecek Sekans] NGTGRCGTAGGYA şeklinde ve kodon 12 baz 1 i (nükleotid 34) hedefleyecek şekilde ayarlanarak yeniden analiz edilmiştir. Şekil 10. Mutant KRAS Control DNA, Sequence to Analyze [Analiz Edilecek Sekans] NGTGRCGTAGGYA şeklinde ayarlanarak, kodon 12 nin ilk bazı hedeflenerek analiz edilmesinden sonra elde edilen Pyrogram izi. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 33

Sorun Giderme Kılavuzu Bu sorun giderme kılavuzu, ortaya çıkabilecek sorunların çözülmesinde yardımcı olabilir. Daha fazla bilgi almak için, aşağıdaki adreste bulunan Teknik Destek Merkezi Frequently Asked Questions [Sık Sorulan Sorular] sayfasına da bakabilirsiniz: www.qiagen.com/faq/faqlist.aspx. QIAGEN Teknik Servisleri ndeki bilim insanları, bu elkitabındaki bilgiler ve protokollere veya örnekleme ve tahlil teknolojilerine ilişkin sorularınızı yanıtlamaktan her zaman mutluluk duyacaklardır (iletişim bilgileri için arka kapağa bakın veya www.qiagen.com adresini ziyaret edin). Aletle ilgili genel sorun giderme için PyroMark Q24 Kullanım Kılavuzu na bakın. Yorumlar ve öneriler Şablonsuz kontrolde (negatif kontrol) sinyaller a) Kuyular arasında parazit b) PCR kontaminasyonu Zayıf veya beklenmeyen sekans Düşük genomik DNA kalitesi Bir kuyudan gelen sinyal komşu bir kuyudan saptanıyor. Yüksek sinyal yoğunluklarına sahip örnekleri, şablonsuz kontrol kuyularının yanına yerleştirmekten kaçının. Filtreli steril pipet uçları kullanın. Örnekler, plazmid kontrolleri ve amplikonlar gibi materyali PCR ayıraçlarından ayrı olarak depolayın ve çıkarın. Düşük genomik DNA kalitesi, PCR işleminin başarısız olmasına neden olabilir. PCR örneklerini bir elektroforetik teknik (örneğin QIAxcel Sistemi veya agaroz jel elektroforez) kullanarak analiz edin. Check [Kontrol Et] veya failed [Başarısız] sonucu Tahlil ayarında tanımlanmamış nadir bir mutasyon Analiz edilecek sekansı tahlil ayarında ayarlayın (bkz. Ek A, sayfa 36) ve çalışmayı yeniden analiz edin. Yüksek arka plan Nükleotidlerin yanlış depolanması Nükleotidleri 2 8 C de depolayın. -20 C de depolamak, arka planda artışa neden olabilir. 34 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

Yorumlar ve öneriler Pozitif kontrollerde sinyal yok (wt KRAS Control DNA ve Mutant KRAS Control DNA) a) Tüm kuyular için yetersiz enzim veya substrat karışımı b) Ayıraçlar yanlış depolanmış veya seyreltilmiş PyroMark Q24 Cartridge ı, Tools [Araçlar] menüsündeki Pre Run Information a [Çalışma Öncesi Bilgiler] uygun olarak doldurduğunuzdan emin olun. PyroMark Gold Q24 Reagents ı, birlikte verilen talimata uygun olarak hazırlayın. Son değişken pozisyonunda beklenmedik izleyici piki Kontrol plazmid DNA ile kontaminasyon Kontrol plazmidleri, wt KRAS Control DNA ve Mutant KRAS Control DNA, kontrollerden gelen sinyalleri saptamakta kullanılabilecek benzersiz bir sekans farkı içerirler (bkz. Kontroller, sayfa 16 ve Ek A: PyroMark KRAS Tahlillerinin Ayarlanması, sayfa 36). Filtreli steril pipet uçları kullanın. Örnekler, plazmid kontrolleri ve amplikonlar gibi materyali PCR ayıraçlarından ayrı olarak depolayın ve çıkarın. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 35

Ek A: PyroMark KRAS Tahlillerinin Ayarlanması PyroMark KRAS tahlili ilk çalışma işleminden önce, tahlil dosyasının aşağıda açıklandığı gibi ayarlanması gerekir. Yöntem KRAS kodonu 12 ve 13 1. KRAS kodonu 12 (pozisyon 2) ve 13 (pozisyon 2) için tahlili, PyroMark Q24 MDx Software kullanarak ayarlayın. 2. Araç çubuğunda simgesine tıklayın ve New AQ Assay i [Yeni AQ Tahlili] seçin. 3. Sequence to Analyze a [Analiz Edilecek Sekans] aşağıdakini yazın. GNTGRCGTAGGYA Kodon 12 mutasyonları en sık nükleotid 35 te (ikinci pozisyon) saptanacaktır. Nükleotid 34 te (ilk pozisyon) mutasyon varsa, Sequence to Analyze ı [Analiz Edilecek Sekans] aşağıdaki sekansa değiştirin. NGTGRCGTAGGYA Değişken pozisyon 3 (Y), plazmid kontrollerden (wt KRAS Control DNA ve Mutant KRAS Control DNA) gelen sinyallerin ve genomik DNA dan gelen sinyallerin birbirlerinden ayırt edilmelerini sağlar. Değişken pozisyon 3 te genomik DNA bir C ile, plazmid kontroller ise bir T ile sonuçlanır. 4. Aşağıdaki Dispensation Order ı [Dağıtım Sırası] elle girin. TACGACTCAGATCGTAGTC 2 1 0 T A C G A 5 C T C A G 10 A T C G T 15 A G T C Şekil 11. Sequence to Analyze [Analiz Edilecek Sekans] GNTGRCGTAGGYA şeklinde ayarlanmışken, kodon 12 (nükleotid 35) ve 13 (nükleotid 38) için histogram. 2 1 0 T A C G A 5 C T C A G 10 A T C G T 15 A G T C Şekil 12. Sequence to Analyze [Analiz Edilecek Sekans] NGTGRCGTAGGYA şeklinde ayarlanmışken, kodon 12 (nükleotid 34) ve 13 (nükleotid 38) için histogram. 36 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

5. Analysis Parameters [Analiz Parametreleri] sekmesine tıklayın ve Peak Height Threshold - Required peak height for Passed quality: [Pik Yükseklik Eşiği -Geçer kalite için gereken pik yüksekliği:] ayarını 30 olarak değiştirin. 6. Araç çubuğunda simgesine tıklayın ve tahlili KRAScodon 12+13 olarak kaydedin. KRAS kodon 61 7. Araç çubuğunda simgesine tıklayın ve New AQ Assay i [Yeni AQ Tahlili] seçin. 8. Sequence to Analyze a [Analiz Edilecek Sekans] aşağıdakini yazın. CTCDTGACCTRC Değişken pozisyon 2 (R), plazmid kontrollerden (wt KRAS Control DNA ve Mutant KRAS Control DNA ile) gelen sinyallerin ve genomik DNA dan gelen sinyallerin birbirlerinden ayırt edilmelerini sağlar. Değişken pozisyon 2 de genomik DNA bir G ile, plazmid kontroller ise bir A ile sonuçlanır. 9. Aşağıdaki Dispensation Order ı [Dağıtım Sırası] elle ekleyin. GCTCAGTCAGACTAG 2 1 0 G C T C A G T C A G 5 10 Şekil 13. Kodon 61 (nükleotid 183) için histogram. A C T A G 15 10. Analysis Parameters [Analiz Parametreleri] sekmesine tıklayın ve Peak Height Threshold - Required peak height for Passed quality: [Pik Yükseklik Eşiği -Geçer kalite için gereken pik yüksekliği:] ayarını 30 olarak değiştirin. 11. Araç çubuğunda simgesine tıklayın ve tahlili KRAScodon 61 olarak kaydedin. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 37

Ek B: Atık Kabını ve Yatakları Boşaltma UYARI Tehlikeli kimyasal maddeler Vakum iş istasyonunda kullanılan Denatürasyon Solüsyonu, gözler ve ciltte tahrişe neden olan sodyum hidroksit içerir. Her zaman emniyet gözlükleri, eldiven ve laboratuar önlüğü kullanın. Sorumlu kurum (örn. laboratuar yöneticisi) işyerinin emniyetli olduğunu ve alet kullanıcılarının tehlikeli toksik madde (kimyasal veya biyolojik) düzeylerine maruz kalmadığını, ilgili material safety data sheets (Malzeme Güvenlik Veri Formları (MSDS) belgelerinde veya OSHA,* ACGIH, veya COSHH belgelerinde tanımlandığı üzere sağlamaktan sorumludur. Duman için havalandırma ve atıkların uzaklaştırılması, ilgili tüm ulusal, eyalet ve yerel sağlık ve güvenlik yasa ve yönetmeliklerine uygun şekilde yapılmalıdır. * OSHA: Occupational Safety and Health Administration [İşyeri Sağlığı ve Güvenliği İdaresi] (Amerika Birleşik Devletleri) ACGIH: American Conference of Government Industrial Hygienists [Amerikan Hükümet Sanayi Hijyen Uzmanları Konferansı] (Amerika Birleşik Devletleri) COSHH: Control of Substances Hazardous to Health [Sağlık İçin Tehlikeli Maddelerin Kontrolü] (Birleşik Krallık) Laboratuar atıklarının uzaklaştırılması için, ilgili federal, eyalet ve yerel çevre yönetmeliklerine mutlaka uyun. Başlamadan önce önemli bir husus Bu protokol, yüksek saflıkta su gerektirir (Milli-Q 18,2 MΩ x cm, www.millipore.com veya eşdeğeri). Yöntem 1. Vakum aletine vakum uygulanmadığından emin olun. Vakumun (Off) [Kapalı] konumunda bulunduğundan ve vakum pompasının kapatıldığından emin olun. 2. Yataklarda kalan solüsyon varsa atın. 3. Yatakları yüksek saflıkta suyla yıkayın veya gerekirse değiştirin. 4. Atık kabını boşaltın. Başlık, tüp bağlantısı kesilmeden çıkarılabilir. 5. Vakum iş istasyonunun temizlenmesi gerekiyorsa (örneğin toz veya döküntü nedeniyle), PyroMark Q24 Kullanma Kılavuzu ndaki talimatı izleyin. 38 PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009

Referanslar QIAGEN, QIAGEN ürünlerini kullanan bilimsel yayınların geniş, güncel bir veritabanını çevrimiçi olarak tutmaktadır. Kapsamlı arama seçenekleri, basit anahtar sözcüklü aramayla ya da uygulama, araştırma alanı, başlık, vb. belirterek aramayla size gereken makaleleri bulmanızı sağlar. Referansların tam bir listesi için, www.qiagen.com/refdb/search.asp adresindeki çevrimiçi QIAGEN Reference Database i [Referans Veritabanı] ziyaret edin veya QIAGEN Teknik Servisleri ni veya yerel distribütörünüzü arayın. PyroMark KRAS Kiti Elkitabı 06/2009 39